专利名称：：免疫球蛋白变体及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗-CD20抗体及其在治疗B细胞相关疾病中的用途。
背景技术：
：淋巴细胞是白细胞的几个群体之一；它们特异性地识別和对外部抗原作出反应。淋巴细胞的三种主要类别是B淋巴细胞(B细胞)、T淋巴细胞(T细胞)与自然杀伤(NK)细胞。B淋巴细胞是负责抗体产生与提供体液免疫的细胞。B细胞在骨髓内部成熟并离开骨髓，在它们的细胞表面表达与抗原结合的抗体。当幼稚B细胞首次遇到其膜-结合抗体所特异的抗原时，细胞开始迅速分裂，其后代分化成记忆B细胞与被称为"浆细胞"的效应细胞。记忆B细胞具有较长寿命期限，并且继续表达与最初的母细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不产生膜结合抗体，但是相反产生分泌形式的抗体。分泌的抗体是体液免疫的主要效应物。CD20抗原(也被称作人B淋巴细胞限制的分化抗原，Bp35)是位于前-B与成熟B淋巴细胞上的疏水跨膜蛋白质，具有分子量大约35kD。/所o/.CTzew.264(19):11282-11287G989);与EinfeWda/.7(3):711-717(1988))。该抗原也在超过90%的B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表达万/oM63(6):1424-1433(1984))，但是在造血干细胞、原B细胞、正常浆细胞或者其它正常组织中没有找到(Tedderd//ww""o/.135(2):973-979(1985))。CD20被认为调节细胞周期起始与分化的激活过程中的一个早期步骤。(Tedderdfl/"，并且可能作为4丐离子通道发挥作用(Tedderda/.JCW/.所。c/z亂14D:195(1990))。由于CD20在B细胞淋巴瘤中的表达，这一抗原已被用作治疗该淋巴瘤的有用的治疗靶向。在美国有超过300,000人患有B细胞NHL，每年有超过56，000个新病例被诊断。例如，rituximab(RITUXAN)抗体被用来治疗具有复发或难治疗的低级或者滤泡的、CD20阳性的B细胞非何杰金氏淋巴瘤，该抗体是遗传改造的针对人CD20抗原的嵌合鼠/人单克隆抗体(可从Genentech,Inc.SouthSanFrancisco,California,U.S.购得)。Rituximab是在1998年4月7日发布的美国专利号5，736，137(Andersonetal.)与在美国专利号5，776，456中被称做"C2B8"的抗体。体外作用机理研究显示RITUXAN与人补体结合，并且通过补体依赖的细胞毒性(CDC)溶解淋巴样B细胞系Blood83(2):435-445(1994))。另外，它在对抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)的分析中具有显著活性。体内临床前研究表明RITUXAN⑧消减来自猕猴周围血液、淋巴结与骨髓的B细胞，推测是通过补体与细胞介导的过程83(2):435-445(1994))。其它指示NHL治疗的抗CD20抗体包括鼠抗体ZevalinTM，其与放射性同位素钇90连接(IDECPharmaceuticals,SanDiego，CA)，和Bexxar,其是与I131偶联的另一个完全的鼠的抗体(Corixa，WA)。鼠抗体在人类治疗中的使用的一个主要限制之处在于人抗小鼠抗体(HAMA)反应(参见，l列i口Miller,R.A.etal."MonoclonalantibodytherapeutictrialsinsevenpatientswithT-celllymphoma"Blood,62:988-995，1983;和Schroff,R.W"etal."Humananti-murineimmunoglobulinresponseinpatientsreceivingmonoclonalantibodytherapy"CancerRes.，45:879-885,1985)。艮卩4吏啮齿类动物抗体的可变(V)结构域与人恒定(C)区域融合的嵌合分子仍然能引发显著的免疫反应(HACA,人抗嵌合抗体)Nature(Lond.)，314:268-270,1985)。克服在单克隆抗体的临床利用中的这些限制的一个有效手段是"人源化，，鼠抗体或者来自非人物种的抗体。(Jones^a/.Nature(Lond),321:522-525:1986;RiechmanNature(Lond),332:323-327,1988)。因此，生产针对CD20抗原的治疗抗体是有利的，该抗体当给药给病人、特别是用于长期治疗时产生最低的或没有抗原性。本发明满足这一及其它需求。本发明提供克服目前治疗性组合物限制性的抗CD20抗体，以及提供额外的好处，这些好处将从下面的详细说明中加以明了。发明概述本发明提供CD20结合抗体或其功能性片段，以及其在治疗B细胞相关疾病中的用途。这些抗体是单克隆抗体。在特定的实施方式中，结合CD20的抗体是人源化的或者嵌合的。人源化的2H7变体包括在FR中具有氨基酸取代的变体，以及在移植的CDR中具有改变的亲和力成熟变体。在CDR或者FR中取代的氨基酸不局限于在供体或者受体抗体中存在的那些氨基酸。在其它实施方式中，本发明的抗-CD20抗体更进一步地包含Fc区域的氨基酸残基改变，这些改变导致效应子功能改善，包括增强CDC和/或ADCC功能与B细胞杀伤(在此也称为B细胞耗尽)。本发明的其它抗-CD20抗体包括那些具有能改善稳定性的改变的抗体。在一个特殊的具体实施方式中，稳定性增加的人源化2H7变体在下面实施例6中加以描述。还提供在体内具有改善的ADCC功能的岩藻糖缺陷的变体。在一个实施方式中，嵌合抗CD20抗体具有鼠可变区与人恒定区。一个像这样的特殊嵌合抗CD20抗体是Rituxan(Rituximab;Genentech,Inc.)。在本发明的所有抗体组合物和使用方法的一个优选实施方式中，人源化的CD20结合抗体是2H7.vl6,具有分别如图6和图7所示的SEQIDNO.21和22的轻与重链氨基酸序列。当提及在图6、7和8中的多肽序列时，应该理解，形成分泌信号序列的前19个左右氨基酸在成熟多肽中不存在。除了在说明书中指示的氨基酸取代位置之外，基于version16的所有其它变体的可变区将具有v16的氨基酸序列。除非另外指明，2H7变体将具有与vl6相同的轻链。本发明提供与人CD20结合的人源化抗体或者其抗原结合片段，其中抗体对体内消减灵长类动物B细胞是有效的，该抗体在H链可变区(VH)包含至少来自抗人CD20抗体的SEQIDNO.12的CDR3序列、和人重链亚群(subgroup)ni(VHlII)的基本上(substantially)的人共有框架(FR)残基。在一个实施方式中，灵长类动物B细胞来自于人和猕猴。在一个实施方式中，抗体更进一步包含SEQIDNO.10的H链CDR1序列与SEQIDNO.11的CDR2序列。在另一个实施方式中，前述抗体包含SEQIDNO.4的L链CDR1序列、SEQIDNO.5的CDR2序列、SEQIDNO.6的CDR3序列，具有人轻链K亚群I(VKl)的实质上人共有框架(FR)残基。在一优选实施方案中，Vl的FR区域在位置46具有供体抗体残基；在一个具体的实施方式中，Vl的FR2具有leuL46pro的氛基酸取代(在人kI共有序列中的Leu换成在m2H7相应位置存在的pro)。VH区域更进一步在框架的至少氨基酸位置49、71与73上包含供体抗体残基。在一个实施方式中，在Vh中，人重链亚群m的以下FR位置被取代FR2中的AlaH49Gly;FR3中的ArgH71Val与AsnH73Lys。在其它实施方式中，人源化抗体的CDR区域更进一步包含氨基酸取代，其中残基既不来自供体抗体也不来自受体抗体。前述实施方式的抗体可以包含v16的SEQIDNO8的Vh序列，如图1B所示。在前面的更进一步的实施方式中，抗体更进一步包含v16的SEQIDN02的Vl序列，如图1A所示。在其它实施方式中，人源化抗体是2H7.v31,具有SEQIDNO.21与23的轻与重链氨基酸序歹!J,分别如图6与图8所示；具有如图8所示SEQIDNO.23的重链氨基酸序列的2H7.v31;具有v16的H链的D56A与N100A与L链的S92A的氨基酸取代的2H7.v96。在分开的实施方式中，任何前述实施方式中的抗体更进一步包含在Fc区域中的至少一个氨基酸取代，该取代与衍生它的原始或者亲本抗体相比改善了ADCC和/或CDC活性，在大多数场合下被比较的亲本抗体是v.16，在其它情况下是Rituxan。具有改善活性的一个象这样的抗体在Fc区域包含S298A/E333A/K334A的三重丙氨酸取代。具有S298A/E333A/K334A取代的一个抗体是具有SEQIDNO.23的重链氨基酸序列的2H7.v31。同Rituxan比较起来抗体2H7.vl14与2H7.vl15显示ADCC活性改善至少10倍。在另一个实施方式中，抗体更进一步包含在Fc区域的至少一个氨基酸取代，该取代同衍生它的亲本抗体比较起来CDC活性降低，衍生它的亲本抗体在大多数情况下是v16。同v16比较起来CDC活性降低的一个象这样的抗体包含在H链中的至少K322A取代。ADCC与CDC活性的比较可以如实施例中所描述的进行分析。在一优选实施方式中，本发明的抗体是全长抗体，其中Vh区域連接至人IgG重链恒定区。在优选实施方式中，IgG是人IgGl或者IgG3。在一个实施方式中，CD20结合抗体结合至细胞毒性剂。在优选实施方式中，该细胞毒性剂是毒素或者放射性同位素。在一个实施方式中，本发明的用于治疗或者诊断用途的抗体在CHO细胞中产生。还提供一种组合物，该组合物包含前述实施方式中的任何一个的抗体，以及载体。在一个实施方式中，载体是药学上可以接受的载体。这些组合物可以以制品或者试剂盒提供。本发明也提供液体制剂，包含20mg/mL抗体的人源化2H7抗体，10mM硫酸组氨酸pH5.8,60mg/mL蔗糖(6%),0.2mg/mL聚山梨酸酯20(0.02%)。本发明也提供分离的核酸，该核酸编码在此所披露的抗体中的任何一种，包括表达抗体的表达载体。本发明的另一个方面是包含前述核酸的宿主细胞与产生该抗体的宿主细胞。在后者的一个优选实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。提供了产生这些抗体的方法，该方法包含培养产生抗体的宿主细胞，并且从细胞培养物中回收抗体。本发明的另一方面是一种制品，包括一个容器与包含在其中的组合物，其中组合物包含前述实施方式中的任何一个的抗体。为用来治疗NHL,该制品更进一步包含包装说明书，指示该组合物被用来治疗非何杰金氏淋巴瘤。本发明的更进一步的方面是体内在B细胞中诱发程序性细胞死亡的方法，包含将B细胞与前述中的任何的抗体接触，从而杀死B细胞。本发明也提供治疗在此所披露的疾病的方法，该方法通过将CD20结合抗体或者其功能性片段给药哺乳动物，例如患该疾病的人类病人，而治疗该疾病。在任何治疗自身免疫病或者CD20阳性癌症的方法中，在一个实施方式中，抗体是2H7.v16，分别具有SEQIDNO.21与22的轻与重链氨基酸序列，如图6与图7所示。因此，一个实施方式是治疗CD20阳性癌症的方法，包含给予患该癌症的病人治疗有效量的本发明的人源化CD20结合抗体。在优选实施方式中，CD20阳性癌症是B细胞淋巴瘤或者白血病包括非何杰金氏淋巴瘤(NHL)或者淋巴细胞占优势的何杰金氏病(LPHD)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或者SLL。在治疗B细胞淋巴瘤或者白血病的方法的实施方式中，抗体以剂量范围大约275-375mg/n^给药。在其它的实施方式中，治疗方法更进一步包含给予病人至少一种化疗剂，在其中对于非何杰金氏淋巴瘤(NHL)而言，化疗剂选自由阿霉素、环磷酰胺、长春新碱与氢化泼尼^Kprednisolone)组成的组。也提供治疗自身免疫病的方法，包含给予病人治疗有效量的前述权利要求中任何一个的人源化CD20结合抗体，该病人患有自身免疫病。自身免疫病选自由下列组成的组类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼^(SLE)、韦格内氏病(Wegener'sdisease),炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少、多发性硬化、牛皮癣、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、血管炎、糖尿病、雷诺氏征(Reynaud，ssyndrome)、斯耶格仑氏综合症(sjorgen，ssyndrome)与肾小球肾炎。当自身免疫病是类风湿性关节炎时，抗体可以与第二治疗剂联合给药，该第二治疗剂优选地是氨曱喋呤。在这些治疗方法中，CD20结合抗体可以单独或者与第二治疗剂结合给药，第二治疗剂例如第二抗体、或者化疗剂或免疫抑制剂。第二抗体可以是结合CD20或者不同B细胞抗原、或者NK或T细胞抗原的抗体。在一个实施方式中，第二抗体是放射性同位素标记的抗CD20抗体。在其它实施方式中，CD20结合抗体偶联至细胞毒性剂，包括毒素或者放射性同位素。在另一方面，本发明提供治疗自身免疫病的方法，自身免疫病选自由皮肌炎(Dermatomyositis)、韦格内氏肉芽肿病、ANCA、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、凝血因子VIII缺乏、曱型血友病、自身免疫性中性白细胞减少、Castleman's综合症、古德帕斯彻氏综合症(Goodpasture'ssyndrome)、实体器官移植排斥、移植物抗宿主疾病(GVhD)、IgM介导的神经病、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、桥本氏曱状腺炎(Hashimoto'sThyroiditis)、自身免疫性肝炎、淋巴组织间质肺炎(HIV)、闭塞NSIP)、格-巴二氏综合症(Guillain-Barresyndrome)、大血管血管炎、巨细月包(高安氏)动脉炎(giantcell(Takayasu，s)ateritis)、中等血管血管炎(mediumvesselvasculitis)、川崎病(Kawasaki'sDisease)、结节性多动&:K炎(polyateritisnodosa),包含给予患该疾病的患者治疗有效量的CD20结合抗体。在该方法的一个实施方式中，CD20结合抗体是Rituxar^。本发明还提供分离的核酸，包含猕猴(Cynomolgusmonkey)CD20的SEQIDNO.:24的核苷酸序歹ll(如图19所示)，或该序列的简并变体。一个实施方式是分离的核酸，包含一序列，该序列编码具有SEQIDNO.25(如图20所示)的氨基酸序列的多肽，或具有保守性氨基酸取代的SEQIDNO.25(图20)。另一个实施方式是包含前述核酸的载体，包括用来在宿主细胞表达的表达载体。也包括包含该载体的宿主细胞。还提供分离的多肽，该多肽包含猕猴CD20的氨基S吏序列(SEQIDNO.25;图20)。本发明涉及1.一种与人CD20结合的人源化抗体或者其抗原结合片段，其中抗体对体内削减灵长类动物B细胞是有效的，该抗体在重链可变区(VH)至少包含来自抗人CD20抗体的SEQIDNO.12的CDR3序列、和人重链亚群III(VhIII)的基本上的人共有框架(FR)残基。2.项1的抗体，所述抗体进一步包含SEQIDNO.10的重链CDR1序列和SEQIDNO.11的CDR2序列3.项2的抗体，进一步包含SEQIDN0.4的轻链CDR1序列、SEQIDNO.5的CDR2序列、SEQIDNO.6的CDR3序列、和人轻链k亚群I(VkI)的基本上的人共有框架(FR)残基。4.前述项的抗体，包含SEQIDNO,8的Vh序歹'J(V16,如图1B所示)。5.项4的抗体，进一步包含SEQIDN0.2的V^序列(V16，如图1A所示)。6.项3的抗体，其中VH区域连接至人IgG链恒定区。7.项6的抗体，其中人IgG是IgGl或lgG3。8.项1的抗体，其中抗体是具有分别为SEQIDNO.21和22的轻链与重链氨基酸序列的2H7.vl6。9.项1的抗体，其中抗体是具有分别为SEQIDN0.21和23的轻链与重链氨基酸序列的2H7.v31。10.项5的抗体，但是具有重链中D56A和N100A、以及轻链中S92A的氨基酸取代(v.96)。11.前述项中任一项的抗体，进一步包含在Fc区域中的至少一个氨基酸取代，所述取代增进ADCC和/或CDC活性。12.项11的抗体，其中氨基酸取代是S298A/E333A/K334A。13.项12的抗体，其中抗体是具有SEQIDN0.23的重链氨基酸序列的2H7.v31(如图8所示)。14.项1-10中任一项的抗体，进一步包含在Fc区域中的至少一个氨基酸取代，所述取代降低CDC活性。15.项14的抗体，至少包含取代K322A。16.项1-10任一项的抗体，其中抗体是2H7.vll4或2H7.vl15，所述抗体同Rituxan比较ADCC活性改善至少10倍。17.项1的抗体，其中灵长类动物B细胞来自于人类和猕猴。18.前述项中任一项的抗体，该抗体偶联至细胞毒药剂。19.项18的抗体，其中细胞毒药剂是放射性同位素或毒素。20.前述项中任一项的抗体，所述抗体在CHO细胞中产生。21.—种分离的核酸，其编码前述项中任一项的抗体。22.—种表达载体，其编码前述项中任一项的抗体。23.—种宿主细胞，其包含项21的核酸。24.项23的宿主细胞，所述宿主细胞产生前述项中任一项的抗体。25.项24的宿主细胞，所述宿主细胞是CHO细胞。26.生产前述项中任一项的抗体的方法，包含培养生产项24的抗体的细胞，并从细胞培养物中回收抗体。27.—种组合物，包含项1的抗体和载体。28.项27的组合物，其中抗体是2H7.vl6,并且载体是药学上可接受的载体。29.—种制品，包含一种容器和包含在其中的组合物，其中该组合物包含前述项中任一项的抗体。30.项29的制品，进一步包含包装说明书，所述包装说明书指示该组合物可用于治疗非何杰金氏淋巴瘤。31.—种体内在B细胞中诱导程序性细胞死亡的方法，包含将B细胞与前述项中任一项的抗体接触，从而杀死B细胞。32.—种治疗CD20阳性癌症的方法，包含^^予患该癌症的病人治疗有效量的前述项中任一项的人源化CD20结合抗体。33.项32的方法，其中CD20阳性癌症是B细胞淋巴瘤或白血病。34.项33的方法，其中CD20阳性癌症是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)或淋巴细胞占优势的何杰金氏病(LPHD)。35.项32的方法，其中癌症是慢性淋巴细胞性白血病或SLL。36.项34或35的方法，其中抗体选自2H7.vl6、v31.v96、vll4或v115，所述抗体具有附图和表中所示的各自氨基酸序列。37.项34或35的抗体，其中抗体是具有分别为图6和图7所示SEQIDN0.21和22的轻链与重链氨基酸序列的2H7.vl6。38.项33的方法，其中抗体以大约275-375mg/m2的剂量范围给药。39.项32的方法，进一步包含给予病人至少一种化疗剂。40.项39的方法，其中癌症是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，并且化疗剂选自阿霉素、环磷酰胺、长春新碱或氢化泼尼松。41.一种治疗自身免疫病的方法，包含给予患该自身免疫病的病人治疗有效量的前述项中任何一项的人源化CD20结合抗体。42.项41的方法，其中该自身免疫病选自由下列疾病组成的组类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、韦格内氏病、炎症性肠病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板减少、多发性硬化、牛皮癣、IgA肾病、IgM多神经病、重症肌无力、血管炎、糖尿病、雷诺氏症、斯耶格仑氏综合症与肾小球肾炎。43.项42的方法，其中自身免疫病是类风湿性关节炎。44.项43的方法，进一步包含给予病人第二种治疗剂。45.项44的方法，其中第二种治疗剂是免疫抑制剂。46.项45的方法，其中免疫抑制剂是氨曱喋呤。47.—种治疗选自由下列组成的组中的自身免疫病的方法，包含给予患该疾病的患者治疗有效量的CD20结合抗体或其功能性片段皮肌炎、韦格内氏肉芽胂病、ANCA(包括在血管炎下的)、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、凝血因子VIII缺乏、曱型血友病、自身免疫性中性白细胞减少、Castleman氏综合症、古德帕斯彻氏综合症、实体器官移植排斥、移植物抗宿主疾病(GVhD)、IgM介导的血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、桥本氏曱状腺炎、自身免疫性肝炎、淋巴间质肺炎(HIV)、闭塞性细支气管炎(非移植)对应的NSIP、格-巴二氏综合症、大血管血管炎、巨细胞(高安氏)动脉炎、中等血管血管炎、川崎病和结节性多动脉炎。48.项47的方法，其中CD20结合抗体是Rituxan。49.一种分离的核酸，所述核酸包含猕猴CD20的SEQIDNO.:24的核苷酸序列(如图19所示)，或这一序列的简并性变体。50.—种分离的核酸，所述核酸包含编码具有SEQIDNO,25(如图20所示)、或带有保守氨基酸取代的SEQIDNO.25(如图20所示)的氨基酸序列的多肽。51.—种载体，包含项50的核酸。52.项51的载体，其为表达载体，所述表达载体包含与表达调控序列可操作连接的项49的核酸。53.—种宿主细^I包，包含项50的核酸。54.—种分离的多肽，包含猕猴CD20的SEQIDNO.25的氨基酸序列(如图20所示)。55.—种液体制剂，包含20mg/mL的人源化2H7抗体、10mM组氨酸硫酸酯pH5.8、60mg/mL蔗糖、0.2mg/mL聚山梨酸酯20。图1A是序列比对，比较小鼠2H7(SEQIDNO.1)、人源化2H7.vl6变体(SEQIDN0.2)、和人k轻链亚群I(SEQIDNO.3)中每一个的轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列。2H7和hu2H7.vl6的Vl的CDR如下CDR1(SEQIDNO,4)、CDR2(SEQIDNO,5)、与CDR3(SEQIDNO.6)。图1B是序列比对，比校如下来源的Vh序列鼠2H7(SEQIDNO,7)、人源化2H7.vl6变体(SEQIDN0.8)、和重链亚群III的人共有序列(SEQIDNO,9)。2H7和hu2H7.v16的VH的CDR如下CDRl(SEQIDNO.IO)、CDR2(SEQIDN0.11)、与CDR3(SEQIDNO.12)。在图1A与图IB中，每一链的CDR1、CDR2与CDR3用括号围起来，其两侧为框架区FR1-FR4,如图中所指示。2H7指鼠2H7抗体。两行序列之间的星号表示在两序列之间不同的位置。残基编号根据Kabatetal.，SequencesofImmunologicalInterest.5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991),插入物用a、b、c、d、与e表示。图2A-E显示用来构建2H7Fab质粒的噬菌粒pVX4的序列(SEQIDNO,13)以及CDR移植的抗IFN-ot人源化抗体的Fab的轻链(SEQIDNO.14)与重链(SEQIDNO.15)的氨基酸序列。图3A-E显示编码嵌合2H7.v6.8Fab的表达质粒的序列(SEQIDNO.16)。显示轻链(SEQIDNO.17)与重链(SEQIDNO.18)的氨基酸序列。图4A-B显示如实施例1中所描述的用于表达免疫球蛋白轻链的质粒pDRl的序列(SEQIDN019;5391bp)。pDRl包含编码一无关抗体、人源化抗CD3抗体的轻链(Shalabyetal.,J.Exp.Med.175:217-225(1992))的序列，其起始和终止密码子以粗体和下划线指示。图5A-B显示如实施例1中描写的用于表达免疫球蛋白重链的质粒pDR2的序列(SEQIDNO.20;6135bp)。pDR2包含一编码无关抗体、人源化抗CD3抗体的重链的序列(Shalabyetal.，上文)，其起始和终止密码子以粗体与下划线指示。图6显示2H7.vl6完整轻链的氨基酸序列(SEQIDN0.21)。DIQ以前的前19个氨基酸是在成熟多肽链中不存在的分泌性信号序列。图7显示2H7.vl6完整重链的氨基酸序列(SEQIDN0.22)。EVQ以前的前19个氨基酸是在成熟多肽链中不存在的分泌性信号序列。将图1B的Vh序列(SEQIDNO.8)与完整重链序列比对，人yl恒定区来自于SEQIDNO.22中的氨基酸位置114-471。图8显示2H7.v31完整重链的氨基酸序列(SEQIDNO,23)。EVQ以前的前19个氨基酸是在成熟多肽链中不存在的分泌性信号序列。轻链与2H7.vl6相同(参见图6)。图9显示如实施例中所描述的2H7.vl6与2H7.v73IgG变体的相对稳定性。分析结果校正至孵育前数值，以孵育后的剩余百分比报告。图10是一流程图，总结从鼠2H7至直到v75的人源化型式的亚群的氨基酸改变。图11是在所有组(结合2H7研究与Rituxan研究)中平均绝对B细胞计数『03-/0040+]的总结，如实施例10中所描述。图12显示如在实施例11中所描述的在岩藻糖缺陷的2H7变体上代表性ADCC试验的结果。图13显示将膜联蛋白V染色以抗体浓度的函数作图的结果。在交联第二抗体存在下，将Ramos细胞用无关IgGl对照抗体(Herceptin;圆形)、Rituximab(方形)、或者rhuMAb2H7.vl6(三角形)处理，用FACS分析。图13-15在实施例13中加以描述。图14显示膜联蛋白V与碘丙锭双染色作为抗体浓度的函数作图的结果。在交联第二抗体存在下，将Ramos细胞用无关IgGl对照抗体(Herceptin⑧;圆形)、Rituximab(方形)、或者rhuMAb2H7.vl6(三角形)处理，用FACS分析。图15显示活的、未染色细胞计数(每10个)作为抗体浓度的函数作图。在交联第二抗体存在下，将Ramos细胞用无关IgGl对照抗体(Herceptin⑧；圆形)、Rituximab(方形)、或者rhuMAb2HTvl6(三角形)处理，用FACS分析。图16、17、18显示如实施例14中所描述的在棵鼠中对Raji细胞肿瘤生长的抑制。动物用PBS(对照)或者用Rituxan⑧或rhuMAb2H7.vl6以5mg/kg(图16)、0.5mg/kg(图17)、或者0.05mg/kg(图18)每周处理(如垂直箭头指示的；！1=8只小鼠每组)，共6周。图19显示如实施例15中所描述的猕猴CD20的核苷酸(SEQIDNO.24)与氨基酸(SEQIDNO.25)序列。图20显示猕猴CD20的氨基酸序列(SEQIDN0.25)。与人CD20不同的残基有下划线，人残基(SEQIDNO.26)直接在猴残基下标示。猴CD20的推定胞外结构域以黑体字表示。图21显示如在实施例15中所描述的，表达CD20的猕猴细胞与hu2H7.v16、.v31与Rituxan的结合。分析抗体结合猕猴CD20并且取代FITC偶联的鼠2H7与猕猴CD20结合的能力。图22显示类风湿性关节炎临床试验阶段I/II剂量渐增的方案。图23显示在CHO细胞中表达2H7.v16的载体。优选实施方案的详细说明"CD20"抗原是一非糖基化的跨膜磷蛋白，具有分子量大约35kD,在来自外周血或淋巴器官的超过90%的B细胞的表面上发现。CD20在早期前B细胞发育期间表达，并且保持直到浆细胞分化。其在人干细胞、淋巴祖先细胞或者正常浆细胞上没有发现。CD20在正常B细胞以及恶性B细胞上存在。在文献中CD20的其它名字包括"B淋巴细胞限制的分化抗原"和"Bp35"。CD20抗原在例如Clark与Ledbetter,Adv.Can.Res.52:81-149(1989)与Valentineetal.J.Biol.Chem.264(19):11282-112871989)中描述。术语"抗体，，以最宽泛的意义使用，并且特别地涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、与抗体片段，只要它们显示出所需的生物活性或功能。抗体与人CD20的结合，更优选与人及其它灵长类动物(包括猕猴、恒河猴、黑猩猩)CD20结合。抗体将以不高于lxlO-8的Kd值结合CD20，优选地Kd值不高于大约lxl(T9，并且能体内杀死或消减B细胞，优选地当与合适的负对照比较时杀死或者消减至少20°/。，所述负对照未用这样的抗体处理。B细胞消减可以是ADCC、CDC、细胞程序死亡或者其它才几制中一个或多个的结果。在这里的疾病治疗的一些实施方式中，特定的效应子功能或者机制与其它相比可能更需要，并且人源化2H7的某些变体对取得生物学功能例如ADCC是优选的。"抗体片段，，包含全长抗体的一部分，通常是其抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2、与Fv片段；双抗体；线状抗体(linearantibody);单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。"Fv"是包含完全抗原识别与结合部位的最小抗体片段。