专利名称：：天然多糖凝胶剂在制备用于治疗关节退行性变的可注射制剂中的应用的制作方法天然多糖凝胶剂在制备用于治疗关节退行性变的可注射制剂中的应用本发明涉及无菌的、可注射的凝胶剂形式的含水制剂，该制剂包含透明质酸(或其盐中的一种)和一种或多种多元醇，有或者没有天然来源的其它多糖。该可注射制剂在关节退行性变的治疗中被用在关节内间隙内。关节是可将两个骨连接在一起并赋予两个骨相对于彼此以移动性的接合点。滑膜关节是为数众多的关节，特别是在四肢内。在这些关节中，骨通过充满液体的腔连接，所述液体即具有粘性又具有弹性，并且被称为滑液。滑液决定着关节的良好动作和保护。其特别地包括多糖透明质酸，其赋予滑液以粘弹性，使得有可能以基于强加的约束而润滑关节或吸收冲力。在关节退行性变诸如膝骨关节炎(特别是由于诸如肥胖症、遗传、外伤等因素所造成的退行性变)的情况下，滑液降解(透明质酸的浓度和分子量降低)，并且这--退行性变减少了滑液润滑关节和吸收冲力的能力。粘弹补充治疗(viscos叩plementation)包括将凝胶注入关节内，从而代替不足的滑液。粘弹补充治疗可以缓解疼痛或止痛，并且有助于修复关节的移动性。目前上市的粘弹补充治疗产品是含有透明质酸的凝胶剂。这些凝胶剂可以基于动物来源或非动物来源的透明质酸并且可经过交联(例如Synvisc，Durolane)或未经交联(例如Synocrom，Arthrum，Lubravisc,Structovial)。本领域技术人员公知的是，基于透明质酸的凝胶剂在关节内的持久性较低(从数小时到数天)。根据Laurent的"TheChemistry,BiologyandMedicalApplicationsofHyaluronananditsDerivatives,Wenner-GrenInternationalSeries,Volume72，"，1%的玻尿糖苷溶液在兔关节内的半衰期是12小时，以及0.5%的HylanB凝胶剂的半衰期是9天。这一低的持久性(在关节内凝胶剂快速再吸收的动力学)可被解释为是由于透明质酸的降解(通过解聚发生)所致。透明质酸在关节内降解的主要因素是自由基降解，在37'C的热降解和机械降解(酶催降解在关节内不是重要的降解因素)。尽管粘弹补充治疗的疗效具有比其在关节内的停留时间更的性质，但是在关节内基于透明质酸计算的凝胶的持久性是突出的控制产品有效性的参数。因此，基于透明质酸的凝胶剂在关节内的停留吋间越长，W'J粘弹纟I、充治疗治疗更有效(疼痛减少，移动性增加)。因此，凝胶剂在关节内的停留时间(持久性)的增加是增加使用基于透明质酸的凝胶剂进行粘弹I卜充治疗的有效性的基本点。本领域技术人员公知的是，增加透明质酸的浓度，使用高分子量透明质酸和透明质酸的交联/接枝技术，使得有可能改善基于透明质酸的凝胶剂的持久性。然而，上述各种参数的优化似乎不足以获得基于透明质酸的凝胶剂的持久性，从而不显著增加关节内时段(目前上市的粘弹补充治疗凝胶剂在关节内的半衰期最多只有数天)。在绝对意外的和惊讶的开发中，据证实.--在基于透明质酸的无菌的含水制剂中存在多元醇使得有可能显著增加该凝胶剂的抗降解性。5-在无菌凝胶剂内的透明质酸和多元醇的强亲合性涉及多元醇向凝胶剂外释放的缓慢动力学在透明质酸和多元醇之间的这一亲合性通过协同作用参予了多元醇对凝胶剂的有效的、远期的保护。-对于透明质酸和多元醇的含水制剂的具体组合物而言，灭菌给出了该凝胶剂粘弹性，该粘弹性在它们事实上重现未被污染的滑液的粘弹性方面绝对使人惊讶一凝胶剂的这些特定的流变性质在由"透明质酸/多元醇"系统作用所诱导的对抗降解的保护期间得以更长久的保持。因此，本发明涉及无菌的、可注射的凝胶剂形式的含水制剂，其包括透明质酸(或其盐中的一种)以及一种或多种多元醇，有或者没有天然来源的其它多糖。该制剂当被用于治疗关节退行性变时，在一些情况下(参见实施例1和3)显示的流变学接近滑液的流变学并且始终显示增加的抗降解性。实施例4S示了当多元醇经历A由基降低、热降解和机械降解试验时，基—f透明质酸的凝胶剂的最好的抗降解性。