专利名称：用于治疗雷特综合征和突触病症的igf的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗雷特综合征(Rett Syndrome)以及其它突触功能和成熟之障 碍的方法。
背景技术：
雷特综合征(RTT)是一种与X染色体基因甲基CpG结合蛋白2 (MeCP2)的突变相 关的发育病症。MeCP2编码调节转录的蛋白质。其形成与甲基化基因序列结合的转录阻遏 物复合物并诱导染色质凝聚。雷特综合征患者几乎全部为女性，所述患者表现出与众不同的手部运动、脑生长 减慢、语言和运动技能衰退、癫痫发作、认知障碍和智力迟钝。皮层结构相对保守，但是树突 结构改变并且树突棘似乎在结构上不成熟。已经建立了雷特综合征的小鼠模型(Chen等，Nat Genet. 27(3) =327-31, 2001 ； Guy 等，Nat Genet. 27(3) :322_6，2001 ；Shahbazian 等，Neuron 35(2) :243_54，2002)。 MeCP2敲除(KO)小鼠表现出运动和呼吸表型、较小的锥体神经元以及电生理异常，这表明 突触和神经元不成熟。MeCP2截短突变导致运动和社交功能障碍、突触可塑性和记忆力的改变。在满足一定条件下的MeCP2K0小鼠模型中MeCP2水平的恢复使运动功能恢复(Guy 等，Science 315(5815) :1143_7，2007)。KO小鼠中BDNF表达增加可逆转运动和电生理表 型(Chang等，Neur0n49(3) :341_8，2006)。这些和其它数据表明，在小鼠模型中，突触仍然 处于不成熟状态，进行合适的治疗(即便在发育后期)可重新恢复功能。
发明内容
强烈需要发现用于治疗雷特综合征和其它具有突触和神经元不成熟或突触可塑 性改变的病症(例如孤独症谱系障碍)的新的和/或更好的可选择方法。根据促进突触成熟的基因和分子可能恢复MeCP2K0小鼠的突触和行为功能这一 假说，本申请人测定了胰岛素样生长因子(IGFl)或IGFl的肽片段(1-3) IGF-I (又称为甘 氨酰-L-脯氨酰-L-谷氨酸，甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸以及GPE)，出乎意料地发现它们是用 于恢复MeCP2KO小鼠功能和人RTT治疗的可行的候选化合物。这两种分子和其它类似分子(例如也可以用在本发明中的(1-3) IGF-I类似物)可透过血脑屏障，因此可作为用于RTT和其 它病症的小分子治疗剂进行全身施用。反之，较大的分子例如脑源性神经营养因子(BDNF) 和大多数其它突触可塑性分子不能透过血脑屏障，因此需要直接进行脑输注，这在人中是 不可行的。根据本发明的一个方面，提供了用于治疗雷特综合征的方法。所述方法包括向需 要此治疗的对象施用有效量的胰岛素样生长因子(IGFl)、(1-3) IGF-I和/或(1-3) IGF-I 类似物来治疗所述对象。在一些实施方案中，施用IGFl。优选地，所述IGFl是重组IGFl或人IGFl。在优选 的实施方案中，所施用的IGFl的剂量是约0. l-10mg/kg/天，更优选是约0. l_2mg/kg/天。在一些实施方案中，施用(1-3)IGF_1。在优选的实施方案中，所施用的(1_3) IGF-I的剂量是约0. l-100mg/kg/天，更优选是约6_20mg/kg/天。在又一些实施方案中，施用(1-3) IGF-I类似物。优选地，所述(1_3) IGF-I类似物 是 Gly-Pro ；Pro-Glu ； (1-3) IGF-I 替换类似物，其中 Gly-Pro-Glu 中的 Gly 被替换为 Ala、 Ser、Thr或Pro中的任一个，或者其中Gly-Pro-Glu中的Pro被替换为Ala、Ser、Thr或Gly 中的任一个，或者其中Gly-Pro-Glu中的Glu被替换为AsruAsp或Gln中的任一个；(1-3) IGF-I酰胺；硬脂酸(1-3) IGF-I ；具有一个或两个D-氨基酸的(1_3) IGF-I类似物；或者具 有一个或两个不可水解肽键的(1-3) IGF-I类似物。在一些实施方案中，施用相关治疗分子。优选地，所述相关治疗分子是IGF-I促 分泌素、生长激素或前体、生长激素促分泌素、生长激素释放肽或生长激素释放激素或类似 物。在所述方法的优选实施方案中，所述对象是人。在所述方法的某些实施方案中，所述IGFl、(1-3) IGF-I和/或(1_3) IGF-I类似物 经口服、静脉内、肌内、鼻内、腹膜内、皮下或鞘内施用。所述IGF1、(1-3) IGF-I和/或(1_3) IGF-I类似物可在诊断出雷特综合征之后施 用，或者可在诊断出雷特综合征之前预防性施用。在另一些实施方案中，所述对象没有其它需要用IGFl、(1-3) IGF-I或(1-3) IGF-1 类似物进行治疗的症状。在另一些实施方案中，所述方法还包括首先检测该对象中编码甲基化CpG结合蛋 白2(MeCP2)之基因的突变。在一些实施方案中，所述方法还包括向所述对象施用第二治疗剂，其中所述第二 治疗剂是tPA，BDNF，调节抑制的分子例如苯并二氮杂:^类，或者是作为神经递质激动剂、 拮抗剂或类似物的分子；其中所述第二治疗剂和所述IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-1类似 物和/或相关治疗分子以有效治疗所述对象的组合量施用。在前述方法中，IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子的量可 有效恢复突触功能和/或使突触成熟、巩固突触和/或调节神经元可塑性。根据本发明的另一个方面，提供了用于治疗对象中突触功能和/或成熟之障碍的 方法。所述方法包括向需要此治疗的对象施用有效量的胰岛素样生长因子(IGFl)、甘氨 酰-L-脯氨酰-L-谷氨酸((1-3) IGF-1)和/或(1-3) IGF-I类似物以治疗所述对象。在一些实施方案中，施用IGFl。优选地，所述IGFl是重组IGFl或人IGFl。在优选的实施方案中，所施用的IGFl的剂量是约0. l-10mg/kg/天，更优选是约0. l_2mg/kg/天。在另一些实施方案中，施用(1-3)IGF_1。在优选的实施方案中，所施用的(1_3) IGF-I的剂量是约0. l-100mg/kg/天，更优选是约6_20mg/kg/天。
在又一些实施方案中，施用(1-3) IGF-I类似物。优选地，所述(1_3) IGF-I类似物 是 Gly-Pro ；Pro-Glu ； (1-3) IGF-I 替换类似物，其中 Gly-Pro-Glu 中的 Gly 被替换为 Ala、 Ser、Thr或Pro中的任一个，或者其中Gly-Pro-Glu中的Pro被替换为Ala、Ser、Thr或Gly 中的任一个，或者其中Gly-Pro-Glu中的Glu被替换为AsruAsp或Gln中的任一个；(1-3) IGF-I酰胺；硬脂酸(1-3) IGF-I ；具有一个或两个D-氨基酸的(1_3) IGF-1类似物；或者具 有一个或两个不可水解肽键的(1-3) IGF-I类似物。在一些实施方案中，施用相关治疗分子。优选地，所述相关治疗分子是IGF-I促 分泌素、生长激素或前体、生长激素促分泌素、生长激素释放肽或生长激素释放激素或类似 物。在所述方法的优选实施方案中，所述对象是人。在所述方法的某些实施方案中，所述IGFl、(1-3) IGF-I和/或(1_3) IGF-I类似物 经口服、静脉内、肌内、鼻内、腹膜内、皮下或鞘内施用。所述IGF1、(1-3) IGF-I和/或(1_3) IGF-I类似物可在诊断出雷特综合征之后施 用，或者可在诊断出雷特综合征之前预防性施用。在优选的实施方案中，所述病症是孤独症、孤独症谱系障碍、安格尔曼综合征 (Angelmann' s Syndrome)、结节性硬化、脆性X综合征、精神分裂症、抑郁症、神经退行性疾 病(包括帕金森病、亨廷顿病和阿尔茨海默病)、中风或外伤。在另一些实施方案中，所述对象没有其它需要用IGF1、(1-3) IGF-I和/或(1-3) IGF-I类似物进行治疗的症状。在一些实施方案中，所述方法还包括首先检测所述对象中作为疾病遗传基础之基 因的突变或者作为该基因之靶标或下游的基因中的突变。在另一些实施方案中，所述方法还包括向所述对象施用第二治疗剂，其中所述第 二治疗剂是tPA，BDNF,调节抑制的分子例如苯并二氮杂革类，或者是作为神经递质激动 齐U、拮抗剂或类似物的分子。在这些实施方案中，其中所述第二治疗剂和所述IGF1、(1-3) IGF-I和/或(1-3) IGF-I类似物以有效治疗所述对象的组合量施用。在前述方法中，IGF1、(1-3) IGF-I和/或(1-3) IGF-I类似物的量可有效恢复突触 功能和/或使突触成熟、巩固突触和/或调节神经元可塑性。根据本发明的第三个方面，提供了用于促进突触成熟的方法。所述方法包括使含 有一个或多个突触的一个或多个神经元与一定量的IGF1、(1-3) IGF-I和/或(1_3) IGF-I 类似物相接触，所述量可有效促进所述一个或多个神经元的一个或多个突触的成熟。在一些实施方案中，所述一个或多个神经元与IGFl接触。优选地，所述IGFl是重 组IGFl或人IGFl。在另一些实施方案中，所述一个或多个神经元与(1-3) IGF-I或(1-3) IGF-1类似 物接触。优选地，所述(1-3) IGF-I类似物是Gly-Pro ；Pro-Glu ； (1-3) IGF-I替换类似物，其 中Gly-Pro-Glu中的Gly被替换为Ala、Ser、Thr或Pro中的任一个，或者其中Gly-Pro-Glu 中的Pro被替换为Ala、Ser、Thr或Gly中的任一个，或者其中Gly-Pro-Glu中的Glu被替换为Asn、Asp或Gln中的任一个；(1-3) IGF-I酰胺；硬脂酸(1-3) IGF-1 ；具有一个或两个 D-氨基酸的(1-3) IGF-I类似物；或者具有一个或两个不可水解肽键的(1-3) IGF-I类似 物。在另一些实施方案中，施用相关治疗分子。优选地，所述相关治疗分子是IGF-I促 分泌素、生长激素或前体、生长激素促分泌素、生长激素释放肽或生长激素释放激素或类似 物。
在优选的实施方案中，所述一个或多个神经元是人神经元。在某些实施方案中，所述一个或多个神经元在体外接触。在另一些实施方案中，所 述一个或多个神经元在体内接触。优选地，所述在体内接触是通过向对象施用IGFl、(l-3) IGF-I和/或(1-3) IGF-I类似物来进行。优选地，所述IGFU (1-3) IGF-I和/或(1-3) IGF-I类似物经口服、静脉内、肌内、鼻内、腹膜内、皮下或鞘内施用。可以相似方式用来治疗本文所述疾病的其它相关治疗分子包括IGF-I促分泌素、 生长激素或前体、生长激素促分泌素、生长激素释放肽、生长激素释放激素及其类似物。本文所述的治疗方法还可包括施用上调或增强抑制的分子，例如苯并二氮杂罩类 或本领域技术人员公知的其它分子。所述上调或增强抑制的分子可单独使用或者与本文所 述的IGFl、(1-3) IGF-I和/或(1-3) IGF-1类似物等组合使用。参照本发明的详细描述，本发明的这些和其它方面以及各种优点和实用性将变得 更为明显。本发明的每个方面可包含多个实施方案，其可通过下文描述来理解。
