壁虎蛆虫蛋白质在制备抗鼻咽癌药品中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种壁虎蛆虫蛋白质的新用途，尤其是壁虎蛆虫蛋白质在制备抗鼻咽 癌药品中的应用。
【背景技术】
[0002] 鼻咽癌是原发于鼻炎粘膜被覆上皮的恶性肿瘤。分子遗传学研宄表明，鼻咽癌肿 瘤细胞发生染色体变化的主要是1，3,11，12和17号染色体。在鼻咽癌肿瘤细胞中发现多 染色体杂合性缺失区（lp、9p、9q、13q、14q和16q)，提示鼻咽癌发生发展过程中存在多个肿 瘤抑癌基因的变异。
[0003] 鼻咽癌的治疗方法有放射治疗、化学治疗、手术治疗及中医治疗。其中，放射治疗 是常用的治疗鼻咽癌的方法，不能放射治疗的晚期鼻咽癌或放射治疗后复发的鼻咽癌可选 用化学药物治疗。此外，化学药物治疗也可以作为放射治疗或手术治疗的辅助性治疗。鼻 咽部解剖结构特殊，手术治疗难以切除全部病灶。中医药治疗传统上作为辅助治疗手段，只 有不能放疗、化疗或手术治疗的患者才以中医药辨证治疗为主。
[0004] CN102526703A公开了一种鼻咽癌相关易感基因YHl蛋白的制备方法及其应用，改 方法公开了所述YHl蛋白制备方法包括表达载体构建、表征工程菌的构建及诱导表达、纯 化和酶切。
[0005] CN103520177A公开了一种化合物在制备治疗鼻咽癌药物中的应用，该发明中的化 合物为AsperterpenolsA是一种原治疗老年痴呆病的药物开展的新用途。
[0006] CN102766215A公开了一种具有协同靶向诊疗鼻咽癌功能的多肽和携带此多肽的 纳米颗粒及其应用。该发明提供的具有协同靶向治疗鼻咽癌功能的多肽由具有靶向治疗鼻 咽癌作用的多肽，连接序列肽以及具有a螺旋结构的鼻咽癌靶向治疗多肽以共价键的形 式串联而成，其纳米颗粒是由多肽磷脂、胆固醇脂或装载物组成。
[0007] CN101683439A公开了一种治疗鼻咽癌的中药制剂，该制剂由白英、野菊花、臭牡 丹、三颗针、苦参、白头翁、七叶一枝花、白花蛇舌草组成。
[0008] CN102516388A公开了一种人源抗鼻咽癌LMPl胞外区抗体及其应用，该发明中抗 体的轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO. 1，重链可变区氨基酸序列为SEQIDNO. 2。
[0009] 201210315707. 2公开了人工培殖壁虎蛆虫的工艺，该发明以壁虎等为原料，配制 成适宜的培养基，培殖出药用壁虎蛆虫，该虫体具有较高生物活性，可以抗鼻咽癌。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供一种壁虎蛆虫蛋白质在制备抗鼻咽癌药品中的应用，根据鼻 咽癌的病灶特性及壁虎蛆虫蛋白质生物活性特点，两者相结合制备的药剂具有适应性强、 疗效好的特点。
[0011] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： (1)将1000 g壁虎蛆虫在常温膨化装置（200520108339.X)中常温条件下膨化粉碎。
[0012] 本步骤中，所述膨化压力为0?l~5MPa，时间为10~60min。
[0013] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中，加入 膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出壁虎蛆虫蛋白质粗品。
[0014] 本步骤中，所述膨胀溶剂由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH3 ?H2O组成或由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组 成。
[0015] 本步骤中，所述提取温度为10~20°C，时间为10~30min。
[0016] (3)收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质。
[0017] 本步骤中，所述微孔过滤器的孔径为0. 5~50Mm。
[0018] (4)用超滤机超滤处理，收集含有相应分子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液。
[0019] 本步骤中，所述超滤机的孔径为50~100nm。
[0020] (5)超滤液溶解在适宜的溶剂中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分。
[0021] 本步骤中，所述溶剂为乙腈。
[0022] (6)将洗脱成分溶解在合适的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱 (200920274485. 8)分离纯化。
[0023] 本步骤中，所述溶剂体系由正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)组成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）组成。
[0024] (7)纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。
[0025] 本步骤中，所述真空冷冻干燥温度为_30~50°C、时间为18~26h。
[0026] (8)赋予不同的药用辅助材料，可用于制备抗鼻咽癌药品。
[0027] 本技术方案中分离的纯化壁虎蛆虫蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向聚丙烯酰 胺凝胶电泳及琼脂聚糖免疫电泳谱上测得非均一蛋白质；用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 及葡聚糖凝胶G-75凝胶过滤法测得相对分子量为10. 9~12. 6KPa;用等电聚焦发测定其等 电点为PH8. 8~10. 2;常规化学法分析结果表明其不含糖基；紫外分光光度法测定纯化的壁 虎蛆虫蛋白质含量为96. 7%。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对 本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵 盖在本发明的保护范围中。
[0029] 实施例1: (1) 将1000 g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至0.l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，壁虎蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 ?H2O,加压至2~10MPa，形成膨 胀溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压 至常压，生成壁虎蛆虫蛋白质粗品与甲醇-NH3 ?H2O的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处固 体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm; (7) 纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~501：、时间18~2611干燥制 备成冻干蛋白粉。
[0030] 实施例2: (1) 将1000 g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至0.l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，壁虎蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入5Kg液态二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3 ?H2O,加压至5MPa，形成膨胀溶剂体系，保持 温度15°C，时间20min，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成壁虎蛆虫蛋 白质粗品与甲醇-NH3 ?H2O的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径30Mm的微孔过滤器过滤去处固体杂 质； (4) 溶液用孔径IOOnm的超滤机超滤处理，压力0. 5MPa，温度为常温，收集含有相应分 子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化预处理，加0. 05%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用1〇~80%的乙腈梯度脱洗，流速 5mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率I. 0KW，频率500KHz，流速200mL/ min，紫外检测器波长260nm; (7) 纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~40°C、时间20h干燥制备 成冻干蛋白粉。
[0031] 实施例3: (1) 将1000 g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至0.l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，壁虎蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵，加压至2~10MPa，形成膨胀 溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至 常压，生成壁虎蛆虫蛋白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处固 体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的壁虎蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)溶剂体系中， 用超声驻波液相制备色谱（200920274485. 8 )分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率 500~1000KHz，流速 50~500mL/min，紫外检测器波长 260~280nm; (7) 纯化后的壁虎蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~501：、时间18~2611干燥制 备成冻干蛋白粉。
[0032] 实施例4: (1) 将1000 g壁虎蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至2MPa，时间40min，然后迅速释放压力至常压，壁虎蛆虫被膨化 成粉体； (2) 膨化粉碎后的壁虎蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入6Kg液态二氧化碳、200mL乙醇及150g氯化铵，加压至6MPa，形成膨胀溶剂体系，保持 温度20°C，时间lOmin，壁虎蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成壁虎蛆虫蛋 白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液； (3) 收集含有壁虎蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径50Mm的微孔过滤器过滤去处固体杂 质； (4) 溶液用孔径IOOnm的超滤