一种蜈蚣蛆虫蛋白质在制备抗食道癌药品中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药品的新用途，尤其是一种蜈蚣蛆虫蛋白质在制备抗食道癌药品 中的应用。
【背景技术】
[0002] 食道癌是由于暴怒忧思、伤及肝脾，脾伤则气结，气结则津液不能输流，阻而成痰， 肝伤则气郁，气郁则血液不能畅行，遂而为瘀，瘀痰阻塞食道，结聚胃腑，故食物难于下行， 或由外因饮食不节，长期刺激食道而引起的病症。
[0003]CN93104343公开了治疗食管癌的中成药，由砒石、斑蝥、蟾蜍、蛇毒、蜈蚣水蛭、蝎 尾、守宫、牛黄、人参等14种中药组成；CN1475233公开了一种治疗食道癌中药粉末的制备 方法，由珍珠、牛黄、冰片、薏苡仁、月石、小皂角、白矾、冬虫夏草、陈皮等11种中药组成； CN101129607A公开了一种治疗食管癌患者化疗后免疫功能损伤的中药空腹也，由人参、黄 芪、冬虫夏草、白术、茯苓、甘草、当归、枸杞子等中药草组成；CN100391525公开了一种治疗 食道癌的中药，由山慈菇、紫河车、半枝莲、金银花、蜈蚣、全蝎、地龙、人参、三期、灵芝、甘草 等16种中药组成。
[0004] 201210178608. 4公开了人工培殖蜈蚣蛆虫的方法，该发明以蜈蚣等为原料，经多 步骤定向培殖蜈蚣蛆虫，培殖过程可控，适合工业化生产，培殖的蜈蚣蛆虫消除了蜈蚣具有 的毒性，该虫体机体成分具有较高的生物活性。
[0005]上述由原植物组成的中药制剂都可以用于抗食管癌药品制备，但是由于前述的几 个药方中药物繁多，每种中草药由于种植区域、气候、品种、采收时间、炮制及加工方法的差 异，在工业化生产中难于保证产品的一致性，也难于控制质量。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种蜈蚣蛆虫蛋白质在制备抗食道癌药品中的应用，采用蜈 蚣蛆虫为原料，通过一系列的工艺条件分离纯化成为蜈蚣蛆虫蛋白质，制备成四项给药系 统，具有药效高、一致性好的特点。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： (1)将1000 g蜈蚣蛆虫在常温膨化装置（200520108339.X)中常温条件下膨化粉碎。
[0008] 本步骤中，所述膨化压力为0?l~5MPa，时间为10~60min。
[0009] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中，加入 膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出蜈蚣蛆虫蛋白质粗品。
[0010] 本步骤中，所述膨胀溶剂由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH3 ?H2O组成或由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组 成。
[0011] 本步骤中，所述提取温度为10~20°c，时间为10~30min。
[0012] (3)收集含有蜈蚣蛆虫蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质。
[0013] 本步骤中，所述微孔过滤器的孔径为0. 5~50Mffl。
[0014] (4)用超滤机超滤处理，收集含有相应分子量的蜈蚣蛆虫蛋白质超滤溶液。
[0015]本步骤中，所述超滤机的孔径为50~100nm。
[0016] (5)超滤液溶解在适宜的溶剂中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分。
[0017] 本步骤中，所述溶剂为乙腈。
[0018] (6)将洗脱成分溶解在合适的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱 (200920274485. 8)分离纯化。
[0019] 本步骤中，所述溶剂体系由正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1.25:3. 75:5)组成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）组成。
[0020] (7)纯化后的蜈蚣蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。
[0021] 本步骤中，所述真空冷冻干燥温度为_30~50°C、时间为18~26h。
[0022] (8)赋予不同的药用辅助材料，分别制备成注射剂、口服靶向给药系统等，可用于 制备抗食道癌药品。
[0023] 本技术方案中分离的纯化蜈蚣蛆虫蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向聚丙烯酰 胺凝胶电泳及琼脂聚糖免疫电泳谱上测得非均一蛋白质；用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 及葡聚糖凝胶G-75凝胶过滤法测得相对分子量为10. 6~11.SKPa;用等电聚焦发测定其等 电点为PH8. 9~9. 6;常规化学法分析结果表明其不含糖基；紫外分光光度法测定纯化的蜈 蚣蛆虫蛋白质含量为98. 2%。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对 本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵 盖在本发明的保护范围中。
[0025] 实施例1: (1) 将1000 g蜈蚣蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至〇.l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，蜈蚣蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的蜈蚣蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 ?H2O,加压至2~10MPa，形成膨 胀溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，蜈蚣蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压 至常压，生成蜈蚣蛆虫蛋白质粗品与甲醇-NH3 ?H2O的混合液； (3) 收集含有蜈蚣蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~5〇Mm的微孔过滤器过滤去处固 体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的蜈蚣蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡,用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱,常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率0. 2~3.OKW，频率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm; (7)纯化后的蜈蚣蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~50°C、时间18~26h干燥制 备成冻干蛋白粉。
