预防、治疗缺血性脑卒中的药物组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种预防、治疗脑血管疾病的药物组合物，尤其涉及用于预防、治疗缺 血性脑卒中的药物组合物。
【背景技术】
[0002] 脑血管疾病是当今世界严重危害人类生命健康的主要疾病之一，是我国的常见 病、多发病。脑卒中是多种脑血管疾病的严重表现形式，是一组突然起病、以局灶性神经功 能缺失为特征的脑血液循环障碍性疾病，其病因主要是各种因素引起脑内动脉狭窄、闭塞 或破裂，从而导致急性脑血液循环障碍，临床上表现为一过性或永久性神经功能障碍的症 状和体征，具有极高的致残率和较高的致死率，它不仅严重威胁病人的生命，影响其生活质 量，还给家庭和社会带来沉重的负担。目前脑血管疾病的致死率仍然很高，有大约75% 的卒中患者会留下神经功能或认知功能异常的后遗症。在欧美国家，脑卒中是继肿瘤、心 脏疾病之后的的第三大死亡原因，目前临床除了早期溶栓措施，急性缺血性脑卒中（acute ischemicstroke，AIS)的临床治疗依然缺乏有效手段，而溶栓治疗的时间窗极短且不能打 断AIS所致的继发性损害及其引起的恶性循环。应用实验动物制备中枢神经系统损伤模 型的研究发现，由缺血诱导的一系列瀑布样延迟性生化反应是导致脑卒中组织损伤及长期 行为学障碍的关键原因，其病理机制包括兴奋性毒性、离子失衡、氧化应激、炎症反应和再 生障碍等，深入研究脑卒中神经损伤及神经保护机制，开拓有效治疗脑卒中的药物已成为 不容忽视的社会性问题，故研发理想的缺血性脑卒中神经保护剂和治疗策略显得十分紧迫 和必要。
[0003] 依达拉奉是一种用于治疗缺血性脑卒中的脑保护剂，通过清除自由基，抑制脂质 过氧化，从而抑制脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化损伤。本发明研究发现，rhEGF(基 因重组人表皮生长因子）能够增加大鼠内源性BDNF蛋白的表达，对缺血性脑卒中大鼠有治 疗作用。本发明通过进一步研究发现，包括依达拉奉和rhEGF的药物组合物对BDNF的调节 有协同作用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种用于预防、治疗缺血性脑卒的药物组合物，其中包括 活性成分rhEGF，依达拉奉和药学可接受载体。
[0005] 本发明还进一步提供一种用于预防、治疗缺血性脑卒的注射剂，包括rhEGF，依达 拉奉，抗氧剂，助溶剂，pH调节剂。
[0006] 作为优选，依达拉奉的含量为l_20g/L，rhEGF含量为5_15g/L，助溶剂含量为 5-20g/L，抗氧化剂含量为10-15g/L，pH调节剂浓度为0. 05-0. 5mol/L。
[0007] 作为优选，抗氧剂包括但不限于亚硫酸氢钠，维生素C，谷胱甘肽中的一种或多种； 助溶剂优选盐酸半胱氨酸；PH调节剂优选磷酸缓冲液。
[0008] 本发明还提供一种用于预防、治疗缺血性脑卒的注射剂的制备方法，包括如下步 骤： 1) .向依达拉奉中加入注射用水，加热至依达拉奉完全溶解，得到依达拉奉溶液； 2) .向依达拉奉溶液中加入助溶剂，抗氧化剂和pH调节剂，搅拌溶解； 3) .向所述混合溶液中加入医用活性炭，过滤得到滤液； 4) .向滤液中加入rhEGF，补加注射用水，灌装，灭菌得成品。
