rhEGF在制备预防、治疗缺血性脑卒中的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了rhEGF的一种新的医药用途，具体而言，是将rhEGF用于制备预防治疗缺血性脑卒中的药物或保健品中的新用途。rhEGF药物能保护和改善缺血性脑卒中，可以促进神经再生，对缺血性脑卒中大鼠有治疗作用，为临床上治疗缺血性脑卒中提供了新的思路和方法。
【专利说明】rhEGF在制备预防、治疗缺血性脑卒中的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及rhEGF的新用途，尤其涉及rhEGF在制备预防、治疗缺血性脑卒中的药 物中的应用。
【背景技术】
[0002] 脑血管疾病是当今世界严重危害人类生命健康的主要疾病之一，是我国的常见 病、多发病。脑卒中是多种脑血管疾病的严重表现形式，是一组突然起病、以局灶性神经功 能缺失为特征的脑血液循环障碍性疾病，其病因主要是各种因素引起脑内动脉狭窄、闭塞 或破裂，从而导致急性脑血液循环障碍，临床上表现为一过性或永久性神经功能障碍的症 状和体征，具有极高的致残率和较高的致死率，它不仅严重威胁病人的生命，影响其生活质 量，还给家庭和社会带来沉重的负担。目前脑血管疾病的致死率仍然很高，有大约75% 的卒中患者会留下神经功能或认知功能异常的后遗症。在欧美国家，脑卒中是继肿瘤、心 脏疾病之后的的第三大死亡原因，目前临床除了早期溶栓措施，急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS)的临床治疗依然缺乏有效手段，而溶栓治疗的时间窗极短且不能打 断AIS所致的继发性损害及其引起的恶性循环。应用实验动物制备中枢神经系统损伤模 型的研究发现，由缺血诱导的一系列瀑布样延迟性生化反应是导致脑卒中组织损伤及长期 行为学障碍的关键原因，其病理机制包括兴奋性毒性、离子失衡、氧化应激、炎症反应和再 生障碍等，深入研究脑卒中神经损伤及神经保护机制，开拓有效治疗脑卒中的药物已成为 不容忽视的社会性问题，故研发理想的缺血性脑卒中神经保护剂和治疗策略显得十分紧迫 和必要。
[0003] 基因重组人表皮生长因子（recombinant human Epidermal Growth Factor, rhEGF)在医学上有显著的创伤修复、愈合伤口等功效。近年来发现，rhEGF在美容 产品领域也有广阔的应用前景，具有促进皮肤细胞更新、防止皮肤衰老等功能。本发明研 究发现，rhEGF对缺血性脑卒中大鼠有治疗作用，从而为缺血性脑卒的治疗提供了新思路， 其作用机理有待于进一步研究。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供rhEGF的一种新的医药用途，具体而言，是将rhEGF用于制 备预防治疗脑血管疾病的药物或保健品中的新用途，更进一步的，所述脑血管疾病为缺血 性脑卒中。
[0005] 本发明还提供rhEGF作为BDNF表达调节剂的用途，可使内源性BDNF表达增加。
[0006] 本发明的目的还在用提供一种用于治疗缺血性脑卒的药物组合物，其中包括活性 成分rhEGF和药学可接受载体。
[0007] 本发明的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括但不限于：甘露醇、山 梨醇、山梨酸或钾盐、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨 酸、维生素 A、维生素 C、维生素 E、维生素 D、氮酮、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳 酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸 钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生 物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、土温60-80、司 班-80、蜂蜡、羊毛脂、液体石蜡、十六醇、没食子酸酯类、琼脂、三乙醇胺、碱性氨基酸、尿 素、尿囊素、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高 岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁，植物油：大豆油、中链油、橄榄油、茶油、棕榈油、当归 油、沙棘油、莪术油、川芎油、薏米仁油、红花油、花椒油、大蒜油；磷脂：蛋黄卵磷脂、大豆磷 月旨、氢化蛋黄卵磷脂、氢化大豆磷脂、人工合成磷脂；聚乙二醇磷脂或其衍生物，选自：聚 乙二醇-脑磷脂或其衍生物、聚乙二醇-胆固醇或其衍生物、聚乙二醇-二-脂肪酸甘油 酯或其衍生物、聚乙二醇-脂肪酸酯或其衍生物、聚乙二醇-脂肪胺或其衍生物、聚乙二 醇-脂肪醇或其衍生物、以及含有脂溶性高分子片段的聚乙二醇磷脂衍生物；油酸或油酸 盐，选自：油酸、油酸钾盐、油酸钠盐；抗氧化剂：维生素 E ;亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、维生素 C ;控制阳离子浓度的络合剂，选自：EDTA或其它离子络合剂。