凝胶剂的这'iii好抗降解性使fg被注入关节内间隙内的凝胶剂的持久性更长。实施例5显示了基于透明质酸的凝胶剂和多元醇的最好的抗热降解性。凝胶剂的这一最好的抗热降解性使得被注入关节内间隙内的凝胶剂的持久性更长，以及使得该产品在使用前的储存期问的制剂稳定性更好(产物失效期的要点)。实施例8证明了在透明质酸和多元醇之间的强亲合性。被注入关节后，在透明质酸和多元醇之间的强亲合性通过协同作用使得凝胶剂具有更好的长期抗降解性。实际上，在将多元醇溶液注入关节内的情况下，天然洗涤会迅速地从关节除去该分子(即多元醇)。在基于透明质酸的凝胶剂与多元醇的情况下，在透明质酸和多兀醇之间的强亲合性将防止多元醇向凝胶剂以外的快速释放(以及多元醇由此从关节以夕卜6的快速消除)，并因此通过多元醇对抗降解来实现对凝胶剂的有效的长期保护作用。实施例1和3显示了基于透明质酸的凝胶剂和多元醇的流变学接近滑液的流变学。MAZZUCCO，D.等人，"RheologyofJointFluidinTotalKneeArthroplastyPatients";Jowr"a/o/(X/zo/ed/c1157-1163，2002的出版物指出，对于膝的未被污染的(非骨关节炎性)滑液，在弹性模量G'和粘性模量G"之间的分频频率等于0.41±0.12Hz。这一分频频率值被Fam等人的"RheologicalPropertiesofSynovialFluids,，，Biorheology,44，59-74，2007的出版物所证实。在该出版物中，附图具有模量G'和G"之间的分频频率为0到Hz，其属于年轻或年长个体的滑液，否则用于骨关节炎滑液。-低于-0.41Hz:G">G'，滑液具有ffi著的粘性作用，意味着当患者静止时关节受到强烈润滑。-高于0.41Hz:G'>G"，滑液具有显著的弹性作用，意味着当患者跑动或跳跃时冲力被强烈吸收。根据本发明的-个方而，包含冇或者没f〗.人然来源的it它多糖i'i勺透明质酸(或其盐中的-种)和一种或多种多兀醇的含水溶液在经过火菌后，在弹性模量G'和粘性模量G"之间的分频频率fc接近于0.41Hz。因此，该凝胶剂具有的粘弹性质与滑液的粘弹性质接近。因此，根据本发明的一个方面-低于fc:G"〉G',该凝胶剂具有显著的粘性作用，意味着当患者静止时关节被有效地润滑。-高于fc:G'〉G"，该凝胶剂具有显著的弹性作用，意味着当患者跑动或跳跃时冲力被有效地吸收(保护关节)。根据本发明的一个方面，分频频率为0到10Hz，优选0.41±0.41Hz。因此这种流变学与关节、特别是膝、髋关节或小关节的机械约束相称。因此，其在通过膝或其它关节的粘弹补充治疗来治疗骨关节炎中具有较大的优势。图1-5显示了根据本发明一个方面的凝胶剂的粘性模量和弹性模量，而图6-9显示了市售的凝胶剂。图10和11说明了凝胶剂的自由基降解、热降解和机械降解的动力学以及透明质酸/多元醇亲合性。因此，本发明涉及使用无菌的、可注射的凝胶剂形式的含水制剂，其包含1-100mg/ml的透明质酸(或其盐中的一种)和0.0001-100mg/ml的一种或多种多元醇，有或者没有天然来源的其它多糖。该可注射制剂在关节退行性变的治疗中被用在关节内间隙内。透明质酸优选通过生物发酵法被获得，但是其也是来自动物来源。其分子量是0.1-10X106Da，优选2-3X106Da。透明质酸的浓度为1-100mg/ml，优选10-25mg/ml。可与透明质酸组合使用的天然来源的多糖选自，例如，硫酸软骨素，角质素，硫酸角质素，肝素，硫酸肝素，纤维素及其衍生物，脱乙酰壳多糖，黄原胶，藻酸盐，及所有的它们各自的盐。透明质酸，正如天然来源的多糖那样，可根据现有技术所述的交联/接枝技术经过交联或未经交联，经过換枝或未经接枝。多元醇选自，例如，甘油，丙二醇，山梨醇，甘露醇，赤藓糖醇，木糖醇，拉克替醇，麦芽糖醇，或其它的环状糖(cyclicoses)诸如葡萄糖。