[0009] 本发明的药物组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，如一日1-3次。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1 取依达拉奉5g，加入600ml注射用水，加热至60°C溶解，得到依达拉奉溶液；冷却至室 温，加入盐酸半胱氨酸5g，亚硫酸氢钠10g，磷酸缓冲液0.Imol;搅拌溶解；向溶液中加入总 体积0. 01%的活性炭，搅拌吸附14min，过滤脱炭；向滤液中加入rhEGF6g，加注射用水至 1000ml，灌封，灭菌得成品。
[0011] 实施例2 取依达拉奉5g，加入600ml注射用水，加热至60°C溶解，得到依达拉奉溶液；冷却至室 温，加入盐酸半胱氨酸5g，维生素C10g，磷酸缓冲液0.Imol;搅拌溶解；向溶液中加入总 体积0. 01%的活性炭，搅拌吸附14min，过滤脱炭；向滤液中加入rhEGFIOg,加注射用水至 1000ml，灌封，灭菌得成品。
[0012] 实施例3 取依达拉奉6g，加入600ml注射用水，加热至60°C溶解，得到依达拉奉溶液；冷却至室 温，加入盐酸半胱氨酸5g，谷胱甘肽10g，磷酸缓冲液0.Imol ;搅拌溶解；向溶液中加入总 体积0. 01%的活性炭，搅拌吸附14min，过滤脱炭；向滤液中加入rhEGF8g，加注射用水至 1000ml，灌封，灭菌得成品。
[0013] 药理实验 缺血性脑卒中动物模型 1实验材料与方法 I. 1实验材料 I.I. 1动物与分组 SD大鼠64只，雌雄各半，体重220-300g，由中国人民解放军军事医学科学院提供。适 应性喂养一周后，随机分为3组，即依达拉奉组（n=16)，rhEGF药物组（n=16)，组合物组 (n=16),空白组（n=16)。
[0014] 1.2 方法 1. 2. 1造模 参照Zea-Longa线栓法的基础上加以改进制成MCAO模型。造模后大鼠出现神经功能 缺损症状证明造模成功。空白组大鼠不做任何处理。
[0015] 1.2.2实验给药 术后24h所有造模成功的大鼠麻醉清醒后即开始给药，具体方法如下：rhEGF药物， 每只100yg/kg静脉滴注，每日1次；依达拉奉药物，每只eOyg/kg静脉滴注，每日1次； rhEGF和依达拉奉药物组合物(按实施例1制备)，每只44Iig/kg静脉滴注(相当于20Iig/kg的依达拉奉和24iig/kg的rhEGF)。空白组大鼠不做任何处理。
[0016] 1. 2. 3神经系统功能缺损评定 采用Longa及Bederson的5分制法进行评分。0分：提起鼠尾，可伸展双上肢，无神经功 能缺损；1分：不能完全伸展左侧前爪，轻度神经功能缺损；2分：提起鼠尾，左侧前肢内旋， 肩内收，行走时，大鼠向左侧转圈，中度神经功能缺损；3分：行走时，大鼠向左侧倾倒，重度 神经功能缺损；4分：不能自发行走，意识丧失。评分为0分和4分者剔除。
[0017] 1.3标本采集与切片制备 大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg体重）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术板上：立即 打开胸腔，暴露心脏，将灌注穿刺针自心尖部穿入左心室至升主动脉根部，用止血钳固定 心尖部穿刺针，并夹闭腹主动脉；剪开右心房放血，用生理盐水250mL左右快速冲洗灌注， 使输液器液管内呈一条直线，待右心房流出的液体变得清亮时，再灌注预冷的4%多聚甲 醛（0.Olmmol/LPBS配制，pH7. 2-7. 4)约400mL，灌入速度先快后慢，直至颈部僵硬；迅速 取出大脑组织，置4°C4%多聚甲醛固定液中后固定约6-8h，然后将组织块依次放入20%、 30%的蔗糖溶液直至组织块下沉，将下沉后的脑组织从蔗糖溶液取出后放_80°C冰箱备用； 从-80°C冰箱取出脑组织，将所切部位用OCT固定后在-20°C恒冷箱切片机中连续做冠状切 片（片厚14um)隔三取一，将切下的脑组织贴于多聚赖氨酸处理过的载玻片上；然后入4°C 的丙酮固定IOmin，后依次入0?OlMPBS洗5minX3次；室温自然晾干后，存储于-80°C冰箱 备用。
