专利名称：含有识别hlai类的抗体作为有效成分的化疗药物耐药性癌症的治疗剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有识别HLA I类的抗体作为有效成分的化疗药物耐 药性癌症的治疗剂及其应用。另外，还涉及治疗化疗药物耐药性癌症 的方法，该方法包括对给药对象给予识别HLAI类的抗体的工序。
背景技术：
HLA是在将外源抗原、细菌、病毒感染细胞等与异物识别、除去 的免疫反应中重要的分子。HLA分子的主要作用是将抗原肽呈递给 CD8+T细胞，所述抗原肽是由在细胞中生产的8-10个残基左右的氨基 酸形成的，HLA分子在由肽呈递诱导的免疫应答和免疫耐受中有非常 重要的作用。HLA分为I类和II类，I类由包含al 3的3个区域(domain) 的45KD的a链和12KD的卩2微球蛋白(p2M)的异源二聚体形成，II 类由包含al、 a2的2个区域的30 34KD的a链和包含pl、 p2的2个 区域的26 29KD的p链的异源二聚体形成。而且，已知HLAI类(HLA-I)中存在HLA-A、 B、 C等(在以下中，将HLA-A也称为"HLA I类 A(HLA國IA)，，)。
迄今为止，报道了，在淋巴细胞中以抗HLA I类A抗体连接的 (ligated with an anti-HLA class IA antibody)细月包增殖抑制效果和细胞， 死亡诱导效果，这表明HLA分子作为信号传导分子的可能性。例如有 报道抗人HLA I类A的al区域的抗体B9.12.1、抗a2区域的抗体 W6/32、抗a3区域的抗体TP25.99和A1.4，对于活化淋巴细胞抑制细 胞增殖(非专利文献1、2)。另有报道抗al区域的两种抗体MoAb90、 YTH862对于活化淋巴细胞诱导凋亡(apoptosis)(非专利文献2、 3、 4 )。 已知由这两种抗体诱导的凋亡是胱天蛋白酶介导的反应(非专利文献 4)。由此可以推测在淋巴细胞细胞中表达的HLA I类A也与凋亡
的信号传导有关。
而且，有报道抗人HLAI类A的a3区域的抗体5H7(非专利文 献5)、抗小鼠MHCI类的a2区域的抗体RE2 (非专利文献6)，在活化淋巴细胞等中也诱导细胞死亡。
有报道将人骨髓瘤细胞免疫而得到的单克隆抗体2D7 (非专利文献8 )也是识别HLA I类A的抗体，通过使该2D7低分子化(双抗体化)，对人骨髓瘤细胞林在短时间内诱导剧烈的细胞死亡。另外，对小鼠免疫使人HLA I类A和人p2M共表达的细胞而得到的单克隆抗体C3B3 (专利文献5)是识别HLA I类抗原的a2区域的抗体，通过与抗小鼠IgG抗体交联，显示出强细胞毒活性(cytotoxic activity),进而通过将该C3B3抗体变为低分子化抗体(C3B3双抗体(diabody))，从而单独的C3B3双抗体(C3B3-DB)比单独的2D7双抗体也显示出更强的抗肿瘤作用(专利文献5)。
2D7双抗体和C3B3双抗体对各种人骨髓瘤细胞林以及活化淋巴细胞显示出强的细胞死亡诱导活性，在对小鼠移植了骨髓瘤细胞林的多发性骨髓瘤模型小鼠中，也显示出显著的延长寿命的效果，由此作为骨髓瘤治疗药的开发正在进行(专利文献l-5、非专利文献7)。如果进一步发展这种利用HLA I类相关的细胞死亡诱导的治疗，可以期待开发对骨髓瘤等有效性高的药品。
作为对恶性肿瘤的化学疗法中存在的问题，已知有在肿瘤细胞中诱导属于ATP结合盒(ABC)转运蛋白总科的MDR1(P糖蛋白，多抗药性蛋白1, ATP结合盒亚科B成员1 (ABCB1))的表达。该MDR1表达与肿瘤细胞的药物(化疗药物)抗药性的获得有关，成为之后化学疗法效果减弱的主要原因。因此，对MDR1表达肿瘤，克服抗药性之类的治疗战略的开发是^艮重要的课题。由于MDR1具有将细胞内的药物向细胞外排出的作用，因此尝试了使用ABC转运蛋白抑制剂维拉帕米等来抑制其作用的疗法，但还没有确定临床有效性。另一方面，有报道在MDR1表达肿瘤中HLAI类分子为高表达(非专利文献9、 10)。
此外，本申请的发明相关的背景技术文献信息如下所示。
专利文献l: WO2004/033499
专利文献2: WO2005/056603
专利文献3: WO2005/100560
专利文献4: WO2006/123724
专利文献5: PCT/JP2007/063946
非专利文献1: Fayen et al.， Int. Immunol. (1998) 10: 1347-1358非专利文献2: Genestier et al.， Blood (1997) 90: 3629-3639非专利文献3: Genestier et al" Blood (1997) 90: 726-735非专利文献4: Genestier et al.， J. Biol. Chem. (1998) 273: 5060-5066非专利文献5: Woodle et al.， J. Immunol. (1997) 158: 2156-2164非专利文献6: Matsuoka et al.， J. Exp. Med. (1995) 181: 2007-2015非专利文献7: Kimura， et al" Biochem. Biophys. Res. Commun.