多元醇的浓度为0.0001-100mg/ml，优选15-45mg/ml。使用的含水溶液优选是经过缓冲的溶液。该缓冲溶液的组成经过选择从而具有所需的物理化学性质(pH，重量克分子渗透浓度)和流变性质。优选地，被选择的缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液。根据本发明，制剂通过本领域技术人员公知的技术进行灭菌，并且优选使用高压釜进行。本发明的制剂被用于注入关节内，并且注射剂量根据被治疗关节的性质而异，可以为0.1到20毫升。例如，以下提供了可以根据本发明制备的两个粘弹性凝胶剂制剂-基于透明质酸和甘油的粘弹性凝胶剂含有20mgml的透明质酸(MM=2.5X106D)和20mg/ml的(i、油在磷酸盐缓冲液中的无菌溶液。-基于透明质酸和山梨醇的粘弹性凝胶剂含有20mgml的透明质酸(MM-2.5X106D)和40mg/ml的山梨醇在磷酸盐缓冲液中的无菌溶液。实施例以下提供了实施例用于非限制地说明本发明。在以下实施例中被制备的制剂是基于未经交联的或经过交联的透明质酸钠(NaHA)与多元醇的凝胶剂。未经交联的或经过交联的凝胶剂的制备根据本领域技术人员公知的技术进行。用于生产这些凝胶剂的透明质酸钠具有的分子量等f2.59X106Da。在经过交联的凝胶剂的情况下，使用的交联剂是BDDE，并且使用的交联度的定义是重量(BDDE)/重量(干NaHA)。在凝胶剂中并入多元醇通过向未经交联的或经过交联的凝胶剂中加入必要量的多元醇并且用刮铲将其混合IO分钟来进行(每100克的最终凝胶剂)。将制备好的凝胶剂填装到玻璃注射器中，然后进行湿热灭菌(T=i2rc)。用来测量流变性的流变仪是AR1000(TAInstruments)，其具有40mm的扁平几何形状，1000微米的缝隙，和37'C的分析温度。多元醇的计量通过HPLCUltimate3000(Dionex)和离子交换柱来进行。实施例1:制备本发明的无菌的可注射制剂制剂A:基于未经交联的NaHA与甘油的凝胶剂-15mg的NaHA(2.5xl06D)-20mg的甘油-足够的1ml的磷酸盐缓冲液制剂B:基于未经交联的NaHA与甘油的凝胶剂-20mg的NaHA(2.5xl06D)-20mg的甘油-足够的1ml的磷酸盐缓冲液制剂C:基于未经交联的NaHA与丙二醇的凝胶剂-20mg的NaHA(2.5"06D)-15mg的丙二醇10-足够的lml的磷酸盐缓冲液制剂D:基于未经交联的NaHA与甘露醇的凝胶剂-20mg的NaHA(2.5xl06D)-15mg的甘露醇-足够的1ml的磷酸盐缓冲液制剂E:基于未经交联的NaHA与山梨醇的凝胶剂-20mg的NaHA(2.5><106D)-40mg的山梨醇-足够的1ml的磷酸盐缓冲液制剂F:基于经过交联的NaHA与山梨醇的凝胶剂-18mg的NaHA(2.5xl06D)，交联度-6%-50mg的山梨醇-足够的Iml的磷酸盐缓冲液实施例2:实施例1的制剂的物理化学性质pH(在环境温度)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>-重量克分子渗透浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>制剂A、B、C、D、E和F是等渗的并具有中性pH。实施例3:实施例1的制剂的流变性质制剂A、B、C、D和E的粘弹性质通过测量基于频率的粘性模量(G")和弹性模量(G，)(参见图l-5)进行表征。对于这五个制剂，注意到弹性模量G'和粘性模量G"的分频频率接近于未被污染的滑液的分频频率。F表提供了每种制剂的和未被污染的滑液的分频频率值fc。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>正如本发明所描述的:-低于fc:G">G'，该凝胶剂具有显著的粘性作用，意味着当患者静止时关节被有效地润滑。-高于fc:G'>G"，凝胶具有显著的弹性作用，意味着当患者跑动或跳跃时冲力被有效吸收。