图1 经(1-3) IGF-I处理的MeCP2K0动物中第5层锥体神经元的突触电流的增加幅度。A0急性皮层切片(acute cortical slice)中细胞内自发性兴奋性突触后电流 (excitatory postsynaptic current, EPSC)记录的代表性描记线。描记线代表野生型 (WT)、敲除型(KO)或利用(1-3) IGF-I处理两周的KO型(KO-T) 0小鼠是28-32日龄。B.所有测量细胞中EPSC幅度的累积分布。分布表示与WT相比，KO有提高的较小 幅度事件百分率。(1-3) IGF-I处理部分但显著地逆转此趋势。C.所有WT、K0和KO-T的记录细胞中所观察的每神经元之EPSC的平均EPSC幅度。 与WT神经元相比，KO神经元的平均EPSC幅度显著降低。与KO相比，KO-T中平均EPSC幅 度适度但显著地增加。D.反映EPSC频率的EPSC事件间间隔分布在WT、K0和KO-T组之间细微但显著地改变。图2.树突棘密度和形态的结构定量。A.在P28对运动皮层中第五层锥体细胞进行高尔基体染色能稀疏标记神经元和 棘的形态。B.较大放大倍数(100X)的共聚焦成像能清楚描述不同亚类的树突棘，包括丝状 伪足型(F)、蘑菇型(M)、短粗型(S)和纤细型(T)的棘。C.将所观察的这些棘数量的加和除以所量化的每个神经元的树突长度，得到其中 敲除型组织中神经元与野生型组织相比表现出棘密度降低的趋势。利用(1-3) IGF-I处理的敲除型组织表现出与野生型更相似的棘密度值。D.就每一处理而言的某些类型的棘的百分数。与野生型和利用(1-3) IGF-I处理 的敲除型相比，敲除型中的蘑菇型或“成熟”棘减少。经处理未被改善的敲除型中也存在过 度体现(over-representation)的“纤细型，，棘。E.野生型、敲除型和用(1-3) IGF-I处理的敲除型之间的平均树突分枝厚度没有变化。
图3.成年MeCP2杂合小鼠的视觉皮层可塑性被(1_3) IGF-I抑制。未单眼剥夺(WT)或单眼剥夺输入4天(WT MD)的个体幼龄(P28)动物的眼优势 指数(ODI)分布，反映了皮层表面对传递到每只眼的刺激的相对活化。分析区域通常包括 900-1300个像素的皮层表面，ODI值是由两只眼睛驱动的每一像素处的光信号强度得到的 (参见方法部分)。每只动物的平均ODI值用于D部分的群体分析。A.在这里所描述的幼龄动物中，与未剥夺的动物(实线)相比，在WT MD动物(虚 线)中观察到了偏向睁开眼群体ODI移动。B.对侧眼单眼剥夺(MD，虚线)或未单眼剥夺(实线)的成年野生型(黑线)和 MeCP2杂合小鼠(粉色线)。C.未处理的(紫色虚线)或用(1-3) IGF-I处理的(红色实线)的MD之后的成 年MeCP2+/_小鼠。未处理的小鼠显示出视觉驱动(通过ODI测量的)从闭合眼朝向睁开 眼的移动，与发育中的动物相似(如A中)-证明可塑性延长并且表示不成熟突触持续到成 年期。在MD期用(1-3) IGF-I处理使可塑性消失，保持成年动物典型的眼优势特性(如B 中)。D.发育中的野生型小鼠(约P28，左)和成年野生型小鼠(约P60，右)的平 均ODI值。ODI正值表示来自对侧眼睛的驱动较高，因此保持组织化，而负值表示来自 同侧眼睛的驱动较高，因此改变了环路。野生型 t”、单眼剥夺后的野生型“wt MD”、 MeCP2+/" “+/_”、单眼剥夺后的MeCP2+/-( “+/-MD”)以及在单眼剥夺期间用(1-3) IGF-I 处理的MeCP2+/-( “+/-MD-t”)。MD后，野生型成年动物的视觉皮层仍然以对侧眼为优势， 而在成年MeCP2+/_小鼠中，对侧眼的驱动严重减少并且ODI向同侧眼移动。在MeCP2+/_小 鼠的MD过程中用(1-3) IGF-I处理能防止眼优势向同侧眼移动。P28野生型动物的ODI值 来自 Tropea 等人(Tropea 等，2006)。图4 :MeCP2敲除动物的心脏功能、运动功能和生存受损，用(1_3) IGF-I处理后得 到恢复A. (1-3) IGF-I降低MeCP2缺陷型小鼠中心动过缓的频率。汇集对不同处理小鼠所 观察到的心率分布，以每分钟跳动次数(bpm)表示。Y轴描述实验组内超过给定bpm值(X 轴)的观察百分率。在8周龄动物(WT或K0)之间进行比较，一些动物用(1-3) IGF-I处理 了 6周(KO-T)。与野生型分布(黑色)相比，KO分布(粉红色)左移，表示心率分布显著 降低。KO-T分布(绿色)在这两条曲线之间，表明部分地恢复了 KO表型，使其趋向更正常 的野生型分布。B. (1-3) IGF-I处理提高MeCP2缺陷型小鼠的运动功能。通过将动物置于配有运 动监测器(红外光束)的笼中测量了基线夜间活动。Y轴显示10小时内的光束阻断次数； 每一条带表示不同的实验组。在6-17周龄间每周记录夜间活动，更幼龄动物的数据还显示在图6中。如所预料的，MeCP2K0小鼠表现出比野生型同窝小鼠显著减少的活动。然而，用 (1-3) IGF-I处理的KO小鼠的活动多于载体处理的KO动物(KO)，但是少于WT。用(1_3) IGF-I处理的野生型小鼠(WT-T)的活动并不比WT的显著增加。“N”=每组的动物数。C. (1-3) IGF-I处理的MeCP2K0小鼠具有比载体处理的对照小鼠更长的预期寿命。 用载体处理的MeCP2-/y小鼠(K0,红线)或用(1-3) IGF-I处理的MeCP2_/y小鼠(Κ0-Τ， 绿线)的Kaplan-Meier生存曲线。X轴表示出生后的天数，Y轴表示生存概率。用(1_3) IGF-I处理的MeCP2-/y小鼠表现出比用载体处理的同窝小鼠显著更长的预期寿命(P = 0. 54*10~-7，log rank 检验)。2 周龄后，每天给MeCP2-/y 小鼠 IP 注射(1-3) IGF-I (0. Olmg/ g体重/天)。“η”是每个实验组的小鼠数。图5 对内源信号进行光学成像以测量视觉皮层中眼优势可塑性。Α.内源信号的光学成像可用于推导初级视觉皮层(Vl)中每只眼的驱动强度。i.视觉路径的示意图，显示由每只眼向Vl的输入。ii.所述光学成像设置的示意图。将麻醉大鼠置于显示周期性漂移之条带状刺激 的监测器的前方。用红光(630nm)照射颅骨表面，并用CXD照相机成像。iii.当刺激对侧眼(左，红色信号)或同侧眼(右，蓝色信号)时具有代表性光信 号水平的Vl双眼区中的血管图案(白色圆圈)。对侧眼的信号比同侧眼的强。B.幼龄小鼠中单眼剥夺后的眼优势移动。i.单眼眼睑缝合4天，ii.除去眼睑缝合后，依次刺激每只眼并记录Vl中的视觉反应。iii.短期单眼剥夺引起被剥夺的对侧眼的输入(红色)减弱，而未被剥夺的同侧 眼的输入(蓝色)增强。C-D.在野生型动物中当在不同条件下刺激每只眼时Vl的双眼区域中信号强度的 示意图。红色圆圈和蓝色圆圈分别表示对侧眼和同侧眼所驱动的光信号强度。由每个像素 处的每只眼的相对驱动强度推导出右侧的眼优势指数(ODI)分布。显示三个条件正常成 年野生型小鼠(C)、单眼剥夺4天后的幼龄小鼠⑶以及MD 4天后的成年小鼠。在野生型 小鼠中，在发育过程中对侧眼的MD引起信号强度和ODI向睁开的同侧眼移动。在成年动物 中在相似MD期后未观察到这样的可塑性。图6 幼龄MeCP2缺陷型小鼠中的(1-3) IGF-I处理和运动功能。通过将动物置于配有运动监测器(红外光束)的笼中测量了基线夜间活动。Y轴 显示10小时内的光束阻断次数；每一条带表示不同的实验组。在4-5周龄间每周记录夜间 活动。在此，与周龄更大的动物(图4B)相比，MeCP2K0小鼠没有表现出比野生型同窝动物 活动更少，并且处理没有改变活动水平。“N” =每组的动物数。图7 (1-3) IGF-I增加海马中神经元胞体大小。与野生型(WT)相比，MeCP2K0动物中海马CA3区中神经元的胞体大小(细胞周长， μπι)显著减小。(1-3) IGFl处理增加了 KO动物(Κ0_Τ)中的平均胞体大小。所述处理对野 生型动物(WT_T)中的胞体大小没有影响。图8 (1-3) IGF-I增加BDNF和tPA的表达与生物活性。A. (1-3) IGF-I (GPE)处理对BDNF表达水平(在mRNA水平上)的影响。单眼剥夺 显著降低对侧Vl的BDNF表达水平。(1-3) IGF-I处理能增加表达，尽管不能达到对照水平。RNA水平是利用Tropea等，2006中所述的微阵列分析得到的。B.对NeuN (绿色)和前体BDNF (ProBDNF)(红色)抗体进行双染色。蛋白质表达证明(1-3) IGF-I (GPE)处理能够通过提高BDNF蛋白质表达来调节单眼剥夺作用，但是不能 调节至对照水平。抗_前体BDNF和抗-NeuN由CHEMIC0N获得并且以1 500的浓度使 用。溶液和孵育时间如下在含有5% BSA、0. 去利通(triton)、10%血清的PBS中预孵 育。在下述溶液中于4度下与第一抗体一起孵育3天含有2% BSA、5%血清、0. 1 %曲拉通 (triton)的PBS。在PBS中清洗后，在与第一抗体的溶液相同的溶液中孵育第二生物素化 的(对前体BDNF而言)或Alexa缀合的(对NeuN而言)抗体(1 200)2小时。通过加 Aextravidine trite (Sigma-I 300)检测所述前体 BNDF 标记。C. (1-3) IGF-I (GPE)处理对tPA的mRNA表达水平的影响。相对于对照和被剥夺的 动物，GPE处理显著上调tPA的mRNA表达。D.对NeuN(红色)和tPA (绿色)抗体进行双染色。tPA染色是蛋白质表达的指 示，其存在于细胞体的尖端部分(pimcta)中，并且在MD中未显示出相对于对照的显著变 化。然而，tPA的表达水平似乎由于(1-3) IGF-I (GPE)处理而强烈增加。抗_tPA购自Oxford BiomedicalResearch并以1 500的浓度使用。孵育条件如下将自由漂浮的切片在含有 以下物质的封闭液中预孵育10%血清、0.3%曲拉通和PBS，然后置于第一抗体与下述物 质的混合物中过夜血清、0. 3%曲拉通、PBS、抗-tPA 1 500和抗-Neu-N 1 500。利 用与Alexa488和Alexa594缀合的第二抗体使染色显色。E. (1-3) IGF-I (GPE)对BDNF活化的作用模式。GPE通过直接影响BDNF表达和控 制tPA(已知其将前体BDNF切割成成熟BDNF)对其的生物活化来促进BDNF活性。图9 重组人IGFl (rhIGFl)表现出与(1-3) IGF-I相似的效力。rhIGFl与(1_3) IGF-I相似地提高P60MeCP2K0小鼠中测定的所有成熟信号，包括 (A)突触传导水平和(B)环路稳定性(通过抑制眼优势可塑性)。应当理解，附图仅仅是示例性的，而并非实施本发明所必需的。