这个片段由一个重链与一个轻链可变区结构域以紧密、非共价联合而形成的二聚物组成。这两个结构域的折叠产生六个高变环(重链与轻链各三个环)，提供抗原结合的氨基酸残基并且赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单个的可变结构域.(或者仅仅包含特定于抗原的三个CDR的Fv的一半)具有识别与结合抗原的能力，虽然亲合力比整个结合部位低。术语"单克隆抗体"如在这里所使用的指获得自实质上均一的抗体群体的抗体，即构成该群体的单独抗体除了那些可能少量存在的自然发生的突变之外是同一的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原位点。此外，与常规的(多克隆)抗体制备相反——所述常规抗体一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体——每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。修饰语"单克隆"指示抗体的特性为获得自实质上均一群体的抗体，不允许被解释为要求经过任何特定的方法生产抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可能是通过Kohleretal.,Nature256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法生产，或可通过重组DNA方法生产(参见，例如，美国专利号4,816,567)。利用例如在Clacksonetal.,Nature352:624-628(1991)与Marksetal.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术，"单克隆抗体，，也可以从噬菌体抗体文库中分离。本发明的CD20结合抗体的"功能性片段"是这样一些片段，其保有与其所衍生的完整全长分子相比实质上相同的亲合力结合CD20的能力，并且在经过例如在这里所描述的体外或体内分析而进行的测量中显示生物活性，包4舌消减B细月包。术语"可变"指这一事实，即可变结构域的某些片段在抗体序列中存在广泛差别。V结构域介导抗原结合，并且定义特定的抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变结构域的110个氨基酸跨度内不是均匀分布的。相反，可变区包括相对不变的几段序列称为框架区(FR)，为15-30氨基酸长，其间被极端可变的较短区域分开，称为"高变区"，每个9-12氨基酸长。天然重与轻链的可变结构域每个包含四个FR，基本上采取(3片层构型，由三个高变区连接，高变区形成连接环，并且有时候形成P片层结构的一部分。每个链的高变区由FR十分接近地维系在一起，并且与另一链的高变区一起参与抗体的抗原结合部位的形成(参见Kabatetal.,S叫uencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD.1991))。恒定结构域不直接涉及抗体与抗原的结合，但是显示出各种效应子功能，例如在抗体参与抗体依赖细胞细胞毒性(ADCC)中。术语"高变区"当在这里使用时指抗体负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包括来自"补体决定区"或"CDR"(例如Vl中大約残基24-34(Ll)、50-56(L2)与89画97(L3)周围，与VH中大约31-35B(H1)、50-65(H2)与95画102(H3)周围(Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD,(1991))),禾口/或来自"高变环，，的残基(例如Vl中残基26-32(L1)、50-52(L2)与91-96(L3),与Vh中26-32(Hl)、52A-55(H2)与96-101(H3)(Chothia与Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。如在此所提到的，"共有序列，，或者共有V结构域序列是人工序列，源自对已知人免疫球蛋白可变区序列的氨基酸序列的比较。基于这些比较，制备编码V结构域氨基酸的重组核酸序列，该序列对于源自人和人H链亚群inv结构域的序列是共有的。该共有v序列没有任何已知抗体结合特异性或亲合力。"嵌合抗体"(免疫球蛋白)重和/或轻链的一部分与来源于特定的物种或者属于特定的抗体种类或者亚类的抗体的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一个物种或者属于另一个抗体种类或者亚类的抗体的相应序列相同或同源，只要它们显示出该所需生物活性(美国专利号4，816,567;与Morrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。在此所使用的人源化抗体是嵌合抗体的亚群。非人(例如，鼠的)抗体的"人源化，，形式是嵌合抗体，其包含来源于非人免疫球蛋白的最小序列。在极大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者或受体抗体)，其中受者的高变区残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、兔或非人类灵长类动物的高变区残基替代，该高变区残基具有所需的特异性、亲合力和能力。在有些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含受者抗体或供体抗体中没有发现的残基。这些修饰被用来更进一步地改善抗体性能例如结合亲合力。一般地，人源化抗体将基本上包含所有至少一个、并且典型地两个可变结构域，其中相当于非人免疫球蛋白的高变环的所有或者基本上所有高变环、以及所有或者基本上所有FR区域是人免疫球蛋白序列的，虽然FR区域可以包括改善结合亲合力的一或多个氨基酸取代。在FR中的这些氨基酸取代的数目在重链中典型地不超过6个，在轻链中不超过3个。人源化抗体任意地也包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，典型地是人免疫J求蛋白恒定区的至少一部分。详细内容参见Jonesetal.，Nature321:522-525(1986);Reichmannetal"Nature332:323-329(1988);与Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。抗体"效应子功能"指可归因于抗体Fc区域(天然序列Fc区域或者氨基酸序列变体Fc区域)的那些生物活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的例子包括Clq结合与补体依赖的细胞毒；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；与B细胞活化。"抗体依赖的细胞介导的细胞毒性，，或"ADCC"指一种细胞毒性形式，其中与存在于某些细胞毒细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性白细胞与巨噬细胞)上的Fc受体结合的分泌Ig使得这些细胞毒效应细胞特定地与携带抗原的靶细胞结合，并且接着用细胞毒素杀死该靶细胞。抗体"武装"细胞毒细胞，并且对这样的杀伤是绝对需要的。介导ADCC的主要细胞一NK细胞一仅仅表达FcyRin,而单核细胞表达FcYRI、FcyRII与FcyRIII。在造血细胞上的FcR表达在Ravetch与Kinet,Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991)第464页表3中概括。为评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC试验，例如在美国专利号5，500,362或5,821,337中描述的。对这样的试验有用的地，目的分子的ADCC活性可以体内评估，例如，在例如Clynesetal.PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的动物模型中。"Fc受体"或者"FcR"描述与抗体Fc区域结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR(—个y受体)，并且包括FcyRI、FcyRII、与FcyRIII亚类的受体，包括等位基因变体和这些受体的不同拼接形式。FcyRII受体包括FcyRIIA("激活受体")与Fc丫RIIB("抑制受体，，)，其具有类似氨基酸序列，该氨基酸序列的主要不同在于其细胞质结构域。激活受体FcyRIIA在它的细胞质结构域包含免疫受体酪氨酸为基础的激活基序(ITAM)。抑制受体FcyRIIB在它的细胞质结构域包含免疫受体酪氨酸为基础的抑制基序(ITIM)。(参见综述M.inDagron，Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997》。FcR在Ravetch与Kinet，Annu.Rev.Immunol9:457-92(1991);Capeletal"Imm画methods4:25-34(1994);与deHaasetal.丄Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中综述。其它的FcR,包括那些将来要被鉴别的FcR，在此包括在术语"FcR"内。该术语也包括新生儿受体FcRn，其负责将母体igG转移给胎儿(Guyeretal.J.Immunol.117:587(1976)与Kimetal.，J.Immunol.24:249(1994))。WO00/42072(Presta)描述抗体变体，其具有改善的或者降低的与FcR结合能力。该专利出版物的内容在这里特别地引入作为参考。也参见，Shieldsetal,J.Biol.Chem,9(2):6591画6604(2001)。"人效应细胞"是表达一或多个FcR并且行使效应子功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcYRIII并且行使ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞与中性粒细胞，以PBMC与自然杀伤细胞为优选。效应细胞可能从天然来源，例如从血中分离。"依赖于补体的细胞毒性"或"CDC"指补体存在下靶细胞的溶解。通过补体系统的第一组分(Clq)与合适亚类的抗体结合而启动经典补体途径的激活，所述抗体是与其相关抗原结合的。为评估补体激活，可进行CDC试验,例如如Gazzano-Santoroetal.，J.Immunol.Methods202:163(1996)中描写的。在美国专利号6，194，551B1与W099/51642中描述了多肽变体，具有改变的Fc区域氨基酸序列与增加或降低的Clq结合能力。那些专利出版物的内容在此特另'J地引入作为参考。也参见Idusogieetal.J.Immunol.164:4178-4184(2000)。IgG中N-糖基化位点在CH2结构域的Asn297。本发明也提供CD20结合的、人源化抗体组合物，该抗体具有Fc区域，其中组合物中抗体的大约80-100%(并且优选地大约90-99%)包含成熟核心糖结构，该糖结构缺乏岩藻糖，附着于糖蛋白的Fc区域。象这样的组合物在此被证明显示出在与F(7RIIIA(F158)结合上的惊人改善，该结合不如FcyRIIIA(V158)与人IgG相互作用有效。因此，在这里的组合物预计优于以前描迷的抗CD20抗体组合物，特别是对于治疗表达FcyRIIIA(F158)的病人而言。在正常、健康的非洲裔美国人与白种人中，FcyRIIIA(F158)比FcyRIIIA(V158)更常见。参见Lehrnbecheretal.Blood94:4220(1999)。本申请更进一步显示FcyRIII结合和/或ADCC功能的协同增加，该协同增加源自在此的糖基化作用变异与糖蛋白Fc区域的氨基酸序列修饰的联合。"分离的"抗体是已经从它的自然环境的组分中鉴别与分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染物组分是将干扰抗体的诊断或治疗使用的物质，并且可包括酶、激素及其它蛋白的或者非蛋白的溶解物。在优选实施方式中，抗体将被纯化至(l)如经过Lowry方法确定的，按重量计算大于抗体的95%，并且最优选按重量计算超过99°/。，(2)足够获得通过利用转杯测序仪(spinningcupsequenator)N末端或者内部氨基酸序列的至少l5个残基的程SDS-PAGE下达到均一。分离的抗体包括在重组细胞内部的原位抗体，因为抗体自然环境中的至少一个组分将不存在。然而，一般地，分离的抗体将通过至少一个纯化步骤制备。"分离的"核酸分子是从至少一个污染物核酸分子中鉴别与分离的核酸分子，在抗体核酸的天然来源中其一般地与该污染物核酸分子有联系。分离的核酸分子在其形式或环境上与其在自然界中发现时不同。分离的核酸分子因此不同于其在自然细胞中存在的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括在通常表达抗体的细胞中加以包含的核酸分子，在该细胞中例如核酸分子位于与自然细胞不同的染色体位置上。表示法"控制序列，，指在一特定宿主有机体中表达可操作连接的编码序列所需的DNA序列。适于原核生物的控制序列例如包括启动子，任选操纵子序列，以及核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号与增强子。当核酸被置于与另一核酸序列的功能性关系时其是"可操作连接的"。例如，如果前序列或分泌性前导序列的DNA作为参与多肽分泌的前蛋白质加以表达，其与多肽的DNA是可操作连接的。如果启动子或者增强子影响序列的转录，其与编码序列是可操作地连接的。或如果核糖体结合位点被置于促进翻译的位置，则其与编码序列是可操作地连接的。一般地，"可操作地连接，，指被连接的DNA序列是邻近的，并且在分泌性前导序列的情况下，是邻近的和在阅读状态下。然而，增强子不必是邻近的。连接通过在适宜限制性位点的连接而完成。如果这样的位点不存在，根据通常的做法使用合成寡核苷酸连接物或接头。"载体，，包括穿梭与表达载体。典型地，质粒构建物包括复制起始点(例如ColEl复制起始点)与选择性标记(例如氨千青霉素或四环素抗性)，分别用于质粒在细菌中的复制与选择。"表达载体"指一种载体，其包含在细菌或真核细胞中表达本发明的抗体、包括抗体片段所需的控制序列或调控元件。合适的载体在下面披露。产生本发明的人源化CD20结合抗体的细胞包括细菌与真核宿主细胞，其中已经引入编码抗体的核酸。合适的宿主细胞在下面4皮露。用词"标记"当在这里使用时指可4全测的化合物或组合物，其直接或间接地与抗体接合。标记可本身是可4企测的(例如放射性同位素标记或荧光的标记)或者，在酶促标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。"自身免疫病，，在此是来自并针对个体自身(自己的)抗原和/或组织的非恶性疾病或紊乱。如同在这里使用的，"B细胞消减"指在药物或者抗体处理之后同像这样的处理以前的水平比较起来在动物或者人中B细胞水平的减少。利用众所周知的试验，例如在实验实施例中描述的试验，测量B细胞水平。B细胞消减可以完全的或者部分的。在一个实施方式中，表达CD20的B细胞消减至少25%。不受任何机制的限制，B细胞消减的可能机制包括ADCC、CDC、细胞程序死亡、钙流的调制或者在前机制中两个或更多的组合。术语"细胞毒性剂"如同在此使用的指一种物质，该物质抑制或防碍细胞功能和/或导致细胞破坏。术语意图包括放射性同位素(例如I131、I125、Y9G与Re186)、化疗剂和毒素例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶促活性毒素或其片段。"化疗剂"是在癌症治疗中有用的化合物。化疗剂实例包括烷化剂，如噻替哌(thiotepa);环膦酰胺(cyclosphamide)(CYTOXANTM);烷基磺酸酯如白消安(busulfan),英丙舒凡(improsulfan)和派泊舒凡(piposulfan);氮丙咬如千替艰(benzodopa),卡波醌(carboquone)，美妥替艰(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa);氮丙咬和methylamelamine包括六曱蜜胺(altretamine)，三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)，三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺和三羟曱基蜜胺(trimethylolomelamine);氮芥(nitrogenmustards)如苯丁酸氮芥,萘氮芥，胆磷酰胺(cholophosphamide),雌氮芥(estramustine),异环磷酰胺(ifosfamide),氮芥(mechlorethamine),盐酸氧氮芥；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan),新氮芥(novembichin)，胆甾醇苯乙酸氮芥，松龙苯芥(prednimustine),曲磷胺(trofosfamide)，尿嘧咬氮芥；亚硝基脲(nitrosureas)如亚硝基脲氮芥(carmustine)，氯脲菌素(chlorozotocin)，福莫司汀(fotemustine)，洛莫司汀(lomustine),尼莫司汀(nimustine),雷莫司汀(ranimustine);抗生素如阿克4立霉素，放线菌素，authramycin,重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素C(cactinomycin)，力口利车審素(calicheamicin),carabicin,洋纟工審素,嗜癌素(carzinophilin)，色霉素(chromomycin),放线菌素D,道诺红菌素(daunorubicin),地托比星(detorubicin)，6-重氮-S-氧-L-正亮氨酸，阿霉素(doxorubicin,Adriamycin),表阿霉素(epirubicin),依索比星(esombicin)，伊达比星(idambicin),发波霉素(marcellomycin)，丝裂霉素，霉酚酸，诺加霉素(nogalamycin),橄榄霉素(olivomycin),培洛霉素(peplomycin)，potfiromycin，噪呤霉素，三铁阿霉素(quelamycin)，罗多比星(rodorubicin),链黑菌素；链脲霉素(streptozocin),杀结核菌素，乌苯美司(ubenimex)，净司他丁(zinostatin)，佐柔比星(zorubicin);抗代谢药如氨曱蝶呤，5-氟尿嗜啶(5-FU);叶酸类似物如二曱叶酸(denopterin)，氨曱蝶呤，丁蝶翼素(pteropterin),三曱曲沙(trimetrexate);噪呤类似物氟达拉滨(fludarabine)，6-巯基。票呤，硫咪噤呤，硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨(ancitabine),阿扎胞苷(azacitidine),6-氮尿苷，卡莫氟(carmofur)，阿糖胞普，双脱氧尿普，多西氟尿啶，依诺他滨(enocitabine)，氟尿苷，5-FU;雄激素类如二曱睾酮，丙酸曱力#烷酉同(dromostanolongpropionate)，环好J,醇(epitiostanol),美力,氨(mepitiostane),睾内酉旨(testolactone);抗肾上腺类如氨鲁米特(aminoglutethimide),邻氯苯对氯苯二氯乙烷(mitotane)，曲洛司坦(trilostane);叶酸补充剂如frolinicacid;醋葡内酯；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);安吖。定(amsacrine);bestrabucil;比生群(biasntrene);依达曲沙(edatraxate);磷氛氮芥(defofamine);秋水仙胺；地吖醌(diaziquone);依洛尼塞(elfornithine);醋酸羟吡呻唑(emptiniumacetate);依托格鲁(etoglucid);硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan);氯尼达明(lonidamine);米4乇胍腙(mitoguazone);米4乇蒽酉昆(mitoxantrone);莫派达醇(mopidamol);二胺》肖吖口定(nitracrine);喷司他丁(pintostatin);phenamet;p比柔t匕星(pirarubicin);鬼臼冲对酸(podophyllinicacid);2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine);PSK;雷佐生(razoxane);西索菲兰(sizofiran);锗螺胺(spirogermanium);细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺(trichlorrotriethylamine);乌拉坦(urethan);长春碱酰胺；达卡巴。秦(dacarbazine);甘露醇氮芥；二溴甘露醇(mitobronitol);二溴卫矛醇；溴丙p底卩秦(pipobroman);gacytosine;阿4i伯3f唐普("Ara画C");塞替卩底(thiotepa);紫杉烷(taxoid)，如紫杉醇(TAXOL③，Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ)和doxetaxel(TAXOTERE,Rhone画PoulencRorer，Antony,France);苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine);6-石克代鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨曱蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；鉑；鬼臼乙叉甙(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺；丝裂霉素C;米托蒽醌；长春新碱；长春花碱；长春瑞宾(vinordbine);l斤霉酰氨(navelbine);二#至基蒽酮(novantrone);替尼泊戒(teniposide);柔红霉素；氨基蝶呤；xdoda;伊拜膦酸盐(ibandronate);CPT-11;拓朴异构酶抑制剂RFS2000;二氟曱基鸟氨酸(DMFO);维曱酸；esperamicins;capecitabine;以及上述4壬4可物质的可药用盐，酉交或书亍生物。此定义还包括能调节或抑制激素对肺瘤的作用的抗激素制剂，如抗雌激素制剂包括他莫昔芬(tamoxifen),雷洛昔芬(mloxifene)，芳香酶抑制剂4(5)-咪唑，4-羟基他莫昔芬，曲沃昔芬(trioxifene),keoxifene,LY117018,奥那司酮(onapristone),和托瑞米芬(Fareston);和抗雄激素制剂如氟他氨(flutamide),尼鲁米特(nilutamide),bicalutamide，亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);和上述任何物质的可药用盐，酸或衍生物。"治疗，，或"处理，，或"缓和"既指治疗性处理也指预防性或者预防性措施，其中目的是防止或减慢(减弱)所针对的病理情况或紊乱。如果个体根据本发明的方法接受治疗量的本发明的CD20结合抗体后，显示该特定疾病的一或多个体征和症状的可M^测的和/或可度量的减少，该个体4皮成功地"治疗，，CD20阳性癌症或自身免疫病。例如，对于癌症来说，癌细胞数目减少或者癌细胞消失；肿瘤体积减小；抑制(即在某种程度上减慢并且优选地停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；延长症状缓解的时间，和/或在某种程度上减轻与该特定的癌症有联系的一个或多个症状；减低发病率与死亡率，与生命质量的改进等事宜。病人也可以感到疾病征候或症状的减低。治疗可以取得完全响应，定义为所有癌症迹象的消失，或者部分响应，其中肿瘤尺寸减小，优选地超过50%,更优选地超过75%。如果病人病情平稳，也被认为是已治疗的。在一优选实施方式中，在一年之后癌症病人的癌症仍然没有进展，优选地在15个月之后。评估疾病成功治疗与改善的这些参数通过为本领域医师所熟悉的常规程序是容易度量的。"治疗有效量"指在个体中有效"治疗"疾病或紊乱的抗体或药物的量。对于癌症，药物治疗有效量可减少癌细胞的数量；减小肿瘤体积；抑制(即在一定程度上减慢并优选停止)癌细胞对周围器官的浸润；抑制(即在一定程度上减慢到并优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。参见前述对"治疗"的定义。"慢性"给药指以与急性方式相反的连续方式给药所述药剂，从而在更长的时间内维持最初的治疗效果(活性)。"间歇性"给药是并非不间断地连续进行、而实际上是周期性的治疗。本发明的方法与组合物本发明提供结合人CD20、并且优选地也结合其它灵长类动物CD20的人源化抗体，包含一个重链，该重链包含非人物种抗人CD20抗体(供体抗体)的至少一个、优选地两个或者所有H链CDR,和作为受者抗体的人共有抗体的基本上所有框架残基。供体抗体可以来自于各种的非人物种，包括小鼠、大鼠、豚鼠、山羊、兔、马、灵长类动物，但是最经常地是小鼠抗体。在这里"基本上所有的，，指人源化抗体的受者FR区域可以包括在人共有FR序列中原来不存在的一或多个氨基酸取代。这些FR改变可以包含在受者或供体抗体中未找到的残基。在一个实施方式中，供体抗体是鼠抗体，可变区包括图1A与1B所示的H与L链的每一个的CDR与FR序歹L在一个特定的实施方式中，人Fab框架的残基相应于人VK亚群I和VH亚群III的共有序列，这些共有序列^别地如图1A与图1B所示。本发明的人源化2H7抗体具有小鼠供体抗体的H链的至少一个CDR。在一个实施方式中，结合人CD20的人源化2H7抗体包含供体抗体H与L链两者的CDR。在一个全长抗体中，本发明的人源化CD20结合抗体将包含人源化的可变结构域，该结构域与人免疫球蛋白的恒定结构域连接。在一优选实施方式中，重链恒定区来自人IgQ优选地IgGl或者IgG3。轻链恒定结构域优选地来自人K链。除非另外指示，除了在下面的实验实施例中指示的氨基酸取代或改变位置之夕卜，在这里的人源化2H7抗体型式将具有2H7.vl6轻链(图6，SEQIDNO.21)与H链(图7，SEQIDNO.22)的V与C结构域序列。该人源化CD20结合抗体将至少结合人CD20,并且优选地结合其它灵长类动物CD20，例如猿猴(monkey)包括猕猴和恒河猴，与黑猩猩的CD20。猕猴CD20的序列在实施例15与图19中披露。体与人CD20的结合，更优选与人和灵长类动物(包括猕猴、恒河猴、黑猩猩)CD20结合，其Kd值不高于lxlO-8，优选地Kd值不高于大约lxl(T9，甚至更优选地Kd值不高于大约lxl0"0,并且能体外或体内杀死或者消减B细胞，优选地当与基线水平或未用这样的抗体处理过的恰当的负对照相比杀死或者消减至少20%。B细胞消减的所需水平将取决于疾病。对于治疗CD20阳性癌症来说，也许需要最大限度消减作为本发明的抗CD20抗体目标的B细胞。因此，对于治疗CD20阳性B细胞肿瘤而言，最好对B细胞的消减是足够的，以至少防止疾病的进展，而疾病的进展是本领域熟练医师可以评估的，例如通过监测肿瘤生长(大小)、癌细胞类型的增殖、转移、及该特定癌症的其它体征和症状。优选地，B细胞消减足以防止疾病的进展至少2个月，更优选3个月，甚至更优选4个月，更优选5个月，甚至更优选6或更多个月。在甚至更优选的实施方式中，B细胞消减足以提高症状緩解时间至少6个月，更优选9个月，更优选一年，更优选2年，更优选3年，甚至更优选5年或更多年。在一个最优选实施方式中，B细胞消减足以治疗疾病。在优选实施方案中，在癌症病人中的B细胞消减是治疗以前基线水平的至少大约75和优选地80%、85%、90%、95%、99。/。并且甚至100%。对于治疗自身免疫病，也许需要依赖个体病人的疾病和/或病症的严重程度，通过调整CD20结合抗体的剂量，调制B细胞消减的程度。因此，可以消减B细胞、但不必是完全的。或者，在起始治疗中可能需要总B细胞消减，但在随后治疗中，可能调整剂量以达到仅部分消减。在一个实施方式中，与治疗前的基线水平相比，B细胞消减至少20°/。，即余留80%或者更少的CD20阳性B细胞。在其它实施方式中，B细胞消减25%、30°/。、40%、50%、60%、70%或者更多。优选地，B细胞消减足以-使疾病进展停顿，更优选緩和在治疗下的特定疾病的体征和症状，甚至更优选治愈疾病。