用于精子性别选择的材料和方法

专利名称：：用于精子性别选择的材料和方法
技术领域：
：本申请涉及鉴别携带X染色体或Y染色体的精子的方法。更具体地说，本申请涉及性别特异性抗原及其在这样的方法中的用途。发明背景鉴别并选择出雄性和雌性精子的能力对畜牧业具有极大的价值，在畜牧业中，存在一个既成的人工授精市场，在经济合作与发展组织(OECD)中，该市场每年超过20亿美元。这对乳品加工业尤其重要，在乳品加工业中，OE⑶重要市场中的大部分奶农通过人工授精使他们的母牛受孕。性控精液(sexedsemen)给农场主提供了提高生产率和增加收入的机会。例如，应用性控精液对降低和/或消除小公奶牛的最低回报(minimalreturn)(相比于小母牛)具有显著影响。目前，通过选择最佳的雄性种畜和使用人工授精(Al)使畜群受孕，实现了促成每头母牛产奶量显著增加的遗传性改善。然而，因为最佳的母牛可具有雄性或雌性后代，所以遗传改善的比率受限。性控精液允许由畜群中选择最佳的公牛和最佳的母牛从而使得畜群更新，由此增加遗传改善的比率。利用性控精液还可提供将高产奶牛的平均哺乳期长度延长至20-24个月的机会，因为可以为这些母牛提供的更新在一生中少于两头小牛。在养猪业中，区分精子性别应通过减少生产的雄性数量消除对阉割的需要、提升饲养效率和增加动物的瘦肉含量。目前唯一可用于分选携带X染色体或Y染色体的精液精子的方法是使用例如在美国专利号5，135，759,5,985，216,6,149，867和6，263，745中描述的流式细胞术。该方法利用由于DNA含量差异而产生的精子大小的微小尺寸差异，产生高度富集的具有X染色体或Y染色体的精子群(Johnson，Anim.R印rod.Sci.60-61:93_107(2000)Johnson等人，Biol.Reprod.41199-203(1989))。然而，该技术受限于流式细胞仪的使用，且太昂贵，不易于放大用于畜牧业中的常规性别选择。利用精子表面分子的性控精液，潜在地提供了成本低而有效且能放大的方法来实现该目标。先前用于检测携带X和Y的精子上的表面差异的方法已经作了分析，包含众多策略，例如色谱学方法和免疫学方法(Blecher等人，Theriogenology521309-1321(1999)；Hendriksen等A,Mol.Reprod.Dev.35189-196(1993)；Howes等人，J.ReprocLFertil.110195-204(1997))。例如，授予Spaulding的美国专利号5,021,244描述了流式细胞术然后使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离与性别相关的膜蛋白，以及使用所述蛋白产生可用于提供富X精子或Y精子的精液样品的抗体。然而，随后使用Spaulding教导的方法的研究未能鉴别任何性别特异性精子，表明Spaulding的方案不太可能成功(Howes等人，Jnl.ReproductionFertility110195-204(1997)；Hendriksen等人，Mol.ReproductionDevelop.45:342_350(1996))。授予Blecher等人的美国公开专利申请号2003/0162238描述了性染色体特异性蛋白的分离，该蛋白被表征为X染色体特异性的，与牛精细胞的细胞膜结合，并具有约32kDa的分子量。最近，分析技术的灵敏度已经随着引入二维PAGE或多维色谱分离继之以质谱分析而得到提升(Domon和Aebersold，Science312:212_217(2006))。然而，分析路径仍受困于两个主要问题首先，使用该系统最难分析的一群蛋白是膜组分，例如整合蛋白，原因在于溶解性问题；其次，通过质谱进行的检测限于动态范围。如果存在其它高丰度的物质，则这种受限的动态范围就转换成检测低丰度分子的灵敏度降低。迄今为止所描述的方法还没有成功发现对携带X或Y的精子特异性的抗原，提示不存在差异和/或就性质和/或丰度而言差异较小。因此，在本领域仍需要可有效用于鉴别和分离携带X染色体或Y染色体的精子的材料和方法。发明概述本发明提供鉴别和分离携带X染色体或Y染色体精子的有效的符合成本效益的非侵入性方法，以及用于这样的方法的组合物和试剂盒。本申请所公开的方法具有高特异性(即几乎不产生假阳性)和高灵敏度(即几乎不产生假阴性)。本申请公开的组合物包含特异性结合抗原的结合剂，所述抗原对携带X-染色体或Y-染色体的精子是特异性的(本申请称为X-染色体或Y-染色体特异性抗原)。