具体实施例方式雷特综合征(RTT)是一种由编码甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)的基因的突变引 起的X连锁智力迟钝的严重形式。相当的证据表明，在作为雷特综合征(RTT)的模型而制备的MeCP2敲除(KO)小鼠 中，突触处于不成熟状态。MeCP2的可能靶标似乎是IGFBP3。在MeCP2K0小鼠和人RTT患 者中IGFBP3水平上调，并且IGFBP3转基因小鼠具有MeCP2K0小鼠的一些脑病变。另外，RTT患者中脑生长缓慢和身体生长迟缓可能表示IGFl/生长激素缺乏。已经在孤独症患者(以及患有脑病和脑白质疾病的患者)的脑脊液(CSF)中检测 到了低浓度的IGFl ；而在RTT患者的CSF中则未检测到IGFl缺乏，样本量小。在此，我们表明成年MeCP2突变小鼠表现出不成熟皮层环路的生理信号标志，包 括较弱的体外突触功能和持久性的体内皮层可塑性。利用(1-3) IGFl (又称为GPE，是胰岛 素样生长因子I(IGFl)的3个氨基酸的活性片段)的全身性处理通过刺激突触功能和稳定 环路的可塑性使成年RTT小鼠的环路恢复到更成熟的水平。此外，利用三肽的处理可改善 敲除小鼠的心动过缓、提高其运动功能和延长其寿命，我们观察到敲除小鼠在这些方面显著降低。我们的结果表明，(1-3) IGFl是用于药理学治疗雷特综合征(并可能用于由延迟的突触成熟引起的其它CNS疾病)的强力的候选化合物。基于这些发现，我们已测定了胰岛素样生长因子(IGFl)或IGFl的末端片段(1_3) IGF-I (又称为甘氨酰-L-脯氨酰-L-谷氨酸，甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸或GPE)，出乎意料地 发现其恢复MeCP2K0小鼠的功能，因此可用作人RTT治疗剂。这些分子和其它类似分子(例 如也可以用在本发明中的(1-3) IGF-I类似物)均能透过血脑屏障，因此可作为用于RTT和 其它病症的小分子治疗剂进行全身施用。不希望受任何特定理论或IGFl作用机制所束缚，认为IGFl可弥补MeCP2损失的 影响通过上调BDNF (直接上调和通过tPA对BDNF切割上调)；通过PI3K起作用来巩固突 触或调节一系列神经元功能；通过弥补MeCP2对IGFBP的作用；通过上调抑制或抑制性环 路；或者通过直接影响乙酰化(例如H3和H4组蛋白的乙酰化)或MeCP2介导的转录。因此，在一些方面中，本发明包括向对象施用有效量的IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子来治疗所述对象。术语“治疗”旨在包括预防、改善、防止 或治愈病症。病症出现以后治疗的目的在于减少、改善或完全消除所述病症和/或其一个 或多个相关症状或者防止其恶化。在开始出现病症之前对对象的治疗(即预防性治疗)的 目的在于降低发生病症的风险和/或如果后来发生病症则减轻其严重程度。本文所用的术 语“预防”指预防性治疗具有发生病症风险的对象，其中所述治疗导致所述对象发生病症的 概率降低，或导致所述病症的严重程度低于不进行该治疗时的概率增加。与不治疗的对象 相比，治疗可降低患有病症的对象的死亡率或延长其预期寿命，如本发明所述。“对象”应指人或动物，包括但不限于狗、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、啮齿动物 (例如大鼠和小鼠)以及灵长类动物(例如猴)。优选的对象是人对象。所述人对象可以 是儿童、成年或老年对象。除雷特综合征以外，本发明的方法还广泛应用于其它疾病。脑发育(以及脑发育 疾病)，包括神经形成、神经元迁移、细胞分化和生长以及突触成熟。因为本文所述的数据涉 及IGFl/(1-3) IGF-I对突触功能和成熟的作用以及对与突触传递和信号转导有关的分子 的作用，所以涉及突触(包括作为恢复功能损失之方法的突触重建)的病症、病况或疾病均 可用本发明治疗。因此，可用本发明的方法和组合物治疗的病症、病况或疾病的实例包括 雷特综合征、孤独症、孤独症谱系障碍、安格尔曼综合征、结节性硬化、脆性X综合征、精神 分裂症、抑郁症、神经退行性疾病(包括帕金森病、亨廷顿病和阿尔茨海默病)、中风或脑部 外伤。在优选的实施方案中，所述病症、病况或疾病是其中突触功能和/或成熟是病症、病 况或疾病的致病因素的那些。在一个特别优选的实施方案中，所述病症、病况或疾病是雷特 综合征。所述对象可已知患有可进行这样治疗的特定病症、病况或疾病，或者可疑似患有 这样的病症、病况或疾病。在一些实施方案中，所述对象没有其它需要用IGF1、(1-3) IGF-I、 (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子进行治疗的症状。孤独症和孤独症谱系障碍是临床诊断的具有单基因和复杂多基因病因的病症。单 基因病况例如雷特综合征和脆性X导致了一小部分孤独症病例(约5-10%)。然而，因为 单基因还可促成多基因病况，所以用于单基因病况的治疗剂可能影响比例大得多的孤独症 病例。
将本发明的治疗方法应用于某些病症、病况或疾病是基于对IGFl信号传导途径 (包括磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和Akt/PKB)的理解。PI3K直接涉及结节性硬化以及涉及PTEN基因的某些形式的孤独症。最近BDNF通 过PI3K影响PSD95变化并因此增加兴奋性突触强度的证据提高了 PI3K的潜在重要性。因 此，通过IGFl、(1-3) IGF-I、(1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子提高PI3K水平可弥补 由于认知下降或神经退行性疾病(包括帕金森病、亨廷顿病和阿尔茨海默病)引起的记忆 力减退。因为PSD95的变化涉及突触功能障碍的发育性病症例如脆性X综合征，所以IGF1、 (1-3) IGF-U (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子可用于治疗这些病症。
Akt是抗凋亡途径的中心部分。其涉及对抗由于中风和阿尔茨海默病引起的神经 元损失以及涉及脑部创伤或损伤后的神经保护。Akt影响GSK3i3途径，其涉及精神分裂症 (锂作用于此途径)。应用IGFl直接作用于Akt或间接作用于PI3K来增加海马齿状回中 神经形成。这样的神经形成是抗抑郁作用的主要可能机制，因此IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子可用于治疗精神分裂症或抑郁症。更广泛地，IGFl促进神经形成和细胞生存、神经元生长和分化以及突触成熟。因 此，利用IGFl、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子的治疗具有可用于多种 病因的多种神经退行性疾病(包括帕金森病、亨廷顿病和阿尔茨海默病)、多发性硬化和脊 髓病(例如ALS)的潜力。在某些情形下，可采用联合治疗来治疗病症。(1-3) IGF-1/IGF1巩固突触并促进 某些类型的可塑性(其依赖于使一组潜在的广泛可用的突触中一些弱突触稳定化)。可 塑性对于促进中风后的功能性重组是重要的，尤其是在联合治疗中，例如(除IGF1、(1-3) IGF-I、(1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子以外)康复治疗和施用其它分子例如tPA， BDNF，调节抑制的分子(例如苯并二氮杂罩类)或者是作为神经递质激动剂、拮抗剂或类似 物的分子。这些分子为治疗协同提供有益作用。许多苯并二氮杂罩类是本领域熟知的，包括催眠的苯并二氮杂$类和抗焦虑的苯 并二氮杂:f类。相似地，与苯并二氮杂$受体相作用的相关种类的药物即“非苯并二氮杂 $类”也可以与苯并二氮杂$类相同的方式用在本发明所述的方法中。在一个具体实施方案中，如下文实施例中所示，(1-3) IGF-I上调tPA。tPA促进突 触的功能和结构重组。因此(1-3) IGF-I和tPA以正反馈方式起作用。相似地，(1-3) IGF-I 上调BDNF，IGFl、(1-3) IGF-I、(1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子与BDNF相组合很可 能比单独使用的效果更好。在某些实施方案中，本发明涉及治疗方法，所述方法包括施用有效量的(1-3) IGF-I类似物。本文所用的“(1-3)IGF-1类似物”(或“GPE”类似物)包括具有基本上与 (1-3) IGF-I相似的药理学性能和治疗活性的化合物。可将本领域中公知的(1-3) IGF-I类似物用在本发明中。EP 0366638描述了(1_3) IGF-I类似物Gly-Pro和Pro_Glu。W002/16408描述了多种(1_3) IGF-I类似物，包括其中 Gly-Pro-Glu中的Gly被替换为Ala、Ser、Thr或Pro中的任一个的那些；其中Gly-Pro-Glu 中的Pro被替换为Ala、Ser、Thr或Gly中的任一个的那些；或者其中Gly-Pro-Glu中的 Glu被替换为Asn、Asp或Gln中的任一个的那些。描述于W002/16408中的其它(1_3)IGF-I类似物包括(1-3) IGF-I酰胺和硬脂酸盐/酯。W002/16408中所述的具体类似物 还包括下述物质(1-3) IGF-I酰胺、硬脂酸(1-3)IGF-1、Gly-Pro-D-谷氨酸盐(GP-D-E) Gly-Pro-Thr (GPT) Gly-Glu-Pro (GEP) Glu-Gly-Pro (EGP) Glu-Pro-Gly (EPG)，所有这些均可 利用标准技术容易地合成。美国专利7，041，314描述了可用于本发明中的其它(1-3) IGF-I 类似物和拟肽。(1-3) IGF-I类似物还可以是本文所述的不可水解肽，例如具有一个或多个(即 一个或两个)不可水解肽键或氨基酸的肽。优选的不可水解肽包括含有D-氨基酸的肽、 含有a- Ψ [CH2NH]-还原酰胺肽键的肽、含有Ψ [CONH2]-酮基亚甲基肽键的肽、含有 a- Ψ [CH (CN) NH]-(氰基亚甲基)氨基肽键的肽、含有Ψ [CH2CN (OH)]-(氰基亚甲基)-羟 基亚乙基肽键的肽、含有Ψ [CH2O]-肽键的肽以及含有a- Ψ [CH2S]-硫代亚甲基肽键的 肽。可用于本发明中的其它(1-3) IGF-I类似物可被确定为具有一个或多个至少基本 等同于(1-3) IGF-I的性质(例如本文所述的性质)或可通过本领域技术人员公知的多种 方法(例如通过血脑屏障的能力的测定方法等)进行评价的(1-3) IGF-I性质的那些类似 物。可用于以与IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-1类似物相似的方式治疗本文所述疾病 的其它“相关治疗分子”包括IGF-I促分泌素、生长激素或前体、生长激素促分泌素、生长激 素释放肽或生长激素释放激素及其类似物。IGF-I促分泌素是本领域公知的，例如美国公开的专利申请2006/0100287中所描 述的那些。生长激素或其前体包括人生长激素(hGH)，例如Nutropin (Genentech)、 Protropin (Genentech)、Humatrope (Lilly)、Genotropin (Pfizer)、Norditropin (Novo) > Saizen (Merck Serono)以及 Omnitrope (Sandoz)。生长激素促分泌素、生长激素释放肽、生长激素释放激素和类似物包括伊帕瑞林 (ipamorelin)及其衍生物(例如由伊帕瑞林衍生的生长激素促分泌素，描述于Ankersen 等 Eur. J.Med. Chem. 34(10) :783_790，1999 中)；MK677 (Merck ；N-[I(R) {[1，2_ 二氢-1-甲 磺酰基螺-(3H-吲哚_3，4’ -哌啶)-1’ -基]羰基}-2-(苯基甲氧基)-乙基]-2-氨 基-2-甲基丙酰胺甲磺酸盐)；NN703(他莫瑞林(tabimorelin)，Novo Nordisk)及其 衍生物(基于NN703的C-末端修饰的GH促分泌素，描述于Ankersen等Eur. J. Med. Chem. 35 (5) 487-497, 2000 中)；SM 130686 (Sumitomo)；卡莫瑞林(Pfizer)；舍莫瑞林 (Salk Institute,Bio-Technology General)；格瑞林(ghrelin)；海沙瑞林(艾沙瑞林)； 他莫瑞林；CP 464709 (Pfizer) ；LY 426410 (Lilly) ；LY 444711 (Lilly ；显示增加 IGF-1 水 平(Seyler 等，Drug Devel. Res. 49 (4) :260_265，2000)) ；W02002057241 中所公开的 8_(氨 基烷氧基氨基)-8H-二苯并[a，e]三唑并[4，5]-环庚烯；W02002056873中所述的2-取代 的二苯并[a, e]l，2，3-三唑并[4，5_c] [7]轮烯_8_酮；美国专利No. 4，411，890和公开号 WO 89/07110,WO 89/07111 中所述的生长激素释放肽 GHRP-1、GHRP_2 和 GHRP-6 ；B-HT920 ； 生长激素释放激素(GHRH，又称为GRF)及其类似物，以及美国专利6，559，150中所述的其它 生长激素促分泌素。