狗骨蛆虫蛋白质的制备方法及其在制备抗皮肤癌药品中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种药物的制备方法及其新用途，尤其是狗骨蛆虫蛋白质的制备方法 及其在制备抗皮肤癌药品中的应用。
【背景技术】
[0002] 皮肤癌是一种生长在皮肤上的癌症，皮肤癌包括鳞状细胞癌、基底细胞癌、恶性黑 色素瘤、恶性淋巴瘤、特发性出血性肉瘤、汗腺癌、隆突性皮肤纤维肉瘤、血管肉瘤等。
[0003] 皮肤癌部位浅表，易于诊断，采用手术切除、放射疗法、冷冻疗法、激光疗法、局部 药物物理腐蚀疗法和化学疗法。
[0004] CN103816116A公开了一种治疗皮肤癌的药物及其制备方法，该发明涉及盐酸氨基 乙酰丙酸和中药有效成分混合制备，溶剂则为乙醇、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇、丙三醇及 水。
[0005]CN102232943A公开了用于抑制皮肤癌肿瘤细胞生长的牛樟芝环己烯酮化合物。该 发明论述了由牛樟芝萃取物中分离纯化得到的一种环己烯酮化合物，该化合物具有抑制皮 肤癌肿瘤细胞的生长并可以用于药物组合物中。
[0006]CN103142653A公开了一种治疗皮肤癌组合药物及其制备方法，该发明的组合药物 由轻粉、蟾酥、壁虎、硫磺、硇砂、凡士林组成，并制备成软膏剂。
[0007] CN104013759A公开了一种治疗皮肤癌的药物组合物，该发明的药物组合物由蛇床 子、龙葵、白癣皮、蒲公英、血竭、炉甘石、密陀僧、乳香、没药、雄黄、五倍子、黄柏、白砒等16 种中药组成。
[0008]CN102895414A公开了一种治疗浅表类型癌症的中药膏，该中药膏由壁虎、独角莲、 乌骨藤、狼毒、乳香、没药、水蛭、冰片组成，涂抹在透气布料上，覆以塑料膜或蜡质膜成为中 药膏。
[0009] CN103070825A公开了一种肌肉或皮下注射用姜黄素微粒混悬液及其制备方法和 用途，该发明描述了制备注射用姜黄素微粒混悬液的制备工艺。
[0010] CN103142653A公开了紫草素和/或其衍生物在制备抑制癌细胞转移药物中的应 用，本发明提供了一种紫草素及其衍生物的用途。
[0011] 狗骨是犬科动物犬的骨骼，骨质坚实，性味：辛、咸，温。狗骨含脂肪16%、骨胶原 12%、水分50%、无机物22%，无机物中含磷酸钙60%、碳酸钙10%和磷酸镁2%，具有健脾和络、 活血生肌的功能。
[0012]CN102783460A公开了人工培殖狗骨蛆虫工艺，该发明以狗骨等原料经粉碎、糊化 配制成特殊功能的培养基，培殖生成狗骨蛆虫，将狗骨中特殊胶原成分转换为小分子成分， 该成分具有较强活性，适合于皮肤病的治疗。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是提供一种狗骨蛆虫蛋白质的制备方法及其在制备抗皮肤癌药品 中的应用，根据皮肤癌的病灶特性及狗骨蛆虫蛋白质生物活性特点，两者相结合制备的药 剂具有适应性强、疗效好的特点。
[0014] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的： (1)将1000 g狗骨蛆虫在常温膨化装置（200520108339.X)中常温条件下膨化粉碎。
[0015] 本步骤中，所述膨化压力为0?l~5MPa，时间为10~60min。
[0016] (2)膨化粉碎后的物料加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中，加入 膨胀溶剂并加压至2~10MPa，形成膨胀溶剂体系，提取出狗骨蛆虫蛋白质粗品。
[0017] 本步骤中，所述膨胀溶剂由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及 100~300gNH3 ?H2O组成或由l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵组 成。
[0018] 本步骤中，所述提取温度为10~20°C，时间为10~30min。
[0019] (3)收集含有狗骨蛆虫蛋白质粗品的溶液并且用微孔过滤器过滤去掉杂质。
[0020] 本步骤中，所述微孔过滤器的孔径为0. 5~50Mm。
[0021] (4)用超滤机超滤处理，收集含有相应分子量的狗骨蛆虫蛋白质超滤溶液。
[0022] 本步骤中，所述超滤机的孔径为50~100nm。
[0023] (5)超滤液溶解在适宜的溶剂中用固相萃取柱分离，收集洗脱成分。
[0024] 本步骤中，所述溶剂为乙腈。
[0025] (6)将洗脱成分溶解在合适的溶剂体系中，用超声驻波液相制备色谱 (200920274485. 8)分离纯化。
[0026] 本步骤中，所述溶剂体系由正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)组成或 4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比）组成。
[0027] (7)纯化后的狗骨蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机制备成冻干蛋白粉。
[0028] 本步骤中，所述真空冷冻干燥温度为_30~50°C、时间为18~26h。
[0029] (8)赋予不同的药用辅助材料，可用于制备抗皮肤癌药品。
[0030] 本技术方案中分离的纯化狗骨蛆虫蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳、双向聚丙烯酰 胺凝胶电泳及琼脂聚糖免疫电泳谱上测得非均一蛋白质；用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 及葡聚糖凝胶G-75凝胶过滤法测得相对分子量为10. 9~12. 6KPa;用等电聚焦发测定其等 电点为PH8. 8~10. 2;常规化学法分析结果表明其不含糖基；紫外分光光度法测定纯化的狗 骨蛆虫蛋白质含量为96. 7%。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限如此，凡是对 本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵 盖在本发明的保护范围中。