例如，本申请公开的方法可用于人工授精，以增加后代成为所需性别的概率和/或增加后代携带产生所需性状的基因的概率。一方面，本发明提供用于由精液中分离携带X-染色体或Y-染色体的精子的方法，以及通过这样的方法制备的精子。本申请公开的方法包括(a)使精液与至少一种对X-染色体或Y-染色体特异性抗原具有特异性的结合剂接触一定时间，所述接触时间足以在结合剂和携带X-染色体或Y-染色体的精子之间形成缀合物；和(b)分离缀合物和未结合结合剂的精子。结合剂可以提供在固体表面上。在一个实施方案中，结合剂提供在磁珠(例如顺磁微球)表面上，并通过施加外部磁场将结合剂-精子缀合物和未结合的精子分离。在某些实施方案中，用于这些方法的结合剂对具有以下序列的抗原是特异性的选自SEQIDNO1-21、43-89、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164和183-201的氨基酸序列；与SEQIDNO:1-21、43-89、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164和183-201的序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；和由在严格杂交条件下与SEQIDNO:22-42、90-136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165-182或202的序列杂交的多核苷酸编码的序列。在某些实施方案中，在这样的方法中使用的至少一种结合剂为抗体(例如单克隆抗体)或其抗原结合片段，例如Fab或scFv。可以有效用于本发明公开方法中的结合剂的实例包括但不限于在以下表1中给出的结合剂。另一方面，本发明提供包含对X-染色体或Y-染色体特异性抗原具有特异性的结合剂的组合物。在一个实施方案中，所述结合剂对具有选自SEQIDN0:l-21、43-89、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164和183-201的氨基酸序列的抗原及其变体是特异性。这样的结合剂可以用检测试剂标记，和/或如上所述，连接至磁珠，以有利于检测和/或分离生物样品如精液中的携带χ-染色体或Y-染色体的精子。又一方面，本发明提供用于所述公开方法的试剂盒，这样的试剂盒包含一个容器，该容器装有至少一种对本申请公开的X-染色体或Y-染色体特异性抗原具有特异性的结合齐。在某些实施方案中，这样的试剂盒包含磁珠，例如顺磁微球，其包被和/或结合有一种或多种所述结合剂。又一方面，本发明提供用于鉴别对携带X-染色体或Y-染色体的精子具有特异性的基因和/或蛋白的方法，这样的方法包括如在以下的实施例中详述的生物信息学分析步骤和直接分析步骤的组合。这些方法还可以用于鉴别其它密切相关的细胞(包括但不限于正常细胞和癌细胞)之间的表面差异。在相关方面，本发明提供用于富集精液样品中的携带X-染色体或Y-染色体的精子的方法，这样的方法包括使天然精液样品与本申请公开的至少一种结合剂接触，其中携带X-染色体或Y-染色体的精子与结合剂的结合有效降低精子的活动率和/或活力。在一个实施方案中，本申请公开的结合剂可以使用已知的方法缀合至细胞毒素，并且其用于破坏携带X-染色体或Y-染色体的精子。这样的方法可以用精液样品在体外进行，或者通过同时或序贯地将精液样品和结合剂导入雌性动物的阴道中在体内进行。在某些实施方案中，用于这类方法的结合剂特异性结合具有以下序列的抗原选自SEQIDN0:l-21、43-89、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164和183-201的氨基酸序列；与SEQIDNO:1-21、43-89、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164和183-201的序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的序列；和由在严格杂交条件下与SEQIDNO:22-42、90-136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165-182或202的序列杂交的多核苷酸编码的序列。参考以下更详细的描述和附图，本发明的上述特征和其它特征以及获得它们的方式将变得显而易见，且能更好地理解本发明。