以有效量施用IGFl、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子来治疗对象中的病症、病况或疾病。有效量是足以提供医疗上所期望反应的治疗剂剂量。例如，所期望反应可以是抑制病症、病况或疾病的进展。这可仅包括暂时性延缓病症、病况或疾病的 进展，但是更优选地，其包括永久性终止病症、病况或疾病的进展。这可通过本领域一般技 术人员公知的常规诊断方法来监测。应当理解，本发明的治疗剂用于治疗或预防病症、病况或疾病，也就是说，它们可 预防性地用于具有发展成病症、病况或疾病的风险的对象。因此，有效量是可降低病症、病 况或疾病的发生的风险，减轻病症、病况或疾病发生的严重程度或者可能完全预防病症、病 况或疾病的发生的量。确定有效量所涉及的因素是本领域一般技术人员众所周知的，并且仅利用常规实 验即可确定。一般而言，优选使用本发明治疗剂(单独或与其他治疗剂组合使用)的最大 剂量，即根据合理医学判断的最高安全剂量。然而，本领域一般技术人员应当理解，患者可 出于医疗原因、生理原因或实际任何其它原因而坚持使用较低剂量或可耐受的剂量。IGFl、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子可单独施用、以药物组 合物施用或者与其它治疗剂或方案组合施用。任选地，可同时或依次施用其它治疗剂。当 同时施用所述其它治疗剂时，它们可在同一制剂或分开的制剂中同时施用。当将所述其它 治疗剂与IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子在时间上分开施用时， 所述其它治疗剂可与IGFl、(1-3) IGF-I、(1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子可彼此依 次施用。施用这些化合物的时间间隔可以是约几分钟或者可以更长，例如1、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11或者12小时，或者更长，包括1、2、3、4、5、6、7天或以上。可用在本发明方法中的药物组合物优选是无菌的并含有有效量的IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子，用于以适用于向对象施用的重量单位或体 积单位形式产生所期望的反应。可根据不同的参数，尤其是根据所用的施用方式和对象的 状态来选择向对象施用的药理剂的剂量。其它因素包括所期望的治疗期。在对象对所施用 的初始剂量反应不足的情形下，可在患者耐受允许的程度上施用较高的剂量(或通过不同 的、更局部化的递送途径有效地施用更高的剂量)。可由各医生或兽医调整药理剂的剂量， 尤其是在有任何并发症的情形下。治疗有效量通常为0. 01mg/kg至约1000mg/kg，优选为 约0. lmg/kg至约200mg/kg，最优选为约0. 2mg/kg至约20mg/kg，每日施用一剂或多剂，施 用一天或多天。还进行了全身施用(1-3) IGF-I或IGFl并对脑功能产生作用的一些研究。在Tropea 等(Nat Neurosci 9，660-8，2006)中，腹膜内(IP)输注(1_3)IGF_1，同 时进行单眼剥夺(MD)。以约20 μ g/g/天注射(1-3) IGF-17天。在针对发育中的大鼠(P21)进行的另一项研究(Sizonenko等，BrainRes 922， 42-50，2001)中，诱导缺血2小时后单次注射(1-3) IGF-I (6. 7 μ g/g) 0在另一项研究(Lupien等，JNeurosci Res 74，512-23，2003)中，用 IGFl 处理糖 尿病大鼠以改善通常在糖尿病中观察到的听力缺陷。给成年大鼠(约400g)植入微型泵， 就每只动物而言，所述微型泵每天释放20 μ g，相对于每天约0. 05 μ g/g。在此情形下，皮下 释放7. 5周。在另一项研究(Saatman等，Exp Neurol 147，418-27，1997)中，在猴中每 12 小时 通过皮下注射1 μ g/g(相当于每天2 μ g/g)或通过皮下泵(每天4yg/g)递送IGF114天，观察其运动学习(motor learning)的提高。Aberg 等(J Neurosci 20，2896-903，2000)用微型泵将重组 IGFl (Genentech， South San Francisco, CA)经皮下递送给P50大鼠，递送6天或20天，剂量分别为1. 25mg/ kg/ 天和 0. 9mg/kg/天。FDA 批准的 Increlex (Tercica, rhIGFl)的剂量为 0. 08-0. 12mg/kg，每日两次等 于 0. 16-0. 24mg/kg/天。就本文所述的本发明方法而言，IGFl的优选剂量是约0. 01-50mg/kg/天，更优选 约0. l-10mg/kg/天，以每日一剂或多剂的方式施用。优选地，IGFl是人IGFl (hIGFl)，优选 地，IGFl是重组制备的(rIGFl)，最优选地是重组人IGFl (rhIGFl)。更优选地，重组IGFl的 剂量是约0. l-2mg/kg/天。尤其考虑将FDA批准的rhIGFl的剂量用于本发明的方法中，但 如本文中所述，还可预计施用更高或更低的剂量。就本文所述的本发明方法而言，(1-3) IGF-I的优选剂量是约0. l-100mg/kg/天， 以每日一剂或多剂的方式施用。更优选地，(1-3)IGF-1的剂量为约6-20mg/kg/天。对本领域普通技术人员而言，将本发明的药理剂有效递送至所期望的组织、细胞 或体液的各种施用方式是已知的。本发明分子的施用包括但不限于口服、静脉内输注、皮下 注射、肌内、局部、贮库型注射(cbpoinjection)、植入、定时释放方式、腔内、鼻内、吸入、肿 瘤内、眼内以及控制释放。本发明的药物组合物还可经胃肠外、经粘膜(例如口含)、经鼻、 经直肠、阴道内、舌下、粘膜下或经皮施用。优选地，施用是胃肠外施用，即不通过消化道而 是通过一些其它途径施用，例如通过静脉内、皮下、肌内、腹膜内、眼眶内(intraorbital)、 囊内、椎管内、胸骨内、动脉内或皮内施用。技术人员能认识到待考虑选择的施用方式的具 体优点和缺点。本发明不限于本文所公开的具体施用方式。本领域中的标准参考文献(例如 Remington' s Pharmaceutical Sciences,20th Edition, Lippincott, Williams and Wilkins, Baltimore MD, 2001)提供了用于递送在药物载体中的各种药物制备物和制剂的 施用方式和配制方法。可用于施用本发明药理剂的其它方案是本领域普通技术人员公知 的，其中所述剂量、施用方案、施用部位、施用方式等可与本文所述有所不同。在基本上与上文所述相同的条件下将本发明的药理剂施用给非人的哺乳动物，例 如用于测试目的或兽用治疗目的。本领域普通技术人员应当理解，本发明适用于人和动物 的疾病。当施用时，本发明的药物制剂以药学上可接受的量和药学上可接受的组合物进行 施用。术语“药学上可接受的”意指不影响活性成分的生物活性效力的无毒物质。这样的 制剂通常可含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体以及任选地其它治疗剂。当用在药物中时， 所述盐应当是药学上可接受的，但是非药学上可接受的盐可方便地用于制备其药学上可接 受的盐并且不排除在本发明范围之外。这样的药理学上和药学上可接受的盐包括但不限于 由下述酸制备的那些盐盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、富 马酸、丙二酸、琥珀酸等。此外，药学上可接受的盐可被制成碱金属盐或碱土金属盐，例如钠 盐、钾盐或钙盐。需要时，可将本发明的药理剂或药理组合物与药学上可接受的载体相组合。本文 所用的术语“药学上可接受的载体”意指适于向人施用的一种或多种相容性固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。术语“载体”表示活性成分与其组合可有助于施用的天然或合成的有机成分或无机成分。药物组合物的成分还能与本发明的药理剂以不具有实质上影响所 期望的药物效力之相互作用的方式共混以及彼此混合。药物组合物可含有上文所述的合适的缓冲剂，包括乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、甘 氨酸、硼酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、氢氧化物(以及其它碱)以及前述化合物的药学上可接受 的盐。所述药物组合物还可任选地含有合适的防腐剂，例如苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲 酸酯类和硫柳汞。所述药物组合物可方便地存在于单位剂型中并且可通过药学领域中熟知的任意 方法制备。所有方法均包括将活性剂与载体相组合的步骤，所述载体由一种或多种辅助成 分组成。一般而言，通过以下步骤制备组合物将活性化合物均勻紧密地与液体载体、微细 固体载体或这两种载体相组合，然后，必要时使产品成型。当希望全身递送化合物时，可将它们配制成通过注射进行胃肠外施用，例如通过 推注或连续输注。供注射的制剂可与所添加的防腐剂一起存在于单位剂型中，例如存在于 安瓿或多剂量容器中。组合物可采取在油性载体或水性载体中的混悬液、溶液或乳液的形 式，并可含有配方剂(formulatory agent)，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。供胃肠外施用的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，可将活 性化合物的混悬液配制成合适的油性注射混悬剂。合适的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油 (例如芝麻油)或合成脂肪酸酯(例如油酸乙酯或甘油三酯)或脂质体。水性注射混悬剂 可含有能增加混悬液粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡萄糖。任选地，所述混 悬剂还可含有合适的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高浓度溶液的试剂。或者，所述化合物可以是使用前与合适的载体(例如盐水、缓冲剂或无菌无热原 的水)一起构建的粉末形式。适用于口服施用的组合物可以作为离散的单位存在，例如胶囊、片剂、丸剂、锭剂， 其各自含有预定量的活性化合物。其它组合物包括在水性液体或非水性液体中的混悬液， 例如糖浆剂、酏剂、乳剂或凝胶剂。供口服施用的药物制剂可以固体赋形剂形式得到，任选地研磨所得混合物，并加 工颗粒混合物以在加入合适的辅助剂之后(必要时)得到片剂或糖锭核心。合适的赋形剂 尤其是填充剂，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇，或纤维素制备物，例如玉米淀粉、 小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤 维素钠，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。必要时，可加入崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、 琼脂或藻酸或其盐，例如藻酸钠。