专利名称：治疗缺血性心血管疾病和皮肤溃疡的生物药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用人的血管内皮生长因子治疗缺血性心血管疾病和皮肤溃疡
的生物药物。属于生物制药技术领域。背景技术：
人的血管内皮生长因子(简称VEGF)，又称血管通透因子，是平滑肌细胞和血管内皮细胞产生的促进内皮细胞分裂增生的蛋白质，是内皮细胞特异的有丝分裂原。VEGF基因产物由于信使核糖核酸(mRNA)的剪切方式不同，分别根据氨基酸的数目的不同，而命名为VEGF121、 VEGF145、 VEGF165、 VEGF189和VEGF206。 VEGF121和VEGF145、 V EGF165是分泌性蛋白质，都能有效地从细胞中分泌出去。VEGF189和VEGF2。6的信号肽尽管和上述三种单体相同，但保留在细胞表面，并与细胞表面的蛋白烯糖有较高的亲和性，而失去生物活性作用(Vincenti V等，Circ，93 :1493-1495,1996)。 VEGF通过其特异性受体，激酶功能区/胎肝激酶-l(KDR/flk-l)，酪氨酸激酶-l(flt-l)而发挥其生物学作用(Anderson MR等，12(4):577-922003)。 VEGF能作用于全身血管内皮细胞，特异地促进血管内皮细胞的分裂、增殖和迁移，并促进血管生成。在体外也可促进血管内皮细胞的增殖和生长(Harvey等，Gene Ther，2002,13(1) :15-63， ；Jingimg等，Mol Cell Biochem214(1-2) :23-30,2002)。
VEGF在血管发生和新生中均起着关键的作用。VEGF不仅能够促进血管内皮细胞特异性有丝分裂，而且还能够剌激血管内皮的细胞移行，血管形成，修复内膜并维持其完整性；同时，VEGF增加血管内皮的通透性，使血浆蛋白溢出血管外，致纤维蛋白凝结，形成血管生成的临时基质，并且促进间质细胞成熟，形成血管基质，从而促进血管生成。VEGF还可剌激内皮细胞产生一氧化氮，并使其浓度呈剂量依赖性升高，从而起到维护血管正常状态及完整性的作用(Zheng W等，Circ Res， 1999，85 :182-198 ;Helisch A等，82 :772-780，1999;Tilton RG等，J Invest Ophthalmol VisSci，40(3) :689-696,1999)。
血管内皮生长因子(VEGF)的血管新生疗法将是治疗缺血性心血管病的一种崭新思路和崭新疗法。所谓血管新生疗法，是指通过输注外源性的血管生长因子或转导其基因，促进缺血部位血管的生成，形成侧支循环，以改善供血的治疗方法。目前国内外研究较多的血管生长因子是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)，以及及血管内皮生长因子(VEGF)，其中VEGF是公认的最具特异性且作用最强的内源性血管生长因子。
缺血性心脏病，又称冠心病。多年来一直被世界卫生组织列为导致死亡的首位疾病。在我国，尽管本病不如工业化国家多见，但今年来呈增长趋势。冠心病的治疗主要包括三个方面一是药物治疗，其二是冠状动脉介入治疗，包括冠状动脉球囊扩张术和冠状动脉内支架，第三是冠状动脉搭桥术。但是，药物治疗主要在于减轻临床症状，治标而非治本。冠状动脉介入治疗虽然可以在短期内扩张狭窄的冠状动脉，增加冠状动脉的血液供应，但是重新再狭窄(6个月内)的机会高，同时，对于弥漫性和多支小冠状动脉病变患者，以及已有过冠状动脉搭桥术患者，冠状动脉介入治疗的效果均不理想。冠状动脉搭桥术是治疗冠心