附图简述图1显示了已知的精子蛋白和本申请公开的候选X-染色体或Y-染色体特异性基因的直系同源物的RNA表达水平的对比。图2是用于本研究的精子处理和结合测定的矩阵。图3是用于本研究的SISCAPA技术的概述。图4是用于本研究的iTRAQ技术的概述。发明详述本申请的公开内容提供了对携带X-染色体或Y-染色体的精子具有特异性的抗原及其变体，特异性结合这样的抗原和/或其变体的结合剂，以及使用这样的结合剂检测和分离携带X-染色体和Y-染色体的精子的方法。本申请公开的牛X-染色体或Y-染色体特异性抗原的氨基酸序列提供于SEQIDNO:1-21、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162和164，相应的DNA序列分别提供于SEQIDNO:22_42、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161和163。本申请公开的人X-染色体或Y-染色体特异性抗原的氨基酸序列提供于SEQIDNO:43-89，相应的DNA序列分别提供于SEQIDNO:90-136。本申请公开的马X-染色体或Y-染色体特异性抗原的氨基酸序列提供于SEQIDNO183-200，相应的DNA序列分别提供于SEQIDN0:165_182。结合剂在本申请被定义为这样的物质其结合本申请公开的X-染色体或Y-染色体特异性抗原或其变体之一的表位，但在相似的条件下不能可检测地结合不相关的多肽。满足这样的要求的任何物质都可以是结合剂。例如，结合剂可以为多肽(例如配体)、核糖体(有或没有肽组分)、RNA分子或小分子。结合剂特异性结合多肽的能力可以使用例如本领域众所周知的技术以ELISA测定来测定，和/或使用以下在实施例部分描述的测定来测定。在优选的实施方案中，结合剂为抗体、其功能性抗原结合片段、小链抗体可变结构域片段(scFv)、Fab片段、其重链可变结构域(Vh)或其轻链可变结构域(Vj。可用于本申请公开的方法的结合剂包括但不限于在表1中标示出的结合剂。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>*SantaCruzBiotechnologyInc.,SantaCruz,CAUSA.**国际血型参比实验室(InternationalBloodGroupReferenceLaboratory),Bristol,UK.在替代的实施方案中，结合剂为蛋白质。例如，蛋白CCL11、CC124和CCL26可以用作SEQIDNO15的抗原的结合剂；CX3CL1和CXXXC趋化分子(fractaline)可以用作SEQIDNO16的抗原的结合剂；CxCL9、CxCLlO和CxCLll可以用作SEQIDNO10的抗原的结合剂；而凝乳酶(rennin)可以用作SEQIDNO12的抗原的结合剂。抗体的“抗原结合位点”或“抗原结合片段”是指参与抗原结合的抗体的一部分。抗原结合位点由重链(“H”)和轻链(“L”)的N-末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的V区中的3个高度不同的序列段被称为“超变区”，其被插入到称为“构架区”或“FR”的更保守的侧翼序列段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的超变区之间并与其邻接的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的3个超变区和重链的3个超变区在三维空间中彼此相对排列，以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，每条重链和轻链的3个超变区均被称为“互补决定区”或“⑶R”。抗体可以通过本领域一般技术人员已知的众多技术中的任一种制备。参见例如Harlow禾口Lane，Antibodies:ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory,1988。一般而言，抗体可以通过细胞培养技术产生，包括如本申请所述产生单克隆抗体，或者通过将抗体基因转染入合适的细菌或哺乳动物细胞宿主中以使得可以产生重组抗体。单克隆抗体可以使用杂交瘤方法制备，例如Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6:511-519，1976的技术及其改进技术。