任选地，口服制剂还可配制在盐水或缓冲液(即用于中和 内部酸环境的EDTA)中或者可不加任何载体进行施用。还可具体预期的是上述成分的口服剂型。可对所述成分进行化学修饰使得口服递 送的衍生物有效。一般而言，所预期的化学修饰是将至少一个部分连接到所述成分自身分 子上，其中所述部分使得可以(a)抑制蛋白质水解；以及(b)从胃或肠吸收到血流中。还期 望的是增加成分的总体稳定性和增加体内循环时间。就成分(或衍生物)而言，释放部位可以是胃、小肠(十二指肠、空肠或回肠)或 大肠。本领域技术人员可利用在胃中不溶解但是在肠的十二指肠或其它部位释放物质的制 齐U。优选地，通过保护所述分子或在胃环境以外处(例如在肠中)释放生物活性分子来避免释放对胃环境造成有害影响。为了保证完全抵抗胃酸，在至少5.0的pH下不渗透的包衣是必不可少的。用作肠溶包衣的更常见惰性成分的实例是偏苯三酸醋酸纤维素(CAT)、邻苯二甲酸羟丙基甲基 纤维素(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、邻苯二甲酸聚醋酸乙烯酯(PVAP)、Eudragit L30D、 Aquateric、邻苯二甲酸聚醋酸纤维素(CAP)、Eudragit L、Eudragit S以及虫胶。这些包衣 可用作混合膜。还可将目的并不在于保护免受胃酸影响的包衣或包衣混合物用在片剂上。这可包 括糖包衣或使片剂更易于吞咽的包衣。胶囊可由用于递送干治疗剂(即粉末)的硬壳(例 如明胶)构成，就液体形式而言，可使用软明胶壳。囊壳材料可以是稠淀粉或其它可食用的 纸。对于丸剂、锭剂、模制片或模印片而言，可使用湿压制技术(moist massingtechnique)。可利用惰性材料稀释或增加治疗剂的体积。这些稀释剂可包括碳水化合物，尤其 是甘露醇、α-乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡萄糖和淀粉。还可将某些无机盐用作 填充剂，包括三磷酸钙、碳酸镁和氯化钠。一些可商购的稀释剂是Fast-Fl0、EmdeX、STA-RX 1500、Emcompress 以及 Avicell0崩解剂可包含在固体形式的治疗剂制剂中。用作崩解剂的材料包括但不限于淀 粉，包括可商购的基于淀粉的崩解剂Explotab。羟乙酸淀粉钠、Amberlite、羧甲基纤维素 钠、超级支链淀粉(ultramylopectin)、藻酸钠、明胶、橙皮油(orange peel)、酸羧甲基纤维 素、天然海绵和膨润土均可使用。另一种形式的崩解剂是不溶性阳离子交换树脂。粉末树 胶可用作崩解剂以及粘合剂，这些可包括粉末化树胶例如琼脂、卡拉牙胶(Karaya)或黄蓍 胶。藻酸及其钠盐也可用作崩解剂。粘合剂可用于使治疗剂粘在一起形成硬片，其包括来自天然产物的材料，例如阿 拉伯胶、黄蓍胶、淀粉和明胶。其它粘合剂包括甲基纤维素(MC)、乙基纤维素(EC)和羧甲基 纤维素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)均可用在醇溶液中使治 疗剂成颗粒。抗摩擦剂可包含在治疗剂制剂中以防止在制剂制备过程中粘连。润滑剂可用作治 疗剂和模具壁之间的层，并且这些润滑剂可包括但不限于硬脂酸(包括其镁盐和钙盐)、聚 四氟乙烯(PTFE)、液体石蜡、植物油和蜡。还可使用可溶性润滑剂，例如十二烷基硫酸钠、 十二烷基硫酸镁、不同分子量的聚乙二醇、Carbowax 4000和6000。可加入助流剂，所述助流剂可在制备过程中提高药物的流动性能并在压制过程中 有助于重新调整。所述助流剂可包括淀粉、滑石、热解二氧化硅和水合硅酸铝。为促进治疗剂溶解在水性环境中，可加入表面活性剂作为润湿剂。表面活性剂可 包括阴离子型去污剂，例如十二烷基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠。可使用 阳离子型去污剂，其可包括苯扎氯铵或苄索氯铵(benzethomium chloride) 0可作为表面 活性剂包含在制剂中的可能的非离子型去污剂的清单是聚桂醇400 ；硬脂酸聚烃氧40酯； 聚氧乙烯氢化蓖麻油10、50和60 ；单硬脂酸甘油酯；聚山梨酯40、60、65和80 ；蔗糖脂肪酸 酯、甲基纤维素和羧甲基纤维素。这些表面活性剂可单独或以不同比例的混合物存在于制 剂中。可口服使用的药物制剂包括由明胶制得的推入配合式(push-fit)胶囊以及由明 胶和增塑剂(例如甘油或山梨醇)制得的密封软胶囊。所述推入配合式胶囊可含有活性成分与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)和/或润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)以及 任选的稳定剂的混合物。在软胶囊中，活性化合物可溶解或混悬在合适的液体(例如脂肪 油、液体石蜡或液体聚乙二醇)中。此外，还可加入稳定剂。就鼻内或吸入施用而言，可利用合适的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二 氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体，以来自加压器或喷雾器的气雾喷雾剂形式方便 地递送用于本发明的化合物。在加压气雾剂的情形下，可通过提供阀门来确定剂量单位以 递送经计量的量。用于吸入器或吹入器中的例如明胶的药囊和药筒可被配制成含有所述化 合物与合适的粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。本发明还包括经肺递送分子。当吸入时，分子被递送到哺乳动物的肺中并透过肺 上皮衬里到达血流。
考虑用于实施本发明的是设计成用于经肺递送治疗产品的多种机械装置，包括但 不限于喷雾器、计量剂量吸入器和粉末吸入器，所有这些均是本领域技术人员所熟悉的。本发明还包括经鼻(或鼻内)递送的药物组合物。经鼻递送使得可以在将治疗产 品施用给鼻以后直接将本发明药物组合物递送到血流中，而不需要将产品沉积到肺中。就经鼻施用而言，可用的装置是与计量剂量喷雾器相连的小硬瓶。在一个实施方 案中，所述计量剂量是通过将本发明的药物组合物溶液吸到限定体积的室中来递送的，所 述室具有形成所需尺寸的孔，以便当压缩所述室中的液体时通过形成喷雾而使气雾剂制剂 气雾化。压缩所述室来施用本发明的药物组合物。在一个具体实施方案中，所述室是活塞 式布置。这样的装置是可商购的。或者，使用具有形成所需尺寸的孔或开口的塑料挤瓶，以便当挤压时通过形成喷 雾而使气雾剂制剂气雾化。所述开口通常在瓶的顶部，一般而言，所述顶部通常为锥形，以 与鼻通道部分匹配，从而有效施用气雾剂制剂。优选地，所述经鼻吸入器将提供计量量的气 雾剂制剂，用于施用经测量剂量的药物。除上述制剂以外，还可将所述化合物配制成贮库型制剂。这样的长效制剂可利用 合适的聚合物或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂或难溶性衍生 物例如难溶性盐来配制。所述药物组合物还可包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂 的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。所述分子适用于多种药物递送系统。关于药物递送方法的简要综述见于Langer， Science 249 1527-1533，1990，其在此通过引用并入本文。治疗剂可被包含在控制释放系统中。术语“控制释放”旨在指任意含有药物的制 剂中药物从制剂中释放的方式和特性是受控的。这指立即释放制剂以及非立即释放制剂， 其中非立即释放制剂包括但不限于持续释放制剂和延迟释放制剂。以常规意义使用的术语 “持续释放”(又称为“延长释放”)指长期逐渐释放药物并且优选地(虽然不是必需地)导 致长期基本上恒定的药物血液水平的药物制剂。以常规意义使用的术语“延迟释放”指其 中在施用制剂和药物从制剂中释放之间具有时间延迟的药物制剂。“延迟释放”可包括或不 包括长期逐渐释放药物，因此可以是或不是“持续释放”。利用长期持续释放的植入物可能特别适用于治疗慢性病症。本文所用的“长期”释放意指将植入物构建和布置成使治疗水平的活性成分递送至少7天，优选30-60天。长期 持续释放的植入物是本领域普通技术人员所熟知的，其包括上文所述的一些释放系统。本发明还包括药盒的用途。在本发明的一些方面中，所述药盒可包含药物制剂瓶、 药物制剂稀释瓶和本文中所述的本发明分子。含有药物制剂的稀释剂的瓶是任选的。所述 稀释瓶含有稀释剂例如生理盐水，用于稀释分子的浓溶液或冷冻干燥粉末。说明书可包含 将特定量的稀释剂与特定量的浓药物制剂混合从而制备供注射或输 注的最终制剂的说明。 说明书可包含利用有效量的分子来治疗对象的说明。还应当理解的是含有制剂的容器(不 论所述容器是瓶、具有隔膜的瓶、具有隔膜的安瓿以及输注袋等)可含有当将制剂进行高 压灭菌或其它灭菌时可变色的标记(例如常用的标志物)。本发明还包括将诊断方法与治疗结合的用途。例如，假设已知雷特综合征在多数 病例中与编码MeCP2的基因的突变或变异有关并且由其引起，那么可首先筛查对象的该突 变。可进行这样的筛查以确定对象对利用本文所述IGF1、(1-3) IGF-U (1_3) IGF-I类似物 和/或相关治疗分子进行治疗的适用性。还可以相同方式诊断和治疗患有其它具有遗传基 础并且适于本发明所述治疗的疾病、病况和病症的对象。尤其是，具有作为MeCP2靶标基因 或下游基因的基因之突变或变异的对象适于本发明所述的治疗并且可以同样的方式进行 诊断和治疗。标准的临床诊断方法是本领域中众所周知的。通常，这些方法包括从对象得到样 品，所述样品可不限于组织样品、活组织切片检查、流体样品(例如血液、尿、唾液、脑脊髓 液)等，然后对所述样品进行诊断步骤。技术人员可利用多种众所周知的方法来分析样品， 例如多种核酸检测和扩增方法(包括基于聚合酶链反应的方法)以及多种蛋白质检测方法 (包括基于抗体的检测方法)。在其它情形下，可使用成像技术进行非侵入式诊断。诊断方法还可与治疗方法联用以在治疗中追踪疾病过程并帮助选择合适的治疗 方法。诊断方法和治疗方法的这种联合应用是医学领域中所常规采用的。通过下述实施例进一步举例说明本发明，所述实施例不应当以任何方式解释为进 一步限制本发明。实施例实施例1:雷特综合征(RTT)是影响万分之一至一万五千分之一的生命的X染色体相关神经 病(Chahrour和Zoghbi，2007)。该疾病的特征在于出生后表面上发育正常，然后生长突然 减慢，这与获得性运动和语言技能的进行性损失、固定的手部运动、肌肉张力减退、自主神 经功能障碍和严重的认知障碍有关。仍然没有针对RTT的特殊治疗，治疗主要是对症的并 且是个体化的。在约85%的RTT患者中，病因是编码甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)的基因的突 变(Amir等，1999)，MeCP2是全局性转录阻遏物(Nan等，1998)，其在神经元成熟和突触形 成之后在中枢神经系统(CNS)中高度表达(Cohen等，2003 ；Shahbazian等，2002b)。已经 建立了小鼠模型，其中CNS特异性MeCP2缺失足以引起Rett样症状(Gemelli等，2006 ；Guy 等，2001 ；Shahbazian等，2002a)，并且即使在疾病晚期活化MeCP2蛋白也可恢复突变表型 (Giacometti等，2007 ；Guy等，2001)。因此，小鼠模型表明RTT的一个重要特征还在于，它 是可逆的_所涉及的CNS环路似乎不萎缩，而是仍然处于不稳定的不成熟状态，而随后环路的活化可修复该综合征的后果。例如，MeCP2突变小鼠中皮层和海马脑环路的特征在于类 似于正常不成熟环路的较弱兴奋性突触(Chao等，2007 ；Dani等，2005 ；Nelson等，2006)。