实施例4:实施例1的制剂的抗降解性为了显示多元醇在基于NaHA的凝胶剂中的存在使得可能降低凝胶剂由自由基作用、热作用和机械作用所引起的降解，比较了使用多元醇的、基于NaHA的凝胶剂的抗降解性(实施例1的制剂)和不使用多元醇的、基于NaHA的凝胶剂的抗降解性(=参考凝胶剂)。对于实施例1的制剂B、C、D和E，不含多元醇的、基于NaHA的参考凝胶剂是未经交联的基于NaHA的凝胶剂，其具有20mg/ml的NaHA(MM=2.5xl06D，在磷酸盐缓冲液中)_制剂G。对于实施例1的制剂F，不含多元醇的、基于NaHA的参考凝胶剂是交联的、基干NaHA的凝胶剂，其具有18mg/ml的NaHA(在交联前MN/^2.5"060，在磷酸盐缓冲液中)，其具有6%的交联度-制剂H。降解试验如下进行向供试凝胶剂中加入氧化剂，用刮铲将混合物搅匀历时1分钟，使其保持在37'C的温度，并强加0.3%的变形。测量在0.7Hz下的经时参数tan5=G"/G'值(凝胶剂的粘弹性质的特征参数)。注意到该参数随着时间增加而增加，意味着凝胶剂的逐渐破坏。对于制剂B、C、D、E、F、G禾nH，在t-0和t-15分钟测量的值在下表中提供。制剂TanS(t=0分钟)Tan5(t=15分钟)△TanS(%)B1.103.34+204%C1.083.13+205%D1.194.63+289%E1.082.57+138%F0.740.80+8%G1,416.56+365%H0.740.93+26%如本发明所描述的，每个制剂B、C、D和E具有的抗降解性显著高于不含多元醇的凝胶剂(制剂G)的抗降解性。同样地，制剂F具有的抗降解性显著高于相应的不含多元醇的凝胶剂(制剂H)的抗降解性。因此，多元醇保护凝胶剂有效对抗降解。实施例5:含有多元醇的和不含多元醇的制剂的加速老化硏究两个制剂经历在40°C下的加速熔炉老化试验-实施例1的制剂B:基于透明质酸和甘油的溶液-制剂G，未添加醇(在实施例4中描述)-20mg的透明质酸(2.5xl06D)-足够的1ml的磷酸盐缓冲液。在3个时间(t=0，7天，26天)测量零粘度(零-切变粘度)和测定在弹性模量G'和粘性模量G"之间的分频频率fc。14获得的结果在下表中提供:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>承ND-未测得注意到，在加速老化期间，在制剂B的情况下(本发明的制剂)，比在不含多元醇的制剂(制剂G)的情况下，零粘度的损失和分频频率fc的偏移更低。实施例6:比较4个巿售的粘弹补充治疗产品和根据本发明获得的制剂的流变学供试产品如下所示:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>对于5个供试凝胶剂，图6-9提供了基于频率的粘性模量(G")和弹性模量(G')。注意到，只有实施例1的凝胶剂具有的分频频率(0.50Hz)接近于未被污染的滑液的分频频率(0.41Hz)。下表联合收录了产品Pl到P4和实施例1的制剂A的分频频率fc的值。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>根据Mazzucco，D.等人的出版物(如上引用)可知，未被污染的滑液的分频频率(0.41Hz)低于在行走期间(0.7Hz)和在跑动期间(3Hz)在膝中所观察到的分频频率。对于产品P1到P3，分频频率高于3Hz，因此，所述产品没有强的弹性，不能使得当膝移动时吸收冲力。产品P4具有极低的分频频率；在整个O.l-lOHz的频率范围内，弹性模量高于粘性模量。因此，当膝移动时弹性高，但是当患者静止时关节的润滑不是非常有效。实施例7:比较3个市售的粘弹补充治疗产品和根据本发明获得的制剂的抗降解性<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>降解试验根据实施例4所述方法进行。湖U量在0.7Hz下-的经吋参数G'的值。