本发明还提供双特异性CD20结合抗体，其中抗体的一个臂具有本发明的人源化CD20结合抗体的人源化重与轻链，并且另一个臂具有针对第二抗原的结合特异性的可变区。在特定的实施方式中，第二抗原选自由CD3、CD64、CD32A、CD16、NKG2D或者其它NK激活配体组成的组。同Rituxan(rituximab)比较起来)，v16显示出ADCC效力增加大约2至5倍，CDC比Rituxan降低3-4倍。抗体产生卓^i發戎傳单克隆抗体可用Kohleretal,Nature,256:495(1975)首先描述的杂交瘤法制备或通过重组DNA法(美国专利4,816,567)制备。在杂交瘤方法中，如上述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，例如仓鼠，来激发产生或能产生特异结合免疫所用蛋白的抗体的淋巴细胞。可选地，所述淋巴细胞可被体外免疫。免疫后，淋巴细胞可被分离并随后使用适宜的融合剂例如聚乙二醇与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,卓义發戎來./V,w—am/尸rac"ce，59-103页(AcademicPress,1986》。由此制备的杂交瘤细胞被接种于适宜的培养基并在其中生长，该培养基优选包含一种或多种抑制未融合亲代骨髓瘤细胞(也称为融合伴估)的生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄噤呤乌噤呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的选择培养基通常包括次黄嘌呤，氨基蝶呤，和胸腺嘧啶("HAT培养基")这些抑制HGPRT-缺陷细胞生长的物质。优选融合伴佔骨髓瘤细胞为那些能有效融合、支持所选抗体生成细胞以稳定的高水平产生抗体、并对选择未融合亲代的选择培养基敏感的那些融合伴侣骨髓瘤细胞系。优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如由SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,CaliforniaUSA提供的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤，和由美国典型培养物保藏中心，Rockville,MarylandUSA提供的SP-2或其衍生物，如X63-Ag8-653细胞。也描述了人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系可用于产生人单克隆抗体[Kozbor,J,Immunol.,133:3001(1984);和Brodeur等，单克隆抗体的制备技术和应用(MarcelDekker,Inc.，NewYork纽约，(1987))51-63页)。可在含有生长的杂交瘤细胞的培养基中分析抗所述抗原的单克隆抗体的产生。优选地，杂交瘤细胞所产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀或通过体外结合试验，如放射免疫分析(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)来分析。单克隆才元体的结合亲合力可通过，例如Muson等，5/oc/zew.，107:220(1980)所述Scatchard分析来测定。一旦鉴定出产生具有所需特异性、亲合力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，这些细胞克隆可通过有限稀释进行亚克隆，并通过标准方法(Goding,卓2發TV/"")/"awd尸rac"ce，59-103页(AcademicPress,1986))使其生长。适合此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，通过例如将细胞腹膜内注射入小鼠中，可以使杂交瘤细胞以动物腹水肿瘤的形式在体内生长。上述亚克隆所分泌的单克隆抗体可用经典抗体纯化方法如，例如，亲和层析(例如使用蛋白A或蛋白G琼脂糖)或离子交换层析，羟基磷灰石层析，凝胶电泳，透析等从培养基，腹水或血清中分离。使用传统方法(例如通过使用能与编码鼠抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核芬酸探针)可轻易分离并测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞是此DNA的优选来源。一旦分离出该DNA,可以将它置入表达载体中，该载体随后被转染至宿主细胞中例如大肠杆菌细胞，猴COS细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不另外生成抗体蛋白的骨髓瘤细胞，从而在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文字包括Skerraa/"Cwr.C^z'm'o"/"/w應wo/"5:256-262(1993)和Pliickthun,/mm画/.130:151-188(1992)。在进一步的实施方案中，可从使用McCafferty等，A^/ww，348:552-554(1990)描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。Clackson等，A^wre，352:624-628(1991)和Marks等，JMo/.所o/.，222:581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。随后的文章描述了通过链改组产生高亲和性(纳米级)人抗体(Marks等，川o/rec/7"o/og);，10:779-783(1992))，以及将组合感染和体内重组作为策略构建非常大的噬菌体文库(Waterhouse等，7Vwc.^c/血i"，21:2265-2266(1993))。因此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行(viable)选择。也可采用以下方法对编码抗体的DNA进行{奮饰以产生嵌合或融合抗体多肽例如，以人重链和轻链恒定区(CH和CO的序列代替同源小鼠序列(美国专利4，816,567;和Morrison等，脂"cd6W.固,81:6851(1984))，或将免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽(异源多肽)的完整或部分编码序列融合。非免疫球蛋白多肽序列可取代抗体的恒定区，或它们可取代抗体的一个抗原结合位点的可变区以产生嵌合二价抗体，该抗体包含针对一个抗原的一个抗原结合位点，和具有对不同抗原的特异性的另一抗原结合位点。人源化拔伴使非人抗体人源化的方法已在本领域中描述。优选地，人源化抗体具有一或多个从非人来源引入它的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为"引进的，，残基，它们通常来自"引进的"可变区。人源化过程基本是按照Winter及其同事(Jones等，7Va^，321:522-525(1986);Riechmann等，Atowre,332:323-327(1988);Verhoeyen等，5We"ce，239:1534-1536(1988))所述，通过高度可变区序列替换人抗体的对应序列来进行。因此，这样的"人源化，，抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567),其中完整人类可变区的^(艮少一部分^f皮非人物种的相应序列取代。实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中有些高变区残基且可能有些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。当抗体用于人类治疗用途时，选择人源化抗体制备所用的人轻链和重链可变区，对于降低抗原性和HAMA反应(人抗鼠抗体)非常重要。根据所谓的"最适，，方法，针对已知人可变区序列的整个文库筛选啮齿类抗体的可变区序列。鉴定与啮齿类V区序列最接近的人V区序列，并且其中的人框架区(FR)作为人源化抗体被接受(Sims"a/"//画圃/"151:2296(1993);Chothiaefa/.,/M/.Si'o/.,196:901(1987))。另一种方法使用从具有轻链或重链特定亚群的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。同样的框架区可被用于几种不同的人源化抗体(Carter等，尸rac.Ato/.^cad"M,89:4285(1992);Presta等，J/m薩o/"151:2623(1993))。重要的是，将抗体人源化后保留了对抗原的高结合亲和力和其它有利的生物特性。为达到此目的，在一种优选方法中，通过用亲本序列和人源源化抗体。免疫球蛋白三维模型已有商品，是本领域技术人员所熟悉的。还有用于描述和展示所选候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。通过检查这些展示结果可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。通过这种方法，可从受体序列和引进序列中选出FR残基并组合，从而得到所需抗体性质，如对靶抗原的亲和力增加。总之，高变区残基直接并且最主要涉及对抗原结合的影响。人源化抗体可以是抗体片段，例如Fab,其可选地与一种或多种细月包毒性制剂偶联以产生免疫偶联物。可选地，人源化抗体可以是全长的抗体，例如全长IgGl抗体。入拔雄^噬,#肩^才法作为人源化的备选，可制备人抗体。例如，现在可以制备转基因动物(如小鼠)，它经过免疫能在缺乏内源性免疫球蛋白生成的情况下产生全套人抗体。例如，已指出在嵌合和胚系(germ-line)突变小鼠中，抗体重链连接区(^)基因的纯合缺失导致内源性抗体生成的完全抑制。将人胚系免疫球蛋白基因阵列转移到此胚系突变小鼠中，将导致在抗原攻击的情况下产生人抗体。见例如，Jakobovits等尸rac.扁.园,90:2551(1993);Jakobovits等，A^we，362:255-258(1993);Bruggemann等，/"/mmw"o.，7:33(1993);美国专利5,545,806，5,569,825,5,591,669(所有均授予GenPharm);5,545,807;和WO97/17852.或者，可用噬菌体展示技术(McCafferty等，自然348:552-553(1990))从未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因库体外产生人类抗体和抗体片段。依据此技术，抗体V区基因在框架内(in-frame)克隆入丝状噬菌体(如M13或fd)主要或次要衣壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒的表面展示为功能性抗体片段。因为丝状颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，根据抗体的因此，噬菌体模仿了B细胞的部分特点。噬菌体展示可以以多种形式进行；这些纟宗述见如Ji口Johnson,KevinS.和Chiswell，DavidJ.,CurrentOpinioninStructuralBiology3，564-571(1993)。可使用V基因节段的多个来源进行噬菌体展示。Clackson等，Nature352,624-628(1991)从免疫小鼠脾脏来源的V基因小随机组合文库中分离出一批多样的抗-噁唑酮抗体。可基本如Marks等，JMo/.廳.222:581-597(1991),或Griffith等，五MBOJ:12:725-734(1993)所述，构建未免疫的人类供体的V基因库，并分离针对多种多样抗原(包括自身抗原)的抗体。也见美国专利5，565，332和5,573,905。如上讨i仑，人抗体也可通过体外活化的B细胞产生(见美国专利5，567，610和5,229,275)。在特定的情况下，使用抗体片段比整个抗体更有优势。片段的较小体积允许快速清除，并可导致更好地接近实体肿瘤。已开发了多种技术用于生产抗体片段。传统上，这些片段通过对完整抗体进行蛋白水解消化来衍生(见例如，Morimoto等，J!历oc/zew.所c^/z;as.MefWs24:107國117(1992)和Brennan等，ScZ,e229:81(1985》。然而，这些片段现在可通过重组宿主细胞直接生产。Fab，Fv和ScFv抗体片段均可在大肠杆菌中表达并从中分泌，从而使这些片段的大量生产变容易。也可自上述的抗体噬菌体文库分离抗体片段。可选地，Fab，-SH片段可自大肠杆茵直接回收并利用化学方法偶联形成F(ab，)2片段(Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992))。根据另一方法，F(ab，)2片段可直接从重组宿主细胞培养物中分离。包括补救受体结合表位残基并具有延长的体内半寿期的Fab和F(ab')2片段在美国专利5,869,046中描述。熟练技术人员掌握其它产生抗体片段的技术。其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。见WO93/16185;美国专利5,571,894;和美国专利5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点的种类中唯一缺乏恒定区的；因此，其适于在体内应用期间降低非特异结合。可以构建sFv融合蛋白，从而在sFv的氨基或羧基末端融合效应蛋白。见上文的AntibodyEngineering,Borrebaeck编辑。抗体片賴二也可以是"线性抗体，，，例如在美国专利5,641,870中描述。此种线型抗体片段可以是单特异或双特异的。双#并我谬双特异抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。典型的双特异抗体可结合CD20蛋白质的两种不同表位。其它此种抗体可将CD20结合位点与针对另一蛋白质的结合位点组合。或者，抗CD20臂可以与结合白细胞上触发分子的臂结合，触发分子例如T细胞受体分子(例如CD3)或IgG的Fc受体(FcyR)例如Fc7RI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyR(CD16),或NKG2D或其它NK细胞激活配体，以将细胞防御机制针对和定位在CD20表达细胞上。双特异抗体也可用来将细胞毒制剂定位在表达CD20的细胞上。这些抗体具CD20臂和结合细胞毒性制剂的臂(例如皂草素(saporin),抗a-干扰素，长春花生物碱，蓖麻毒蛋白A链，氨曱蝶呤或放射性同位素半抗原)。可以将双特异抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异抗体)。W096/16673描述了双特异性抗ErbB2/抗FcyRIII抗体，美国专利5,837,234披露了双特异性抗ErbB2/抗FcyRI抗体。在WO98/02463中显示双特异性抗ErbB2/Fca抗体。美国专利5,821,337教导了双特异性抗ErbB2/抗CD3抗体。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统制备是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中这两条链具有不同特异性(Millsteinetal,Nature,305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链轻链随机分配，这些杂交瘤("四链瘤，，(quadroma))产生IO种不同抗体分子的可能混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。对所述正确分子的纯化(通常通过亲和层析步骤来进行)非常复杂，且产量很低。类似的方法在WO93/08829和Traunecker等，EMBOJ,10:3655-3659(1991)中披露。依据另一不同方法，可将具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合优选与包含铰链区、CH2及CH3区的至少一部分的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少在一种融合中。可将编码免疫球蛋白重链融合体，以及必要时，编码免疫球蛋白轻链的DNA插入不同表达载体，共转染至适当宿主细胞。在使用非等比的三种多肽链进行构建以获得所需双特异性抗体最佳产量的实施方案中，这提供调整三种多肽片段的相互比例上的较大灵活性。但也可在至少两种多肽链以等比例表达而获得高产时或所述比例对所需链组合的产量无特别意义时，将两种或所有三种多肽链的编码序列插入同一表达载体。在该方法的一个优选实施方案中，所述双特异性抗体由一条臂上的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。已发现这种不对称结构有利于从不想要的免疫球蛋白链的混合中分离出所需双特异性化合物，因为只有该双特异性分子的一半存在免疫球蛋白轻链，这使得分离更加容易。此方法公开于1994年3月3日公开的WO94/04690中。制备双特异性抗体的进一步细节可以参见，例如Suresh等，MethodsinEnzymology，121:210(1986)。根据美国专利5，731,168所述的另一种方法，可改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中获得的异二聚体的百分比最大。优选的界面包括CH3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一抗体分子界面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补"沟"可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二抗体分子的界面上形成。这提供了一种机制，其使异二聚体的产量比其它不想要的终产物如同型二聚体高。双特异性抗体包括交联抗体或"异源偶联的，，抗体。例如，可使异源偶联物中的抗体之一与抗生物素蛋白偶联，使另一抗体与生物素偶联。有观点认为，这类抗体可用于将免疫系统细胞导向不想要的细胞(美国专利4,676,980)，也可用于治疗HIV感染(W091/00360，WO92/200373,EP03089)。异源偶联抗体可通过任何适当的交联方法制备。适当的交联制剂和多种交联技术为本领域已知，在美国专利4,676,980号中获得。从抗体片段制备双特异性抗体的技术已有文献。例如，双特异性抗体可利用化学连接制备。Brennan等，科学229:81(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解切割制备F(ab')2片段的方法。这些片段在二疏基复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的巯基，并阻止分子间二硫键的形成。生成的Fab'片段被转化为硫硝基苯曱酸盐(TNB)衍生物。其中一种Fab'-TNB衍生物经巯基乙胺还原再转化成Fab'-硫醇，再与等摩尔量的其它Fab'-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可作为酶的选择性固相化中所用的试剂。近期的进展促进了Fab'-SH片段从大肠杆菌的直接回收，该片段可经化学偶联形成双特异性抗体。Shalaby等，MW.，175:217-225(1992)描述了完全人源化双特异抗体F(ab')2分子的产生。每一Fab'片段分别从大肠杆菌中分泌出来，体外直接化学偶联形成双特异性抗体。如此制备的双特异性抗体能与过表达ErbB2受体的细胞和正常人T细胞结合，还能引发人类细胞毒淋巴细胞对人乳腺肿瘤靶向的裂解活性。直接从重组细胞培养中制备并分离双特异性抗体片段的多种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。Kostelny等，//w,肌"o/.,148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab'部分通过基因融合而连接。使抗体的同二聚体在铰链区被还原成单体，然后被再氧化形成抗体的异二聚体。该方法也可用于制备抗体同二聚体。Hollinger等，A^/.4cad5W,t/SA90:6444-6448(1993)所述的"二价抗体"技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有Vh，其通过接头与VL相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，同一片段上的Vh和VL结构域被迫与另一片段上的互补Vl和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。此外还报道了另一种用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体的策略。见Gruber等，■//画画/.，152:5368(1994)。本发明还涉及二价以上的抗体。例如可制备三特异抗体。Tutt等//mw歸/.147:60(1991)。多价抗体比二价抗体更容易被表达与该抗体结合的抗原的细胞内化(和/或异化)。本发明的抗体可以是具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(例如四价抗体)(它们不是IgM类)，通过使编码所述抗体多肽链的核酸重组表达可轻易制备该抗体。多价抗体可以包含二聚体化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选的二聚体化结构域包括Fc区或铰链区，或由其组成。在本文中，抗体包含一个Fc区和三个或更多个位于Fc区氨基端的抗原结合位点。优选的多价抗体在此包括三到约八个抗原结合位点，或由它们组成，但优选四个抗原结合位点。多价抗体包括至少一条多肽链(并优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或多个可变区。例如，多肽链可包含VDl-(XlVVD2-(X2)n-Fc,其中VD1是第一可变区，VD2是第二可变区，Fc是Fc区的一条多肽链，XI和X2代表氨基酸或多肽，n是0或l。例如，多肽链可包括VH-CHl-柔韧接头(flexiblelinker)-VH-CHl-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文的多价抗体优选进一步包含至少两个(优选四个)轻链可变区多肽。例如本文的多价抗体可包含从约两个到约八个轻链可变区多肽。本文的轻链可变区多肽包含轻链可变区以及可选地进一步包含CL结构域。^它疯差^修谬本发明还涉及对本文所述CD20结合抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗CD20抗体的氨基酸序列变体可通过在抗CD20抗体核酸中导入适当的核苷酸改变，或通过肽合成法来制备。所述修饰包括，如该抗CD20抗体的氨基酸序列中的残基缺失，和/或插入和/或取代。可对缺失、插入、和取代进行任意组合以获得最终构建体，只要该最终构建体具有所需特性。氨基酸的变化还可改变抗CD20抗体的翻译后加工，如改变糖基化位点的数目或位置。一种鉴别抗CD20抗体中处于诱变优选位置的特定残基或区域的有效方法是Cunningham和Wells，科学244:1081-1085(1989)所述的"丙氨酸扫描诱变"。这里，筌定一个残基或一组靶残基(例如，带电的残基如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)取代，以便影响氨基酸与CD20抗原的相互作用。那些证实对取代具有功能敏感性的氨基酸位置通过在取代点51入进一步的或其它的变体而改进。故，尽管引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，但突变本身不必是预定的。例如，为分析在指定位点处突变的作用，在所述靶密码子或区域实行丙氨酸扫描或随机诱变，并筛选所表达的具有预期活性的抗CD20抗体变体。氨基酸序列插入包括氨基-和/或羧基-端的融合(其长度从一个残基至包括100个或更多残基的多肽)，以及序列内单个或多个氨基酸残基的插入。末端插入的例子包括带有N-末端曱硫氨酰残基的抗CD20抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗CD20抗体分子的其它插入变体包括使该抗CD20抗体的N或C末端与酶(例如ADEPT)或增加该抗体血清半寿期的多肽融合形成的融合体。另一类变体是氨基酸取代变体。这些变体使抗CD20抗体分子中至少一个氨基酸残基被不同残基取代。最有兴趣进行取代诱变的位点包括高变区，也可以改变FR。保守取代见表1的"优先取代"栏。如果这些取代引起生物学活性的改变，则可引入表l中"取代举例"栏的更实质性改变，或进一步在下文的氨基酸分类中所述的更实质性改变，并筛选产物。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>的效应在维持(a)取代区多肽框架的结构，例如片层结构或螺旋构象，(b)该分子耙位点的电荷或疏水性，(c)侧链的大小这几方面有显著差异。天然残基根据共有的侧链特性可分为(1)疏水性正亮氨酸，蛋氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸(2)中性亲水半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸(3)酸性天冬氨酸，谷氨酸(4)碱性天冬酰胺，谷氨酰胺，组氨酸，赖氨酸，精氨酸C5)影响侧链定向的残基甘氨酸，脯氨酸，和(6)芳香族色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸。非保守取代将限定上述某一类的成员被另一类取代。任何不参与保持抗CD20抗体正确构型的半胱氨酸残基可被替代，通常由丝氨酸替代，来提高分子的氧化稳定性并防止错误交联。反之，可在抗体中添加半胱氨酸连接以提高其稳定性(特别当抗体为抗体片段如FV片段时)。取代变体的特别优选类型包括取代亲本抗体(例如人源化抗体或人抗体高变区的一或多个残基。通常，所选用于进一步开发的所得变体相对于其所来源的亲本抗体应具有改进的生物学活性。产生这种取代变体的一个方便方法是利用了噬菌体展示的亲和力成熟。简单地说，使高变区的几个位点(如6-7个位点)突变以便在每一位点产生所有可能的氨基酸取代。这样产生的抗体变体以单价形式展示在丝状噬菌体颗粒上，其为与每个颗粒内包装的Ml3基因III产物的融合体。然后筛选噬菌体展示的变体是否具有本文所述生物学活性(如结合亲和力)。为了鉴定备选的高变区修饰位点，可通过丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合作出主要贡献的高变区残基。或者或此外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以确定CD20与抗体之间的接触点也较有利。这些接触残基及邻近残基是根据本文所述技术进行取代的候选位点。一旦产生这样的变体，如本文所述对它们全部进行筛选，选出在一或多个相关实验中具有良好特性的抗体以便进一步开发。抗体的另一种氨基酸变体改变了该抗体原来的糖基化模式。所谓改变就是去掉抗体中的一或多个糖组分，和/或添加一或多个原本不存在于该抗体中的糖基化位点。抗体的糖基化通常为N-连接或O-连接。N-连接指将糖组分与天冬酰胺残基的侧链相连。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-x-苏氨酸(其中x是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是使糖组分与天冬酰胺进行侧链酶促相连的识别序列。因此，多肽中存在上述任一种三肽序列都可产生潜在的糖基化位点。O-连接糖基化指将N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖附着于羟基氨基酸，主要是丝氨酸、苏氨酸，但也可用5-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。在抗体分子中添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列，使其包含一或多个上述三肽序列(在添加N-连接糖基化位点的情况下)而实现。这种改变也可通过在原始抗体序列中添加或取代一或多个丝氨酸或苏氨酸残基来实现(在添加O-连接的情况下)。