虽然很难鉴定可促进此表型的MeCP2靶标基因(Tudor等，2002)，但是最充分表征 的MeCP2调节靶标是脑源性神经营养因子BDNF (Chen等，2003)，公知BDNF激发成熟和促进 突触更强壮(Schuman，1999)，并且实际上可恢复突变小鼠的活动水平以及减少突变表型的 一些症状(Chang等，2006)。遗憾的是，BDNF透过血脑屏障的效率差，这阻碍了其治疗应用。 尽管如此，可因此由鉴定能类似刺激突触成熟的药剂而导致在人中进行的介入性治疗。在CNS治疗中具有相似前景的另一种多效的生长因子是胰岛素样生长因子 1 (IGF-I)。与BDNF相似，IGFl在正常发育过程中在CNS中广泛表达(Bondy，1991)，其 强烈促进神经元细胞存活和突触成熟(Liu等，1993)，并有助于发育中的皮层的功能可塑 性成熟(Tropea等，2006)。虽然BDNF通过涉及PI3K/pAkt/PSD95的途径刺激突触强壮 (Yoshii和Constantine-Paton，2007)以强化突触后器并促进突触功能，但是IGFl也刺激 相同路径(Tropea等，2006 ；Zheng和Quirion，2004)，并且还表明显著升高兴奋性突触后 电流(Ramsey等，2005 ；Xing等，2007)。IGFl的生物作用还通过与可对RTT和其他疾病具 有重要意义的IGF结合蛋白(IGFBP 1-6)的结合来调节。例如，IGFBP3具有MeCP2蛋白结 合位点，由于MeCP2缺陷型小鼠和Rett患者缺少此甲基化阻遏物，因此异常表达高水平的 IGFBP3 (Itoh等，2007)，IGFBP3反过来抑制IGFl-实际上在几种形式的ASD中已经观察到 了受抑制的IGFl水平(Riikonen等，2006)。与BDNF不同，IGFl能透过血脑屏障，尤其是以其三肽形式(1_3) IGF-1 (Baker 等，2005)，其在脑中仍然具有强的神经营养作用(Guan等，2004 ；Itoh等，2007 ；Saura等， 1999 ；Sizonenko等，2001)。考虑到这具有通用性以及实际上IGFl已被批准用于人临床试 验(需要引证)这一事实，IGF-I信号传导以更适于治疗性施用给RTT患者的形式提供了 可比较的BDNF靶标，用于参与刺激突触成熟和逆转RTT表型的关键分子路径。因此，我们 研究了全身性递送的(1-3) IGF-I在用于克服作为RTT病生理学特征的突触和神经元的不 成熟性(Johnston等，2001 ；Kaufmarm等，1997)以及改善所述疾病小鼠模型中Rett样症状 中的潜能。实验步骤小鼠匹配和基因分型我们利用了 Chen等人(Chen等，2001)的MeCP2种系无效 等位基因。如Chen等人所述(Chen等，2001)进行了基因分型。(1-3) IGF-I处理就生存测定、夜间活动分析和免疫印迹分析而言，每日通过腹 膜内注射施用(1-3) IGF-I (Bachem Biosciences#H22468,0. 01mg/g 体重，载体=盐水， 0.01% BSA) 0在P15开始处理并在整个实验过程中维持所述处理。就细胞内生理学实验而 言，每日给小鼠注射(0. 01mg/g体重，载体=盐水，0. 01% BSA)，注射2周，从P15至P28-32， 然后将小鼠用于制备急性切片。就光学成像实验而言，从眼睑缝合当天至成像当天，每日给 小鼠注射(1-3) IGF-I (0. 02mg/g 体重，载体=盐水，0. 01% BSA)。生理切片准备利用Vibratome将感觉运动皮层上的或附近的冠状断面(300 μ m 厚)切到< 4°C的ACSF中。切片后，将切片于37°C下孵育20分钟，在剩余实验中置于室温 下。将切片转移到Warner室中并记录视觉识别的位于第五层的锥体神经元。人工脑脊液 (ACSF)含有 126mMNaCl、25mM NaHCO3UmM NaHPO4,3mM KCl、2mM MgSO4、2mMCaCI2 以及 14mM葡萄糖，将其调节至315-320m0sm和pH 7. 4，并通入95% 02/5% C02。细胞内移液管溶液含 有 IOOmM 葡萄糖酸钾、20mM KClUOmM HEPES、4mM MgATP、0. 3mM NaGTP 以及 IOmM 磷酸肌酸钠。细胞内全细胞记录用Sutter P-80拉管器(Sutter Instruments)拉出硼硅 酸盐移液管(3-5MQ，WPI)。利用配有红外微分干涉差显光学(infrared-DIC optics) (Zeis s)的Achroplan 40倍水浸式镜头使细胞显现并用投射至视频监视器上的红外照相 机(Hamamatsu)检测。利用 Multiclamp 700B 放大器(Axon Instruments)由自定义采 集和实时分析软件(以Matlab (Mathworks，Natick, ΜΑ)编写)启动实验，所述放大器与 BNC-2110连接器模块和M系列双通道采集卡(National Instruments)相连。达到吉伽封 口和破裂，并连续检验全细胞记录的低水平渗漏和串联电阻。就每一记录而言，在电压钳中 施加5mV试验脉冲约10次以测量输入电阻和串联电阻。然后在电流钳中施加约10个脉冲 (500ms，40-140pA，增量为IOpA)以量化诱发的放电率和细胞兴奋性。经检验，组与组之间 的接入电阻、渗漏和细胞内兴奋性一致。最后，在IOkHz下对-60mV电压钳下的自发性EPSC 采样并在IkHz下低通过滤。利用以Matlab写成的用户软件包进行分析，根据自动化阈值 检测所有事件并由实验者单独对每个事件进行盲法校验。Golgi染色将P28小鼠样品(< Icm)于10%福尔马林和3%重铬酸钾中固定 24小时。然后于室温下在黑暗中将组织转移到2%硝酸银中2天。然后将这些样品断面以 50 μ m厚切到蒸馏水中。将对应于运动皮层的断面固定在载玻片上，晾干10分钟，然后通过 以95%乙醇、100%乙醇和二甲苯依次清洗来脱水，然后用盖玻片密封。利用Zeiss Pascal 5Exciter共聚焦显微镜于10X (全细胞)和100X (棘成像)下获取图像。内源信号的光学成像将成年(> P60)野生型(SVEV或BL6)和MeCP2 (+/-)突变 雌性(BL6)用于此实验。野生型对照组由野生型同窝出生的MeCP2+/_雌性或野生型年龄 匹配的SVEV雌性组成。为进行单眼剥夺，利用Averting). 016ml/g)麻醉动物，将一只眼睛 的眼睑缝合4天。在成像前除去缝合，被剥夺的眼睛重新睁开。仅将其中剥夺缝合完整并 且被剥夺眼睛的状况看上去健康的动物用于成像期。为激活IGF-I信号传导，在整个剥夺 期每日腹膜内(IP)注射含有(1-3) IGF-I的溶液。就成像期而言，用乌拉坦(1.5g/kg;每 20-30分钟IP施用全剂量的20%，至达到最终剂量，在首次施用时还一起注射0. 02ml 1% 的氯普噻吨(cloroprothixene))麻醉小鼠。暴露出颅骨，将定制的板粘在头上以使活动降 到最少。用dremel钻孔器将Vl上的颅骨钻薄，并用琼脂糖盐水溶液(1. 5% )和玻璃盖玻 片覆盖。在成像期中，不停地给动物充氧，用加热毯维持动物的温度，用硅酮油周期性地处 理眼睛；连续监测生理条件。将麻醉小鼠置于监测器前方，监测器显示对任何一只眼睛的周 期性刺激(单眼)；所述刺激由飘移的垂直或水平白条组成，白条的尺寸为9° X72°，以 9秒/循环在均勻的灰色背景上飘移。用红光(630nm)照射颅骨表面，在每个25分钟的刺 激期中，用CCD照相机(Cascade 512B,Roper Scientific)以15帧/秒的速度捕获亮度变 化。利用时域高通滤波器(135帧)除去慢信号噪音，然后用计算机对信号进行处理，以便在 每个像素下提取对应于刺激频率的时域快速傅里叶变换(FFT)成分。使用FFT幅度来测量 视觉诱发的每只眼睛的反应强度。眼优势指数由每个像素下的每只眼睛的反应(R)导出， 为ODI = (R对侧-R同侧)/(R对侧+R同侧)。双眼区定义为刺激与成像半球同侧的眼睛 所活化的区域。
心率测量使用尾夹传感器(Mouse OX Oximeter-Oakmont，PA)测量实时心脏脉 搏速率。不麻醉小鼠，而是将其物理性地约束在具有合适开口的塑料筒中。在记录期之前， 将所述筒置于饲养实验动物的笼中过夜以便进行适应。在整个记录时间中体温维持在约 82-84° F。我们记录了每只小鼠的3次15分钟的实验，小鼠为8周龄并且从P15开始用载 体或(1-3) IGF-I处理。夜间活动测量利用红外线光束激发的运动监测室(Opto-Varimax-MiniA ； Columb us Instruments，Columbus，OH)测定自主运动活动。就每次实验而言，在开始记 录之前，将小鼠置于所述室中至少3小时。在正常的12小时黑暗循环(下午7点至上午7 点)中监测运动。针对每个动物的每个时间点，采集一个黑暗循环。结果为了测试(1-3) IGF-I处理是否影响RTT疾病的主要特征的进展，在2周龄突变动 物的生命期间对其每日进行腹膜内注射。然后如下文所述获得突触生理学、突触分子组成 和皮层可塑性的测量值以及与健康相关的测量值，例如心率、运动活动水平和寿命。(1-3) IGF-I对MeCP2突变小鼠的突触生理学的影响最近的研究报道了 MeCP2_/y小鼠多个脑区域的神经元表现出自主性活动显著减 少(Chang 等，2006 ；Chao 等，2007 ；Dani 等，2005 ；Nelson 等，2006)，这是通过 BDNF 过量表 达来恢复的表型(Chang等，2006)。相似地，急性施用IGF-I衍生物表明能将大鼠海马培养 物中诱发的兴奋性突触后电流(EPSC)幅度提高40% (Ramsey等，2005 ；Xing等，2007)。因 此，为了测试(1-3) IGF-I恢复MeCP2-/y生理表型的效力，我们获得了急性脑切片中的细胞 内全细胞记录，测量了第五层皮层神经元中的兴奋性突触驱动(自发性EPSC幅度和频率) (图1A)。在此，与野生型动物中所测量的EPSC相比，由_/y动物记录的EPSC的幅度显著 降低(图1B)。在由(1-3) IGF-I处理的MeCP2-/y动物记录的EPSC中，该趋势被部分地逆 转，其幅度显著高于载体处理的MeCP2-/y小鼠的EPSC幅度(图1B)。当在细胞间进行平均 时也可观察到这些差异(图1C)。在所有这些测量值中，经检验，组与组之间的接入电阻、渗 漏和细胞内兴奋性也一致(数据未显示)。对EPSC间隔定量也显示野生型和MeCP2-/y动 物之间的EPSC事件之间的间隔稍微提高(EPSC频率降低)(P = 0. 04,Kolmogorov-Smirnov 检验；图1D)。因此，我们的发现表明MeCP2_/y小鼠的皮层细胞中兴奋性突触驱动降低，并 且在用(1-3) IGF-I处理后其得到部分恢复，这部分地归因于EPSC幅度的改变，是此区域中 突触介导兴奋性传递的强度改变的结果。(1-3) IGF-I处理刺激皮层棘成熟我们推测，RTT是由突触成熟和稳定性的缺陷(这在树突状接触点的结构中应当 是物理上明显的)引起的。此外，由于敲除的特征在于兴奋性突触传递的缺陷，所述缺陷能 通过(1-3) IGFl处理而部分地改善，我们预计可能存在树突棘的结构和密度方面的可比较 的改变。因此，我们利用golgi染色来稀疏且清楚地标记神经元，并用高分辨共聚焦成像来 测量标记细胞中树突棘的密度和形态，将分析限定至关键期小鼠(P28)的运动皮层节段的 第五层锥体神经元。虽然低倍放大成像清楚地描述了这些锥体细胞的分枝程度(图2A)，但是我们可利用更高倍数的放大来计数突触接触点(图2B)并确定每个棘的形态类别。我们将棘分为 大而圆的(“蘑菇型”，M)、短而粗的(“短粗型”，S)、短而细的(“纤细型”，T)或丝状伪足型(F)。