[0008] 本发明所述的药物组合物，可以以药物制剂的形式存在，可以是任何一种可服用 的药物制剂形式，如：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊 齐U、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、 软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、滴丸或贴剂。
[0009] 本发明的药物组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，如一日2-3次。
【具体实施方式】
[0010] 实施例1 缺血性脑卒中动物模型 1实验材料与方法 1. 1实验材料 1. 1. 1动物与分组 SD大鼠140只，雌雄各半，体重220-300g，由中国人民解放军军事医学科学院提供。适 应性喂养一周后，随机分为4组，即空白组（n=8)，假手术组（n=8)，安慰剂组（n=8)，rhEGF 药物组（n=8)，安慰剂组和rhEGF药物组又随机分为5小组。
[0011] 1.1.2实验药品及试剂 rhEGF药物，由桂林华诺威基因药业有限公司提供。
[0012] 1.2 方法 1. 2. 1造模 参照Zea-Longa线栓法的基础上加以改进制成MCAO模型。造模后大鼠出现神经功能 缺损症状证明造模成功。空白组大鼠不做任何处理。
[0013] 1.2.2实验给药 术后24h所有造模成功的大鼠麻醉清醒后即开始给药，具体方法如下：空白组、假手术 组不做任何处理；安慰剂组给予生理盐水，每只静脉滴注lmL/kg，每日1次；rhEGF药物，每 只100 μ g/kg静脉滴注，每日1次。
[0014] L 2. 3神经系统功能缺损评定 采用Longa及Bederson的5分制法进行评分。O分：提起鼠尾，可伸展双上肢，无神经功 能缺损；1分：不能完全伸展左侧前爪，轻度神经功能缺损；2分：提起鼠尾，左侧前肢内旋， 肩内收，行走时，大鼠向左侧转圈，中度神经功能缺损；3分：行走时，大鼠向左侧倾倒，重度 神经功能缺损；4分：不能自发行走，意识丧失。评分为0分和4分者剔除。
[0015] 1.3标本采集与切片制备 大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg体重）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术板上：立即 打开胸腔，暴露心脏，将灌注穿刺针自心尖部穿入左心室至升主动脉根部，用止血钳固定 心尖部穿刺针，并夹闭腹主动脉；剪开右心房放血，用生理盐水250mL左右快速冲洗灌注， 使输液器液管内呈一条直线，待右心房流出的液体变得清亮时，再灌注预冷的4%多聚甲 醛（0. Olmmol/LPBS配制，pH7. 2-7. 4)约400mL，灌入速度先快后慢，直至颈部僵硬；迅速 取出大脑组织，置4°C 4%多聚甲醛固定液中后固定约6-8h，然后将组织块依次放入20%、 30%的蔗糖溶液直至组织块下沉，将下沉后的脑组织从蔗糖溶液取出后放_80°C冰箱备用； 从-80°C冰箱取出脑组织，将所切部位用OCT固定后在-20°C恒冷箱切片机中连续做冠状切 片（片厚14um)隔三取一，将切下的脑组织贴于多聚赖氨酸处理过的载玻片上；然后入4°C 的丙酮固定IOmin，后依次入0· OlM PBS洗5minX 3次；室温自然晾干后，存储于-80°C冰箱 备用。
[0016] 1.4免疫荧光染色 切片从_80°C冰箱取出，室温自然晾干；PBS液洗3次，每次2min ;切片微晾干后滴加5% 正常山羊血清封闭液和0. 3%TritonX-100破膜剂，室温下Ih ;PBS液洗3次，每次2min ;滴加 一抗(一抗的比例为1 :1〇〇,用5%正常山羊血清稀释)，置4°C冰箱内13h ;切片从冰箱取出 后PBS液洗3次，每次2min ;滴加荧光素标记的羊抗兔IgG (二抗的比例为1 :50,用5%正 常山羊血清稀释)，室温下Ih ;PBS液洗3次，每次2min ;用滤纸将切片上的残液吸净，缓冲 甘油（甘油9份，0. OlMPBS液1份）封片。荧光镜下观察拍照。阴性对照试验：用0. OlMPBS 液代替一抗，以排除二抗的非特异性染色，与实验片同步进行染色。从滴加二抗开始以后操 作均应避光进行。2结果判断与数据处理 应用JD-801形态学图像处理和分析软件对免疫组织化学反应的强度进行灰度测量， 进行半定量分析。所有实验数据均以均数土标准差（）表示，各组间进行方差分析，两组比 较用t检验，采用SPSS17. 0统计软件包进行单因素方差分析，以P〈0. 05判断差异显著性。
[0017] 3试验结果 BDNF免疫荧光染色灰度值测定结果)
【权利要求】
1. rhEGF用于制备预防、治疗缺血性脑卒中的药物或保健品中的应用。 2. rhEGF作为BDNF表达调节剂的用途，可使内源性BDNF表达增加。 3. rhEGF在制备BDNF调节剂中的用途。
4. 一种用于治疗缺血性脑卒的药物组合物，其中包括活性成分rhEGF和药学可接受载 体。
【文档编号】A61P9/10GK104491841SQ201510023294
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2015年1月19日 优先权日:2015年1月19日
【发明者】梁青, 梁兰, 邹庆薇, 郝瑞雪, 闻家兴, 王菁, 于琪, 顾久莹, 田雪, 李姣, 刘建强 申请人:天津冠勤生物科技有限公司