(2004) 325: 1201-1209
非专利文献8:冈达三三共生命科学财团研究报告集(1998) 12:
46-56
非专利文献9: Neoplasma (2003) 50 (2): 91-96
非专利文献10: Prados J. et al" Neoplasm (2006) 53 (3): 226-231
非专利文献11: Journal of Internal Medicine (2000) 247: 521-53
发明内容
发明所要解决的问题
本发明鉴于上述情况而进行，其目的在于提供一种化疗药物耐药性癌症的治疗剂，该治疗剂含有识别HLA I类的抗体作为有效成分。另外，还提供一种治疗化疗药物耐药性癌症的方法，该方法包括对给药对象给予识别HLAI类的抗体的工序。
解决问题的方法
为了解决上述问题，本发明人等研究了作为C3B3抗体的低分子型抗体的C3B3双抗体(C3B3-DB)对抗药性肿瘤细胞的效果。
首先确认了 在化疗药物(长春新碱)耐药性的血液肺瘤细胞林中，MDRl和HLA-IA (HLA I类A)蛋白质为高表达；以及将来源于血液肿瘤患者的肿瘤细胞在初诊时和复发时进行比较，复发时MDR1和HLA-IA蛋白质为高表达。
继而明确了该化疗药物耐药性血液肿瘤细胞林中，由C3B3双抗体产生的细胞毒活性与亲本林相比在低浓度被诱导。另外明确了如果用C3B3双抗体(0.1ng/mL)对化疗药物耐药性血液肿瘤细胞林进行6小时前处理，与不进行前处理的情况相比，化疗药物(长春新碱)产生的细胞损伤增强。进而明确了如果用C3B3双抗体(0.1jig/mL)对化疗药物耐药性血液肿瘤细胞林进行前处理，则细胞表面上的MDR1蛋白质
6的表达在一部分细胞中降低，细胞中的药物摄入量增加。
即，发现了对于HLAI类高表达的MDR1表达肿瘤细胞，C3B3双抗体发挥抗肿瘤活性，以及具有克服抗药性的作用，由此完成了本发明。
更加具体地，本发明提供以下的[1
[43]。所述的化疗药物耐药性癌症的治疗剂，其特征在于，抗体是低分子化抗体。所述的化疗药物耐药性癌症的治疗剂，其特征在于，与化疗药物并用。化疗药物的作用增强剂，其含有识别HLAI类的抗体作为有效成分。根据[5所述化疗药物的作用增强剂，其特征在于，抗体是低分子化抗体。根据[5]或6]所述的化疗药物的作用增强剂，其特征在于，与化疗药物并用。根据[5]~[7]中任一项所述的化疗药物的作用增强剂，其特征在于，用化疗药物治疗的癌症是化疗药物耐药性癌症。根据[8]所述的化疗药物的作用增强剂，其特征在于，化疗药物耐药性癌症是血液肿瘤。药物组合物，其含有识别HLAI类的抗体作为有效成分，其特征在于，与化疗药物并用。根据[10或[11]所述的药物组合物，其特征在于，抗体是低分子化抗体。根据[13所述的癌症治疗用药物組合物，其特征在于，抗体是低分子化抗体。根据[10
[14]中任一项所述的药物组合物，其特征在于，用化疗药物治疗的癌症是化疗药物耐药性癌症。根据[15]所述的药物组合物，其中化疗药物耐药性癌症是血液肺瘤。根据17]所述的方法，其特征在于，抗体是低分子化抗体。[19p艮据[17或[18所述的方法，其特征在于，与化疗药物并用。[201根据[17
[191中任一项所述的方法，其特征在于，化疗药物耐
药性癌症是血液肺瘤。增强化疗药物作用的方法，该方法包括对给药对象给予识别
HLAI类的抗体的工序。所述的方法，其特征在于，抗体是低分子化抗体。[23根据[21或[22所述的方法，其特征在于，与化疗药物并用。[24根据[21
[23]中任一项所述的方法，其特征在于，用化疗药物
治疗的癌症是化疗药物耐药性癌症。根据[261所述的方法，其特征在于，抗体是低分子化抗体。[28根据[26]或[27所述的方法，其特征在于，癌症是化疗药物耐
药性癌症。根据[30所述的用途，其特征在于，抗体是低分子化抗体。[32]根据[30]或[31]所述的用途，其特征在于，化疗药物耐药性癌症是血液肿瘤。所述的用途，其特征在于，抗体是低分子化抗体。35根据[33或[34所述的用途，其特征在于，通过化疗药物来治
疗的癌症是化疗药物耐药性癌症。根据[351所述的用途，其特征在于，化疗药物耐药性癌症是血