比较每单位分枝的棘密度，表明敲除型神经元中棘密度降低的趋势可在敲除型中通 过处理来显著改善(图2C)。分析每一病症中存在的每种类型的棘的比例(图2D)，表明敲 除型中的蘑菇型(成熟)棘不足通过处理得到部分恢复，而敲除型中达到过度呈现的纤细 型(不成熟)棘不受处理的影响。最后，在病症之间未检测到分枝厚度定量(图2E)的任 何差异。这些结果一起表明，敲除型中树枝状接触点的数量不足和不成熟状态可能以利用 (1-3) IGFl处理之后得到部分恢复的方式巩固兴奋性传递功能缺陷。MeCP2缺陷引起成年小鼠中异常的眼优势可塑性上文提供的功能数据(图1)和结构数据(图2)以及MeCP2表达的时间选择 (Shahbazian 等，2002b)和恢复实验数据(Giacometti 等，2007 ；Guy 等，2007)表明，MeCP2 缺陷可能引起突触和神经元成熟不完全(Johnston等，2001 ;Kaufmann等，1997)。如果 Rett的症状是由于脑环路不成熟使得突触处于发育不良或衰退状态而引起的，那么我们推 测MeCP2K0小鼠中皮层环路的其他结果将不能维持稳定的呈现，并且突触将更易于并且倾 向于适应其环境而改变。我们利用已经充分建立的用于测试称为“眼优势可塑性”的皮层 可塑性的模型(Hofer等，2006)评价了这些现象，其中测量了对两眼中的每只眼的视觉皮 层反应(图5A)，然后使更占优势的眼闭合数天(单眼剥夺，MD)，此后再次测量皮层反应以 了解输入改变数天可如何改变对两眼的反应。在小鼠中，对侧眼通常在皮层中占优势(图 5A和5C)，但是如果环路仍然不成熟、不稳定，则闭合优势眼可导致皮层“转移”至另一只眼 (Gordon和Stryker, 1996)，因此导致“眼优势指数” (ODI)移动(图5B和5D)。然而，如果 大脑环路成熟且稳定(例如在成年动物中)，那么ODI将不发生改变(图5E)。我们推断，如果MeCP2缺陷型小鼠中的突触发育受到抑制，那么成年小鼠视觉 皮层中的突触将仍将对短期MD敏感。为了测量刺激眼睛引起的皮层反应，我们利用了 内源信号的光学成像技术，该技术检测去氧血红蛋白水平，去氧血红蛋白水平与神经元 活动密切相关，并且是皮层可塑性的高度敏感和可靠的度量值(Hofer等，2006 ；Smith和 Trachtenberg, 2007)。因为成年MeCP2_/y小鼠不耐受此分析所需的麻醉，所以我们利用了 MeCP2杂合雌性小鼠，其出现的症状较轻(图3)。我们首先测量了幼龄WT小鼠(出生后28 天)的眼优势可塑性，并且发现4天MD使群体ODI明显移动(图3A)。然而，当将未剥夺的 小鼠(黑色实线)与单眼剥夺的小鼠(黑色虚线)进行比较时，在WT成年小鼠(P60)中重 复此模式未产生群体ODI的移动(图3B)。与之相反，年龄匹配的MeCP2突变(+/-)小鼠显 示出现视觉驱动反应向睁开眼显著移动(图3B，粉红色线)。这些结果表明，在成年MeCP2 突变视觉皮层中，在不平衡的视觉驱动之后存在持久的快速突触可塑性，这是不成熟皮层 的典型特征并且与MeCP2缺陷后突触成熟度或稳定性的缺陷是一致的。(1-3) IGF-I处理抑制成年MeCP2+/_小鼠的眼优势可塑性OD可塑性的发育改变部分受到IGF-I路径活化的控制，施用(1_3) IGF-1可消除 野生型幼龄小鼠中的OD可塑性(Tropea等，2006)。因此，我们测试了(1_3) IGF-I处理是 否可稳定在成年MeCP2突变小鼠中观察到的延长的OD可塑性。对P60日龄或以上的雌性 MeCP2+/"小鼠单眼剥夺4天并同时用(1-3) IGF-I处理。图3C显示(1-3) IGF-I处理抑制 了成年MeCP2+/_小鼠中的OD可塑性，表明实际上(1_3) IGF-I快速诱导突触稳定化或成 熟。在所有动物中，在幼龄(P28)小鼠中或成年(P60)MeCP2缺陷型小鼠中观察到了眼优势可塑性，但是在正常成年小鼠中或利用(1-3) IGF-I处理的MeCP2缺陷型小鼠中没有观察到 眼优势可塑性(图3D)。(1-3) IGF-I处理部分恢复MeCP2_/y小鼠的心动过缓
除了检测(1-3) IGF-I改善神经生理症状的效力以外，我们还探寻表征其对机体 一般健康状况的影响。临床和实验证据显示了雷特综合征患者中自主系统功能紊乱，比如 呼吸节律不稳定以及基线心迷走紧张下降(Julu等，2001)。对通过交感神经系统调节血压 自稳态的反馈机制(例如过度换气诱导的心率降低)的控制差，这在雷特综合征患者中是 常见的并且可引起威胁生命的心率失常(Acampa和Guideri，2006 Julu等，2001)。心脏 自主神经功能异常的发病机理(尽管还没有很好地了解)表明脑干中的不成熟的神经元连 接可能是原因。为了考察MeCP2-/y小鼠中的心率异常和(1_3) IGF-1处理的作用，我们监 测了未麻醉的野生型和利用载体或(1-3) IGF-I处理的MeCP2-/y动物中的实时心脏心率。 野生型小鼠表现出规律的心率测量值分布，以约750次/分钟为中心(图4A)。相比之下， MeCP2-/y小鼠表现出了更不规律的心率，平均心率更低，利用(1-3) IGF-I处理之后不规律 心率的发生率显著降低。(1-3) IGF-I施用增加运动活动并延长寿命MeCP2-/y小鼠在4_6周龄时开始出现雷特样症状，这时它们逐渐变得嗜睡，出现 步态共济失调并在10-12周龄间死亡(Chen等，2001)。因此通过计算笼区内的夜间红外 线光束交叉事件还记录了小鼠6周后的基线运动活动(图4B)。在此，与野生型小鼠(WT) 相比，MeCP2敲除小鼠(KO)表现出运动活动水平显著降低，但是利用(1-3) IGF-I处理的 (KO-T)则此水平升高。此升高对敲除型动物是特异性的，其中处理不能增加野生型动物 (WT-T)的活动。这些结果与在更幼龄的动物中所测量的其中在敲除型小鼠中未检测到活动 改变的那些形成对比(图6)，表明表型的出现是与疾病进展的表达相一致的。最后，与MeCP2K0同窝小鼠相比，利用(1_3) IGF-1处理的MeCP2_/y小鼠还表现出 预期寿命增加约50% (0. 5生存概率从约60天增加到90天)。我们还测量了(1-3) IGFl处理对海马神经元胞体体积的影响。如上文对运动活动 所述，利用(1-3) IGFl处理了小鼠。如图7所示，与野生型动物相比，MeCP2K0动物中海马 CA3区中神经元胞体的体积显著受损。(1-3) IGFl处理增加了 KO动物的平均胞体体积，但 是对野生型动物的胞体体积没有影响。讨论在此研究中，我们提供了(1-3) IGF-I减轻RTT疾病小鼠模型中RTT症状的证据。 一系列证据支持了 MeCP2突变动物显示CNS中的不成熟环路的特征持续到成年期这一假 设。首先，单个神经元和突触表现出兴奋性突触后电流的降低，表示突触接触的不成熟或不 稳定。第二，PSD-95(成熟功能性突触及其强度的标志)在缺少MeCP2的脑中下调。第三， 成年MeCP2+/_小鼠中的视觉皮层连接在单眼剥夺之后表现出通常是幼龄小鼠的特征的突 触变化。利用(1-3) IGF-I (已知其刺激IGF-I信号传导并模拟BDNF路径促进神经元和突 触成熟)全身处理MeCP2敲除小鼠导致基本上改善这些度量谱，并且还改善了敲除型小鼠 中所观察到的心率、运动活动和寿命的缺陷。尽管这些作用非常显著，但需重点强调的是利用(1-3) IGF-I处理的MeCP2敲除小 鼠仍然出现全部症状并在成熟前死亡。像在患者中一样，此疾病在小鼠中的进展包括几乎无症状的早期阶段，然后是4到8周的进行性恶化期，并且通常在10-12周间死亡。(1-3)IGF-I处理的小鼠与对照小鼠在同样龄期出现症状，但明显活得更长并在疾病后期保持活 动增加。IGF-I水平通常随年龄而降低，并且IGF-I水平在啮齿动物和人中的人为增加与肌 肉丢失减少和运动增加有关(Rudman等，1990)。相似的作用可能是(1_3) IGF-I介导的，并 且可导致(1-3) IGF-I处理的小鼠易于接近食物和水。(1-3) IGF-I处理还可能增加树枝向 外生长或成年神经形成(Aberg等，2000 ；Aberg等，2003)，并因此可促进信号传导和环路的 整体稳健性与稳定化。虽然没有观察到作为敲除或处理的结果的细胞体体积的变化，但是 观察到了作为敲除和处理结果的总脑重量的小变化。我们的结果构成了在成年MeCP2+/_脑内皮层连接持续呈不成熟状态的第一个功 能证据。雌性MeCP2突变小鼠具有几乎正常的寿命(8-10个月)，并且出现症状比雄性突变 小鼠的更轻微、更晚。因此，在雌性MeCP2突变脑内观察到的对突触可塑性的显著影响相当 出乎意料。由于随机X失活，雌性MeCP2+/_小鼠脑内大约50%的神经元表达野生型MeCP2 蛋白。这说明突变神经元对整个突触网络具有支配性影响，与早期基因恢复的实验结果是 一致的，其证明在> 70%的神经元中再活化MeCP2表达不阻止MeCP2_/y小鼠症状的发展 (Giacometti等，2007)。我们推测(1_3) IGF-I通过稳定突触接触来降低成年突变小鼠中的 OD可塑性，虽然其还可能增加突触接触的数目。(1-3) IGF-I还似乎在稳定视觉皮层中的突 触接触方面迅速起作用，因为用于单眼剥夺试验的小鼠仅在光学成像前被处理4天。我们 不能排除(1-3) IGF-I影响非神经元细胞的可能性；例如，(1-3) IGF-I处理可增加在脑中的 血管密度和葡萄糖利用，或者对周围组织具有其它作用。在上述实验中，(1-3) IGF-I是通 过腹膜内注射施用给小鼠的。其它递送方法也是可行的，例如静脉内输注或者心室内递送 可更有效，并且可能进一步提高症状的恢复程度。总之，我们已表明，全身性递送(1-3) IGF-I可显著提高MeCP2突变小鼠的生理行 为和存活。我们还提供了以下直接证据MeCP2缺陷导致不成熟的突触功能和组织化，这可 通过施用(1-3)IGF-1由可涉及PI3K/Akt/PSD-95路径的机制来进行部分地恢复。虽然还 需要进一步研究以阐明(1-3) IGF-I的准确作用机制，但是本文所提供的结果指出了(1-3) IGF-I以及IGFl信号传导对治疗雷特综合征的潜在用途。针对RTT的成功治疗对其它孤独 症谱系障碍和神经发育疾病以及(如果表型显著重叠)基因敏感性和所建议的潜在神经生 物学机制具有重要意义。实施例2. (1-3) IGF-I增加BDNF和tPA的表达和生物活性研究了(1-3) IGF-I处理对MD期间BDNF和tPA的表达和生物活性的影响。如上 文所述对小鼠进行MD并用(1-3) IGF-I处理。图8A显示(1-3) IGF-I处理对BDNF表达水平(在mRNA表达水平上)的影响。单 眼剥夺显著降低了对侧Vl中的BDNF表达水平。(1-3) IGF-I处理能增加进行MD的动物中 的表达，但是不能增加到对照水平。图8B显示对NeuN(绿色)和前体BDNF(红色)抗体的双染色。蛋白质表达证实， (1-3) IGF-I处理能通过增加BDNF蛋白质表达来调节MD作用，但是不能调节至对照水平。图8C显示(1-3) IGF-I处理对tPA的mRNA表达水平的影响(在mRNA水平上)。 相对于对照和被剥夺的动物而言，(1-3) IGF-I处理显著上调了 tPA的mRNA表达。图8D显示对NeuN (红色)和tPA (绿色)抗体的双染色。tPA染色是蛋白质表达的标志，其存在于细胞体的尖端部分中，并且在MD中相对于对照未显示出显著变化。然而， tPA的表达水平似乎通过(1-3) IGF-I处理而强烈增加。图8E代表(1-3) IGF-I对BDNF活化的作用模型。(1_3) IGF-I通过直接影响BDNF 表达和通过tPA控制BDNF生物活化(已知tPA将前体BDNF切割成成熟BDNF)而促进BDNF 活性。实施例3 =IGFl表现出与(1-3) IGF-I同样的效力上述数据针对于促进IGFl信号传导的IGFl的(1_3) IGF-I片段上。我们还测试 了已经被批准用于人患者中儿童施用(用于身材矮小适应症)的全长IGFl肽的作用。我 们已经证明了(1-3) IGF-I和重组人IGFl (rhIGFl)作用的相关性。我们测定了直接应用这 两种分子时对突触传递的作用，并且发现它们各自可比较地成功地诱发突触活动的显著增 加(图9A)。此外，利用(1-3) IGF-I或rhIGFl，眼优势可塑性过程中皮层环路的成熟度(即 如实施例1所示)被促进至相似程度(180 μ g/kg/天，ip递送，于2周时开始，如图9B所 示)°参考文献Aberg, M. A. , Aberg, N. D. , Hedbacker, H. , Oscarsson, J. , and Eriksson, P.S. 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权利要求