编码抗CD20抗体的氨基酸序列变体的核酸分子由本领域已知的各种方法制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离(在天然氨基酸序列变体的情况下)，或通过对早期制备的变体或未变异的抗CD20抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变，PCR诱变和盒式诱变来制备。也许希望在效应子功能方面修饰本发明的抗体，例如以增强抗体的抗原依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或依赖于补体的细胞毒性(CDC)。这可通过在抗体Fc区域引入一或多个氨基酸取代而达到。二者择一地或者另外，半胱氨酸残基可被引入Fc区域，从而允许在该区内形成链间二硫键。如此生产的同型二聚体抗体可具有改善的内在化能力，和/或增加补体介导的细胞杀伤与抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)。见Caronetal.,J.ExpMed.176:1191-1195(1992)与Shopes,B丄Immunol.148:2918-2922(1992)。也可以利用如Wolffetal.CancerResearch53:2560-2565(1993)描述的异双功能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体。或者，抗体可以被改造使其具有两个Fc区域，并且可以由此具有增强的补体介导的溶解与ADCC能力。见Stevensonetal.Anti-CancerDrugDesign3:219-230(1989)。为延长抗体的血清半衰期，可以将补救受体结合表位加入抗体(特别是抗体片段)，例如在美国专利5,739,277中描述的。如同在这里所使用的，术语"补救受体结合表位"指IgG分子(例如IgGl，IgG2，IgG3，或IgG4)Fc区域的表位，其负责延长IgG分子的体内血清半衰期。,它在体,谬在此也涉及抗体的其它修饰。例如，抗体可以与各种非蛋白聚合物中的一种连接，例如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯，或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。抗体也可以在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球粒、微乳剂、纳米颗粒与纳米胶嚢)中，或者在粗乳状液中捕捉在微胶囊中，所述微胶嚢例如通过凝聚技术或界面聚合作用制备，例如，分别是羟曱基纤维素或明胶微胶嚢与聚异丁烯酸曱酯微胶嚢。这一技术在Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Oslo,A.，Ed.,(1980)中才皮露。谬逸^^"席需一一^的我沐可如实验实施例中描述的选择具有某些生物学特性的抗体。本发明的抗CD20抗体的生长抑制效果可以通过本领域已知的方法评估，例如利用内源或者在用CD20基因转染之后表达CD20的细胞。例如，肿瘤细胞系与CD20转染的细胞可以用本发明的抗CD20单克隆抗体在各种浓度处理几天(例如，2-7天)，用结晶紫或MTT染色，或用其它比色定量进行在下处理，细胞3H-胸腺嘧啶核苷的摄取。在抗体处理之后，收获细胞，并且在闪烁计数器上测定掺入DNA的放射性的量。合适的正对照包括用已知抑制该细胞系生长的生长抑制性抗体处理选定的细胞系。为选择诱导细胞死亡的抗体，可相对于对照评估膜完整性的丧失，膜完整性的丧失用例如碘化丙锭(PI)、锥虫蓝或7AAD摄取指示。PI摄取试验可以在缺乏补体与免疫效应细胞下进行。表达CD20的肿瘤细胞单独与培养基孵育，或者与包含浓度例如大约10pg/ml的合适的单克隆抗体的培养基一起孵育。细胞孵育3天。每次处理后，洗细胞，等分入35毫米带过滤器帽的12x75管(每管lml，每试验组3管)，以除去细胞团块。样品可用FACSCANTM流式细胞仪与FACSCONVERTTMCellQuest软件(BectonDickinson)分析。用PH聂取确定诱导统计上显著意义的细胞死亡水平的抗体可被选为诱导细胞死亡的抗体。为了筛选与被目的抗体结合的CD20上的表位结合的抗体，可以进行常规杂交阻滞试验，例如在antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlowandDavidLane(1988)中所描述的。这一试验可用于判断受试抗体是否与本发明的抗CD20抗体结合在相同的位点或表位上。或者或另外，可以用本领域已知的方法进行表位作图。例如，抗体序列可以例如通过丙氨酸扫描进行诱变处理，以鉴别接触残基。一开始测试突变抗体对多克隆抗体的结合以保证适当的折叠。在一不同方法中，相应于CD20不同区域的肽可用在与测试抗体或者与测试抗体和具有已表征或已知表位的抗体的竟争试验中。载体，宿主细胞和重组方法
技术领域：
：本发明还提供编码人源化CD20结合抗体的分离的核酸，包含该核酸的载体和宿主，以及制备该抗体的重组纟支术。为了重组制备所述抗体，分离其编码核酸并插入复制型载体中以便进一步克隆(扩增DNA)或表达。编码所述抗体的DNA可以用常规方法很容易地分离并测序(例如使用能够特异性结合编码抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。有多种载体可以利用。载体组分通常包括但不限于一或多个下列组分信号序列，复制起点，一或多个标记基因，增强子元件，启动子，和转录终止序列。0針,顺为、本发明的CD20结合抗体不仅可以直接重组产生，还可作为与异源多肽融合的融合多肽来重组产生，所述异源多肽优选信号序列或其它在成熟蛋白或多肽的N末端上具有特异性裂解位点的多肽。所选异源信号序列优选是被宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶裂解)的序列。对于不能识别和加工天然CD20结合抗体信号序列的原核宿主细胞，信号序列被选自，例如，碱性磷酸酶，青霉素酶，lpp或热稳定肠毒素II前导序列的原核生物信号序列取代。为了进行酵母分泌，可以将天然信号序列取代为，例如，酵母转化酶前导序列，a因子前导序列(包括糖酵母OSacc/wram;;ce力a因子前导序列和克鲁维酵母(尺/wyvera^yc^)a因子前导序列)，或酸性磷酸酶前导序列，白色念珠菌葡萄糖淀粉酶前导序列，或WO90/13646描述的信号。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒的分泌前导序列，如单纯疱渗病毒gD信号都可以采用。这些前体区的DNA与编码CD20结合抗体的DNA连4妾在阅读框内。表达载体和克隆载体都包含能使该载体在一或多种选定的宿主细胞中复制的核酸序列。一般情况下，在克隆载体中，这种序列是能使该载体独立于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。这样的序列在各种细菌、酵母和病毒中都是众所周知的。质粒pBR322的复制起点适合大多数革兰氏阴性细菌，2p质粒起点适合酵母菌，多种病毒起点(SV40,多瘤病毒(Polyoma)，腺病毒，VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。复制起点组分一般不是哺乳动物表达载体所必需的(SV40起点的使用通常仅仅是由于其包含早期启动子)。》逸#^西遂分表达载体和克隆载体可以包含选择基因，也称选择标记。典型的选择基因编码具有以下性质的蛋白(a)赋予对抗生素或其它毒素(如氨千青霉素，新霉素，氨曱蝶呤或四环素)的抗性，(b)弥补营养缺陷，或(c)提供复合培养基不能供给的关键营养物，例如编码芽孢杆菌(^""7//)0-丙氨酸消旋酶的基因。选择方案的一个实例是利用药物限制(arrest)宿主细胞的生长。那些被异源基因成功转化的细胞产生赋予药物抗性的蛋白，从而在该选择环境中存活。这种显性选择的实例采用药物新霉素，霉酚酸和潮霉素。适合于哺乳动物细胞的另一例选择标记是允许鉴定能摄取所述抗体核酸的细胞的那些，如DHFR，胸苷激酶，金属硫蛋白-I型和-II型，优选灵长类金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶，鸟氨酸脱羧酶等。例如，细胞被DHFR选择基因转化后，先将所有转化体培养在包含氨甲蝶呤(Mtx，为DHFR的一种竟争型拮抗剂)的培养基中来鉴定细胞。当采用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是DHFR活性有缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。或者，宿主细胞(尤其包含内源DHFR的野生型宿主)被编码CD20结合抗体的DNA序列，野生型DHFR蛋白，以及另一种选择标记如氨基糖苷3，-磷酸转移酶(APH)转化或共转化以后，可以通过在含有针对该选择标记的选择试剂如氨基糖苷类抗生素(如卡那霉素，新霉素或G418)的培养基中培养细胞来进行选择。参见美国专利4,965，199。适用于酵母的合适选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的基因(Stinchcomb等，Atow^，282:39(1979))。^1基因为不能在色氨酸中生长的酵母突变抹(例如ATCC44076或PEP4-1)提供了选择标记(Jones，Ge"Wcs,85:12(1977))。此后，酵母宿主细胞基因组中^pl损伤的存在提供了通过在缺乏色氨酸的条件中生长而检测转化的有效环境。类似地，丄ew2-缺陷型酵母菌抹(ATCC20,622或38,626)可以由携带丄ew2基因的已知质粒来互补。此外，源自1.6pm环状质粒pKDl的载体可以用于转化克鲁维酵母(尺/wyverawyce力。备选地，VandenBerg,5/o/Tec/7"o/ogv,8:135(1990)报道了一种用于在乳克鲁维酵母(K/flCto)中大规模制备重组小牛凝乳酶的表达系统。还有人公开了用于通过克鲁维酵母工业菌抹分泌成熟重组人血清白蛋白的稳定、多拷贝表达载体。Fleer等，Ao/rec/z"o/ogy,9:968-975(1991)。启动子iff为、表达载体和克隆载体通常包含能被宿主生物识别的启动子，它与所述编码CD20结合抗体的核酸可操作相连。适用于原核宿主的启动子包括;^"启动子，(3-内酰胺酶和乳糖启动子系统，碱性磷酸酶，色氨酸(trp)启动子系统，和杂合(hybrid)启动子如tac启动子。但其它已知的细菌启动子也是合适的。适用于细菌系统的启动子还可以包含与编码CD20结合抗体的DNA可才喿作相连的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。真核生物的启动子序列是已知的。几乎所有的真核基因在转录起始点上游约25-30个碱基处具有AT-富集区。很多基因在其转录起始点上游70-80个碱基处有另一种序列CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。大多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可以作为一种信号用于将poly-A尾添加到编码序列3，端。所有这些序列都适合于插入真核表达载体中。适用于酵母宿主的启动子序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，所述其它糖酵解酶如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6磷酸异构酶，3-磷酸甘油变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酵。其它的酵母启动子，即那些另具有由生长条件控制转录的优点的诱导型启动子，是下述基因的启动子区醇脱氢酶2、异细胞色素C(isocytochromeC)、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氬酶，以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶。在EP73,657中进一步描述了适用于酵母表达的载体和启动子。酵母增强子与酵母启动子联合使用也是有利的。在哺乳动物宿主细胞中，从载体转录CD20结合抗体是受，例如启动子调控，所述启动子来自病毒基因组，如多形瘤病毒、鸡痘病毒(fowlpoxvirus)、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒，最优选猴病毒40(SV40)的启动子，来自异源哺乳动物的启动子，如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子等，来自热休克启动子，前提是这些启动子与宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子可以作为还包含SV40病毒复制起点的SV40限制性片段而方便地获得。人巨细胞病毒的立即早期启动子可以作为HindIIIE限制性片段方便地获得。美国专利4,419，446中公开了在哺乳动物宿主中用牛乳头瘤病毒作为载体来表达DNA的系统。美国专利4，601，978中叙述了对这个系统改进。另见Reyes等，iV^ww,297:598-601(1982)关于在单纯疱渗病毒胸苦激酶启动子控制下在小鼠细胞中表达人|3干扰素cDNA。备选地，可以将劳氏肉瘤病毒长末端重复序列用作启动子。fv」增强子无伴细、编码本发明CD20结合抗体的DNA在高等真核生物中的转录常常通过将增强子序列插入载体中来增加。目前已知很多哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、曱胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。但通常使用真核细胞病毒的增强子。实例包括在复制起始点晚期侧的SV40增强子(bp100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，在复制起始点晚期侧的多形瘤增强子，和腺病毒增强子。也可参见Yaniv,A^"w,297:17-18(1982)所述用于活化真核启动子的增强元件。增强子可以剪接插入载体中抗体编码序列的5，或3'侧，但优选位于启动子的5'侧。脊录终乂iff分用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的有核细胞)的表达栽体，还可以包括对转录终止和mRNA稳定所必需的序列。这些序列通常来自真核细胞或病毒的DNA或cDNA的5，(偶尔为3')非翻译区。这些区域包含转录为编码多价抗体的mRNA的非翻译区中聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一种有效的转录终止组分是牛生长激素聚腺苦酸化区。参见WO94/11026以及本文公开的表达载体。^这举;^^化荷J:细ig克隆或表达本文所述载体中的DNA的适宜宿主细胞，包括上述原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae),如埃希氏菌属C&c/zen'c/2/a),例如，大肠杆菌CE.co"),肠杆菌属(五"fera^cfer),欧文菌属(五nWw'a)，克雷白菌属C^/e^wW/a)，变形菌杆属(尸ra&w力，沙门菌属(5W/wowe〃a)(长口鼠i另寒沙、门菌0S""/附o"e〃fl/^//w'wwn'ww))，沙、雷菌属(5"erraf/1/(3)(如粘质沙雷菌(&m7"awwc^com))和志贺菌属(幼/ge〃a)等，以及芽孢杆菌属(5ac/〃/)如枯草芽孢杆菌(及sw6"fc)和地衣芽孢杆菌(及//c/2ew/om^)(例如1989年4月12日出版的DD266,710中所述地衣芽孢杆菌41P)等，假单胞菌属^口#1纟录菌4艮单月包菌oferwg7'"c^(3),及链霉菌(&reptom;;ce力。优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，但其它菌林，如大肠杆菌B，大肠杆菌X1776(ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是合适的。这些实例是用于说明，并非限制。全长抗体、抗体片段与抗体融合蛋白质可以在细菌中产生，特别是当不需要糖基化作用与Fc效应子功能时，例如当治疗抗体偶联至细胞毒药剂(例如毒素)并且免疫偶联物自身显示在破坏胂瘤细胞上的效力时。全长抗体在循环中具有更长的半衰期。在大肠杆菌中生产是更快和更具有成本效率的。对于抗体片段与多肽在细菌中的表达，见例如美国专利5,648，237(Carteret.al.)，美国专利5，789，199(Jolyetal.)，与美国专利5,840,523(Simmonsetal.),其中描绘了用于最优化表达与分泌的翻译起始区域(TIR)和信号顺序，这些专利在此引入作为参考。在表达之后，抗体从大肠杆菌细胞糊状混合物中在可溶组分中分离，并且取决于同种型，可以通过例如蛋白A或者G柱纯化。最后纯化可以以类似于纯化在CHO细胞中表达的抗体的程序进行。除了原核生物，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合于编码CD20结合#元体的载体的克隆或表达宿主。酉良酒酵母(5"acc/207wwjKcescerev7、/ae)或常见的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。还有多个其它属、种和抹已有商品供应，并且可以用于本发明，例如粟酒裂殖酵母(Sc/n'zosacc/zarawyc&s1pom6e);克鲁维酵母属(X7wyveramyces)宿主,侈'H口乳克鲁维酵母(K/flc他)、脆壁克鲁维酵母(/rag/fc)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K6w/gan'cw力(ATCC16,(M5)、威克曼氏克鲁维酵母(尺.w/cferam")(ATCC24，178)、Kwa/"/(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(尺.Awo;/n7aram)(ATCC36，906)、耐热克鲁维酵母(KAe/7wto/erara)和马克斯克鲁维氏酵母(/:.wwx/am^)等；西洋蓍霉0wrow/a)(EP卯2，2M);巴斯德毕赤酵母0/c/n'a/oston;)(EP183,070);念珠菌属(Camfe/");7Hc/2o^rwaew'a(EP244，234);粗糙链孢霉(7Vewmy;ora;许旺氏酵母属(sc/2丽ww.omyce力如西方许旺氏酵母(sc/z而wm'cw7c"oc"'ofe她//力等；和丝状真菌,i"列^口"f连孑包霉属(iVeMnw/on3)、青霉属(尸e"/c/〃/ww)、7b(v/oc/acZ/w/w以及曲霉属宿主如构巢曲霉(AmV/w/a""和黑曲霉(Am'ger)等。适合于表达糖基化CD20结合抗体的宿主细胞来自多细胞生物。无脊推动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。目前已经从下述宿主中鉴定了大量的杆状病毒林和变体以及相应的容许型昆虫宿主细胞草地夜蛾(5^ocb/^erai^wg^eraa，毛虫)、i矣及〗尹虫丈(」aegvp",虫丈子)、白纟丈〗尹虫文(」e(iesa/6o/〖c/ws,虫丈子)、Dnwop/n'/awe/awoga^er(果虫菱)禾口家蚕蛾(5ow6yA:mon')等。用于转染的各种病毒抹可以公开地获得，例如加利福尼亚Y级夜蛾C4wtogra/7/2aca/z/orm'a)NPV的L-l变体和家蚕蛾NPV的Bm-5林，并且这些病毒可以在此用作本发明的病毒，尤其是用于转染草地夜蛾细胞。棉花(cotton)、玉米(corn)、土豆(potato)、大豆(soybean)、矮牵牛(petunia)、西红柿(tomato)和烟草(tobacco)的植物细胞培养物也可以用作宿主。然而，关注最多的是脊推动物细胞，而且在培养(组织培养)中繁殖脊推动物细胞已经成为常规方法。有效哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚肾细胞系(293细胞或经过再克隆后能在悬浮培养物中生长的293细胞，Graham等，Wra/.36:59(1977));仓鼠幼鼠肾细胞(BHK,ATCCCCL10);中国仓鼠卵巢细胞ADHFR(CHO，Urlaub等，户rac.A^/.^a^.Sc/.t/.S.A77:4216(1980));小鼠足细胞(TM4，Mather,5/o/.23:243-251(1980));猴肾细胞(CV1ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCKATCCCCL34);布法罗(buffalo)大鼠肝细胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺细胞(W138，ATCCCCL75);人肝细胞(HepG2，HB8065);小鼠乳腺肺瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI细胞(Mather等，7VUcad383:44-68(1982));MRC5细胞；FS4细胞；和人肝细胞癌细胞系(HepG2)。宿主细胞用上述用于制备CD20结合抗体的表达或克隆载体转化，并在改进型传统营养培养基上培养，所述培养基经改进已适于诱导启动子、筛选转化体、或扩增编码所需序列的基因。—;}接#凉力皮應用于产生本发明的CD20结合抗体的宿主细胞可以在各种培养基中培养。市售培养基如Ham'sF10(Sigma),极限必需培养基((MEM)，Sigma)，RPMI-1640(Sigma),和Dulbecco改良Eagle培养基((DMEM)，Sigma)都适于j备养戶斤述宿主纟田月包。jt匕夕卜，HamWa/.,tW^/z.Swz.58:44(1979)，BarnesW爿"a/.102:255(1980)，U.S.Pat.Nos.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;or5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或U.S.PatentRe.30，985所述的任一种培养基也可以用作宿主细胞培养基。任何上述培养基可以根据需要添加激素和/或其它生长因子(如胰岛素，运铁蛋白，或表皮生长因子)，盐(如氯化钠，钓，镁，和磷酸盐)，緩沖液(如HEPES),核苷酸(如腺苷和胸苷)，抗生素(如Gentamycin),痕量元素(定义为通常以微摩尔水平的终浓度出现的无机化合物)，和葡萄糖或等效能源。还可以包括本领域技术人员已知的适当浓度的任何其它必需添加物。培养条件，如温度，pH等，都是在选定的表达宿主上已用到的那些，并且对本领域技术人员而言也是显而易见的。p力在谬趟化使用重组技术时，所述抗体可产生在细胞内，在周质空间中，或直接分泌到培养基中。如果所述抗体是产生在细胞内，首先要通过例如离心或超滤作用除去颗粒状残渣(为宿主细胞或裂解的片^:)。Carter"a/.,历o/Tec/mo/^y10:163-167(1992)描述了一种将已分泌到大肠杆菌周质空间中的抗体分离的方法。简言之，在有乙酸钠(pH3.5),EDTA，和苯曱基磺酰氟(PMSF)存在的情况下将细胞团解冻约30分钟。细胞碎片可以通过离心除去。在抗体分泌至培养基的情况中，通常首先使用诸如Amicon或MilliporePellicon超滤单元等市售蛋白浓缩滤器浓缩这类表达系统的上清。上述任一步骤中可以包括PMSF等蛋白酶抑制剂，以便抑制蛋白水解，还可以包括抗生素，以便防止外来污染物(adventitiouscontaminant)的生长。从所述细胞制备的抗体组合物可以利用，例如，羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、和亲和层析等方法纯化，优选亲和层析纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适宜性有赖于所述抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可以用来纯化基于人yl,或丫4重链的抗体(Lindmark"a/.，J://wmwo/.M"/2.62:1-13(1983))。蛋白G被建议用于所有小鼠同种型以及用于人丫3(Guss"a/"五M5(9J:5:15671575(1986))。亲和配体附着的基质最常是琼脂糖，也可以采用其它基质。机械稳定的基质例如控制孔径的3皮璃(controlledporeglass)或聚(苯二乙烯)苯(poly(styrenedivinyl)benzene)与琼脂糖相比，其流速更快且处理时间更短。当抗体包含Ch3区时，可以用BakerbondABXTM树脂(J.T.Baker,Phillipsburg，NJ)纯化。其它蛋白纯化技术，例如离子交换柱分级分离，乙醇沉淀，反相HPLC，硅层析，肝素SEPHAROSETM层析，阳离子或阴离子交换树脂(例如聚天冬氨酸柱)层析，层析聚焦，SDS-PAGE，和硫酸铵沉淀也可以采用，这取决于所回收的抗体。在任何初步提纯步骤之后，在pH大约2.5-4.5之间利用洗脱緩冲液对包含目的抗体与污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，优选地在低盐浓度下进行(例如大约0-0.25M盐)。抗体偶联物抗体可被偶联至细胞毒性剂例如毒素或放射性同位素。在某些实施方式中，毒素是力口利车霉素、maytansinoid、多拉司他汀、auristatinE与其类似物或衍生物是优选的。优选的药物/毒素包括DNA损伤剂、微管聚合或解聚抑制剂与抗代谢物。细胞毒药剂的优选类别包括，例如，酶抑制剂例如二氢叶酸还原酶抑制剂，与胸苷酸合酶抑制剂，DNA嵌入剂，DNA裂解剂、拓朴异构酶抑制剂、蒽环类抗生族药物、长春花属药物、丝裂霉素素、博来霉素、细胞毒核苷、喋啶族药物、diynenes、鬼臼霉素与分化诱导物。这些类别的特别有用的成员包括，例如，氨曱喋呤，曱氨喋呤，二氯氨曱喋呤，5-氟尿嘧啶，6-巯基嘌呤，阿糖胞苷，美法仑，环氧长春碱，洛诺西丁、放线菌素、道诺红菌素、阿霉素、N-(5，5-二醋氧戊基)阿霉素、吗啉代阿霉素、l-(2-氯乙基)-l，2-二精脒曱磺酰酰肼、N8-乙酰基精脒、氨基蝶呤曱氨喋呤、esperamidn、丝裂霉素C、丝裂霉素A、放线菌素、博来霉素、洋红霉素、氨基蝶呤、太利苏霉素、鬼臼霉素与鬼臼霉素衍生物例如鬼臼亚乙苷或鬼臼亚乙苷磷酸盐、长春碱、长春新碱、去乙酰长春酰胺、紫杉酚、泰索帝、视黄酸、丁酸、N8-乙酰基精脒、喜树碱、加利车霉素、苔藓才中素、cephalostatins、美登木素、布4立》也杀斤4内、maytansinoids例i口DM-1、美登素、美登醇、N-去曱基-4,5-去环氧基美登醇、C-19-去氯美登醇、C-20-羟美登醇、C-20-去曱氧基美登醇、C-9-SH美登醇、C-14-烷氧基曱基美登醇、C-14-雍基或乙酰氧曱基美登醇、C-15-羟基/乙酰氧美登醇、C-15-曱氧基美登醇、C-l8-N-去甲基美登醇与4,5-脱氧美登醇、auristatins例如auristatinE、M、PHE与PE;dolostatins例如dolostatinA、dolostatinB、dolostatinC、dolostatinD、dolostatinE、(20-epi与ll-epi)、dolostatinG、dolostatinH、dolostatinI、dolostatin1、dolostatin2、dolostatin3、dolostatin4、dolostatin5、dolostatin6、dolostatin7、dolostatin8、dolostatin9、dolostatin10、deo-dolostatin10、dolostatin11、dolostatin12、dolostatin13、dolostatin14、dolostatin15、dolostatin16、dolostatin17、与dolostatin18;cephalostatins例如cephalostatin1、cephalostatin2、cephalostatin3、cephalostatin4、cephalostatin5、cephalostatin6、cephalostatin7、25'-epi-cephalostatin7、20-epi-cephalostatin7、cephalostatin8、cephalostatin9、cephalostatin10、cephalostatin11、cephalostatin12、cephalostatin13、cephalostatin14、cephalostatin15、cephalostatin16、cephalostatin17、cephalostatin18、与cephalostatin19。