液肺瘤。根据[37所述的用途，其特征在于，抗体是低分子化抗体。[39]根据[37]或[38所述的用途，其特征在于，癌症是化疗药物耐
药性癌症。识别HLA I类的抗体，其在用于增强化疗药物作用的方法中使用。等的微胶嚢)，或者制成胶体药物传递系统(脂质体、白 蛋白微球、微乳、纳米粒及纳米胶嚢等)(参照"Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980)。而且，还公知有 将药物制成緩释制剂的方法，可适用于本发明(Langer et al.， J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15: 167-277; Langer， Chem. Tech. (1982) 12: 98-105; 美国专利No. 3,773,919;欧洲专利申请公开(EP) No. 58，481; Sidman et al" Biopolymers (1983) 22: 547-556; EP 133,988)。
使用的制剂上容许的载体可以根据剂型从上述之中适当选择或者 进行组合，但并不局限于此。
本发明还涉及治疗化疗药物耐药性癌症的方法，该方法包括将识 别HLA I类的抗体对对象给药的工序。另外，本发明还涉及诱导细胞 死亡的方法以及治疗癌症的方法，其特征在于将化疗药物与识别HLAI 类的抗体并用。
本发明中，"对象"是指给予本发明化疗药物耐药性癌症的治疗剂 的生物体、该生物体体内的一部分。生物体没有特别限定，包括动物 (例如，人、家畜动物种、野生动物)。对上述的"生物体体内的一部 分"没有特别限定。
本发明中，"给药"包括口服或胃肠外给药。作为口服给药，可以 列举以口服制剂的形式给药，作为口服制剂，可以选择颗粒剂、散剂、
片剂、胶嚢剂、溶液剂、乳剂或混悬剂等剂型。作为胃肠外给药，可以列举以注射剂形式的给药，作为注射剂，
可以列举静脉注射剂、皮下注射剂、肌肉注射剂或腹腔内注射剂等。 另外，可以通过使用基因治疗的方法将包含要给予的寡核苷酸的基因 引入生物体，来达到本发明方法的效果。另外，也可以将本发明的药 物在要进行处置的区域进行局部给药。例如，通过手术中的局部注入、 导管的使用、或者通过本发明的编码蛋白的DNA的定向基因送递来进 行给药。
对对象给予本发明的药剂，可以一次给药，也可以连续给药。
另外，对从生物体摘出或排出的生物体的一部分进行给药时，也 可以使本发明的药剂与生物体的一部分"接触"。
另外，本发明中"接触，，根据生物体的状态进行。例如，可以列举 向生物体的一部分散布本药剂、或者向生物体的一部分的破碎物添加 本药剂等，但并不局限于这些方法。生物体的一部分为培养细胞时， 向该细胞的培养液添加本药剂、或者将含有本发明寡核苷酸的DNA引 入到构成生物体的一部分的细胞中，由此也可以进行上述的"接触"。
此外，本说明书中引用的全部背景技术文献作为参照引入本说明 书中。
实施例
以下，通过实施例进一步具体地说明本发明，但本发明并不局限 于这些实施例。化疗药物(长春新碱)耐药性血液肿瘤细胞林的建立 在长春新碱的存在下培养急性髓细胞白血病细胞林HL60 (American Type Culture Collection, Manassas, VA， USA)、 和伯基特淋 巴瘤细胞林BLTH(由德岛大学广濑先生提供，Br. J. Cancer (1987) 56: 413-417),;彈到长春新碱抗药性细月包林HL60-R和BLTH-R。肿瘤细胞林中mdrlmRNA和HLAI类表达量的确认 最初对HL60、 HL60-R、 BLTH和BLTH-R中mdrl mRNA表达， 使用RT-PCR进行确认；对细胞表面上的MDR1蛋白质及HLAI类蛋 白质表达，使用流式细胞术进行确认。
通过使用了特异性引物(5，-CCC ATC ATT GCA ATA GCA GG (序列号13)、 3，-GTT CAA ACT TCT GCT CCT GA (序列号14))的RT-PCR来研究这些细胞中的mdrl mRNA表达。作为对照，使用特异 性引物(5，画ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA (序列号15) 、 3，-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG (序列号16))来研究卩2-微球蛋白mRNA 的表达。