3病的重要手段，但是手术死亡率较高(达到4_8%)，尤其年龄较大的患者。同时，对于弥漫 性和多支小冠状动脉病变患者，手术效果也不理想。 血管内皮生长因子(VEGF)血管新生疗法将是治疗冠心病的一种崭新思路和崭新 疗法。 越来越多的动物实验和临床试验均已证明，采用VEGF质粒、蛋白质或基因制剂治 疗缺血性心脏病的早期效果是肯定的。 在实验动物的慢性心肌缺血模型，使用VEGF，不仅能够能促进缺血心肌区毛细血 管增生，而且还能促进侧枝血管的生成和侧枝循环的建立，增加缺血部位的血流量，改善缺 血心脏的功能(Baniai S等，J Circulation, 1994， 89 (5) :2183-2189 ;张端珍等，生理学 报，2001， 53 :183-187蒋捷等，中国介入心脏病学杂志2001， 9 (4) :220-223)。
美国学者将VEGF质粒，或用腺病毒作载体的VEGF直接注入常规治疗无效的心 绞痛患者的缺血心肌，所有患者心绞痛症状减轻，单光子发射计算机断层检查显示心肌 缺血明显改善，平板运动试验提示心脏缺血改善，其疗效均达6个月以上(Losordo等， Circulation,98 :2800—2804，1998 ;Rosengant等，J Circulation, 100 :468—4741999)。
下肢动脉硬化闭塞性疾病是常见的缺血性外周血管病，是引起残废的常见的原 因。据估计，美国50岁以上的人群中约有15%患有这种疾病。在吸烟、糖尿病和高血压的 人群中，不仅下肢动脉病变发病率高，而且常常十分严重，包括动脉多处狭窄，甚至完全闭 塞，或涉及较小的动脉。坏疽，溃疡和感染的发生率高，药物疗效不佳，并且不便于其它血管 成型术，比如球囊，激光等的应用。肢体血管闭塞可以导致肢体缺血、坏死，最终常导致截肢 治疗。下肢动脉疾病常常与冠心病同时存在，严重影响人们的身心健康。
美国学者首先在兔后肢急性缺血的局部注入血管内皮生长因子，30天后选择性髂 内动脉造影显示，血管内皮生长因子治疗组侧支血管、毛细血管密度明显增加。在糖尿病鼠 后肢缺血模型中，给予血管生长因子后能改善缺血组织的激光多普勒灌注图像及毛细血管 密度均明显改善(Isner等，J S聊plement II circulation, 96 (II) 382-3881997)。我国 学者范瑞云等在兔缺血右后肢肌肉组织注射血管内皮生长因子(Ad-VEGF^)，5周后，血管 造影、免疫组化检查及单光子发射计算机断层显像检测均显示治疗组缺血肢体侧枝血管、 血管密度及相对血流均明显增加。我国学者杨述华等用大耳白兔的实验表明VEGF能够促 进兔耳伤口肉芽组织的生长，促进伤口的愈合(中华骨科杂志，2001，21 :301-304)。
美国学者首先在临床上使用VEGF治疗缺血性下肢血管病变所引起的慢性皮肤溃 疡和坏疽，取得显著的临床治疗效果，磁共振血管造影检查显示患肢血流显著增加，血管数 目明显增多，难治性皮肤溃疡得到愈合(Isner等，Lancet， 1996. 348 :370-374 ;Ba咖grtner 等，Circulation 97(3) :1114-1123， 1998))。 总上所述，血管内皮生长因子是治疗缺血性心血管疾病的一种有效、安全和简便 的新方法，有着及其广阔的临床应用前景。 本发明人对血管内皮生长因子进行过深入全面的研究，发现了新的血管内皮生长 因子41。发明人经过大量的实验，证实了发现的新的血管内皮生长因子41基因与众所周知 的其它血管内皮生长因子具有相同的生物学活性。但到目前为止，还没有利用该血管内皮 生长因子41治疗缺血性心血管疾病和皮肤溃疡的生物药物。
4(三)
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用血管内皮生长因子41治疗缺血性心血管疾病和 皮肤溃疡的生物药物。 本发明的目的是这样实现的一种治疗缺血性心血管疾病和皮肤溃疡的生物药 物，其特征在于它是采用化学合成法制备人血管内皮生长因子41基因，插入融合蛋白表达 载体中，构建含有血管内皮生长因子41的重组质粒，经转化宿主菌，筛选高效率转化子，摇