Maytansinoids是有丝分裂抑制剂，通过抑制微管蛋白聚合而起作用。美登素最初从东非灌木齿叶美登木分离出来(美国专利3，896，111)。随后，人们发现某些微生物也产生maytansinoids,例如美登醇与C-3美登醇酯(美国专利4,151,042)。在美国专利4,137,230;4，248，870;4,256,746;4,260,608;4，265，814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;与4,371,533中披露了合成美登醇与其衍生物和类似物，在此特别地引入作为参考。美登素与maytansinoids已与特定地与肿瘤细胞抗原结合的抗体偶联。包含maytansinoids的免疫偶联物及其治疗用途在例如美国专利5，208，020，5,416,064与欧洲专利EP0425235B1中披露，其公开在此特别地引入作为参考。Liuetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:8618-8623(1996)描述了包含指定为DM1的maytansinoid，该maytansinoid与4f只于人结肠直肠癌症的单克隆抗体C242连接。偶联物被发现对培养的结肠癌细胞具有高度细胞毒性，并且在体内胂瘤生长试验中显示抗肺瘤活性。Charietal.CancerResearch52:127-131(1992)描述了免疫偶联物，其中maytansinoid通过二硫键接头与鼠抗体A7偶联，该鼠抗体A7与人结肠癌细胞系上的抗原结合，或者maytansinoid偶联至另一鼠单克隆抗体TA.l，该抗体与HER-2/neu癌基因结合。本领域已知许多连接基团用于制备抗体maytansinoid偶联物，包括，例如，在美国专利5，208,020或EP专利0425235B1，与Charietal.CancerResearch52:127-131(1992)中所披露的。连接基团包括如上述专利中所披露的二硫化物基团、硫醚基团、对酸敏感的基团、对光敏感的基团、对肽酶敏感的基团、或对酯酶敏感的基团，优选二硫化物与硫醚基团。可以使用各种双功能蛋白偶联剂制备抗体与maytansinoid的偶联物，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸盐(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺曱基)环己烷-l-羧酸盐、iminothiolane(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如二甲基己二酰亚氨酯HCL)，活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二叠氮化物(例如二-(p-叠氮苯曱酰基)已二胺)、二重氮衍生物(例如二-(p-重氮苯曱酰基)-乙二胺)、二异氰酸盐(例如曱苯2,6-二异氰酸盐)、与二-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2，4-二硝基苯)。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸盐(SPDP)(Carlssonetal.，Biochem.J.173:723-737[1978])与N画琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基巯基)戊酸盐(SPP)，以提供二硫键。取决于连接类型，接头可以附着于maytansinoid分子的各个位置。例如，利用常规的偶联技术，用羟基反应可以形成酯键。反应可以发生在有羟基的C-3位置，C-14位置用羟曱基修饰，C-15位置用羟基修饰，C-20位置具有羟基。在优选实施方式中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接*辦另一个感兴趣的免疫偶联物包含偶联至一或多个加利车霉素分子的CD20结合抗体。加利车霉素族抗生素能够在皮摩尔浓度以下产生双链DNA断裂。制备加利车霉素族的偶联物参见美国专利5,712,374，5,714,586，5,739,116,5,767285,5,770,701,5,770,710，5，773，001,5，877,296(均属于AmericanCyanamidCompany)。可被使用的加利车霉素的结构类似物包括，4旦不局限于，yl1，a21，a31，N-乙酰基yl1，PSAG与211(Hinmanetal.CancerResearch53:3336-3342(1993),Lodeetal.CancerResearch58:2925-2928(1998)与前面提到过的属于AmericanCyanamid的美国专利)。另一个可以偶联至抗体的抗肿瘤药物是QFA,其为抗叶酸物。加利车霉素与QFA均具有胞内作用位点，并且不容易越过质膜。因此，通过抗体介导的内在化所导致的这些药剂的细胞摄取大大增强他们的细胞毒效果。放射性同位素抗体可以包含高度放射性原子以选择性破坏肿瘤。已有各种放射性同位素用于生产放射性偶联的抗CD20抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re'88、Sm153、Bi212、P32、Pb212与Lu的放射性同位素。当偶联物被用于诊断时，其可包含放射性原子用于闪烁法研究，例如tc"m或I123,或包含自旋标记物用于核/磁共振(NMR)成像(又名》兹共振成象，mri),例如还是石典-123,碘-131,铟-111,氟國19，碳隱13,氮画15，氧-17,4U，锰或铁。放射性或其它标记可以已知方式掺入偶联物。例如，肽可以生物合成或可以利用合适的氨基酸前体经由化学氨基酸合成来合成，化学氨基酸合成涉及例如用氟-19代替氢。标记例如tc"m或I123、Re186、Re哪与In'"可以通过肽中的半胱氨酸残基附着。钇-90可以通过赖氨酸残基附着。IODOGEN方法(Frakeretal(1978)Biochem,Biophys.Res.Commun.80:49-57)可用于掺入石典-123。"MonoclonalAntibodiesinImmunoscintigraphy"(Chatal,CRCPress1989)详细描述了其它方法。可以使用各种双功能蛋白偶联剂制备抗体与细胞毒性剂的偶联物，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二巯基)丙酸盐(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺曱基)环己烷-l-羧酸盐、iminothiolane(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如二曱基己二酰亚氨酯HCL),活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(例如戊二醛)、二叠氮化物(例如二-(p-叠氮苯甲酰基)已二胺)、二重氮衍生物(例如二-(p-重氮笨曱酰基)-乙二胺)、二异氰酸盐(例如曱苯2，6-二异氰酸盐)、与二-活性氟化合物(例如1，5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitettaetal.Science238:1098(1987)描述制备蓖麻毒免疫毒素。碳-14-标记的l-异硫氰酸节基-3-曱基二乙烯-三胺五乙酸(MX-DTPA)是示例性的螯合剂，用来将放射性核苷酸结合至抗体。见WO94/11026。接头可以是"可断裂的接头"，以促进细胞毒类药物在细胞中的释放。例如，可使用酸不稳定的接头、肽酶敏感的接头、光敏感的接头、二曱基接头或包含二硫化物的接头(Charietal.CancerResearch52:127-131(1992);美国专利5,208,020)。CD20结合抗体的治疗用途本发明的CD20结合抗体可用于治疗多种恶性与非恶性疾病，包括自身免疫病与相关病症，与CD20阳性癌症，包括B细胞淋巴瘤与白血病。骨髓中的干细胞(B细胞祖先)缺乏CD20抗原，允许健康B细胞在治疗后再生，并在几个月之内回复至正常水平。风湿性关;炎,'i关节i^，牛皮癣关节炎)，、牛:癣:皮炎包括异位性皮炎；慢性自身免疫荨麻疹，多肌炎/皮肌炎，中毒性表皮坏死松解，全身性硬皮病/硬化症，与炎性肠疾病(inflammatoryboweldisease(IBD))有关的应答(Crobn，s病，溃疡性结肠炎)，呼吸窘迫综合症，成人呼吸窘迫综合症，脑膜炎，过敏性鼻炎，脑炎，葡萄膜炎，结肠炎，肾小球肾炎，过敏性病症，湿渗，哮喘，T细胞浸润有关的病症和慢性炎症反应，动脉粥样硬化，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，系统性红斑狼疮(SLE),狼疮(包括肾炎型，非肾型，盘型，脱发型)，少年发作的糖尿病(juvenileonsetdiabetes),多发性硬化，变应性脑脊髓炎，细胞因子与T淋巴细胞介导的与急性和迟发性过敏反应有关的免疫反应，肺结核，结节病，肉芽肿病包括韦格内氏肉芽肿病，粒细胞缺乏症，血管炎，再生障碍性贫血，库姆斯氏阳性贫血，戴布二氏贫血，免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血，纯红细胞发育不全(PRCA),凝血因子VIII缺乏，甲型血友病，自身免疫性中性白细胞减少，全血细胞减少症，白血球减少症，涉及白细胞血细胞渗出的疾病，CNS炎性紊乱，多器官损伤综合症，重症肌无力，抗原抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基底膜疾病，抗磷脂抗体综合症，过敏性神经炎，Bechet病，Castleman综合症，古德帕斯彻氏综合症，兰-伊二氏类重症肌无力综合征，雷诺氏综合症，斯耶格仑氏综合症，斯-约二氏综合症，实体器官移植排斥(包括对高位反应性抗体滴度的预处理，IgA在组织沉积，等等)，移植物抗宿主病(GVhD),天疱疮样大疱，天疱疮(所有的，包括寻常的、叶状的)，自身免疫性多内分泌腺病，赖特尔氏病(Reiter'sdisease),僵人综合症，巨细胞性动脉炎，免疫复合物性肾炎，IgA肾病，IgM多神经病或IgM介导的神经病，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，血栓性血小板减少性紫癜(TTP),自身免疫性血小板减少，睾丸与卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎与卵巢炎，原发性曱状腺功能减退，自身免疫性内分泌疾病包括自身免疫性曱状腺炎，慢性甲状腺炎(桥本氏曱状腺炎)，亚急性曱状腺炎，自发性曱状腺机能减退，阿狄森氏病，格雷夫斯氏病、自身免疫的多腺综合症(或多腺内分泌病综合症)，I型糖尿病也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)与席汉氏综合症，自身免疫性肝炎，淋巴结间质肺炎(HIV),闭塞性细支气管炎(非移植)与NSIP，格-巴二氏综合症，大血管血管炎(包括风湿性多肌痛与巨细胞(高安氏)动脉炎)，中等血管血管炎(包括川崎病与结节性多动脉炎)，强直性脊柱炎，贝尔格尔氏病(IgA肾病)，快速进展的肾小球肾炎，原发性胆汁性肝硬变，Celiacsprue(粘胶质肠病)，冷球蛋白血症，ALS，冠状动爿永病。CD20阳性癌症是那些包含在细胞表面表达CD20的细胞的异常增殖的癌症。CD20阳性B细胞胂瘤包括CD20阳性何杰金氏病，包括淋巴细胞占优势的何杰金氏病(LPHD);非何杰金氏淋巴瘤(NHL);滤泡中心细胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴细胞性白血病(ALL);慢性淋巴细胞性白血病(CLL);毛细胞白血病。非何杰金氏淋巴瘤包括低级/滤泡的非何杰金淋巴瘤(NHL)，小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，中等/滤泡NHL,中等扩散NHL，高级成免疫细胞的(highgradeimmuoblastic)NHL,高级成淋巴细胞的NHL,高级小非核裂细月包(highgradesmallnon-cleavedcell)NHL,bulkydiseaseNHL,类浆细月包淋巴细胞性淋巴瘤，套细胞淋巴瘤，AIDS相关的淋巴瘤与瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症。也涉及这些癌症复发的治疗。LPHD是一类何杰金氏病，尽管用放射或化学疗法治疗仍倾向经常复发，其特征在于CD20阳性的恶性细胞。CLL是四种主要类型的白血病之一。作为称为淋巴细胞的成熟B细胞的癌症，CLL表现为细胞在血液、骨髓与淋巴组织中的进行性堆积。在具体的实施方式中，人源化CD20结合抗体与其功能性片段被用于治疗非何杰金氏淋巴瘤(NHL),淋巴细胞占优势的何杰金氏病(LPHD)，小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，慢性淋巴细胞性白血病，类风湿性关节炎与青年类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)包括狼疮肾炎，韦格内氏病，炎症性肠病，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，血栓性血小板减少性紫癜(TTP),自身免疫性血小板减少，多发性硬化，牛皮癣，IgA肾病，IgM多神经病，重症肌无力，血管炎，糖尿病，雷诺氏症，斯耶格仑氏综合症与肾小球肾炎。人源化CD20结合抗体或其功能性片段可用在对，例如，复发或难治的低级或滤泡CD20阳性B细胞NHL的单一药剂治疗中，或者可以在多种药物疗法中与其它药物联合对病人给药。无痛淋巴瘤是一缓慢增长、不可治愈的疾病，其中一般的病人存活六到十年之间，经历多个症状緩解与复发周期。在一个实施方式中，人源化CD20结合抗体或其功能性片段被用来治疗无痛NHL。评估肺瘤治疗效力或成绩的参数对于对该恰当疾病熟悉的医师来说是已知的。通常，熟练医师将试图减少该特定疾病的体征和症状。参数可以包括疾病进行的中值时间、症状緩解时间及病情平稳。以下参考文献描述了淋巴瘤与CLL，其诊断、治疗和用于测量治疗效力的标准医学程序。CanellosGP,Lister,TA，SklarJL:T7zeZ^wp/wwos.W.B.SaundersCompany,Philadelphia,1998;vanBesienKandCabanillas,F:ClinicalManifestations,StagingandTreatmentofNon-Hodgkin'sLymphoma,第70章,pp1293-1338,在//emato/ogy,5ow/cPn'"")/^a"t/ZVac"ce，3rded.Hoffmanetal.(editors).ChurchillLivingstone,Philadelphia,2000中；和Rai,KandPatel，D:ChronicLymphocyticLeukemia,第72章,pp1350-1362，在//ewafo/ogy,5as7.c/V/wc^/eya"<i尸narc7'ce,3rded.Hoffmanetal.(editors).ChurchillLivingstone,Philadelphia,2000.评估治疗自身免疫或自身免疫相关疾病效力或成绩的参数对于在该恰当疾病领域熟练的医师来说是已知的。通常，熟练医师将试图减少该特定疾病的体4正和症状。以下举例i兌明。在一个实施方式中，本发明的抗体用于治疗类风湿性关节炎。类风湿性关节炎的特征在于多关节炎症、软骨损耗与骨侵蚀，导致关节破坏，并且最终减低关节功能。另外，由于RA是全身疾病，其可对其它組织例如肺、眼与骨髓产生作用。在患RA超过10年的病人中不到50%能继续进行曰常工4乍或生活。抗体可以在早期RA(即未用氨曱喋呤(MTX)治疗的)病人中作为第一线治疗使用，可作为单一治疗药物使用，或者与例如MTX或环磷酰胺联合使用。或者，抗体可以在治疗DMARD和/或MTX难治的病人中作为第二线治疗药物使用，可作为单一治疗药物使用，或者与例如MTX联合使用。人源化CD20结合抗体在预防和控制关节损害、延緩结构破坏、降低与RA中炎症相关的疼痛中有用，并且通常在中度至严重RA中减少体征和症状。可以在用其它用于治疗RA的药物治疗之前、之后或过程中用人源化CD20抗体治疗RA病人(见下面的联合治疗)。在一个实施方式中，先前曾用具有减轻疾病效果的抗风湿药治疗失败和/或对仅用氨曱喋呤治疗反应不足的病人用本发明的人源化CD20结合抗体治疗。在这一治疗的实施方式中，对病人实施17天的治疗方案，其中仅接受人源化CD20结合抗体(在第1与第15天，lgiv输注)；CD20结合抗体加环石粦酰胺(在第3与第17天，750mgiv输注)；或者CD20结合抗体加氨曱喋呤。评价RA治疗效力的一个方法是以美国风湿病学学院(ACR)标准为基础，该标准测量在关节触痛与肺胀上改善的百分比，同时测量其它内容。与未用抗体治疗(例如治疗前基线)或用安慰剂治疗相比较，RA病人可被评分为，例如ACR20(改善20%)。评价抗体治疗效力的其它途径包括X线评分，例如SharpX线评分，该评分被用来对结构破坏例如骨侵蚀与关节间隙变窄评分。在治疗期间或之后，也可以健康评估调查表[HAQ]评分、AIMS评分、SF36为基础，评价病人残疾的预防或改善。ACR20标准可以包括在触痛(疼痛)关节计数与肿胀关节计数上改善20%,加上在如下5个附加测量标准中至少3个改善20%:用视觉模拟尺度(VAS)评估病人疼痛，病人对疾病活动性的综合评估(VAS)，医师对疾病活动性的综合评估(VAS)病人通过健康评估调查表对残疾的自我评估，和急性期反应物，CRP或ESR。ACR50与70类似地进行定义。优选地，给予病人有效量的本发明的CD20结合抗体，以达到评分为至少ACR20，优选地至少ACR30,更优选地至少ACR50，甚至更优选地至少ACR70，优选地至少ACR75和更高。牛皮癣关节炎具有独一无二和特殊的放射线照相特征。对于牛皮癣关节炎而言，关节侵蚀与关节间隙变窄也可以用Sharp记分评估。本发明的人源化CD20结合抗体可用于防止关节损害和减少该紊乱的疾病体征和症状。本发明的另一方面为通过给予患SLE的患者治疗有效量的本发明的人源化CD20结合抗体，治疗狼疮或SLE的方法。SLEDAI评分提供疾病活动性的数值定量。SLEDAI是24个已知与疾病活动性相关的临床与实验室参数的加权指数，数值范围为0-103。见BryanGescuk&JohnDavis,"Noveltherapeuticagentforsystemiclupuserythematosus"在CurrentOpinioninRheumatology2002，14:515-521中。针对双链DNA的抗体被认为导致肾性潮红(renalflares)及其它狼瘉表现。可以对进行抗体治疗的病人随时间监测肾性潮红，其被定义为血清肌酸酐、尿蛋白质或血尿的显著的、可再现的增加。或者或另外，可以监测病人抗核抗体与抗双链DNA抗体的水平。对于SLE的治疗包括高剂量皮质类固醇和/或环磷酰胺(HDCC)。脊推关节病是关节的一组疾病，包括强直性脊柱炎、牛皮癣关节炎与克朗氏病(crohn'sdisease)。治疗成果可以用经验证实的病人与医师综合评估测量工具来判定。各种药物被用来治疗牛皮癬，治疗与疾病严重程度直接有关。具有较轻型牛皮癣的病人一般用局部治疗，例如局部类固醇、蒽林、卡泊三烯、氯氟美松、与他佐罗汀，以控制病症，而具有中度与重度牛皮癣的病人则更可能使用系统的(氨甲喋呤、类视黄醇、环孢菌素、PUVA与UVB)疗法。也使用焦油(Tars)。这些疗法的缺点在于安全性考虑、耗时或治疗过程不便利。此外，有些要求昂贵的设备与在办公室环境下设定专用空间。系统药物可产生严重的副作用，包括高血压、高脂血症、骨髓抑制、肝脏疾病、肾病与胃肠不适。并且，使用光照疗法可以增加皮肤癌的发病率。除与使用局部治疗相关的不便与不适之外，光照疗法和系统治疗要求不断地使病人在治疗与停止治疗之间反复，并由于其副作用需要监测终生照射量。牛皮裤治疗效力通过监测与基础状态相比较疾病临床征象与症状的改变而评估，包括医师综合评估(PGA)改变与牛皮癣面积和严重性指数(PASI)评分、牛皮癣症状评估(PSA)。可在整个治疗过程重周期性地测量病人的视觉模拟等级(Visualanalogscale),视觉模拟等级被用来表示特定时间点所感受到的痒感程度。病人在首次输注治疗性抗体时可发生输注反应或输注相关症状。这些症状在严重程度方面有差异，并且通常在药物介入后是可逆的。这些症状包括但不局限于流感样发热、寒战/强直、恶心、荨麻疹、头痛、支气管痉挛、血管性水胂。对本发明的疾病治疗方法来说，可能需要使输注反应达到最小。因此，本发明的另一方面是通过给予人源化CD20结合抗体而披露的治疗疾病的方法，其中抗体同用Rituxan⑧治疗比较起来具有降低的或不具有依赖于补体的细胞毒性，并且导致与输注相关的症状的减少。在一个实施方式中，人源化CD20结合抗体是2H7.vl16。取决于所要治疗的适应症以及本领域熟练医师所熟悉的与规定剂量有关的因素，本发明的抗体将以有效治疗适应症并使毒性与副作用减至最小的剂量被给药。对于治疗CD20阳性癌症或自身免疫病来说，治疗有效的剂量在大约250mg/mS至大约400mg/m2或500mg/ml范围内，优选地大约250-375mg/m2。在一个实施方式中，剂量范围是275-375mg/m2。在治疗CD20阳性B细胞肿瘤的一个实施方式中，抗体以300-375mg/n^的范围给药。对于治疗患B细胞淋巴瘤例如非何杰金氏淋巴瘤的病人而言，在特定的实施方式中，本发明的抗CD20抗体与人源化抗CD20抗体将以10mg/kg或375mg/m2剂量给予人类患者。对于治疗NHL来说，一个给药法是在治疗第一周以10mg/kg剂量给予一次剂量的抗体组合物，继之以二周间隔，然后给予第二次剂量的相同量的抗体。通常，NHL病人在一年内接受一次象这样的治疗，但是一旦淋巴瘤复发，象这样的治疗可以被重复。在另一个给药法中，治疗低级NHL的病人接受四周一种型式的人源化2H7，优选地vl6(375mg/m2每周)，随后在第五周进行三个附加疗程的抗体加标准CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)或CVP(环磷酰胺、长春新碱、强的松)化疗，其每三周给药，共三个周期。对于治疗类风湿性关节炎而言，在一个实施方式中，人源化抗体的剂量范围是125mg/m、相当于大约200mg/每剂)至600mg/m2,分成两剂，例如第一剂200mg在第一天给药，继之以在第15天给予第二剂量200mg。在不同实施方式中，剂量是250mg/每剂、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg。在治疗疾病时，如在该疾病领域熟练的医师所决定的，本发明的CD20结合抗体可以长期或者间歇地给予病人。静脉内输注或皮下给药可使病人感觉到不利反应例如发热、寒战、烧灼感、无力和头痛。为緩和或使这样的不利反应达到最小，病人可接受抗体的初始调制剂量(initialconditioningdose),继之以治疗剂量。调制剂量可以比治疗剂量低，以调节病人使其耐受较高剂量。絲途径根据已知方法将CD20结合抗体给予人类病人，例如通过静脉内给药，例如以丸剂(bolus)或通过在一段时期内的连续输注，经过皮下、肌肉、腹膜内、脑脊膜内、关节内、滑膜内、鞘内、或吸入途径，通常经过静脉内或皮下给药。在一个实施方式中，人源化2H7抗体经过静脉内输注给药，以0.9%氯化钠溶液作为输注载体。在治疗上面描述的B细胞肺瘤时，病人可以用本发明的CD20结合抗体与一或多种治疗剂例如化疗剂一起用多药物疗法加以治疗。CD20结合抗体可以与化疗剂同时、序贯地或者交替地给药，或在用其它治疗不反应之后进行联合治疗。淋巴瘤治疗的标准化学疗法包括环磷酰胺、阿糖胞苷、美法仑、与米托蒽醌加美法仑。CHOP是治疗非何杰金氏淋巴瘤最常见的化学疗法。以下是用于CHOP疗法的药物环磷酰胺(商品名Cytoxan,neosar);阿霉素(亚德里亚霉素/羟基亚德里亚霉素)；长春新碱(Oncovin);与氢化泼尼松(有时称为Deltasone或Orasone)。在一个具体的实施方式中，CD20结合抗体与下列化疗剂中的一个或多个联合给药至需要其的病人阿霉素、环磷酰胺、长春新碱与氢化泼尼松。在特定的实施方式中，患淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤)的病人用本发明的抗CD20抗体与CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)疗法联合治疗。在另一个实施方式中，癌症病人可以用本发明的人源化CD20结合抗体与CVP(环磷酰胺、长春新碱与强的松)化疗联合治疗。在特定的实施方式中，患CD20阳性NHL的病人用人源化2H7.vl6与CVP结合进行治疗。在治疗CLL的特定实施方式中，CD20结合抗体与用氟达拉滨与环磷酰胺中的一个或两个进行的化学疗法联合给药。在治疗上面描述的自身免疫病或自身免疫相关病症中，病人可以用本发明的CD20结合抗体与第二治疗剂，例如免疫抑制剂，例如在多药物疗法中联合治疗。CD20结合抗体可以与免疫抑制剂同时、序贯地或者交替地给药，或在不反应时与其它疗法联用。免疫抑制剂可以以现有技术中所披露的相同或较少剂量给药。优选的附加免疫抑制剂将取决于许多因素，包括所治疗的疾病种类以及病人的病史。在此用于附加治疗的"免疫抑制剂，，指抑制或掩蔽病人的免疫系统的物质。象这样的药剂将包括抑制细胞因子生产、下调或抑制自身抗原表达、或掩蔽MHC抗原的物质。象这样的药剂的例子包括类固醇例如糖皮质激素，例如强的松、甲基强的松龙、与地塞米松、2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利4,665,077)、咪唑^琉嘌呤(或环磷酰胺，如果有对咪唑^/票呤的副反应)；溴隐亭；戊二醛(掩蔽MHC抗原，如美国专利4，120，649所描述)；针对MHC抗原与MHC片段的抗特应抗体；环孢菌素A;细胞因子或细胞因子受体拮抗剂包括抗干扰素Y，(3，或a抗体；抗肿瘤坏死因子a抗体；抗肿瘤坏死因子p抗体；抗白介素-2抗体与抗IL-2受体抗体；抗L3T4抗体；异源的抗淋巴细胞球蛋白；泛T抗体，优选地抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；包含LFA-3结合结构域的可溶性肽(W090/08187,公开日7/26/90);链激酶；TGF-(3;链道酶；来自宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脱氧精胍菌素；雷帕霉素；T细胞受体(美国专利5,114，721);T细胞受体片l殳(Offneretal.,Science251:430-432(1991);WO90/11294;与WO91/01133);与T细胞受体抗体(EP340,109)例如T10B9。为了治疗类风湿性关节炎，病人可以用本发明的CD20抗体结合下述药物中的任何一个或更多进行治疗DMARDS(减轻病症的抗风湿病药物(例如氨曱喋呤)，NSAI或NSAID(非类固醇类抗炎药物)，HUMIRATM(adalimumab;AbbottLaboratories),ARAVA(来氟米特)，REMICADE(infliximab;CentocorInc.ofMalvern,Pa),ENBREL(etanercept;Immimex，WA):COX-2抑制剂。通常用于RA的DMARD是hydroxydoroquine、sulfasalazine、氨曱喋呤、来氟米特、依那西普、英夫利昔单抗、咪唑硫嘌呤、D-青霉胺、Gold(口服)、Gold(肌肉)、二曱胺四环素、环孢菌素、葡萄球菌蛋白A免疫吸附。阿达木单抗(Adalimumab)是与TNFa结合的人单克隆抗体。英夫利昔单抗(Infliximab)是与TNFa结合的嵌合单克隆抗体。依那西普(etanercept)是一"免疫粘附素"融合蛋白，包括人75kD(p75)肿瘤坏死因子受体(TNFR)的细胞外配体结合部分连接至人IgGl的Fc部分。对于RA的常规治疗，参见例如,"GuidelinesForthemanagementofrheumatoidarthritis，,,arthritis&Rheumatism46(2):328-346(2002年2月)。在一特定的实施方式中，RA病人用本发明的CD20抗体联合氨曱喋呤(MTX)治疗。示例性的MTX剂量为大约7.5-25mg/kg/周。MTX可口服和皮下给药对于治疗强直性脊柱炎、牛皮癣关节炎与克朗氏病而言，病人可以用本发明的CD20结合抗体与例如Remicade(infliximab;来自CentocorInc.,Malvern,Pa),ENBREL(etanercept;Immunex,WA)联合治疗。对于SLE的治疗包括高剂量皮质类固醇和/或环磷酰胺(HDCC)。对于治疗牛皮癣而言，可以给予病人CD20结合抗体结合局部治疗，例如局部类固醇、蒽林、卡泊三烯、氯氟美松与他佐罗汀，或结合氨曱喋呤、类4见黄醇、环孢菌素、PUVA与UVB治疗。