[0032] 实施例1: (1)将1000 g狗骨蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至0.l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，狗骨蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的狗骨蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL甲醇及100~300gNH3 ?H2O,加压至2~10MPa，形成膨 胀溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，狗骨蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压 至常压，生成狗骨蛆虫蛋白质粗品与甲醇-NH3 ?H2O的混合液； (3) 收集含有狗骨蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处固 体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的狗骨蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率500~1000KHz， 流速50~500mL/min，紫外检测器波长260~280nm; (7) 纯化后的狗骨蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~501：、时间18~2611干燥制 备成冻干蛋白粉。
[0033] 实施例2: (1) 将1000 g狗骨蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至0.l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，狗骨蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的狗骨蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入5Kg液态二氧化碳、300mL甲醇及200gNH3 ?H2O,加压至5MPa，形成膨胀溶剂体系，保持 温度15°C，时间20min，狗骨蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成狗骨蛆虫蛋 白质粗品与甲醇-NH3 ?H2O的混合液； (3) 收集含有狗骨蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径30Mm的微孔过滤器过滤去处固体杂 质； (4) 溶液用孔径IOOnm的超滤机超滤处理，压力0. 5MPa，温度为常温，收集含有相应分 子量的狗骨蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用80%乙腈活化预处理，加0. 05%三氟乙 酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用1〇~80%的乙腈梯度脱洗，流速 5mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在4. 5%聚乙二醇-7%葡聚糖T500 (重量比)溶剂体系中，用超声驻 波液相制备色谱（200920274485. 8)分离纯化，超声波功率I. 0KW，频率500KHz，流速200mL/ min，紫外检测器波长260nm; (7) 纯化后的狗骨蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~40°C、时间20h干燥制备 成冻干蛋白粉。
[0034] 实施例3: (1)将1000 g狗骨蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至0.l~5MPa，时间10~60min，然后迅速释放压力至常压，狗骨蛆 虫被膨化成粉体； (2) 膨化粉碎后的狗骨蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入l~10Kg液态二氧化碳、100~500mL乙醇及100~300g氯化铵，加压至2~10MPa，形成膨胀 溶剂体系，保持温度l〇~20°C，时间10~30min，狗骨蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至 常压，生成狗骨蛆虫蛋白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液； (3) 收集含有狗骨蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径0. 5~50Mm的微孔过滤器过滤去处固 体杂质； (4) 溶液用孔径50~100nm的超滤机超滤处理，压力0. 3~0. 8MPa，温度为常温，收集含有 相应分子量的狗骨蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用50~100%乙腈活化预处理，加 0. 02~0. 1%三氟乙酸-水平衡，用10%乙腈溶液溶解的超滤溶液上柱，常温下用10~80%的 乙腈梯度脱洗，流速l~l〇mL/min，收集相关梯度的洗脱成分； (6) 将洗脱成分溶解在正丁醇-乙酸乙酯-水(体积比1. 25:3. 75:5)溶剂体系中， 用超声驻波液相制备色谱（200920274485. 8 )分离纯化，超声波功率0. 2~3. 0KW，频率 500~1000KHz，流速 50~500mL/min，紫外检测器波长 260~280nm; (7) 纯化后的狗骨蛆虫蛋白质用真空冷冻干燥机在温度-30~501：、时间18~2611干燥制 备成冻干蛋白粉。
[0035] 实施例4: (1) 将1000 g狗骨蛆虫干燥品装入常温膨化装置（200520108339.X)中，对膨化装置内 充入二氧化碳气体并加压至2MPa，时间40min，然后迅速释放压力至常压，狗骨蛆虫被膨化 成粉体； (2) 膨化粉碎后的狗骨蛆虫粉体加入到膨胀溶剂体系提取装置（201210179076. 6)中， 加入6Kg液态二氧化碳、200mL乙醇及150g氯化铵，加压至6MPa，形成膨胀溶剂体系，保持 温度20°C，时间lOmin，狗骨蛆虫粉体中的蛋白质溶解，然后降压至常压，生成狗骨蛆虫蛋 白质粗品与乙醇-氯化铵的混合液； (3) 收集含有狗骨蛆虫蛋白质粗品的溶液，用孔径50Mm的微孔过滤器过滤去处固体杂 质； (4) 溶液用孔径IOOnm的超滤机超滤处理，压力0. 5MPa，温度为常温，收集含有相应分 子量的狗骨蛆虫蛋白质超滤溶液； (5) 超滤溶液用20%乙腈溶解，C18固相萃取柱用60%乙腈活化预处理，加0. 08%三氟乙 酸-水平衡，用