瓶培养，用异丙基-b-d-硫代半乳糖苷诱导高效表达蛋白质。
本发明具有如下优点 本发明以新的血管内皮生长因子M(VEGFJ为主体，形成治疗缺血性心血管疾病 和皮肤溃疡的生物药物。具有促进血管内皮细胞的分裂、增殖和迁移，促进血管生长的生物 学活性，可作为一种治疗缺血性心血管疾病和皮肤溃疡的有效、安全和简便的生物药物。
(四)
图1为血管内皮生长因子41重组质粒构建示意图。 图2为血管内皮生长因子41促进鸡胚绒毛尿囊膜血管的生长示意图。
(五)
具体实施例方式
本发明涉及的治疗缺血性心血管疾病和皮肤溃疡的生物药物，它是采用化学合成 法制备人血管内皮生长因子41(VEGFJ基因，插入融合蛋白表达载体中(pGEX-4T-l)，构建 含有血管内皮生长因子41的重组质粒(pGEX/VEGF41)。经转化宿主菌(bcl-2)，筛选高效 率转化子，摇瓶培养，用异丙基-b-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导高效表达蛋白质。表达产 物采用谷胱甘肽_琼脂糖亲和层析和等电聚焦电泳纯化后供发明实验实例使用。
实验实施例1 :对人脐带静脉细胞倍增时间的影响 方法l :采用化学合成法制备人血管内皮生长因子41基因，插入融合蛋白表达载 体中，构建含有血管内皮生长因子41的重组质粒，经转化宿主菌，筛选高效率转化子，摇瓶 培养，用异丙基-b-d-硫代半乳糖苷诱导高效表达蛋白质。表达产物采用谷胱甘肽一琼脂 糖亲和层析和等电聚焦电泳纯化后供发明实验实例使用。 方法2 :选用生长良好的人脐带静脉细胞(HUVEC)制成浓度为4X 104/mL的细胞悬
液，接种24孔板，每孔0. 5mL，用含10%的胎牛血清培养液(DMEM)于37°C、5% C02培养箱
中培养12小时后，再换用无血清的培养液培养24小时使细胞同步于Gl期，换含2%胎牛血
清培养液，并将HUVEC随机分为3组 1)、血管内皮生长因子M(VEGF4》实验组 2)、血管内皮生长因子165(VEGF165)对照组 3)、生理盐水对照组 VEGF165组给药浓度为每个细胞感染10个病毒颗粒；VEGF41组的终浓度为5ng/ ml。分别在给药后0、12、24、36、48、60、72小时8个时间点，每组3孔收集孔内的细胞消 化计数，并根据该曲线计算群体倍增时间，计算公式群体倍增时间(TD) = (tXLog2)/ (LogNt-LogN。) ， t为时间点，Nt为每一时间点的细胞数，N。为最初细胞数。
结果表明，VEGF41表达蛋白和VEGF165能够促进HUVEC细胞生长。生理盐水对照组的细胞平均倍增时间为23. 4± 3. 2，而VEGF41组和VEGF165组的细胞倍增时间明显縮短，分别 为17. 5±4. 1和17. 8±3. 7。 表l :血管内皮生长因子41对细胞倍增时间的影响
组别 细胞倍增时间(小时)
血管内皮生长因子41 17.8±3./ [QQ32] 血管内皮生长因子165 17.5±4.1'
生理盐水组 23.4±3.2
-^-_-—-, 注1)表中数字为均值±标准差；2)* :与生理盐水组比较，p < 0. 01。
实验实施例2 :对人脐带静脉细胞增殖的影响 噻唑兰(MTT)法检测活细胞数量是经典的细胞增殖检测方法。取人脐带静脉细胞 同代对数生长期细胞，以5X 10VmL接种于96孔培养板(每孔100 y L)，置37°C 、5% C02培 养箱中培养12小时后，生理盐水清洗2遍换无血清的培养基继续培养24小时以使细胞周 期同步。5组细胞每组8孔分别加药VEGF165组给药浓度为每个细胞感染10个病毒颗粒； VEGF41组的终浓度为5ng/ml，再培养48小时。进行MTT检测，每孔加入10 y L MTT继续培 养4小时。轻轻吸净培养液，每孔加入100 iil 二甲基亚砜，在微型振荡器上振荡10min，酶 标仪测570nm波长处光吸收值。同法重复3次，取A值均值。 实验结果显示VEGF41组和VEGF165组均能能够促进HUVEC细胞生长和增殖，剌激 脐带静脉细胞对MTT的摄取，与生理盐水对照组比较差异十分显著(表2)。