在一个实施方式中，牛皮癣病人用CD20结合抗体顺序处理或者同时用环孢菌素处理。药物制剂根据本发明使用的CD20结合抗体的治疗制剂通过以冻干制剂或水溶液的形式混合具有所需纯度的抗体和任选药学上可接受的载体、赋形剂或稳、定剂(Remington'sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.(1980))用于储存而制备。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度对受体无毒性，并包括緩沖剂例如磷酸盐，柠檬酸盐，及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和曱硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基千基氯化铵；氯化己烷双胺；笨扎氯铵，笨索氯铵；酚、丁醇或苯曱醇；烷基对羟基苯曱酸酯如曱基或丙基对羟基苯曱酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间曱酚)；4氐分子量多肽(少于约IO个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它糖包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA;糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)和/或非离子表面活性剂如TWEEN,PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。示例性的抗CD20抗体制剂在W098/56418中描述，在此特别地引入作为参考。另一种制剂是液体多剂量制剂，包含40mg/mL抗CD20抗体、25mM醋酸盐、150mM海藻糖、0.9%苯曱醇、0.02。/。pH5.0的聚山梨酸酯20，在2-8。C最短保存期限两年。另一感兴趣的抗CD20制剂包含溶解在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨酸酯80与灭菌注射水中的10mg/mL抗体，pH6.5。另一水性药物制剂包含大约pH4.8至大约pH5.5、优选地pH5.5的10画30mM乙酸钠、含量大约0.01-0.1%v/v的聚山梨酸酯作为表面活性剂、含量大约2-10%w/v的海藻糖与作为防腐剂的苯曱醇(U.S.6，171,586)。适宜于皮下给药的冻干制剂在WO97/04801中描述。象这样的冻干制剂可以用合适的稀释剂重新配制成高蛋白浓度溶液，并且重新配制的制剂可皮下给药至在此将要#1治疗的哺乳动物。人源化2H7变体的一个制剂是12-14mg/mL抗体，溶解在10mM组氨酸、6%蔗糖、0.02%聚山梨酸酯20中,pH5.8。在一个具体的实施方式中，2H7变体并且特别地是2H7.vl6，以20mg/mL抗体溶解在10mM组氨酸硫酸酯、60mg/mL蔗糖、0.2mg/mL聚山梨酸酯20与灭菌注射水中，pH5.8的形式配制。制剂在此也可包含特定适应症所需的多于一种活性化合物，优选地是那些具有不对彼此产生不利影响的互补活性的化合物。例如，可能需要进一步提供细胞毒药剂、化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的药剂例如环孢菌素，或作用于结合T细胞的抗体的药剂例如结合LFA-1的药剂)。象这样的其它药剂的有效量取决于制剂中存在的抗体量、疾病或紊乱或治疗的种类、以及上面所讨论的其它因素。这些通常以相同剂量、和经由在此所描述的给药途径、或在此以前所使用的剂量的大约1-99%而使用。活性成分也可以在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球粒、微乳剂、纳米颗粒与纳米胶嚢)中，或者在粗乳状液中捕捉在微胶嚢中，所述微胶囊例如通过凝聚技术或界面聚合作用制备，例如，分别是羟甲基纤维素或明胶微胶嚢与聚异丁烯酸甲酯微胶嚢。这一技术在Remington'sPharmaceuticalSciences,16thedition,Oslo,A.,Ed.,(1980)中披露。可以制备緩释制剂。合适的緩释制剂的例子包括含拮抗剂的固态疏水聚合物的半渗透性基质，其中基质是以成形物品的形式，例如薄膜或微嚢剂。緩释基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸)、或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利3,773,919)、L-谷氨酸与乙基-L-谷氨酸的共聚物、非可降解乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物例如LUPRONDEPOTTMC由乳酸-羟基乙酸共聚物与醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球粒)、与聚-D-(-)-3-羟丁酸。用于体内给药的制剂必须是无菌的。这通过经由无菌过滤膜过滤而很容易地完成。制品和试剂盒本发明的另一实施方式是一种制品，包含对治疔自身免疫病与相关病症和CD20阳性癌症例如非何杰金氏淋巴瘤有用的物质。制品包含容器和标签或包装说明书，该标签或包装说明书在容器上或与容器相关。合适的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等等。容器可能是由各种材料形成，例如玻璃或塑料。容器容纳对治疗该病症有效的组合物，并且可具有无菌进入孔(例如容器可以是具有可被皮下注射针穿透的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中至少一种活化剂是本发明的CD20结合抗体。标签或包装说明书指示该组合物用于治疗该特定病症。标签或包装i兌明书将进一步包含将抗体组合物给药病人的指示。包装说明书指通常包括在治疗产品商业包装中的指示，该指示包含有关适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或关于使用象这样的治疗产品的警告的信息。在一个实施方式中，包装说明书指示该组合物用于治疗非何杰金氏'淋巴瘤。另外，该制品可进一步包含第二容器，该容器包含药学上可接受的緩冲液，例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐緩沖盐水、林格氏液与右旋糖溶液。其可进一步包括从商业与用户角度需要的其它材料，包括其它緩沖液、稀释剂、滤器、针头与注射器。也提供用于各种用途的试剂盒，例如用于B细胞杀伤试验、作为细胞程序死亡试验的正对照、用于从细胞纯化或免疫沉淀CD20。为了分离和纯化CD20，试剂盒可包含偶联至珠(例如琼脂糖i朱)的抗CD20抗体。可提供试剂盒，该试剂盒包含用于体外，例如在ELISA或者蛋白质印迹中检测与定量CD20的抗体。如同制品一样，试剂盒包含容器，和在容器上或与容器相关的标签或包装说明书。容器容纳包含本发明的至少一个抗CD20抗体的组合物。可包括额外的容器，该容器包含例如稀释剂和緩冲液、对照抗体。标签或包装说明书可提供对组合物的描述，以及对预期体外或诊断用途的指示。猕猴CD20本发明还提供分离的核酸，该核酸包含如图19所示的猕猴CD20的核苷酸序列SEQIDNO.:24。在一个实施方式中，核酸是cDNA。在一个实施方式中，编码猴CD20的核酸位于用于在宿主细胞中表达的表达载体中。表达载体中的SEQIDNO.:24的核苷酸序列可操作地连接至表达控制序列，例如启动子、或启动子与增强子。表达控制序列可以是通常与猕猴CD20基因相关的天然序列，或者是对该基因异源的序列。还提供分离的多肽，该多肽包含猕猴CD20的氨基酸顺序[SEQIDNO.25;图19和20]，以及包含猕猴CD20核酸的宿主细胞。在一个方面，宿主细胞是真核细胞，例如CHO细胞。也考虑包含猕猴CD20氨基酸序列或序列片段的融合蛋白。实验实施例实施例12H7抗CD20鼠单克隆抗体的人源化鼠抗人CD20抗体2H7(在这里也称为m2H7，m指鼠的)的人源化在一系列定点诱变步骤中进行。鼠2H7抗体可变区序列和小鼠V与人C的嵌合2H7已被描述，见例如美国专利5，846,818与6，204，023。通过将鼠2H7可变区的氨基酸序歹Q(披露在U.S.5,846，818中)与已知抗体的序列(Kabatetal.，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,Ed.5.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991))进行比较，而筌别2H7的CDR残基。基于序列高变性(Kabatetal.,上文)定义轻与重链的CDR区域，并分别显示于图1A与图1B。利用合成寡核苷酸(表1),用定点诱变(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.82:488-492(1985))将所有六个鼠2H7CDR区域引入包含在质粒pvx4上包含的相应于共有序列VkI、VHin(vlk亚群i、vH亚群in)的完整人Fab框架(图2)。噬菌粒pVX4(图2)被用于诱变以及用于F(ab)s在大肠杆菌中的表达。pVX4以pb0475(Cunninghametal.，Science243:1330-1336(1989))的衍生物、谨菌粒pb0720为基础，包含一DNA片段，该片段编码人源化的共有K亚群I轻链(VLKl-CL)和人源化的共有亚群III重链VHIII-CH1抗IFN-a(干扰素-ot)抗体。pVX4还具有碱性磷酸酶启动子和Shine-Dalgamo序列，两者均来源于另一以前描述过的以pUC119为基础的质粒pAK2(Carteretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992))。在编码F(ab)轻与重链DNA之间引入唯一的Spd限制性位点。抗IFN-a重与轻链中的前23个氨基酸是StII分泌信号序列(Changetal.,Gene55:189-196(1987))。为了构建2H7的CDR交换型式(CDR-swapversion)(2H7.v2)，在包含脱氧尿苦的pVX4模板上进行定点诱变；抗IFN-a的所有六个CDR都换成小鼠2H7CDR。所得到的分子称为人源化的2H72型(2H7.v2)或2H7的"CDR交换型式，，；其具有图1A与1B所示的带有共有人FR残基的m2H7CDR残基。人源化的2H7.v2被用于进一步人源化。表1显示被用来生成重链与轻链中每一鼠2H7(m2H7)CDR的寡核苷酸序列。例如，CDR-H1寡核香酸被用来再生成m2H7重链CDRl。CDR-H1、CDR-H2与CDR-H3分别指重链CDR1、CDR2、与CDR3;类似地，CDR-L1、CDR-L2与CDR-L3指轻链CDR中的每一个。CDR-H2中的取代用两个寡核苷酸，CDR-H2A与CDR-H2B，在两个步骤中进行。表1用于将鼠2H7CDR的CDR交换构建入pVX4中的人框架的寡核香酸。在被每一寡核苷酸改变的残基下划线。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table>CATTG(SEQIDNO.31)CDR-L2AACTACTGATTTACGCTCCATCGAACCTCGCGTCTGGAGTCC(SEQIDNO.32)CDR-L3TATTACTGTCAACAGTGGAGCTTCAATCCGCCCACATTTGGACAG(SEOIDNO.33)为与人源化的构建物进行比较，使用合成寡核普酸、经由定点诱变(Kunkel，上文)构建表达嵌合2H7Fab(包含鼠Vl和Vh結枸域，和人Cl与Cw结构域)的质粒，以将鼠框架残基引入2H7.v2。所得到的质粒构建物序列示于图3，该构建物用于表达称为2H7.v6.8的嵌合Fab。Fab的每一编码链具有如上面为pVX4(图2)所描述的23个氨基酸的StII分泌信号序列。基于鼠2H7框架残基与人VkI，VhIII共有框架(困1A与1B)和先前人源化的抗体(Carteretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285-4289(1992))进行的序列比较，通过定点诱变将几个框架突变引入2H7.v2Fab构建物。这些突变导致某些人共有框架残基改变成在鼠2H7框架中发现的那些残基，所述改变在那些可能影响CDR构型或抗原接触的位点发生。型式3包含VH(R71V，N73K)，型式4包含Vh(R71V)，型式5包含Vh(R71V，N73K)和Vl(L46P),型式6包含Vh(R71V,N73K)和Vl(L46P,L47W)。如下述在大肠杆菌中表达与纯化m2H7抗体的人源化与嵌合Fab型式。质粒被转化入大肠杆菌抹XL-1Bue(Stratagene,SanDiego,CA)用于制备双链DNA与单链DNA。对于每一变体，使用双脱氧核苷酸法(Sequenase，，U.S.BiochemicalCorp.)对轻与重链进行完全测序。质粒被转化入MM294的衍生物、大肠杆菌抹16C9，铺于含5吗/ml羧千青霉素的LB板上，选择用于蛋白表达的单一菌落。单个菌落生长在5mlLB-100吗/ml羧千青霉素上，37°C5-8小时培养。5ml培养物被加至500mlAP5-100吗/ml羧千青霉素中，并允许在4L带障板的摇瓶中在37C生长16小时。AP5培养基包括1.5g葡萄糖，11.0HycaseSF，0.6g酵母抽提物(经过检验的)，0.19g无水MgS04,1.07g丽4Cl，3.73gKCl，1.2gNaCl，120ml1M三乙醇胺，pH7.4,加水至1L，然后通过0.1pMSealkeen过滤器无菌过滤。通过在1L离心瓶(Nalgene)中在3000xg离心收获细胞，并且除去上清液。冰冻1小时后，沉淀小丸被再悬浮在25ml冷的10mMMES-10mMEDTA，pH5.0(緩沖液A)。加入250pl0.1MPMSF(Sigma)以抑制蛋白质水解，并且力口入3.5ml10mg/ml鸡蛋白溶菌酶(heneggwhitelysozyme)(Sigma)储存液，以帮助细菌细胞壁溶解。水上轻轻摇动l小时后，样品在40，000xg离心15分钟。上清液用緩沖液A加至体积50ml,并且加样至用緩沖液A平衡的2mlDEAE柱上。然后将流出物(flow-through)上样至用緩冲液A平衡的G蛋白-琼脂糖CL-4B(Pharmacia)柱(0.5ml柱床体积)。柱子用10ml緩沖液A洗，用3ml0.3M甘氨酸pH3.0洗脱入1.25mllMTris,pH8.0中。然后用Centricon-30(Amicon)将F(ab)緩冲液更换入PBS，并且浓缩至终容积0.5ml。所有F(ab)的SDS-PAGE凝胶均进行电泳以保证纯度，每个变体的分子量用电喷射质谱法证实。在以细胞为基础的ELISA结合试验中(如下所述)，包括嵌合2H7Fab在内的Fab与CD20的结合难以检测。因此，2H7Fab型式被重新4各式化(reformatted)成全长IgGl抗体，以进行试验和进一步诱变。通过将嵌合2H7(v6.8)Fab的V^与Vh結枸域和人源化Fab型式2至型式6亚克隆至先前描述过的用于哺乳动物细胞表达的pRK载体(Gormanetal.，DNAProt.Eng.Tech.2:3(1990))，构建表达全长IgG的质粒。简要地说，每个Fab构建物用五co/V与5/;I消化以切除VL片段，该片段被克隆入质粒pDRl的五coiV/5/pI位点(图4)用于完整轻链(VL-CL结构域)的表达。另夕卜，每个Fab构建物用尸v"TI与j/7al消化以切除VH片段，该片段被克隆入质粒pDR2的尸vwIIA4;al位点(图5)用于完整重链(VH-CH广铰链-CH2-CH3结构域)的表达。对于每个IgG变体，通过将表达轻链的质粒与表达重链的质粒共转染入用腺病毒转化的人胚肾细胞系293(Grahametal.，J.Gen.Virol.，36:59-74，(1977)),进行瞬时转染。简要地说，在转染的前一天将293细胞分瓶，并且铺于含血清的培养基上。第二天，加入以磷酸钙沉淀制备的双链DNA,继之以pAdVAntageTMDNA(Promega，Madison,WI)，细胞在37°C孵育过夜。细胞在无血清培养基中培养，在4天之后收获。用蛋白质A-琼脂糖CL-4B从培养物上清液纯化抗体，然后緩沖液更换入10mM琥珀酸钠、140mMNaCl，pH6.0,并用Centricon-10(Amicon)浓缩。用定量的氨基酸分析测定蛋白质浓度。为了测量对CD20抗原的相对结合亲合力，发展出以细胞为基础的ELISA试验。将人B类淋巴母WIL2-S细胞(ATCCCRL8885,AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MD)在补充有2mML-谷氨酰胺、20mMHEPES,pH7.2与10。/。热灭活的胎牛血清的RPMI1640中、在湿润的5%C02培育箱中生长。细胞用含1%FBS的PBS(分析緩冲液)洗，以250-300,000细胞/孔接种于96孔圓底平板上(Nunc,Roskilde,Denmark)。向板中加入溶于分析緩冲液的两倍连续稀释的标准液(15.6-1000ng/ml的2H7v6.8嵌合的IgG)与三倍连续稀释的样品(2.7-2000ng/ml)。将平板埋在水中，孵育45分钟。为了除去未结合抗体，向孔中加入O.lmL分析緩沖液。将平板离心，除去上清。细胞再用0.2mL分析緩冲液洗两次。通过向平板中加入过氧化物酶偶联的山羊抗人Fc抗体(JacksonImmunoResearch,Grove,PA)，检测与平板结合的抗体。孵育45分钟后，如以前所述洗细胞。板中加入TMB底物(3，3',5,5'-四曱基联苯胺；Kirkegaard&PerryLaboratories,Gaithersburg,MD)。力口入1M磷酸以停止反应。用四参数非线性回归曲线拟合程序(KaleidaGraph,Synergysoftware,Reading,PA)拟合滴定曲线。测定滴定曲线中点的吸收率(中点-OD)确定标准物的相应浓度。然后测定每个变体在这一中点OD所对应的浓度，标准物浓度被每个变体的浓度除。因此所得数值是每个变体的结合相对于标准的比率。相对亲合力(当量浓度)在实验间的标准偏差通常为+/-10%。如表2所示，与嵌合2H7(v.6.8)相比，CDR交换变体(CDR-swapvariant)(v.2)的结合被极度降低。然而，型式3至6显示结合改善。为了测定将结合亲合力恢复至嵌合2H7的结合亲合力所需突变的最小数目，通过定点诱变构建额外的突变与突变组合，以生成变体7至17,如表2中所指示。特别地，这些包括Vh突交A49G、F67A、I69L、N73K和L78A;与VL突变M4L、M33I和F71Y。型式16和17显示最好的相对结合亲合力，在嵌合型式的2倍范围内，型式16和17之间没有显著差异(s.d尸+/-10%)。为了使突变数目最少，因此选择型式16作为人源化形式用于额外表征，该型式仅具有4个由人框架残基变为鼠框架残基的突变(表3)。表2.使用以细胞为基础的ELISA，将人源化的2H7IgG变体和CD20的相对结合亲合力与嵌合2H7和CD20的相对结合亲合力进行比较。相对结合用嵌合2H7的浓度比等量结合所需变体浓度来表示；因此比值<1指示对变体亲合力较弱。相对亲合力测定中的标准偏差平均为+/-10%。可变结构域中的框架取代系根据Kabat的编号系统(Kabatetal.,上文)相对于CDR-交换型式。<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表3用来在人源化2H7型式16(2H7.vl6)中构建突变Vh(A49QR71V，N73K)与V!XL46P)的寡核香酸序列。带下划线的密码子编码所指示的氨基酸取代。对于Vh(R71V,N73K)与VL(L46P),寡核苷酸以有意义链显示，因为这些被用于在Fab模板上诱变，而对于VH(A49G)，寡核苷酸以反义链显示，因为该链被与pRK(IgG重链)模板一起使用。型式16的蛋白质序列示于图6和图7。<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>实施例22H7的抗原结合决定簇(互补位)在2H7.vl6或2H7.vl7中进行丙氨酸取代(Cunningham&Wells,Science244:1081-1085(1989)以检验抗体的个别侧链在与CD20结合中的作用。在293细胞中从pDRl与pDR2载体表达IgG变体，纯化，并如上述分析相对结合亲合力。几处丙氨酸取代导致WIL-2S细胞上与CD20相对结合的显著降低(表4)。表4利用以细胞为基础的ELISA(WIL2-S细胞)测量得到的丙氨酸取代对人源化2H7.vl6的CDR区域的效应。相对结合用2H7.vl6亲本的浓度比等量结合所需的变体浓度来表示，因此比值<1指示变体具有较弱亲合力；比值>1指示变体具有较高亲合力。相对亲合力测定中的标准偏差平均为+/-10%。可变结构域中的框架取代系根据Kabat的编号系统(Kabatetal.,上文)相对于2H7.v16。NBD的意思是没有可检测的结合。型式45中的两个数字来自于各自独立的实验。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>实施例32H7CDR区域内部的附加突变也测试了额外残基的取代以及通过丙氨酸扫描被鉴定为是重要的CDR位置的取代的结合。几种变体组合，特别是v.96,似乎比v.l6结合更紧密。表5使用以细胞为基础的ELISA(WIL2-S细胞)测量在人源化2H7.vl6的CDR区域中的突变组合与非丙氨酸取代的效应。对CD20的相对结合用2H7.vl6亲本的浓度比等量结合所需的变体浓度来表示，因此比值<1指示变体具有较弱亲合力；比值>1指示变体具有较高亲合力。相对亲合力测定中的标准偏差平均为+/-10%。可变结构域中的框架取代系根据Kabat的编号系统(Kabatetal.,上文)相对于2H7.vl6。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>实施例4在框架人源化取代位点的突变在人源化期间发生改变的框架位置中附加残基的取代也在2H7.vl6背景中被测试。特别地，在Vl(P46)与VH(G49，V71,与K73)中进行既不在鼠2H7亲本中也不在人共有框架中存在的可替换的框架取代。这些取代通常导致相对结合的极子的改变(表6)，指示在这些位置的框架残基中存在一些灵活性。对于2H7.vl6背景的突变显示IgG变体。相对结合用2H7.v6.8嵌合体的浓度比等量结合所需的变体浓度来表示，因此比值<1指示变体具有较弱亲合力；比值>1指示变体具有较高亲合力。相对亲合力测定中的标准偏差平均为+/-10%。可变结构域中的框架取代系根据Kabat的编号系统(Kabatetal.，上文)相对于2H7.vl6的。(*)用2H7.vl6作为标准比较物分析的变体；相对值校正至嵌合体的值。<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>(*)用2H7.vl6作为标准比较物分析的变体；相对值校正至嵌合体的值。实施例5具有增强的效应子功能的人源化2H7变体由于2H7可通过补体依赖的细胞毒性(CDC)和抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)介导B细胞溶解，我们设法产生具有改善的CDC与ADCC活性的人源化2H7.v16的变体。其它抗体的Fc区域内的某些残基突变也已经被描述(Idusogieetal.,J.Immunol.166:2571-2575(2001))，用于通过增强与补体成分Clq的结合而改善CDC。用于改善ADCC的某些突变也已被描述>(Shieldsetal.,丄Biol.Chem.276:6591-6604(2001);Prestaetal.,Biochem.Soc.Trans.30:487-490(2002)),所述改善是通过增强IgG与激动性Fcy受体的结合、并降低IgG与抑制性FcY受体的结合而达到的。特别地，三种突变已被鉴别具有改善的CDC与ADCC活性如所描述的(Idusogieetal.,上文(2001);Shieldsetal.,上文)，S298A/E333A/K334A(在这里也称为三重丙氨酸突变体或变体；Fc区域的编号方式才艮据EU编号系统；Kabatetal.，上文)。为了增强2H7的CDC与ADCC活性，构建2H7Fc的三重丙氨酸突变体。用突变S298A/E333A/K334A也已经产生抗HER2抗体4d5的人源化变体，称为4D5FcllO(即抗pl85HER2IgGl(S298A/E333A/K334A);ShieldsetaL上文)。编码抗体4D5Fc110的质粒p4D5FcllO(ShieWsetal.，上文)用与历w/ni消化，Fc片段(包含突变S298A/E333A/K334A)连接入2H7重链载体pDR2-v16的^al////w/in位点，产生pDR2-v31。31型完整重链的氨基酸序列示于图8。轻链与vl6的轻链相同。虽然IgGl抗体的Fc区域恒定区在一特定物种内相对保守，仍存在等位基因变异(综述见Lefranc与Lefranc,在"ThehumanIgGsubclasses:molecularanalysisofstructure,function,andregulation"中,pp.43-78,F.Shakib(ed.),PergammonPress,Oxford(1990))。表7Fc区域的取代对CD20结合的影响。与CD20的相对结合在对框架取代所进行的以细胞为基础的(WIL2-S)试验中加以测量。Fc突变(*)用EU编号方式(Kabat,上文)加以指示，并相对于2H7.vl6亲本。v.31的Fc区域中三个丙氨酸改变的组合被称作"FcllO"。用相对于2H7.vl6背景的突变显示IgG变体。相对结合用2H7.v6.8嵌合体的浓度比等量结合所需的变体浓度来表示；因此比值<1指示变体的亲合力较弱。相对亲合力测定中的标准偏差平均为+/-10%。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>实施例6稳定性增强的人源化2H7变体为了开发出治疗性蛋白质，需要选择在适当制剂緩冲液中，在氧化、脱胺或其它可影响产品质量的过程中保持稳定的变体。在2H7.vl6中，几个残基被鉴定为不稳定性的可能来源Vl(M32)与VH(M34，NIOO)。因此，突变被引入这些位点，用于与vl6进行比较。表8.被设计具有增强的稳定性和/或效应子功能的2H7变体在以细胞为基础的(WIL2-S)试验中对CD20的相对结合。用相对于2H7.vl6背景的突变显示IgG变体。相对结合用2H7.v6.8嵌合体的浓度比等量结合所需的变体浓度来表示；因此比值<1指示变体的亲合力较弱。相对亲合力测定中的标准偏差平均为+/-10%。可变结构域框架取代相对于2H7.vl6，并根据Kabat的编号系统，Fc突变(*)用EU编号方式(Kabatetal.，上文)指示。(**)用2H7.vl6测量的变体，作为标准比较物；相对值校正至嵌合体的值。基于先前报导过的突变(Idusogieetal.(2000);Idusogieetal.(2001);Shieldseta1.(2001)),附加的Fc突变与稳定性或亲合力增强的突变结合起来，以改变或增强效应子功能。这些改变包括实施例中所描述的S298、E333A、K334A;K322A,以降低CDC活性；D265A,以降低ADCC活性；K326A或K326W,以增强CDC活性；和E356D/M358L，以测试Fc区域异型改变(allotypicchange)的效果。这些突变均不导致CD20结合亲合力的显著变化。<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>(**)用2H7.vl6测量作为比较物的变体相对结合值校正至嵌合体的值为了测试稳定性突变对蛋白质降解率的影响，2H7.vl6与2H7.v73以12-14mg/mL配制在10mM组氨酸、6%蔗糖、0.02%聚山梨酸酯20,pH5.8中，在40。C孵育16天。所孵育的样品然后用离子交换层析分析电荷变体的改变、用大小排阻层析分析聚合与断裂、通过测试以细胞为基础的(WIL2-S)试验分析相对结合。结果(图9)显示，与2H7v.l6相比，2H7v.73具有4t高稳定性，这是通过在增加稳定性的条件下离子交换层析中主峰级分的丢失而检测的。在聚合、断裂或结合亲合力上未见明显差别。实施例7在WIL2-S细胞上抗体与CD20结合的Scatchard分析使用放射性同位素标记的2H7IgG测定2H7IgG变体与WIL2-S细胞结合的平衡离解常数(Kd)。IgG变体在CHO细胞中产生。Rituxai^(所有实验中均来自Genentech,S.SanFrancisco，CA)和小鼠2H7(BDPharMingen，SanDiego，CA)被用来与人源化变体比较。鼠2H7抗体也可从其它来源获得，例^口eBioscience与Calbiochem(均在SanDiego,CA)、AccurateChemical&ScientificCorp.