[0018] 1.4免疫荧光染色 切片从_80°C冰箱取出，室温自然晾干；PBS液洗3次，每次2min;切片微晾干后滴加5% 正常山羊血清封闭液和0. 3%TritonX-100破膜剂，室温下Ih;PBS液洗3次，每次2min;滴加 一抗(一抗的比例为1 :1〇〇,用5%正常山羊血清稀释)，置4°C冰箱内13h;切片从冰箱取出 后PBS液洗3次，每次2min;滴加荧光素标记的羊抗兔IgG(二抗的比例为1 :50,用5%正 常山羊血清稀释)，室温下Ih;PBS液洗3次，每次2min;用滤纸将切片上的残液吸净，缓冲 甘油（甘油9份，0.OlMPBS液1份）封片。荧光镜下观察拍照。阴性对照试验：用0.OlMPBS 液代替一抗，以排除二抗的非特异性染色，与实验片同步进行染色。从滴加二抗开始以后操 作均应避光进行。2结果判断与数据处理 应用JD-801形态学图像处理和分析软件对免疫组织化学反应的强度进行灰度测量， 进行半定量分析。所有实验数据均以均数土标准差（）表示，各组间进行方差分析，两组比 较用t检验，采用SPSS17. 0统计软件包进行单因素方差分析，以P〈0. 05判断差异显著性。
[0019] 3试验结果 BDNF免疫荧光染色灰度值测定结果(ii：.s )
【主权项】
1. 一种用于预防、治疗缺血性脑卒的药物组合物，其中包括活性成分rhEGF，依达拉奉 和药学可接受载体。
2. -种用于预防、治疗缺血性脑卒的注射剂，包括rhEGF，依达拉奉，抗氧剂，助溶剂， pH调节剂。
3. 如权利要求2所述注射剂，其特征在于，依达拉奉的含量为l-20g/L，rhEGF含 量为5-15g/L，助溶剂含量为5-20g/L，抗氧化剂含量为10-15g/L，pH调节剂浓度为 0.05-0. 5mol/L〇
4. 如权利要求2或3所述注射剂，其特征在于，抗氧剂选自亚硫酸氢钠，维生素C，谷胱 甘肽中的一种或多种；助溶剂选自盐酸半胱氨酸；pH调节剂选自磷酸缓冲液。
5. -种用于预防、治疗缺血性脑卒的注射剂的制备方法，包括如下步骤： 1) .向依达拉奉中加入注射用水，加热至依达拉奉完全溶解，得到依达拉奉溶液； 2) 向依达拉奉溶液中加入助溶剂，抗氧化剂和pH调节剂，搅拌溶解； 3) 向所述混合溶液中加入医用活性炭，过滤得到滤液； 4) 向滤液中加入rhEGF，补加注射用水，灌装，灭菌得成品。
【专利摘要】本发明公开了一种用于预防、治疗缺血性脑卒的药物组合物/注射剂，包括rhEGF，依达拉奉，抗氧剂，助溶剂，pH调节剂。本发明的药物能保护和改善缺血性脑卒中，可以促进神经再生，对缺血性脑卒中大鼠有治疗作用，为临床上治疗缺血性脑卒中提供了新的思路和方法。
【IPC分类】A61K38-18, A61P9-10, A61K31-4152
【公开号】CN104623634
【申请号】CN201510023268
【发明人】梁青, 梁兰, 邹庆薇, 郝瑞雪, 闻家兴, 王菁, 于琪, 顾久莹, 田雪, 李姣, 刘建强
【申请人】天津冠勤生物科技有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月19日