表2、血管内皮生长因子41对细胞增殖的影响
组别 平均光密度(OD)
血管内皮生长因子41 1.301± 0.057' 血管内皮生长因子165 1.224±0.084+
生理盐水组 1.076 ±0.089 注1)光密度为均值±标准差；2)*与生理盐水组比较，P < 0. 001
实验实施例3 :对培养人脐带静脉细胞迁移的影响 参照国外学者(Engelmann等，Phytomedicine 2002 ;9(6) :489-95)介绍的方法， 将高压灭菌的琼脂在平皿上制成胶，紫外线照射30min后用无菌刀片切去其中1/2胶块。将 生长良好的HUVEC制成密度为4X 105/ml的细胞悬液接种在切去胶的部分，每皿lml，放置 培养箱中(37°C、5%C02)培养12小时后，换用无血清的培养液培养24小时，使细胞同步于 Gl期。刮去另一部分胶块并同时按照前法分组和给药，每组4个平皿。培养48小时后，吸 弃培养液，生理盐水清洗2次，用1 : 3的醋酸甲醇固定细胞30min，加入lml Giemsa染 色液染色15min，清水清洗2次，显微镜镜下观察摄影并计数5个不同视野的迁移细胞数，取 均值。 实验结果表明VEGF41表达蛋白与VEGF165能够促进了 HUVEC的移行。VEGF41组与VEGF165组的细胞数目明显增加，与生理盐水空白对照组比较，差异明显(表3)。
表3、血管内皮生长因子41对人脐带静脉细胞迁移的影响
组别 细胞数/每个视野(n/pv)
178±11*
182±7.8*
96±5 注1)细胞数为均值±标准差；2)*与生理盐水组比较，P < 0. 001 实验结果表明VEGF41表达蛋白与VEGF165能够促进了 HUVEC的移行。VEGF41组与
VEGF165组的细胞数目明显增加，与生理盐水空白对照组比较，差异明显(表3)。 实验实施例4 :血管内皮生长因子41促进鸡胚绒毛尿囊膜血管的生成 鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管形成模型简便、经济和可靠的研究血管生成的经典方法。 鸡胚模型的制作将受精第7天的种蛋用75%酒精擦洗后放置在恒温培养箱中 (38°C 士0.2tO，气室向上，甲醛熏蒸30min消毒灭菌。用砂轮在蛋壳表面划出凹痕，用尖针 在气室表面扎一小孔，放置培养箱中24小时后用眼科镊轻轻将凹痕处的弹壳和壳膜撕掉， 此时CAM凹陷形成假气室，用透明胶带密封后放置培养箱中稳定24小时(以上操作均保持 无菌)。在制作假气室后的第二天即鸡胚第9天，揭去胶带，选择远离大血管且血管密度相 对稀疏的位置放置事先准备好的定性滤纸载体，将药滴加在滤纸上，无菌胶带封口后放入 培养箱48小时后取膜制作标本。(付生法等，军事医学科学院院刊1993 ;17 (4) 294-297)。
药物剂量血管内皮生长因子41(VEGF41)为4.5yg。血管内皮生长因 子^(VEGF^)l(fpfu/ml的病毒液10iU，尿囊膜标本的制作及血管计数向开口处注入甲 醛和丙酮l : l混合液固定20min，待绒毛尿囊膜上的血管内血液凝固后，以加药位置为中 心将膜剪下，在水中将膜展开贴在滤纸上，立即拍照，然后晾干滤纸保存。解剖显微镜下以 相同放大倍数计数血管，以实验部位边缘lmm范围内为一级血管，以实验部位边缘5mm为二 级血管，凡属趋向性生长的血管，即以载体为中心发出，与滤膜半径的夹角小于45。者均予 计数；而穿行、绕行的血管则不算在内。一、二级血管分别观察计数。 实验结果表明血管内皮生长因子^(VEGFJ与血管内皮生长因子^(VEGF^)明 显地促进鸡胚绒毛尿囊膜血管的生长，明显地增加一、二级血管数目，且明显多于生理盐水 对照组。 表4、血管内皮生长因子41对鸡胚绒毛尿囊膜血管形成的影响
