一种小分子多肽lz1的应用
【技术领域】
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[0001]本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及一种小分子多肽LZl在制备抗肿瘤药物中的应用。
【背景技术】
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[0002]恶性肿瘤目前已经成为威胁人类健康的主要疾病，在我国恶性肿瘤疾病发病率及死亡率均呈现逐年增多的趋势，《2014中国肿瘤登记年报》显示在2010年中国新增恶性肿瘤病例309万，死亡病例196万。恶性肿瘤疾病不仅严重威胁着人类的健康，同时对恶性肿瘤的治疗需要投入大量的人力与资金，严重影响着经济建设与社会的发展。因此，寻找并开发安全有效的抗肿瘤药物或方法是大家共同关心的问题，也是目前科学界最重要的研宄热点。
[0003]恶性肿瘤的药物治疗是肿瘤综合治疗中的重要组成部分，其中，肿瘤细胞毒类抗肿瘤药物是临床上使用最多也是目前抗肿瘤药物开发的重要切入点。近几年来科学家在抗肿瘤药物开发方面取得了一系列重要的研宄成果，临床上新型抗肿瘤药物的应用也有效的延长了癌症病人的生存时间。但是关于抗肿瘤药物使用过程中出现的一系列问题也逐渐引起了人们的重视，如:抗肿瘤药物选择性差，对正常细胞毒副作用大，抗肿瘤药物使用过程中容易产生耐药性。小分子天然多肽广泛存在于自然界，由于其存在组成简单，分子量小，合成方便的特点表现出广阔的应用前景。但小分子多肽抗癌药物在临床使用过程中也存在部分问题，如:抗癌机制不明确，体内代谢快，稳定性差，存在免疫原性，对正常细胞存在细胞毒作用。针对天然多肽的这些缺点，能在保留天然多肽抗癌作用的同时对其进行改造，增强其稳定性，减弱天然多肽对正常细胞的杀伤作用，这是肽类药物研宄的重要方向。
【发明内容】
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[0004]本发明的目的在于提供一种小分子多肽LZl在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0005]本发明的LZl为人工设计合成的直链抗菌肽，包含15个氨基酸残基，分子量为2228.77Da，等电点为12.05。LZl抗菌肽的全序列如下:缬氨酸-赖氨酸-精氨酸-色氨酸-赖氨酸-赖氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸-赖氨酸-色氨酸-赖氨酸-赖氨酸-色氨酸-缬氨酸-NH2。
[0006]本发明的有益效果在于:LZ1多肽为人工合成，具有分子量小，人工合成方便；多肽LZl选择性的杀伤肿瘤细胞，对正常细胞没有作用，且该多肽对肿瘤细胞杀伤作用的机理是诱导肿瘤细胞凋亡；该多肽对体内实体瘤的生长具有明显的抑制作用，能够在制备抗肿瘤药物中的应用。
【附图说明】
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[0007]图1为不同浓度的小分子多肽LZl对肝癌细胞Huh-7、乳腺癌细胞HCC1806、乳腺癌细胞MCF-7和宫颈癌细胞Hela的作用不意图。
[0008]图2为不同浓度的小分子多肽LZl对人正常对照细胞胚肾细胞HEK-293的作用示意图。
[0009]图3为小分子多肽LZl对肝癌细胞Huh-7作用后通过流式细胞术手段检测的该细胞的凋亡情况示意图。
[0010]图4为小分子多肽LZl对乳腺癌细胞HCC1806诱导的裸鼠体内实体瘤生长的抑制作用，分别用生理盐水和顺铂做对照。其中，图4A为小分子多肽LZl及对照在给药不同天数后裸鼠实体瘤的体积变化情况示意图，图4B为小分子多肽LZl及对照给药28天后裸鼠实体瘤的大小对比图，图4C为小分子多肽LZl及对照给药28天后裸鼠实体瘤的重量对比图。** 表示 p〈0.0lo
[0011]图5为小分子多肽LZl对肝癌细胞Huh-7诱导的裸鼠体内实体瘤生长的抑制作用，分别用生理盐水和顺铂做对照。其中，图5A为小分子多肽LZl及对照在给药不同天数后裸鼠实体瘤的体积变化情况示意图，图5B为小分子多肽LZl及对照给药28天后裸鼠实体瘤的大小对比图，图5C为小分子多肽LZl及对照给药28天后裸鼠实体瘤的重量对比图。** 表示 p〈0.0lo