(Westbury，NY)、Ancell(Bayport,應)、与Vinci-Biochem(Vinci,Italy)。所有稀释均在结合分析緩冲液(DMEM培养基，包含1%牛血清白蛋白、25mMHEPESpH7.2、与0.01%叠氮钠)中进行。将浓度为0.8nM的^I-2H7.vl6(用乳过氧物酶碘化了的)等分试样(0.025mL)分配入V形底96孔微分析板的孔中，加入冷的抗体的系列稀释物(0.05mL),并混合。然后加入WIL2-S细胞(0.025mL中60，000个细胞)。封闭板子，在室温下孵育24小时，然后在3,500RPM离心15分钟。然后吸出上清液，洗细胞沉淀团并离心。再次吸去上清液，细胞小团溶解在1NNaOH中，并转移至管中用于y计数。使用Ligand程序(McPherson，Comput.ProgramsBiomed.17:107-114(1983))对数据进行Scatchard分析(Munson与Rodbard，Anal.Biochem.107:220-239(1980))。如表9所示，结果表明人源化2H7变体的CD20结合亲合力类似于鼠2H7、结合亲合力类似于Rituxai^。基于上面表7所示结合，预期2H7.v31将具有与v.16非常类似的Kd。<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>实施例8补体依赖的细胞毒性(CDC)分析基本上如所描述的(Idusogieetal.，J.Immunol.164:4178-4184(2000);Idusogieetal.，J.Immunol.166:2571-2575(001))，分析2H7IgG变体介导WIL2-S细胞补体依赖的溶解的能力，该细胞是表达CD20的成淋巴细胞样(limphoblastoid)的B细胞系。抗体从O.lmg/mL贮存液中1:3连续稀释。向包含0.05mL正常人补体(Quidel,SanDiego,CA)溶液的96孔组织培养板中加入每一稀释的0.05mL等分试样。向这一混合物中加入0.05mL体积的50，000WIL2-S细胞。37。C孵育2小时后，加入0.05mLAlamarblue溶液(AccumedInternational,Westlake,OH)，在37°C再继续孵育18小时。将盖子从板上拿开，板子在定轨摇床上于室温下摇动15分钟。使用530nm激发滤光器和590nm发射滤光器读取相对焚光单位(RFU)。使用KaleidaGraph软件，通过将RFU拟合为每一抗体的浓度的函数计算EC50。结果(表10)显示人源化2H7抗体导致CDC令人惊奇的改善，v.73的相对效能类似于Rituxan,v.75比Rit親n⑧强出3倍，v.16比Rituxan⑧弱3倍。表10与Rituxan相比2H7抗体的CDC活性。数字>1表示CDC活性不如Rituxai^强，数字<1表示活性比Rituxar^更强。除那些用(*)指示的是短暂产生的以外，抗体产生自稳定的CHO系。<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>实施例9抗体依赖的细胞毒性(ADCC)分析基本上如所描述的(Shieldsetal.，J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001))，利用乳酸脱氬酶(LDH)读数，分析2H7IgG变体介导自然杀伤细胞(NK细胞)溶解WIL2-S细胞的能力，该细胞是表达CD20的成淋巴细胞样的B细胞系。NK细胞制备自用100mLPBS稀释的100mL肝素化的血液，该血液获得自已经为FcyRIII(又名CD16)(Koeneetal.,blood90:1109-111409-1114(1997))同种型的(isotyped)正常人供体。在这一实验中，NK细胞来自于对CD16杂合的人供体(F158/V158)。稀释的血液在15mL淋巴细胞分离介质(ICNBiochemical,Aurora,Ohio)上进行分层，在2000RPM离心20分钟。将层间分界面上的白细胞分配于4个干净的50mL管中，管里充满含15%胎牛血清的RPMI培养基。管子在1400RPM离心5分钟，弃去上清液。细胞小团重悬浮于MACS緩沖液(0.5。/oBSA,2mMEDTA)中，NK细胞用小珠(NK细胞分离试剂盒，130-046-S0"根据厂家的操作程序(MiltenyiBiotech，)纯化。NK细胞在MACS緩沖液中稀释至2xl06细胞/毫升。将分析培养基(F12/DMEM50:50无甘氨酸，lmMHEPES緩冲液pH7.2,青霉素/链霉素(100单位/mL;Gibco)，谷氨酰胺，与1%热灭活的胎牛血清)中的抗体系列稀释加至96孔圆底组织培养板中。WIL2-S细胞在分析緩冲液中稀释至浓度4xl0VmL。WIL2-S细胞(0.05mL每孔)在96孔板中与稀释抗体混合，在室温下孵育30分钟，让抗体与CD20结合(调理作用)。通过向每孔中加入0.1mLNK细胞起动ADCC反应。在对照孔中，加入2%TritonX-100。板子在37。C孵育4小时。释放的乳酸脱氢酶水平用细胞毒'I"生(LDH)斥企测i式剂盒G式齐寸盒#1644793，RocheDiagnostics，Indianapolis，Indiana)按照厂家指示进行测量。每孔加入O.lmLLDH显色剂，随后混合10秒。板子然后用铝箔覆盖，在黑暗中室温下孵育15分钟。然后读取490nm光密度，并通过被对照细胞中测得的总LDH除，来计算溶解百分比。溶解被绘制为抗体浓度的函数，四参数曲线拟合(KaleidaGraph)被用于判定EC50浓度。结果表明，人源化2H7抗体在ADCC方面活跃，v.31与v.75的相对功效比Rituxar^高20倍，v.16比Rituxan⑧强5倍，v.73比Rituxan⑧高几乎4倍。表11基于n实验，与2H7.vl6相比，2H7抗体对WIL2-S细胞的ADCC活性。(数值H表示比2H7.vl6效力较低，数值<1表示效力较强。)<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>进行额外的ADCC分析，以将2H7组合变体与Rituxar^比较。这些分析的结果显示，同Rituxar^比较，2H7.vl14和2H7.vl15的ADCC效力改善超过10倍(表12)。表12基于n实验，与Rituxai^相比，2H7抗体对WIL2-S细胞的ADCC活性。(数值>1表示比Rituxan⑧效力较低，数值<1表示效力较强。)<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>实施例10猕猴pilot研究中2H7变体的体内效应在正常雄性猕猴(Macacafascicularis)中测试瞬时转染CHO细胞所产生的2H7变体，以评定其体内活性。其它抗CD20抗体，例如C2B8(Rituxan⑧已显示具有在正常灵长类动物中消减B细胞的能力(Reffetal.,Blood83:435-445(1994))。在一项研究中，比较人源化2H7变体。在一项平行研究中，在猕猴中也测试了Rituxan。以下五个剂量组中，每组使用四只猴子(1)载体，(2)0,05mg/kghu2H7.v16，(3)10mg/kghu2H7.v16，(4)0.05mg/kghu2H7.v31，和(5)10mg/kghu2H7.v31。抗体以0、0.2、或20mg/mL浓度静脉内给药，总共两剂，一剂在研究的第一天，另一剂在第八天。给药的第一天指定为第l天，前一天指定为第-l天；恢复的第一天(对于每组中两个动物而言)指定为第11天。在第-19、-12、l天(给药前)，以及在第一次给药后第6、24、72小时收集血样。在第8天(给药前)、第10天(杀死每组两只动物前)和在第36和37天(对于恢复动物而言)取额外的样本。用FACS方法测定外周B细胞浓度，该方法计数CD3-ZCD40+细胞。通过如下门化(gating)策略在猴样品中获得CD3-CD40+B细胞在总淋巴细胞中的百分率。在前向散射/侧向散射点图上标记淋巴细胞群体以定义区域l(Rl)。使用R1中的事件，显示CD40和CD3标志物的荧光强度点图。荧光标记的同种型(isotype)对照被用来判定CD40和CD3阳性各自的截止点。结果指示2H7.vl6和2H7.v31能在10mg/kg剂量产生完全外周B细胞削减、并且在0.05mg/kg剂量产生部分外周B细胞削减(图11)。时间进程与在给药的第一个72小时期间测量得到的B细胞削减的程度在两种抗体间类似。对恢复动物的随后分析表明，同用2H7.vl6给药的动物比较起来，那些用2H7.v31处理的动物显示B细胞削减的持续时间较长。特别地，在用10mg/kg2H7.v16处理的恢复动物中，B细胞在第10天与第36天取样之间的某个时间显示实质性(substantial)的B细胞恢复。然而，对于用10mg/kg2H7.v31处理的恢复动物中，B细胞直到第36天与第67天之间的某个时间才显示恢复(图11)。这暗示，与2H7.vl6相比，2H7.v31完全削减的持续时间长出大约一个月。在猕猴研究中，低或高剂量未观察到毒性，总病理学(grosspathology)也是正常的。在其它研究中，在这些猴子中相隔两周i.v.给药两次后，Vl6直到所评估的最高剂量(l00mg/kgx2^200mg/m、2)仍被良好耐受。在猕猴中用2H7.vl6与Rituxai^比较所得到的数据暗示，CDC活性减少5倍对于效力并没有不利影响。具有强ADCC活性、但CDC活性降低的抗体在首次灌注反应方面可能比具有较强CDC活性的抗体具有更好的安全特性。实施例11具有增强的效应子功能的岩藻糖缺陷的2H7变体抗体正常CHO与HEK293细胞将岩藻糖加至IgG寡糖至高程度(97-98%)。来自血清的IgG也是高度岩藻糖基化的。DP12和Lecl3被用来产生本研究的抗体，DP12是具有岩藻糖基化能力的无二氢叶酸还原酶缺陷的(DHFR-)CHO细胞系，Lecl3是蛋白质岩藻糖基化缺陷的细胞系。CHO细胞系Pro-Lecl3.6a(Lecl3)获得自犹太高等学校大学阿尔伯特爱因斯坦医学院PamelaStanley教授。亲本系是Pro-(脯氨酸营养缺陷型)和Gat-(甘氨酸、腺苷、胸苷营养缺陷型)。CHO-DP12细胞系是CH0-K1细胞系的衍生物(ATCC弁CCL-61)，后者是二氢叶酸还原酶缺陷的，并且对胰岛素的需求降低。使用Superfect方法(Qiagen，Valencia,CA)用cDNA转染细胞系。使用噤呤霉素二盐酸化物(Calbiochem,SanDiego,CA)在10pg/ml浓度在生长培养基中选择表达转染的抗体的Lecl3细胞，所述生长培养基含有具有L-谷氨酰胺、核糖核苷与脱氧核糖核苷酸的MEMa培养基(GIBCO-BRL,Gaithersburg,MD)、补充有10%灭活FBS(GIBCO)、10mMHEPES、与IX青霉素/链霉素(GIBCO)。在无GHT的包含Ham'sF12生长培养基中类似地选择CHO细胞无甘氨酸、有NaHC03、补充有5%FBS的低葡萄糖DMEM(GIBCO)、10mMHEPES、2mML-谷氨酰胺、IXGHT(甘氨酸、次黄嘌呤、胸苷)与1X青霉素/链霉素。在两至三周之内形成菌落，混合起来用于进行扩增和蛋白质表达。细胞集合体最初以3乂106细胞/10厘米板的浓度接种，用于小批量蛋白质表达。一旦细胞生长至90-95%满板，便转移至无血清培养基中，并且在3-5天之后收集细胞上清液，在FcIgG与完整IgGELISA中测试以估计蛋白质表达水平。Lecl3与CHO细胞在转移至PS24生产培养基之前一天以大约8xl06细胞/15厘米板接种，所述PS24生产培养基补充有10mg/L重组人胰岛素与lmg/L微量元素。Lecl3细胞与DP12细胞在无血清生产培养基中保持3-5天。收集上清液，在150ml锥形管中通过离心作用使之澄清以除去细胞和碎片。加入蛋白酶抑制剂PMSF与抑肽酶(Sigma,StLouis，MO)，使用MWCO30过滤器(Amicon，Beverly，MA)在搅动的细胞上浓缩上清液5倍，然后使用G蛋白层析法(AmershamPharmaciaBiotech,Piscataway，NJ))立即纯化上清液。所有蛋白质均利用Centripriep-30浓缩器(Amicon)緩冲液更换入磷酸盐緩冲盐水(PBS)，并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。利用A280测定蛋白质浓度，并利用氨基酸组成分析验证。使用表达人源化2H7v16、2H7v.31的载体转染CHO细胞，并如所描述的进行选择。2H7v.16抗体保留有野生型Fc区域，而v.31(见上面实施例5，表7)的Fc区域中3个氨基酸发生改变(S298A、E333A、K334A)，导致对FcyRIIIa受体的高亲合力(Shieldsetal.J.Biol.Chem.276(9):6591-6604(2001))。转染和选择后，分离出细胞的单个集落，并评估蛋白质表达水平，产量最高的细胞进行氨曱喋呤选择以选择那些质粒拷贝数被扩增并且因此生产较高水平抗体的细胞。使细胞生长，转移至无血清培养基中7天，然后收集培养基，装载至A蛋白柱上，用标准技术洗脱抗体。使用测定完整抗体的Elisa测定抗体的最后浓度。使用Centripriep-30浓缩器(Amicon)将所有蛋白质缓冲液更换入磷酸盐緩冲盐水(PBS)并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。夭冬魔展遂凝的漆^#的差|^#勿的濃^席吸/逸筹飞/户^河fM^D/-rOF」j渗为Vf:使用Papacetal.，Glycobiology8,445-454(1998)的程序从重组糖蛋白上释放N-连接的寡糖。简要地说，96孔带有PVDF衬里的微滴定板(Millipore，Bedford,MA)用100(^1曱醇调理，通过在Millipore多屏幕真空歧管上施加真空使该曱醇透过PDVF膜。调理过的PVDF膜用3X250pl水洗。在所有洗涤步骤之间，通过向歧管轻轻施加真空^f吏孔完全排干。用还原和羧曱基化緩冲液(RCM)洗膜，所述緩冲液包含6M盐酸胍、360mMTris、2mMEDTA、pH8.6。将糖蛋白样品(50昭)加至各个孔中，再次轻轻施加真空使其透过PVDF膜，孔用2X50pl的RCM緩冲液洗。通过向每孔中加入O.IM二硫苏糖醇(DTT)溶液并将微滴定板在37。C孵育1小时来还原被固定化的样品。用真空除去DTT，孔用4x250jul水洗。通过添加50)ul的O.IM碘乙酸(IAA)溶液来羧曱基化半胱氨酸残基，所述碘乙酸溶液在1MNaOH中新鲜配制，并用RCM缓冲液稀释至O.IM。通过在室温下在黑暗中孵育30分钟完成羧甲基化。向板子施加真空以除去IAA溶液，孔用4x250pl净化水洗。通过添加100^1的1。/。PVP360(聚乙烯吡咯烷360，OOOMW)(Sigma)溶液并在室温下孵育1小时封闭PVDF膜。通过轻轻施加真空除去PVP-360溶液，孑L用4x250(il水洗。PNGaseF(NewEnglandBiolabs,Beverly,MA)消化溶液(在10mMTris醋酸盐中的25jul的25单位/ml溶液，pH8.4)被加入每孔中，消化在37。C进行3小时。消化之后，样品转移至500^1-微量离心管中，每个样品中加入2.5^1的1.5M乙酸溶液。酸化样品在室温孵育3小时以将寡糖从葡基胺转换成羟基形式。在MALDI-TOF质谱分析之前，所释放的寡糖用匀浆填充入压紧的反应管(USBiochemical,Cleveland,OH)的0.7ml床的阳离子交换树脂(以氢形式的AG50W-X8树脂)(Bio-Rad，Hercules,CA)脱盐。为了以阳性方式(positivemode)进行样品的MALDI-TOF质谱分析，将脱盐的寡糖(0.5jul等分试样)用0.5)il的2，5二羟苯曱酸基质(sDHB)上样至不锈钢輩巴(stainlesstarget),所述2,5二羟苯曱酸基质通过将2mg2,5二羟苯曱酸用溶解在lml乙醇/lmM氯化钠1:1(v/v)中的O.lmg的5-methoxyslicylicacid溶解而制备。样品/基质混合物用真空干燥。为了以负方式(negativemode)进行分析，将脱盐的N-连接的寡糖(0.5^11等分试样)与0.5^112，，4，，6，-三羟基乙酰苯基质(THAP)—起上样至不锈钢靶，所述2，，4，，6，-三羟基乙酰苯在l:3(v/v)乙腈/13.3mM柠檬酸铵緩冲液中制备。真空干燥样品/基质混合物，然后在分析之前让其吸收空气中的水分。所释放的寡糖在PerSeptiveBioSystemsVoyager-质谱仪上用MALDI-TOF进行分析。质谱仪在20kV以正性或负性方式用线状排列(linearconfiguration)并利用延迟提取(ddayedextraction)进行操作。使用1300的激光功率并以数据总和方式(240扫描)获得数据以改善信噪比。仪器用标准寡糖的混合物校准，并在质量分配前用19点Savitsky-Golay算法将数据变平滑(smoothed)。利用Caesar7.0数据分析软件包(SciBridgesoftware)得到质谱数据的整合。《#杀務(2V/^勿/6我伴该虑的勿應毒#试發如实施例9所描述进行ADCC试验。NK细胞与靶细胞(WIL2-S)的比例为4:1，试验进行4小时，如前面使用乳糖脱氢酶试验那样测量毒性。在添加NK细胞之前用所指示的抗体浓缩物调理靶细胞30分钟。所使用的Rituxan⑧抗体来自Genentech(S.SanFrancisco,CA)。图12显示代表性的ADCC试验的结果。结果表明，低岩藻糖基化的抗体比完全岩藻糖化的抗体更有效地介导NK细胞靶细胞杀伤。低岩藻糖基化抗体2H7v.31在介导靶细胞杀伤上最有效。这一抗体在较低浓度下有效，并能在较高浓度下比其它抗体介导更高比率的靶细胞杀伤。抗体活性如下Lecl3衍生的2H7v31〉Lec13衍生的2H7vl6〉Dp12衍生的2H7v31>Dpl2书亍生的2H7vl6〉或-Rituxan。附加蛋白质与糖的改变。比较Lecl3产生的与CHO产生的IgG中天然IgG上的糖，显示在半乳糖苦化程度上没有可明显察觉的差异，由此该结果可以完全归因于岩藻糖的存在或缺乏。实施例12具有体内增强的ADCC的岩藻糖缺陷2H7变体抗体本实施例描述了在表达人CD16[FcRIII]和人CD20的小鼠中，Lecl3产生的岩藻糖缺陷的人源化2H7变体包括v.l6与v.31与在DP12中产生的正常的岩藻糖基化的同类抗体相比，体内ADCC活性。/m0^org+/ma^6rg+wCD6^v、葳的,i人CD20转基因小鼠从人CD20BACDNA(Invitrogen，Carlsbad,CA)产生。基于人CD20表达的FACS分析筛选小鼠。HuCD20Tg+小鼠然后与huCD16Tg+mCD16一小鼠杂交以生成huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16一小鼠。经腹膜内注射将10至100|ug的每一2H7变体或Rituxan⑧给药给huCD20Tg+huCD16Tg+mCD16一小鼠。等量的同种型匹配的抗体以类似方式给药给负对照组动物。Vv鼠淋S勿應斜备来自全血、脾、淋巴结、与骨髓的小鼠淋巴细胞根据在"CurrentProtocolsinImmunology,JohnColigan、AdaKruisbeek、DavidMargulies编辑,EthanShevachandWarrenStrober，1994，，中所描述的标准程序制备。E4CS为、浙洗50万个细胞，重悬在100|Lil的FACS緩沖液中，该缓冲液是含1°/。BSA的磷酸盐緩冲盐水，包含5pl的染色或对照抗体。所有染色抗体，包括同种型对照，均获自PharMingen,SanDiego,CA。通过用Rituxan⑧与FITC-偶联的抗人IgGl第二抗体一起染色，评估人CD20表达。使用FACScan和CellQuest(BectonDickinsonImmunocytometrySystems,SanJose，CA)进行FACS分析。所有淋巴细胞用前和侧光散射确定，而所有B淋巴细胞用细胞表面上的B220的表达确定。在注射后第一周每天、并在此后每周通过分析外周B细胞计数和通过对脾、淋巴结和骨髓进行FACS分析hCD20+B细胞，来评估B细胞削减与恢复。监测所注射的2H7变体抗体的血清水平。这一体内试验的结果进一步证实了体外研究结果，即岩藻糖缺陷的2H7变体与野生型(在岩藻糖基化方面)糖基化同类抗体相比具有较高ADCC活性和较多的B细胞削减。实施例13细胞程序性死亡活性包括Rituxar^在内的抗CD20抗体已表明当^皮第二抗体或者通过化学方法净皮交耳关时可体外谏导细胞程序死亡(Shanetal.,Blood9:1644-1652(1998);Byrdetal.,Blood99:1038-43(2002);Pedersonetal.，Blood99:1314-19(2002))。当被化学交联时，鼠2H7二聚物诱导Daudi细胞的细胞程序死亡(Ghetieetal.，ProcNatlAcadSciUSA94:7509-14(1997))。鼠2H7抗体与第二抗体交联也诱导细胞程序死亡(Shanetal.,1998)。这些活性被认为是在生理上相关的，因为各种各样的机制可以导致体内与细胞表面CD20结合的抗CD20抗体的交联。利用第二交联抗体在体外细胞程序死亡试验中比较RhuMAb2H7.vl6[人源化2H7vl6;RhuMAb表示重组人单克隆抗体]与Rituxai^。表达CD20的人B淋巴细胞细胞系Ramos细胞(CRL-1596,ATCC，Manassas,VA)被用于测量抗CD20单克隆抗体rhuMAb2H7.vl6与Rituximab相对于负对照抗体Trastuzumab(Herceptin,Genentech，SouthSanFrancisco,CA)诱导细胞程序死亡的能力，所述诱导细胞程序死亡的能力通过膜联蛋白(Annexin)V染色与碘丙锭染料排斥(Vybrant⑧细胞程序死亡分析试剂盒，MolecularProbes,Seattle,WA)测量。Ramos细胞培养在包含10。/。胎牛血清(BiosourceInternational,Camarillo,CA)和2mML-谷氨酰胺(Gibco)的RPMI-1640培养基中。分析之前，细胞在新鲜培养基中洗两次，然后调整至细胞浓度2X1()6每毫升。细胞(150pL)被加至96孔分析板(BectonDickinson,PaloAlto，CA)中，板子包含150)iL的预先确定H量的对照IgGl、rhuMAb2H7.vl6或Rituximab、以及F(ab)'2山羊抗人Fc(PierceBiotechnology,Rockford，IL)。最终的IgG浓度为100、10、1.0、0.1、0.01与O.OOlnM，F(ab)，2山羊抗人Fc抗体浓度被设置成各个样品抗体浓度的两倍。每次稀释都设置成一式三份。在37。C孵育24小时后，细胞用PBS洗两次，然后根据厂家建议用膜联蛋白V与碘丙锭染色。Ramos细胞的染色才莫式〈吏用FACscan流式细月包4义(BectonDickinson,SanJose，CA)通过流式细胞计分析，在10秒的时间内收集数据。使用CellquestPro软件(BectonDickinson)对数据还原。Ramos细胞对于(l)膜联蛋白V染色、(2)膜联蛋白V与捵丙锭双染色呈阳性，并且(3)计数未染色的活细胞的数目，并利用KaleidaGraph软件(Synergysoftware,Reading,PA)纟会图。当与抗人Fc交联和同无关IgG1对照抗体比较时，rhuMAb2H7.v16和Rituximab两者都诱导Ramos细胞的细胞程序死亡(图13-15)。rhuMAb2H7的细胞程序死亡活性稍低于Rituximab。在交联rhuMAb2H7、Rituximab和对照IgGl抗体的浓度为10nM时，膜联蛋白V染色的细胞的比例分别是18.5%、16.5%、2.5%,双标记细胞的比例为29%、38%与16%,并且每10秒计数的活细胞数目为5200、3100与8600。这些体外数据显示，细胞程序死亡是体内B细胞削减的一个可能的机制。与细胞表面CD20结合的rhuMAb2H7或Rituximab的体内交联可能通过免疫效应细胞表面上的FcyR发生。实施例14肺瘤生长的体内抑制在Balb/c棵(无胸腺)小鼠中评估rhuMAb2H7.vl6抑制淋巴瘤细胞系Raji人B细胞(ATCCCCL86)生长的能力。Raji细胞表达CD20,并已4艮道可在棵鼠中生长，产生转移性疾病；肿瘤生长被Rituxar^所抑制(Clyneseta1.，NatureMedicine6,443-446(2000))。五十六只8-10周大的Balb/c棵鼠被分成7组(A-G)，每组包括8只小鼠。在第0天，每只小鼠在胁部接受5xl06的RajiB淋巴瘤细胞皮下注射。从第O天开始，每只小鼠接受lOOitil的负对照溶液(PBS;磷酸盐緩冲盐溶液)、Rituxar^或2H7.vl6。剂量取决于体重，通过尾静脉静脉内给药。A组小鼠接受PBS。B-D组分别以5.0mg/kg、0.5mg/kg、与0.05mg/kg接受Rituxan⑧。组E-G分别以5.0mg/kg、0.5mg/kg、与0.05mg/kg接受2H7v，16。注射每周重复，共6周。在治疗期间一周一次，观察每只小鼠注射部位可触肿瘤的存在，如果存在则测量肿瘤体积并登记。在第8周做最后的检查(在间隔两周不进行治疗之后)。这一研究的结果表明rhuMAb2H7.vl6与Rituxan⑧在抑制棵鼠中皮下Raji细胞肺瘤的生长中均有效(图16-18)。从第4周开始在PBS对照组中观察到肿瘤生长。然而，在该研究的8周持续时间内，在用Rituxai^或2H7.vl6以5mg/kg或0.5mg/kg处理的组中没有观察到肿瘤生长。在低剂量0.05mg/kg处理组中，在2H7组的一只动物和在Rituxan③组的一只动物中观察到胂瘤(图18)。实施例15猕猴CD20的克隆与抗体结合从猕猴脾cDNA文库分离编码CD20的cDNA之后，测定猕猴(7l/acflca/fls"'cw/an》CD20DNA序列。cDNA合成与质粒克隆的SUPERSCRIPTTM质粒系统(目录号18248-013，Invitrogen，Carlsbad，CA)稍加改变后被用于构建文库。使用限制性位点Xhol和Notl将cDNA文库连接入pRK5E载体。从脾组织分离mRNA((CaliforniaRegionalResearchPrimateCenter,Davis,CA)。基于人CD20的非编码序列设计用于扩增编码CD20的cDNA的引物。N末端区域引物5'-AGTTTTGAGAGCAAAATG-3'(SEQIDNO.37)与C末端区域引物5'-AAGCTATGAACACTAATG-3'(SEQIDNO.38)被用来通过聚合酶链式反应(PCR)克隆编码猕猴CD20的cDNA。使用PlatinumTaqDNAPolymeraseHighFidelity根据厂家建议(Gibco,Rockville,MD)进行PCR反应。PCR产物亚克隆入PCR⑧2.1-TOPO⑧载体(Invitrogen),并转化入XL-1蓝色大肠杆菌(Stratagene.LaJolla,CA)。从单个克隆中分离包含连接有PCR产物的质粒DNA,并测序。猕猴CD20的氨基酸序列示于图19。图20显示猕猴与人CD20的比较。猕猴CD20与人CD20具有97.3。/。的相似性，有8处差异。细胞外结构域在V157A包含一个改变，而其余7个残基可在细胞质或跨膜区域找到。分析针对抗人CD20的抗体结合并替代FITC偶联的鼠2H7结合表达CD20的猕猴细胞的能力。从两只猕猴(CaliforniaRegionalResearchPrimateCenter,Davis,CA)取血20毫升加入肝素钠，并直接运至健泰科^〉司。在同一天，汇集血样，通过添加40ml的磷酸盐緩冲盐溶液(PBS)1:1稀释。20ml的稀释血液分层铺于50ml锥形管(目录号352098，Falcon,FranklinLakes,NJ)中的4x20mlFicoll-PaqueTMPlus(AmershamBiosciences，Uppsala,Sweden),在Sorval7离心机(Dupont,Newtown,CT)上以1300rpm室温离心30分钟。分离出PBMC层，在PBS中洗。红细胞在0.2%NaCl溶液中裂解，用等体积的1.6。/。NaCl溶液恢复至等渗，以1000RPM离心10分钟。PBMC小丸再悬浮在包含5。/。胎牛血清(FBS)的RPMI1640(Gibco，Rockville,MD)中，在37。C分散入10cm组织培养亚1小时。非粘附的B和T细胞群体用吸出除去，离心并计数。回收得到总共2.4xl(f细胞。重新悬浮的PBMC分配入20个12x75mm培养管(目录号352053，Falcon),每管包含lxl()6细胞，体积0.25ml。管子被分成四组，每组五管。每组加入培养基(RPMI1640，5%FBS)、滴定量的对照人IgGl抗体、Rituxan⑧、2H7.vl6、或2H7.v31,每个抗体的终浓度为30、10、3.3与l.lnM。此外，每管还加入20|ul的异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗人CD20(目录号555622,BDBiosciences,SanDiego,CA)。