通过使用了抗MDRl抗体(UIC國2， Chemicon, Temecula， CA， USA) 和FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体(Biosource, Camarillo， CA， USA)的流 式细胞术来研究细胞表面的MDRl表达。使用小鼠IgG(BD Biosciences, San Jose， CA， USA)作为对照抗体。
其结果，在作为亲本林的HL60和BLTH中未发现mdrl mRNA 的表达，但在作为长春新碱抗药性林的HL60-R和BLTH-R中发现了 mdrl mRNA的表达(
图1 )。
另外，比较了这些细胞的细胞表面上的HLAI类表达强度。HLAI 类的表达4吏用Alexa 488 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)标记的 C3B3抗体通过流式细胞术进行测定。其结果表明，在任意长春新碱抗 药性林中细胞表面上的HLAI类的表达增强(图2)。
对急性髓细胞白血病患者的初诊时和复发时得到的肿瘤细胞同样 通过流式细J!包术进行解析，确i人肺瘤细胞表面上的MDRl和HLAI类 表达量。其结果可以确认，与初诊时相比，复发时MDRl的表达被诱 导(图3) ， HLAI类的表达也增强(图4)。
[实施例3肿瘤细胞林中的C3B3-DB的细胞毒活性
首先，使用这些肿瘤细胞研究对C3B3-DB的敏感性。对于C3B3-DB 的抗肿瘤活性(细胞毒活性)，在各种浓度的C3B3-DB存在下培养这些 肿瘤细胞，之后通过使用了 WST-8 (Kishida Chemicals, Osaka)的细胞 增殖试验来进行测定。
在C3B3-DB的存在下将这些细胞培养24小时，比较细胞的生存 率，之后在作为长春新碱抗药性林的HL60-R和BLTH-R中，从更低 浓度的C3B3-DB诱导细胞损伤(图5)。
进而，在C3B3-DB (0.1ng/mL)存在下或非存在下将这些细胞培养 6小时后，添加长春新碱，对是否克服(改善)化疗药物耐药性肿瘤细胞 的抗药性进行研究。在作为亲本抹的HL60和BLTH中，有无C3B3-DB 的前处理几乎不会影响诱导由长春新碱引起的浓度依存性细胞损伤， 以及C3B3-DB前处理引起的长春新碱的细胞毒活性的增强效果尚未明确。另一方面明确了，在HL60-R和BLTH-R中，通过C3B3-DB的前 处理增强了由长春新碱引起的细胞毒活性(图6)。 [实施例4
为了明确C3B3-DB引起的克服药物(化疗药物)抗药性的机理， 对于将这些细胞用C3B3-DB (0.1fig/mL)处理6小时后的细胞表面上的 MDR1表达进行研究。明确了，用C3B3-DB处理后， 一部分细胞中 MDR1的表达降低(图7)。而且，将这些细胞用C3B3-DB处理后， 在柔红霉素(0.1ng/mL、明治制果、东京)的存在下进行培养，对细胞内 的柔红霉素的摄入量进行比较。
具体;也，对于药物的细月包内才聂入(累积相；accumulation phase), 通过以下方法评价在C3B3-DB存在下或非存在下培养2小时后，添 加柔红霉素，培养30分钟，将细胞洗净后使用流式细胞术测定PE强 度。对于药物的细胞内残留(流出相；efflux phase),在上述方法之后进 一步培养30分钟，同样用流式细胞术进行评价。
其结果，亲本林中在累积相和流出相中均摄入一定量的柔红霉素， 未发现C3B3-DB的前处理带来的影响。另一方面明确了，在长春新碱 抗药性林中，在任意相中柔红霉素的摄入量均显著减少，但通过 C3B3-DB的前处理，摄入量显著增加(图8)。
由以上可以确认在抗药性抹和来源于复发的急性髓细胞白血病 患者的肺瘤细胞中，细胞表面上的MDR1表达被诱导，同时HLAI类 的表达增强。作为HLAI类高表达的机理，考虑可能是由MDR1的转 运功能引起的。