【具体实施方式】
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[0012]下面结合附图对本发明做详细说明，实施例的作用仅是解释而非限定本发明。
[0013]实施例1:小分子多肽LZl的制备
[0014]1、抗菌肽LZl的化学合成方法:根据我们设计的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433Α, Applied B1systems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。
[0015]I1、分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD1-T0F)。
[0016]II1、纯化的金抗菌肽LZl用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD1-T0F)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。
[0017]抗菌肽LZl —共包含15个氨基酸残基，分子量为2228.77Da，等电点为12.05。LZl抗菌肽的全序列如下:缬氨酸-赖氨酸-精氨酸-色氨酸-赖氨酸-赖氨酸-色氨酸-色氨酸-精氨酸-赖氨酸-色氨酸-赖氨酸-赖氨酸-色氨酸-缬氨酸-NH2 (C-端酰胺化)。
[0018]实施例2:小分子多肽LZl对肝癌细胞Huh-7、乳腺癌细胞HCC1806、乳腺癌细胞MCF-7和宫颈癌细胞Hela的作用实验
[0019]分别收集处于对数生长期的肝癌细胞Huh-7、乳腺癌细胞HCC1806、乳腺癌细胞MCF-7和宫颈癌细胞Hela制成细胞悬液，调整细胞密度至2X 16个/ml，每种细胞按照200 μ I/孔的体积种入96孔板，细胞在37°C，5%的CO2的条件下过夜贴壁。第二天针对每种细胞分别加入终浓度为50?300 μ g/ml的小分子多肽LZ1，其中用同等体积的生理盐水作为对照。细胞培养24小时后，每孔加入20 μ 15mg/ml的MTT溶液，继续培养4h。培养结束后吸出孔内培养基，每孔加入200 μ I的二甲基亚砜，将96孔板置摇床上低速摇动1min充分溶解细胞内结晶物。用酶标仪检测0D490nm处96孔板的吸光度值，注意设置调零孔，对照孔，结果如图1所示:小分子多肽LZl在50?300 μ g/ml浓度范围内以梯度依赖的形式对肝癌细胞Huh-7、乳腺癌细胞HCC1806、乳腺癌细胞MCF-7和宫颈癌细胞Hela具有明显的抑制生长的作用，其中该多肽对肝癌细胞Huh-7和乳腺癌细胞HCC1806的抑制作用最强。
[0020]实施例3:小分子多肽LZl对人正常细胞胚肾细胞HEK-293的作用实验
[0021]收集处于对数生长期的胚肾细胞HEK-293制成细胞悬液，调整细胞密度至2X 16个/ml，按照200 μ I/孔的体积种入96孔板，细胞在37°C，5%的CO2的条件下过夜贴壁。第二天加入终浓度为50?300 μ g/ml的小分子多肽LZ1，其中用同等体积的生理盐水作为对照。细胞培养24小时后，每孔加入20 μ I 5mg/ml的MTT溶液，继续培养4h。培养结束后吸出孔内培养基，每孔加入200 μ I的二甲基亚砜，将96孔板置摇床上低速摇动1min充分溶解细胞内结晶物。用酶标仪检测0D490nm处96孔板的吸光度值，注意设置调零孔，对照孔，结果如图2所示:小分子多肽LZl在50?300 μ g/ml浓度范围内对胚肾细胞HEK-293没有明显的生长抑制作用。
[0022]实施例4:小分子多肽LZl对肝癌细胞Huh-7凋亡的影响