[0026] 实施例2: (1) 将1000 g蜈蚣蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至〇.l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，蜈蚣蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的蜈蚣蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入5Kg液态二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3 ?H2O,加压至5MPa，形成膨胀溶剂体系，保持 温度15°C，时间20min，蜈蚣蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成蜈蚣蛆虫蛋 白质粗品与甲醇-NH3 ?H2O的混合液； (3) 收集含有蜈蚣蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径3〇Mm的微孔过滤器过滤去处固体杂 质； (4) 溶液用孔径IOOnm的超滤机超滤处理，压力0. 5MPa，温度为常温，收集含有相应分 子量的蜈蚣蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化预处理，加0. 05%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用1〇~80%的乙腈梯度脱洗，流速 5mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率I. 0KW，频率500KHz，流速200mL/ min，紫外检测器波长260nm; (7) 纯化后的蜈蚣蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~40°C、时间20h干燥制备 成冻干蛋白粉。
[0027] 实施例3: (1) 将1000 g蜈蚣蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至〇.l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，蜈蚣蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的蜈蚣蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵，加压至2~10MPa，形成膨胀 溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，蜈蚣蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至 常压，生成蜈蚣蛆虫蛋白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液； (3) 收集含有蜈蚣蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~5〇Mm的微孔过滤器过滤去处固 体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的蜈蚣蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡,用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱,常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1.25:3.75:5)溶剂体系中， 用超声驻波液相制备色谱（200920274485. 8 )分离纯化，超声波功率0. 2~3.OKW，频率 500~1000KHz，流速 50~500mL/min，紫外检测器波长 260~280nm; (7) 纯化后的蜈蚣蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~50°C、时间18~26h干燥制 备成冻干蛋白粉。
[0028] 实施例4: (1) 将1000 g蜈蚣蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至2MPa，时间40min，然后迅速释放压力至常压，蜈蚣蛆虫被膨化 成粉体； (2) 膨化粉碎后的蜈蚣蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入6Kg液态二氧化碳、200mL乙醇及150g氯化铵，加压至6MPa，形成膨胀溶剂体系，保持 温度20°C，时间lOmin，蜈蚣蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成蜈蚣蛆虫蛋 白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液； (3) 收集含有蜈蚣蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径5〇Mm的微孔过滤器过滤去处固体杂 质； (4) 溶液用孔径IOOnm的超滤机超滤处理，压力0. 5MPa，温度为常温，收集含有相应分 子量的蜈蚣蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用60%乙腈活化预处理，加0. 08%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用1〇~80%的乙腈梯度脱洗，流速 8mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)溶剂体系中，用超 声驻波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率2. 0KW，频率lOOOKHz，流速 300mL/min，紫外检测器