这些方法包括制备能够生产具有所需特异性的抗体的永生化细胞系。单克隆抗体还可以通过重组DNA方法制备，例如在美国专利4，816，567中描述的那些。可以使用常规程序分离并测序编码本申请公开的单克隆抗体的DNA。重组抗体、抗体片段及其融合体和聚合物可以在体外或在原核细胞(例如细菌)或真核细胞(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)中表达，并根据需要使用众所周知的方法进一步纯化。抗体还可以来源于重组抗体库，该重组抗体库基于已经由计算机模拟设计并由合成产生的多核苷酸编码的氨基酸序列。用于设计和获得计算机模拟产生的序列的方法是本领域已知的(Knappik等人，J.Mol.Biol.296254:57_86，2000；Krebs等人，J.Immunol.Methods254:67_84，2001；美国专利号6,300,064)。Rauchenberger等人(J.Biol.Chem.278=38194-38205,2003)已描述了可用于产生功能性Fab片段的人组合文库的构建方法。可以使用本领域众所周知的技术对抗体进行消化，以产生其抗原结合片段。例如，蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子，以产生几个片段，其中两个(“F(ab)”片段)各自包含共价异二聚体，其包含完整的抗原结合位点。所述酶胃蛋白酶能够切割IgG分子，以提供几个片段，包括“F(ab')2”片段，该片段包含两个抗原结合位点。“Fv”片段可以通过优先蛋白酶剪切IgM、IgG或IgA免疫球蛋白分子产生，但更通常使用本领域已知的重组技术获得。Fv片段包括非共价VH:异二聚体，其包含抗原结合位点，该位点保留了天然抗体分子的大部分抗原识别和结合能力(Inbar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA692659-2662(1972)；Hochman等人，Biochem.15:2706_2710(1976)；和Ehrlich等人，Biochem.194091-4096(1980))在本领域中有众多的表达系统可用于生产抗体片段，包括Fab片段、ScFv、\和VH。例如，原核生物和真核生物源的表达系统可用于大规模生产抗体片段和抗体融合蛋白。特别有利的是允许将大量抗体片段分泌入培养基中的表达系统。已描述了用于大规模生产抗体片段和抗体融合蛋白的真核表达系统，其基于哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物、转基因动物和低等真核生物。例如，可以在酵母发酵系统中实现符合成本效益且能大规模生产抗体片段。这些生物的大规模发酵在本领域是众所周知的，目前用于几种重组蛋白的原液生产。酵母和丝状真菌易于遗传修饰，而且目标蛋白可被分泌到培养基中。另外，某些产物符合GRAS(美国食品药物主管机构给予的检验标记，GenerallyRegardedasSafe)要求，因为它们不具有热原、毒素或病毒包涵体。甲基营养酵母和其它酵母，如波氏假丝酵母(Candidaboidinii)、多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)和巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)，是众所周知用于生产异源蛋白的系统。可以获得mg至g数量的高蛋白水平，并有可能成比例放大至工业应用的发酵。巴斯德毕赤氏酵母(P.pastoris)系统用于几种工业规模的生产工艺。例如，已描述了毕赤酵母(Pichia)表达scFv片段以及重组抗体及其片段的应用。RidderφA,Biotechnology13:255-260(1995)；AnadradeφA,J.Biochem.(Tokyo)128891-895(2000)；Pennell等人，Res.Immunol.149:599_603(1998)。在摇瓶培养中，可以实现250mg/L至超过lg/LscFv或Vhh的水平(Eldin等人，J.Immunol.Methods20167-75(1997)；Freyre等人，J.Biotechnol.76157-163(2000))已针对酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)描述了用于scFv的相似表达系统。