[0023]收集处于对数生长期的肝癌细胞Huh-7制成细胞悬液，调整细胞密度至2 X 16个/ml，按照2ml/孔的体积种入6孔板，细胞在37°C，5%的CO2的条件下过夜贴壁。第二天加入终浓度为12.5?200 μ g/ml的小分子多肽LZl，其中用同等体积的生理盐水作为对照。细胞培养24小时后，先将细胞用胰酶消化并制成细胞悬液，再用碘化丙啶(PI)/Annexin V凋亡检测试剂盒染色后通过流式细胞仪检测肝癌细胞Huh-7的凋亡情况。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜内侧，在细胞凋亡早期细胞膜中的磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧，Annexin V是一种与磷脂酰丝氨酸具有高亲和力的蛋白，因此可通过检测细胞外部暴露的磷脂酰丝氨酸来判定细胞早期的凋亡。PI是一种核酸染料，不能穿过正常的细胞膜，细胞早期凋亡过程中PI染色为阴性。结果如图3所示:在12.5?200 μ g/ml的浓度范围内，随着多肽浓度的增加，肝癌细胞Huh-7PI染色阳性比例变化不大，但是Annexin V阳性染色比率逐渐增加，即小分子多肽LZl以梯度依赖的形式诱导肝癌细胞Huh-7凋亡。
[0024]实施例5:小分子多肽LZl对乳腺癌细胞HCC1806诱导的裸鼠体内实体瘤生长的影响
[0025]取对数生长期的乳腺癌细胞HCC1806，在无菌条件下，按IX 17/只/0.1ml的量接种于BALB/cA裸鼠后肢右侧腋窝皮下。待肿瘤块生长8天后测量瘤径，根据瘤体大小随机分组，每组6只，分组日为O天，次日开始给药。
[0026]肿瘤体积(tumorvolume, TV)，计算公式为:TV = l/2XaXb2
[0027]其中a、b分别表不长宽。
[0028]给药分组如下:生理盐水对照组:同等体积的生理盐水；顺铂对照组:2mg/kg ;小分子多肽LZl给药组:4mg/kg。
[0029]给药方式如下:每两天给药一次，通过鼠尾静脉注射的方式给药，连续给药28天。
[0030]给药结束后处死小鼠，剥离出实体瘤，测量瘤体重量。
[0031]结果如图4所示:小分子多肽LZl能明显抑制乳腺癌细胞HCC1806诱导的裸鼠体内实体瘤的生长，即小分子多肽LZl在体内能发挥良好的抗肿瘤作用。
[0032]实施例6:小分子多肽LZl对肝癌细胞Huh-7诱导的裸鼠体内实体瘤生长的影响
[0033]取对数生长期的肝癌细胞Huh-7，在无菌条件下，按IX 17/只/0.1ml的量接种于BALB/cA裸鼠后肢右侧腋窝皮下。待肿瘤块生长8天后测量瘤径，根据瘤体大小随机分组，每组6只，分组日为O天，次日开始给药。
[0034]肿瘤体积(tumorvolume, TV)，计算公式为:TV = l/2XaXb2
[0035]其中a、b分别表示长宽。
[0036]给药分组如下:生理盐水对照组:静脉注射同等体积的生理盐水；顺铂对照组:2mg/kg ;小分子多肽LZl给药组:4mg/kg。
[0037]给药方式如下:每两天给药一次，通过鼠尾静脉注射的方式给药，连续给药28天。
[0038]给药结束后处死小鼠，剥离出实体瘤，测量瘤体重量。
[0039]结果如图5所示:小分子多肽LZl能明显抑制肝癌细胞Huh-7诱导的裸鼠体内实体瘤的生长，即小分子多肽LZl在体内能发挥良好的抗肿瘤作用。
【主权项】
1.分子量为2228.77Da、等电点为12.05、包含15个氨基酸残基的小分子多肽LZl在制备抗肿瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域，具体涉及一种小分子多肽LZ1在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的LZ1为人工设计合成的活性多肽，包含15个氨基酸残基，分子量为2228.77Da，等电点为12.05。本发明的LZ1在体外通过诱导细胞凋亡的形式对肿瘤细胞表现出显著的抗肿瘤活性，且对正常细胞无毒性，在体内同样表现出良好的抗肿瘤活性，能够在制备抗肿瘤药物中应用。该多肽序列短，人工合成方便，易于实现规模化生产，具有广阔的应用前景。
【IPC分类】A61K38-10, A61P35-00
【公开号】CN104623628
【申请号】CN201510015916
【发明人】赖仞, 张治业, 韩亚君
【申请人】中国科学院昆明动物研究所
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月13日