血管内皮生长因子 血管内皮生长因子 生理盐水样品上样量胚数/次数新生血管数/胚一级血管二级血管
血管内皮生长因子7/334.13±3.44*63.56±4.75*
4110nL7/336.29±3.55*65.74±4.46*
血管内皮生长因子6/315.43±1.0638.73±2.86
165 生理盐水组 注1)血管数为均值±标准差；2)* :与生理盐水组比较差异显著(P < 0. 001)
人脐带静脉细胞和鸡胚绒毛尿囊膜血管形成的实验均已表明血管内皮生长因子41 具有促进血管内皮细胞分裂、增殖，促进血管生成等的生物学的活性。显而易见，与已被国 际基础研究和临床试验所公认的血管内皮生长因子165基因一样，本发明可以用于治疗各种 原因所致的缺血性心血管疾病，如缺血性外周血管病，缺血性心脏病，以及治疗皮肤溃疡， 缺血性坏疽，以及有助于促进伤口和创口的愈合。 本发明的实验例证阐述所用术语是描述性而非限制性的。因而，在所附权利要求 范围内，本发明可以与本文不同方式实施。 图1为血管内皮生长因子41重组质粒构建示意图。采用化学合成法制备人血管内 皮生长因子41(VEGFJ基因。分别建立目的基因人血管内皮生长因子41(VEGFJ片断和融 合蛋白表达载体质粒(pGEX-4T-l)的酶切体系。分别用适量的VEG&DNA，质粒(pGEX-4T-l) 与纯净水混合，再分别加入2单位的两种限制性内切酶(EcoRI， Notl)，经混匀，离心，反应 和灭活内切酶后，经1%琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片断的酶切产物。经EcoRI和NotI双 酶切的目的基因VEGF41片断和质粒pGEX-4T-l进行连接、转化后，可获得含有血管内皮生长 因子41重组质粒(pGEX/VEGF41)。 图2为血管内皮生长因子41促进鸡胚绒毛尿囊膜血管的生长示意图。在制作鸡 胚模型的假气室后的第二天，即鸡胚第9天，揭去胶带，选择远离大血管且血管密度相对 稀疏的位置放置事先准备好的定性滤纸载体，将药滴加在滤纸上，无菌胶带封口后放入培 养箱48小时后，取膜制作标本。药物剂量血管内皮生长因子^.5i!g，血管内皮生长因 子165 1 07pfu/ml的病毒液10 ii 1，生理盐水10 iil。 实验结果表明血管内皮生长因子41 (图示A和B)和血管内皮生长因子165(图示C) 能够促进鸡胚绒毛尿囊膜血管生长的功能，与生理盐水组(图示D)比较，其血管数目明显 地增多，且较为粗大。
权利要求
一种治疗缺血性心血管疾病和皮肤溃疡的生物药物，其特征在于它是采用化学合成法制备人血管内皮生长因子41基因，插入融合蛋白表达载体中，构建含有血管内皮生长因子41的重组质粒，经转化宿主菌，筛选高效率转化子，摇瓶培养，用异丙基-b-d-硫代半乳糖苷诱导高效表达蛋白质。
全文摘要
本发明涉及一种治疗缺血性心血管疾病和皮肤溃疡的生物药物，其特征在于它是采用化学合成法制备人血管内皮生长因子41基因，插入融合蛋白表达载体中，构建含有血管内皮生长因子41的重组质粒，经转化宿主菌，筛选高效率转化子，摇瓶培养，用异丙基-b-d-硫代半乳糖苷诱导高效表达蛋白质。本发明以新的血管内皮生长因子41(VEGF41)为主体，形成治疗缺血性心血管疾病和皮肤溃疡的生物药物。具有促进血管内皮细胞的分裂、增殖和迁移，促进血管生长的生物学活性，可作为一种治疗缺血性心血管疾病和皮肤溃疡的有效、安全和简便的生物药物。
文档编号A61P9/00GK101716334SQ200810196718
公开日2010年6月2日 申请日期2008年10月9日 优先权日2008年10月9日
发明者蔡涛, 陈以旺 申请人:陈以旺