Horwitz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8678-8682(1988)；Davis等人，Biotechnology9165-169(1991)；禾口Swennen等人，Microbiologyl48=41-50(2002)。丝状真菌，如木霉属和曲霉属，有能力分泌大量蛋白质。该特性可用于表达scFv和VHH。Radzio等人，Process-biochem.32529-539(1997)；Punt等人，TrendsBiotechnol.20200-206(2002)；Verdoes等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.43195-205(1995)；Gouka等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.471-11(1997)；Ward等人，Biotechnology8:435-440(1990)；Durand等人’EnzymeMicrob.Technol.6:341_346(1988)；Keranen等人，Curr.Opin.Biotechnol.6534-537(1995)；Nevalainen等人，J.Biotechnol.37:193_200(1994)；Nyyssonen等人，Biotechnology11:591-595(1993)；和Nyyssonen等人，国际专利公布号WO92/01797。在某些实施方案中，结合剂特异性结合本申请公开的X-染色体或Y-染色体特异性抗原的变体。本申请使用的术语“变体”包含与特异性鉴别的序列不同的核苷酸序列或氨基酸序列，其中一个或多个核苷酸或氨基酸残基被缺失、取代或添加。变体可以为天然等位基因变体，或者非天然变体。变体序列(多核苷酸或多肽)优选表现出与本申请公开的序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。如下测定同一性百分率比对如下所述要对比的两个序列，确定比对部分的相同残基数，将该数除以本发明的(查询)序列的残基总数，并将结果乘以100。除了表现出所述水平的序列同一性之外，所公开的X-染色体或Y-染色体特异性抗原的变体自身优选对携带X-染色体或Y-染色体的精子具有特异性。一般来说，变体序列与特异性鉴别的序列的差异仅在于保守取代、缺失或修饰。本申请使用的“保守取代”是这样的取代其中一个氨基酸取代另一个具有相似特性的氨基酸，使得肽化学领域的技术人员能够预期多肽的二级结构和亲疏水性质未显著改变。一般而言，以下的氨基酸基团代表保守改变(1)ala、pro、gly、glu、asp、gin、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val>ile、leu>met>ala>phe；(4)lys、arg、his；禾口(5)phe>tyr>trp、his。变体还可以(或替代地)包含其它修饰，包括对多肽的抗原性质、二级结构和亲疏水性质影响最小的氨基酸的缺失或添加。例如，多肽可以缀合至蛋白N-末端的信号(或前导)序列，该序列共翻译或翻译后引导蛋白的转移。多肽还可以缀合至接头或其它序列，以易于合成、纯化或鉴别多肽(例如聚-His)，或者增强多肽与固体支持体的结合。例如，多肽可以缀合至免疫球蛋白Fc区。可以比对多肽和多核苷酸序列，并可以使用可公开获得的计算机算法，针对另一个多核苷酸确定特定区域中的相同核苷酸的百分率。用于比对和鉴别多核苷酸序列的同一性的两个示例性算法是BLASTN和FASTA算法。可以使用BLASTP和算法检验多肽序列的比对和同一性。BLASTX和FASTX算法针对多肽序列比较所有读框中翻译的核苷酸查询序列。FASTA和FASTX算法描述于Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444-2448，1988；和Pearson，MethodsinEnzymol.183:63_98，1990。FASTA软件包可得自维吉尼亚大学，Charlottesville，VA22906-9025。FASTA算法设定为文件中所描述的并随算法一起分发的默认参数，可用于测定多核苷酸变体。随算法一起分发的FASTA和FASTX2.Ox版的自述文件描述了所述算法的应用，并描述了默认参数。