一种治疗雷特综合征的方法，包括向需要这种治疗的对象施用有效量的胰岛素样生长因子1(IGF1)、(1-3)IGF-1、(1-3)IGF-1类似物和/或相关治疗分子来治疗所述对象。
2.权利要求1的方法，其中施用IGFl。
3.权利要求2的方法，其中所述IGFl是重组IGFl。
4.权利要求2或3的方法，其中所述IGFl是人IGFl。
5.权利要求2-4的方法，其中所施用的IGFl的剂量是约0.l-10mg/kg/天。
6.权利要求5的方法，其中所施用的IGFl的剂量是约0.l-2mg/kg/天。
7.权利要求1的方法，其中施用(1-3)IGF-1。
8.权利要求7的方法，其中所施用的(1-3)IGF-I的剂量是约0. Ι-lOOmg/kg/天。
9.权利要求8的方法，其中所施用的(1-3)IGF-I的剂量是约6-20mg/kg/天。
10.权利要求1的方法，其中施用(1-3)IGF-I类似物。
11.权利要求10的方法，其中所述(1-3)IGF-I类似物是Gly-Pro ;Pro-Glu ； (1-3) IGF-I替换类似物，其中Gly-Pro-Glu中Gly被替换为Ala、Ser、Thr或Pro中的任一个， 或者其中Gly-Pro-Glu中的Pro被替换为Ala、Ser、Thr或Gly中的任一个，或者其中 Gly-Pro-Glu中的Glu被替换为Asn, Asp或Gln中的任一个；(1-3) IGF-I酰胺；硬脂酸 (1-3) IGF-I ；具有一个或两个D-氨基酸的(1-3) IGF-I类似物；或者具有一个或两个不可 水解肽键的(1-3) IGF-I类似物。
12.权利要求1的方法，其中施用相关治疗分子。
13.权利要求12的方法，其中所述相关治疗分子是IGF-I促分泌素、生长激素或前体、 生长激素促分泌素、生长激素释放肽或生长激素释放激素或类似物。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述对象是人。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-1类似物 和/或相关治疗分子经口服、静脉内、肌内、鼻内、腹膜内、皮下或鞘内施用。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-1类似物 和/或相关治疗分子在诊断出雷特综合征之后施用。
17.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-1类似物 和/或相关治疗分子在诊断出雷特综合征之前预防性施用。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中所述对象没有其它需要用IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子进行治疗的症状。
19.权利要求1-18中任一项的方法，还包括首先测试所述对象中编码甲基CpG结合蛋 白2(MeCP2)之基因的突变。
20.权利要求1-19中任一项的方法，还包括向所述对象施用第二治疗剂，其中所述第 二治疗剂是tPA，BDNF，调节抑制的分子例如苯并二氮杂$类，或者是作为神经递质激动 齐U、拮抗剂或类似物的分子；其中所述第二治疗剂和所述IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I类 似物和/或相关治疗分子以有效治疗所述对象的组合量施用。
21.权利要求1-20中任一项的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-1类似物 和/或相关治疗分子的量可有效恢复突触功能和/或使突触成熟、巩固突触和/或调节神 经元可塑性。
22.—种治疗对象中突触功能和/或成熟的障碍的方法，包括向需要这种治疗的对象施用有效量的胰岛素样生长因子I(IGFl)、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子来治疗所述对象。
23.权利要求22的方法，其中施用IGF1。
24.权利要求23的方法，其中所述IGFl是重组IGFl。
25.权利要求23或24的方法，其中所述IGFl是人IGFl。
26.权利要求23-25的方法，其中所施用的IGFl的剂量是约0.l-10mg/kg/天。
27.权利要求26的方法，其中所施用的IGFl的剂量是约0.l_2mg/kg/天。
28.权利要求22的方法，其中施用(1-3)IGF-1。
29.权利要求28的方法，其中所施用的(1-3)IGF-I的剂量是约0. Ι-lOOmg/kg/天。
30.权利要求29的方法，其中所施用的(1-3)IGF-I的剂量是约6_20mg/kg/天。
31.权利要求22的方法，其中施用(1-3)IGF-I类似物。
32.权利要求31的方法，其中所述(1-3)IGF-I类似物是Gly-Pro ;Pro-Glu ； (1-3) IGF-I替换类似物，其中Gly-Pro-Glu中的Gly被替换为Ala、Ser、Thr或Pro中的任一 个，或者其中Gly-Pro-Glu中的Pro被替换Ala、Ser、Thr或Gly中的任一个，或者其中 Gly-Pro-Glu中的Glu被替换为Asn, Asp或Gln中的任一个；(1-3) IGF-I酰胺；硬脂酸 (1-3) IGF-I ；具有一个或两个D-氨基酸的(1-3) IGF-I类似物；或者具有一个或两个不可 水解肽键的(1-3) IGF-I类似物。
33.权利要求22的方法，其中施用相关治疗分子。
34.权利要求33的方法，其中所述相关治疗分子是IGF-I促分泌素、生长激素或前体、 生长激素促分泌素、生长激素释放肽或生长激素释放激素或类似物。
35.权利要求22-34中任一项的方法，其中所述对象是人。
36.权利要求22-35中任一项的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-I类似物 和/或相关治疗分子经口服、静脉内、肌内、鼻内、腹膜内、皮下或鞘内施用。
37.权利要求22-36中任一项的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-I类似物 和/或相关治疗分子在诊断出所述病症之后施用。
38.权利要求22-36中任一项的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-I类似物 和/或相关治疗分子在诊断出所述病症之前预防性施用。
39.权利要求22-38中任一项的方法，其中所述病症是孤独症；孤独症谱系障碍；安 格尔曼综合征；结节性硬化；脆性X综合征；精神分裂症；抑郁症；神经退行性疾病，包括帕 金森病、亨廷顿病和阿尔茨海默病；中风或外伤。
40.权利要求22-39中任一项的方法，其中所述对象没有其它需要用IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子进行治疗的症状。
41.权利要求22-40中任一项的方法，还包括首先检测所述对象中作为所述病症遗传 基础之基因的突变或者作为该基因之靶标或下游的基因的突变。
42.权利要求22-41中任一项的方法，还包括向所述对象施用第二治疗剂，其中所述第 二治疗剂是tPA，BDNF，调节抑制的分子例如苯并二氮杂:^类，或者是神经递质激动剂、拮 抗剂或类似物的分子；其中所述第二治疗剂和所述IGF1、(1-3) IGF-U (1-3) IGF-1类似物 和/或相关治疗分子以有效治疗所述对象的组合量施用。
43.权利要求22-42中任一项的方法，其中所述IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-I类似物 和/或相关治疗分子的量可有效恢复突触功能和/或使突触成熟、巩固突触和/或调节神 经元可塑性。
44.一种促进突触成熟的方法，包括使含有一个或多个突触的一个或多个神经元与一定量的胰岛素样生长因子1 (IGFl)、 (1-3) IGF-U (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子相接触，所述量可有效促进所述一个 或多个神经元的一个或多个突触的成熟。
45.权利要求44的方法，其中使所述一个或多个神经元与IGFl接触。
46.权利要求45的方法，其中所述IGFl是重组IGFl。
47.权利要求45或权利要求46的方法，其中所述IGFl是人IGFl。
48.权利要求44的方法，其中使所述一个或多个神经元与(1-3)IGF-I接触。
49.权利要求44的方法，其中使所述一个或多个神经元与(1-3)IGF-I类似物接触。
50.权利要求49的方法，其中所述(1-3)IGF-I类似物是Gly-Pro ;Pro-Glu ； (1-3) IGF-I替换类似物，其中Gly-Pro-Glu中的Gly被Ala、Ser、Thr或Pro中的任一个替换，或者 其中Gly-Pro-Glu中的Pro被Ala、Ser、Thr或Gly中的任一个替换，或者其中Gly-Pro-Glu 中的Glu被Asn、Asp或Gln中的任一个替换；(1-3) IGF-I酰胺；硬脂酸(1-3) IGF-I ；具有 一个或两个D-氨基酸的(1-3) IGF-I类似物；或者具有一个或两个不可水解肽键的(1-3) IGF-I类似物。
51.权利要求44的方法，其中使所述一个或多个神经元与所施用的相关治疗分子接触。
52.权利要求51的方法，其中所述相关治疗分子是IGF-I促分泌素、生长激素或前体、 生长激素促分泌素、生长激素释放肽或生长激素释放激素或类似物。
53.权利要求44-52中任一项的方法，其中所述一个或多个神经元是人神经元。
54.权利要求44-53中任一项的方法，其中使所述一个或多个神经元在体外接触。
55.权利要求44-53中任一项的方法，其中使所述一个或多个神经元在体内接触。
56.权利要求55的方法，其中所述在体内接触是通过向对象施用IGF1、(1-3)IGF-U (1-3) IGF-I类似物和/或相关治疗分子来进行的。
57.权利要求56的方法，其中所述IGFl、(1-3)IGF-I、(1-3) IGF-I类似物和/或相关 治疗分子经口服、静脉内、肌内、鼻内、腹膜内、皮下或鞘内施用。
全文摘要
本发明涉及利用IGF1、(1-3)IGF-1、(1-3)IGF-1类似物和/或相关治疗分子来治疗雷特综合征和其它突触功能和成熟之障碍的方法。
文档编号A61K38/30GK101820896SQ200880024937
公开日2010年9月1日 申请日期2008年6月6日 优先权日2007年6月8日
发明者埃马努埃拉·科梅蒂, 姆里甘卡·苏尔, 纳撒·R·威尔逊, 达妮埃拉·特罗佩亚, 鲁道夫·耶尼施 申请人:麻省理工学院;怀特黑德生物医学研究院