C3B3-DB，对高表达HLA I类的抗药性肿瘤细胞，诱导由特异性 抗体单独产生的细胞损伤。另外，与化疗药物的并用，使药物引起的
细胞毒活性增强。其机理明确为C3B3-DB使这些细胞的MDR1的表 达降低，由此增强化疗药物的细胞内摄入量。
由以上结果可知，通过将C3B3-DB与化疗药物并用，可以克月良 MDR1表达肿瘤细力包的抗药性。
工业适用性
根据本发明可提供含有识别HLA I类的抗体作为有效成分的化 疗药物耐药性癌症的治疗剂；以及治疗化疗药物耐药性癌症的方法，该方法包括对对象给予识别HLAI类的抗体的工序。
在对恶性肿瘤的化疗中，对于作为使化疗效果降低的主要原因的 MDR1表达肿瘤来说，使克服抗药性之类的治疗战略的开发成为重要 的课题。利用本发明的治疗剂，即使是具有抗药性的MDR1表达肿瘤， 耙向HLA I类分子的免疫学治疗方法也是可能的。
权利要求
1.化疗药物耐药性癌症的治疗剂，其含有识别HLA I类的抗体作为有效成分。
2. 权利要求1所述的化疗药物耐药性癌症的治疗剂，其特征在于， 抗体是低分子化抗体。
3. 权利要求1或2所述的化疗药物耐药性癌症的治疗剂，其特征 在于，与化疗药物并用。
4. 权利要求1~3中任一项所述的化疗药物耐药性癌症的治疗剂， 其特征在于，化疗药物耐药性癌症是血液肺瘤。
5. 化疗药物的作用增强剂，其含有识别HLAI类的抗体作为有效 成分。
6. 权利要求5所述的化疗药物的作用增强剂，其特征在于，抗体 是低分子化抗体。
7. 权利要求5或6所述的化疗药物的作用增强剂，其特征在于， 与化疗药物并用。
8. 权利要求5~7中任一项所述的化疗药物的作用增强剂，其特征 在于，用化疗药物治疗的癌症是化疗药物耐药性癌症。
9. 权利要求8所述的化疗药物的作用增强剂，其特征在于，化疗 药物耐药性癌症是血液肿瘤。
10. 含有识别HLA I类的抗体作为有效成分的药物组合物，其特 征在于，与化疗药物并用。
11. 含有识别HLA I类的抗体作为有效成分的癌症治疗用药物组 合物，其特征在于，与化疗药物并用。
12. 权利要求10或11所述的药物组合物，其特征在于，抗体是低 分子化抗体。
13. 癌症治疗用药物组合物，其含有化疗药物和识别HLA I类的 抗体作为有效成分。
14. 权利要求13所述的癌症治疗用药物组合物，其特征在于，抗 体是低分子化抗体。
15. 权利要求10~14中任一项所述的药物组合物，其特征在于，用 化疗药物治疗的癌症是化疗药物耐药性癌症。
16. 权利要求15所述的药物组合物，其特征在于，化疗药物耐药性癌症是血液肿瘤。
17. 治疗化疗药物耐药性癌症的方法，该方法包括对对象给予识别 HLAI类的抗体的工序。
18. 权利要求17所述的方法，其特征在于，抗体是低分子化抗体。
19. 权利要求17或18所述的方法，其特征在于，与化疗药物并用。
20. 权利要求17~19中任一项所述的方法，其特征在于，化疗药物 耐药性癌症是血液肺瘤。
21. 增强化疗药物作用的方法，该方法包括对对象给予识别HLAI 类的抗体的工序。
22. 权利要求21所述的方法，其特征在于，抗体是低分子化抗体。
23. 权利要求21或22所述的方法，其特征在于，与化疗药物并用。
24. 权利要求21 23中任一项所述的方法，其特征在于，用化疗药 物治疗的癌症是化疗药物耐药性癌症。
25. 权利要求24所述的方法，其特征在于，化疗药物耐药性癌症 是血液肿瘤。
全文摘要
本发明人等明确了在高表达MDR1和HLA I类A蛋白质的化疗药物耐药性血液肿瘤细胞株中，与亲本株相比，以低浓度诱导C3B3双抗体带来的细胞毒活性。另外明确了如果对该化疗药物耐药性血液肿瘤细胞株进行C3B3双抗体前处理，则化疗药物单独引起的细胞损伤增强，细胞中的药物摄入量增加。即，发现了对于高表达HLA I类的MDR1表达肿瘤细胞，C3B3双抗体发挥抗肿瘤活性，并具有克服抗药性的作用。
文档编号A61P43/00GK101687034SQ200880015359
公开日2010年3月31日 申请日期2008年3月12日 优先权日2007年3月12日
发明者安倍正博, 尾崎修治, 松本俊夫 申请人:中外制药株式会社