轻轻混合细胞，在冰上孵育l小时，然后在冷PBS中洗两次。在EpicXL-MCL(Coulter，Miami,FL)上分析细胞表面染色，针对抗体浓度导出并绘制几何平均^:(KaleidaGraphTM,SynergySoftware,Reading,PA)。图21中的数据显示，2H7v.16与2H7v.31竟争性替代FITC-鼠2H7与猕猴细胞的结合。此外，Rituxan⑧也替代FITC-鼠2H7的结合，因此证明2H7与Rituxar^两者结合于CD20上的重叠表位。此外，数据显示，2H7v.16、2H7v.31与Rituxan具有类似的IC50值，落在4-6nM范围内。实施例16rhuMAb2H7(2H7.vl6)在中度至重度类风湿性关节炎中的I/II期研究过程提要在患中度至重度类风湿性关节炎的个体中，所述个体同时接受稳定剂量的氨曱喋呤，对逐渐升高剂量的PRO70769(rhuMAb2H7)的安全性进行随机的、安慰剂对照的、多中心(multice血)、盲的I/II期研究。目的本研究的主要目的是评定在患中度至重度类风湿性关节炎(RA)个体中逐渐增高的静脉内(IV)剂量的PRO70769(rhuMAb2H7)的安全性与耐受性。研究设计这是一项随机的、安慰剂对照的、多中心的、盲的、1/11期、研究者与受试者双盲研究，研究逐渐增高剂量的PRO70769与MTX联合在中度至重度RA个体中的安全性。研究包括剂量逐渐增高期和第二期，其中第二期中有更多数量的个体加入。主办者对治疗方案保持不参与。可以加入治疗的受试者患中度至重度RA,遭受一种至五种具有减轻症状作用的抗风湿药或生物制剂治疗失败，目前用MTX治疗的临床反应不佳。在研究开始之前，受试者要每周接受10-25mg范围内的MTX至少12周，并接受稳定剂量至少4周，然后接受其首次量的研究药物(PR070769或安慰剂)。受试者也可以接受稳定剂量的口服皮质激素(最多达每天10mg或等量强的松)和稳定剂量的非类固醇类抗炎药(NSAID)。根据下面的剂量渐增计划(参见图22)，受试者将在第1与第15天以指定剂量接受PR070769或安慰剂的两次静脉内输注。根据特定标准，并且在由内部安全数据检查委员会对安全性数据进行检查之后，并且在每一组的最后一个受试者接受第二次输注后72小时对急性毒性进行了评估之后，进行剂量升级。剂量升级期后，另外40个受试者(32个接受药物的和8个接受安慰剂的)将被随机分配入以下剂量水平的每一剂量2x50mg、2x200mg、2x500mg、和2xl000mg，如果该剂量7K平在剂量升级期内已经被证实是可耐受的。大约205个受试者将加入该研究。获得B细胞计数并登记。在为时6个月的效力估价期之外的48周追踪期内，利用流式细胞计评价B细胞计数。B细胞削减将不会被认为是剂量限制的毒性(dose-limitingtoxicity,DLC)，而是PRO70769治疗的预期药效学结果。在一可选的亚研究中，将在各个时间点从受试者获得血清血和RNA分析、以及尿样。这些样品可被用来鉴定生物标志物，这些生物标志物可能对患中度至重度RA的受试者对PRO70769治疗响应性有预示作用。结果的测量本研究的主要结果测量是患中度至重度RA的受试者中PRO70769的安全性与耐受性。研究治疗受试者群体将根据以下升级计划在第l与第15天以指定剂量接受PRO70769或等量安慰剂的两次静脉内输注-lOmgPRO70769或等量安慰剂4个受试者接受活性药物，1个接受对照-50mgPRO70769或等量安慰剂8个受试者接受活性药物，2个接受对照-200mgPRO70769或等量安慰剂8个受试者接受活性药物，2个接受对照-500mgPRO70769或等量安慰剂8个受试者接受活性药物，2个接受对照墨1000mgPRO70769或等量安慰剂8个受试者接受活性药物，2个接受对照效力PRO70769的效力将通过ACR反应测量。取得ACR20、ACR50、和ACR70反应的受试者百分率将通过处理组汇总，每一组生成95%置信区间。结论上面的数据证明制备人源化CD20结合抗体，特别是人源化2H7抗体变体的成功，所述抗体保持、甚至增强其生物学特性。本发明的人源化2H7抗体以与小鼠供体和嵌合2H7抗体类似的亲合力与CD20结合，在灵长类动物的B细胞杀伤中是有效的，导致B细胞削减。某些变体与目前用于治疗NHL的嵌合抗CD20抗体相比显示出增强的ADCC,有利于在患者中使用较低剂量的治疗抗体。此外，尽管对带有鼠FR残基的嵌合抗体而言，需要以足以取得完全B细胞削减的剂量给药以消除针对其的抗体反应，本发明人源化抗体可以以取得部分或完全B细胞削减的剂量给药，并且依该特定疾病和病人所需按不同持续时间给药。此外，这些抗体显示出在溶液中的稳定性。人源化2H7抗体的这些性质使得它们在CD20阳性癌症和自身免疫疾病中可用作理想的免疫治疗药剂；在人类患者中这些抗体预期是不具免疫原性的，或将至少比完全的鼠或嵌合抗CD20抗体免疫原性小。参考文献在本申请中所引用的参考文献，包括专利、公开的申请及其它出版物，在此引入作为参考。除非另外指明，本发明的实施将使用本领域范围内的分子生物学的传统方法等等。这样的技术在文献中充分加以解释。参见，例如MolecularCloning:ALaboratoryManual,(J.SambrookColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989);CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.Ausubela/.，eds.，1987updated);EssentialMolecularBiology(T-Browned.,IRLPress1991);GeneExpressionTechnology(Goeddeled.，AcademicPress1991);MethodsforCloningandAnalysisofEukaryoticGeii6s(A.Bothwellaa/,eds.，BartlettPubl.1990);GeneTransferandExpression(M.Kriegler,StocktonPress1990);RecombinantDNAMethodologyU(R.Wua/,eds,，AcademicPress1995);PCR:APracticalApproach(M.McPhersona/.，IRLPressatOxfordUniversityPress1991);OligonucleotideSynthesis(M.Gaited.,1984);CellCultureforBiochemists(R.Adamsed.,ElsevierSciencePublishers1990);GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.Miller&M.Caloseds"1987);MammalianCellBiotechnology(M.Butlered.,1991);AnimalCellCulture(J.Pollard&a/,eds"HumanaPress1990);CultureofAnimalCells,2ndEd.(R.Freshney&a/,eds"AlanR.Liss1987);FlowCytometryandSorting(M.Melamededs"Wiley-Liss1990);theseriesMethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.);WirthM.andHauserH.(1993);ImmunochemistryinPractice,3rdedition,A.Johnstone&R.Thorpe,BlackwellScience,Cambridge,MA,1996;TechniquesinImmunocytochemistry,(G.Bullock&RPetruszeds.,AcademicPress1982,1983，1985，1989);HandbookofExperimentalImmunology,(D.Weir&C.Blackwell,eds.);CurrentProtocolsinImmunology(J.Coliganetal.eds.1991);Immunoassay(E.RDiamandis&T.K.Christopoulos,eds.，AcademicPress,Inc.,1996);Goding(1986)MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice(2ded)AcademicPress,NewYork;EdHarlowandDavidLane,AntibodiesAlaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1988;AntibodyEngineering,2ndedition(C.Borrebaeck,ed.，OxfordUniversityPress,1995);和theseriesAnnualReviewofImmunology;theseriesAdvancesinImmunology。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage94</formula>PheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSer657075SerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinTrp808590SerPheAsnProProThrPheGyGinGlyThrLysValGlulie95100105LysArg<210>3<211>108<212〉PRT<213>人工序列<220><223〉该序列是人工合成的<400>3AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerVal151015GlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSerGinSerlieSer202530AsnTyrLeuAlaTrpTyrGinGinLysProGlyLysAlaProLys354045LeuLeulieTyrAlaAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSer505560ArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlie657075SerSerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGin808590TyrAsnSerLeuProTrpThrPheGlyGinGlyThrLysValGlu95100105lieLysArg<210>4<211>10<212>PRT<213>鼠(Musmusculus)<400>4ArgAlaSerSerSerValSerTyrMetHis510<210>5<211>7<212>PRT<213>鼠(Musmusculus)<400〉5AlaProSerAsnLeuAlaSer5<210>6<211>9<212>PUT<213>鼠(Musmusculus)<400>6GinGinTrpSerPheAsnProProThr5<210>795<211>122<212>PRT<213>鼠(Mus画culus)<400>7GinAlaTyrLeuGinGinSerGlyAlaGluLeuValArgProGly151015AlaSerValLysMetSerCysLysAlaSerGlyTyrThrPheThr202530SerGluAsnSerSerTyrSerTyrTrpGinSerAlaTrpSerAsnMetHisTrpValLysGinThrProArgGinGlyLeu354045lieGlyAlalieTyrProGlyAsnGlyAspThrSerTyr505560LysPheLysGlyLysAla丁hrLeuThrValAspLysSer657075ThrAlaTyrMetGinLeuSerSerLeuThrSerGluAsp808590ValTyrPheCysAlaArgValValTyrTyrSerAsnSer95100105TyrPheAspValTrpGlyThrGlyThrThrValThrVal110115120<210>8<211>122<212>PRT<213>人工序列<220><223>该序列是人工合成的<楊>8GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGly151015GlySerLeuArgLeuSerCysAUAlaSerGlyTyrThrPheThr202530SerTyrAsnMetHisTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeu354045GluTrpValGlyAlalieTyrProGlyAsnGlyAspThrSerTyr505560AsnGinLysPheLysGlyArgPheThrlieSerValAspLysSer657075LysAsnThrLeuTyrLeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAsp808590ThrAUValTyrTyrCysAlaArgValVatTyrTyrSerAsnSer95100105TyrTrpTyrPheAspVal丁rpGlyGinGlyThrLeuValThrVal110115120SerSer<210>9<211〉119<212〉PRT<213>人工序列<220〉<223>该序列是人工合成的<400>9GluValGinLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGinProGly151015GlySerLeuArgUuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSer202530SerTyrAlaMetSerTrpValArgGinAlaProGlyLysGlyLeu354045GluTrpValAlaVallieSerGlyAspGlyGlySerThrTyrTyr505560AlaAspSerValLysGlyArgPheThrlieSerArgAspAsnSer657075LysAsnThrI>euTyrLeuGinMetAsnSerLeuArgAlaGluAsp808590ThrAlaValTyrTyrCysAlaArgGlyArgValGlyTyrSerLeu95100105TyrAspTyrTrpGlyGinGlyThrLeuValThrValSerSer110115<210>10<211>10<212>PRT<213〉鼠(Musmusculus)<400〉10GlyTyrThrPheThrSerTyrAsnMetHis510<210>11<211>17<212>PRT<213>鼠(Musmusculus)<400>11AlalieTyr1ProGlyAsnGlyAspThrSerTyrAsnGinLysPhe51015LysGly<210>12<211>13<212〉PRT<213>鼠(Musmusculus)<400>12ValValTyrTyrSerAsnSerTyrTrpTyrPheAspVal510<210>13<211>5679<212>DNA<213>人工序列<220><223>该序列是人工合成的<400>13gaattcaacttctccatactttggataaggaaatacagacatgaaaaatc50tcaugctgagttgttatttaagcttgcccaaaaagaagaagagtcgaat100gaactgtgtgcgcaggtagaagctttggagattatcgtcactgcaatgct150tcgcaatatggcgcaaaatgaxcaacagcgcaggtagagg200gggcgctgUcgaggtaaagcccgatgccagcattcctgacgacgatacg250gagctgctgcgcgattacgtaaagaagttattgaagcatcctcgtcagta300ct11tcaacagctgtcaUaagUgtcacggccgagactt350atagtcgctttgtttttattttttaatgu11tgtaacUgaattcgagc400tcggUcccgggg"cctctagaggttgaggtgatutatgaaaaagaat450atcgcatttcttcttgcatctatgttcgttttttcUUgctacaaacgc500gtacgctgatatccagatgacccagtccccgagctccctgtccgcctctg550tgggcgaUgggtcaccatcacctgcagagccagtcagagcgtgtcgact600agctcttatagctatatgcactggtatcaacagaaaccaggaaaagctcc650gaaactactgatttacutgctagcaacctcgagtctggagtcccttctc700gcttctctggatccggttctgggacggatttcactctgaccatcagcagt750ctgcagccagaagacttcgcaactuttactgtcaacactcttggggtat800tccgcgcacaUtggacagggtaccaaggtggagatcaaacgaactgtgg850ctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgaagagc汪gttgaaattct900ggaactgcttctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggc950caaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccagg1000agagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagc1050accctgacgctgagcaaagcagacUcgagaaacacaaagtcUcgcctg1100cgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaaca1150ggggagagtgttaagctgatcctctacgccggacgcatcgtggccctagt1200￡LCgC￡L￡LgttCggUtctatgaiggttgaggtga_UtUtgaat1250aaagaaUtcgcatUcUcttgcatctatgttcgttttttctattgcta1300caaacgcgtacgctgaggttcagctggtggagtctggcggtggcctggtg1350cagcc3gggggctcactccgUtgtcctgtgcagcttctggctacacctt1400caccgaatatatcatccactgggtccgtcaggccccgggtaagggcctgg1450aatgggttgcatcgattaatcctgacUcgacatcacgaactataaccag1500cgcttcaagggccgtttcactaUagtcgcgacgattccaaaaacacatt1550aUcctgcagatgaacagcctgcgtgctgaggaC2LCtgCCgtcuttatt1600gtgctcgatggatcagcg3tttcttcgactactggggtcaaggaaccctg1650gtcaccgtctcctcggcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggc1700accctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctgg1750tcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgcc1800ctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtccUcagtcctcaggact1850ctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcaccc1900agaccUcatctgcaacgtgaatcacaagcccagcatacaccaaggtggac1950aagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgaccaccgca2000tgcaccagtagctagcgccgatggagccggcggattcacctgaatgcgcatccagcagccggtgcgcatggttgccttacagcgactgctcttcggtttcgcaccattatggaacacctattttctctgggttccagtaactctctcgttacacggaggcccgctttatctggacgcggagatgagctttaaattcgcgtcgaaatcggctgagtgttgttccaacgtcatgaaccateataaatcgg3accggcgaacgtagggcgctgccgcgctUattcggtg"gcacagcttgtcgtcagcgggagcgaUgcggagaaaaUctgcgctcggtgUatacggttcgtccattcccctatacctgccacctcgaactccaagaaaaccaaccctgcacgcggcgatcgtgctcctggtU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yrPheSerSerTyrThrLeuVal5Leu20His35Ala50Lys65Tyr80Tyr95Asp110Thr125Thr140Phe155Ser170Tyr185GluSerTrplieGlyLeuCysValLysSerProGlySerGinValGinVallieAlaLysThrTyrSerValPheThrGin<210〉49<211>452<212>PRT<213>人工序列<220><223〉该序列是人工合成的SerGlyCysAlaValArgTyrProArgPheGinMetAlaArgTrpGlyGlyProGlyGlyGluProValHisLeuSerTyrSerValThrLysSerLys340Thr355Leu370Glu385Pro400Leu415Cys430Ser化GlyAlaGinGlyThrAsnValGinSerThrValThrSerLeuThrTrpProThrSerLeuGly10Ser25Ala40Asn55lie70Ser85Val100Gly115Val130Ala145Thr160Phe175Val190LeuGlyProGlySerLeuTyrThrPheAlaValProValProProCysLeuGluSerValLeuValAspValMetSerLeuSerValAsnAspLysHisSerValGinTyrThrGlyLysAlaThrValAspArgAlaTyrSerLeuValProLeuLeuGlySerTrpAlaValThrValProPheGlySerLysGluAlaThrAlaCysAsnLeuPro345Arg360Lys375Gly390Ser405Ser420Glu"5Pro450Gly15Thr30Leu45Tyr60Ser75Asp90Ser105Val120Pro135Leu150Ser165Gin180Ser195<formula>formulaseeoriginaldocumentpage134</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage135</formula>ArgTrpGinAlaLeuHisGlyLys410GinGlyAsn425AsnHisTyr440<400>51GluVal1GlySerSerTyrGluTrpAsnGinLysAsnThrAla丁yrTrpSerSerGinLeuLeuArgAsnMetValGlyLysPheThrLeuValTyrTyrPheVal5Leu20His35Ala50Lys65Tyr80Tyr95Asp110GluSerTrplieGlyLeuCysVal<400〉52Asplie1GlyAspTyrMetLeuliePheSerSerLeuGinArgHisTyrGlyGinMetValTrpAlaSerProThr5Thr20Tyr35Pro50Gly65Glu80ValPheSerThrGinLys415420CysSerValMetHisGlu430435SerLeuSerLeuSerPro445450<210>51<211>122<212>PRT<213>人工序列<220〉<223>该序列是人工合成的SerGlyGlyCysAlaAlaValArgGinTyrProGlyArgPheThrGinMetAsnAlaArgValTrpGlyGin<210>52<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>该序列是人工合成的GinlieGinSerSerAspGlyLeuValGinProGly1015SerGlyTyrThrPheThr2530AlaProGlyLysGlyLeu4045AsnGlyAlaThrSerTyr5560lieSerValAspLysSer7075SerLeuArgAlaGluAsp8590ValTyrTyrSerAlaSer100105GlyThrLeuValThrVal115120SerProSerThrCysArgGinLysProAsnLeuAlaGlyThrAspPheAlaThrSerLeuSerAlaSerVal1015AlaSerSerSerValSer2530GlyLysAlaProLysPro4045SerGlyValProSerArg5560PheThrLeuThrlieSer7075TyrTyrCysGinGinTrp8590AlaPheAsnProProThrPheGlyGinGlyThTLysValGlulie95100105LysArg<210>53<211>107<212>PRT<213〉人工序列<220〉<223>该序列是人工合成的<400>53AsplieGinMetThrGinSerProSerSerLeuSerAlaSerVal151015GlyAspArgValThrlieThrCysArgAlaSerSerSerValSer202530TyrLeuHisTrp丁yrGinGinLysProGlyLysAlaProLysPro354045LeulieTyrAlaProSerAsnLeuAlaSerGlyValProSerArg505560PheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrlieSer657075SerLeuGinProGluAspPheAlaThrTyrTyrCysGinGinTrp808590AlaPheAsnProProThrPheGlyGinGlyThrLysValGlulie95100105LysArg权利要求1.一种与人CD20结合的人源化抗体或者其抗原结合片段，其中抗体对体内削减灵长类动物B细胞是有效的，该抗体在重链可变区(VH)至少包含来自抗人CD20抗体的SEQIDNO.12的CDR3序列、和人重链亚群III(VHIII)的基本上的人共有框架(FR)残基。2.—种分离的核酸，其编码前述权利要求中任一项的抗体。3.—种表达载体，其编码前述权利要求中任一项的抗体。4.一种宿主细胞，其包含权利要求2的核酸。5.生产权利要求1的抗体的方法，包含培养生产权利要求4的抗体的细月包，并/人细月包培养物中回收抗体。6.—种组合物，包含权利要求1的抗体和载体。7.—种制品，包含一种容器和包含在其中的组合物，其中该组合物包含权利要求1的抗体。8.—种体内在B细胞中诱导程序性细胞死亡的方法，包含将B细胞与权利要求1中的抗体接触，从而杀死B细胞。9.一种治疗CD20阳性癌症的方法，包含给予患该癌症的病人治疗有效量的权利要求1中的人源化CD20结合抗体。10.—种治疗自身免疫病的方法，包含给予患该自身免疫病的病人治疗有效量的前述权利要求中任何一项的人源化CD20结合抗体。全文摘要本发明涉及免疫球蛋白变体及其用途。本发明提供人源化和嵌合的抗CD20抗体，用于治疗CD20阳性恶性肿瘤和自身免疫病。文档编号A61KGK101418044SQ20081017481公开日2009年4月29日申请日期2003年12月16日优先权日2002年12月16日发明者亨利·B·洛曼,伦纳德·G·普雷斯塔,克雷格·W·克劳利,卡梅利亚·W·亚当斯,安德鲁·C·陈,杰拉尔德·R·纳卡马拉申请人:健泰科生物技术公司