如此获得的流变学曲线如图IO所不。注意到，本发明的凝胶剂比3个供试的市售产品发生不太迅速的显著降低。实施例8:透明质酸/多元醇强亲合性的证明为了证明在透明质酸和多元醇之间的强亲合性，从而证明多元醇对凝胶剂的长期保护作用，通过渗析进行了多元醇释放的追踪研究。将5g的制剂E(基于20mgZml的未经交联的NaHA和40mg/ml的山梨醇的凝胶剂-实施例l)引入到第一透析膜(No.1)(Spectra/Pore,MWCO:12-14,000)中。将5g的包含40mg/ml的山梨醇的磷酸盐缓冲液引入到第二透析膜(No.2)(Spectra/Pore,MWCO:12-14,000)-中，第二膜与第一膜具有相同的大小。这些膜被置于各自含50g纯化水^渗析浴)并同时进行磁力搅拌的瓶中。在不同的时间，在渗析中根据HPLC测量山梨醇浓度，从而追踪含有凝胶剂或缓冲溶液的膜以外的山梨醇的释放动力学。山梨醇浓度一时间的跟踪曲线如图11所示。山梨醇释放进入凝胶剂中的动力学显著慢于在缓冲溶液中的动力学。该研究支持了在凝胶剂中存在的透明质酸和多元醇之间的协同作用强的透明质酸/多元醇亲合性使得多元醇在凝胶剂中得以长期存在，并且多元醇对凝胶剂的保护能力使得凝胶剂冇可能具有强的、长期的18权利要求1.用在关节内间隙内的、无菌的、可注射的凝胶剂形式的含水制剂，其包含透明质酸或其盐中的一种和任选的天然来源的一种或多种其它多糖以及包含一种或多种多元醇，该制剂通过制备包含透明质酸或其盐中的一种、任选的天然来源的一种或多种其它多糖以及包含一种或多种多元醇的含水组合物、然后对该组合物进行灭菌而被获得。2.权利要求l的无菌的、可注射的凝胶剂形式的含水制剂，其特征在于透明质酸的含量为1-100mg/ml和多元醇的含量为0.0001-100mg/ml，并且获得的凝胶剂具有的弹性模量G'和粘性模量G"的分频频率为0到10Hz，优选0.41±0.41Hz，从而在高频率下G'大于G"。3.权利要求1或2的制剂，其中透明质酸未经交联或基本上未经交联。4.权利耍求1或2的制剂，其中透明质酸是交联的。5.权利要求1到3中任一项的制剂，其中透明质酸或其盐中的一种的浓度是10到25mg/ml并且多元醇的浓度是15到45mg/ml。6.权利要求1到5中任一项的制剂，其中透明质酸(或其盐中的一种)，单独或作为混合物，其分子量为0.1-10X106Da，并且多兀醇单独或作为混合，是甘油、丙二醇、山梨醇、甘露醇或葡萄糖。7.权利要求1-6中任一项的制剂，其中透明质酸的分子量为2-3X106Da。8.权利要求1-7中任一项的制剂，其中透明质酸浓度是20mg/ml以及甘油浓度是20mg/ml。9.权利要求1-7中任一项的制剂，其中透明质酸浓度是20mg/ml以及山梨醇浓度是40mg/ml。10.权利要求1-9中任一项的制剂，其中灭菌在高压釜内进行。11.制备权利要求1-10中任一项的无菌的、可注射的凝胶剂形式的含水制剂的方法，包括制备含水组合物的步骤和将如此获得的组合物进行灭菌的步骤，所述含水组合物包含透明质酸或其盐的一种以及任选的天然来源的一种或多种其它多糖以及包含一种或多种多元醇。12.权利要求ll的制备方法，其中灭菌在高压釜内进行。13.权利要求1-10中任一项的制剂用于关节退行性变治疗中的关节内注射的应用。14.权利要求13的应用，其中制剂以0.1到20ml的速度被注射。全文摘要本发明涉及无菌的、可注射的凝胶剂形式的含水制剂，其包含透明质酸(或其盐中的一种)以及任选的天然来源的一种或多种其它多糖以及一种或多种多元醇。所述制剂用于治疗关节退行性变的关节内注射的应用，在一些情况中，具有的流变学类似于滑液，并且由于在透明质酸和多元醇之间的协同作用而始终具有高的抗降解性。文档编号A61K31/728GK101686936SQ200880023126公开日2010年3月31日申请日期2008年7月2日优先权日2007年7月2日发明者塞缪尔·加瓦尔莫里阿尔德,奥利维尔·贝努瓦申请人:安特易斯有限公司