BLASTN软件可在NCBI匿名FTP服务器上获得，并可以由国家生物技术信息中心(NCBI)，国家医药图书馆，38A楼，8N805室，Bethesda,MD20894获得。BLASTN算法2.0.6版[1998年9月10日]和2.0.11版[2000年1月20日]设定为在文件中描述的并随算法一起分发的默认参数，优选用于按照本发明测定变体。包括BLASTN在内的BLAST算法家族的应用描述于NCBI站点和出版物Altschul等人，“GappedBLASTandPSI-BLASTanewgenerationofproteindatabasesearchprograms,"NucleicAcidsRes.25:3389_3402,1997。用BLASTN、BLASTP,FASTA或相似算法产生的查询序列对一个或多个数据库序列的“命中结果”比对并鉴别序列的相似部分。按照相似度和序列重叠长度的顺序排列命中结果。针对数据库序列的命中结果，一般代表仅一部分查询序列序列长度内的重叠。如下确定多核苷酸或多肽序列的同一性百分率使用合适的算法，例如分别设定为默认参数的BLASTN或BLASTP，比对多核苷酸和多肽序列；鉴别比对部分内相同的核酸或氨基酸的数量；将相同的核酸或氨基酸的数目除以本发明的多核苷酸或多肽的核酸或氨基酸的总数；然后乘以100得到同一性百分率。在替代的实施方案中，变体多肽由在严格条件下与所公开的多核苷酸杂交的多核苷酸序列编码。用于测定互补性的严格杂交条件包括低于约1M、更通常低于约500mM和优选低于约200mM的盐条件。杂交温度可以低至5°C，但一般高于约22°C，更优选高于约30°C，最优选高于约37°C。对于特异性杂交，较长的DNA片段可能需要较高的杂交温度。因为杂交严格性可能受其它因素如探针组成、存在有机溶剂和碱基错配程度的影响，所以参数组合比任一个单独参数的绝对度量更重要。示例性的“严格条件”是以6XSSC，0.2%SDS的溶液预洗涤；以65°C，6XSSC，0.2%SDS过夜杂交；接着各以IXSSC，0.1%SDS于65°C进行30分钟的两次洗涤，并各以0.2XSSC,0.SDS于65°C进行30分钟的两次洗涤。分离并纯化本申请公开的所有结合剂和X-染色体或Y-染色体特异性抗原，如这些术语在本领域通常使用的那样。优选地，结合剂和抗原为至少约80%纯，更优选至少约90%纯，最优选至少约99%纯。本申请公开的结合剂可以有效用于分离携带X-染色体和Y-染色体的精子，并因此可用于富集精液样品的确定雄性或雌性的精子。这些方法特别有利于制备用于哺乳动物人工授精的精子，所述哺乳动物包括但不限于牛、猪、绵羊、山羊、人、骆驼、马、鹿、羊驼、狗、猫、兔和啮齿动物。用于这类方法的精子可以为新鲜的一次射精液，或者可以预先冷冻并随后融化。用于分离携带X-染色体和Y-染色体的精子的方法包括使精液样品与本申请公开的一种或多种结合剂接触一定时间，所述接触时间足以在精子和结合剂之间形成缀合物或复合物，然后分离缀合物和未结合的精子。在一个实施方案中，诸如顺磁微球的磁珠用结合剂包被，例如对Y-染色体特异性抗原具有特异性的结合剂，然后与在适宜容器中的精细胞悬浮液接触一定时间，所述接触时间足以允许形成结合剂和Y-染色体特异性抗原的缀合物，由此将携带Y-染色体的精子连接至所述珠。然后通过对容器施加磁场保留含有Y染色体的精子，而携带X染色体的精子易于通过由容器中除去上清液而被分离。使用磁珠分离和/或除去所需细胞类型的技术是本领域已知的，包括例如Olsaker等人(AnimalGenetics,24:311_313(1993))以及美国专利号6，893，881和7，078，224所描述的那些。要认识到的是，本申请公开的结合剂可用于本领域技术人员众所周知的其它用于分离需要细胞群的技术中。例如，首先可使天然精液样品接触本申请公开的结合剂，例如针对Y-染色体特异性抗原的抗体，然后接触特异性结合第一种抗体的第二种抗体，其中第二种抗体固定在基体(asubstrate)上。携带Y-染色体的精子将结合第一种抗体，第一种抗体再结合第二种抗体因此最终结合到基体上，由此分离携带Y-染色体的精子和携带χ-染色体的精子。可用于这些方法的基体是本领域众所周知的，包括例如硝酸纤维素膜。还提供用于本申请公开的方法的试剂盒和/或装置。在一个实施方案中，这样的试剂盒和/或装置包括磁性粒子，例如顺磁微球，其用至少一种用于X-染色体或Y-染色体特异性抗原的结合剂包被和/或结合其上。所述试剂盒和/或装置可以以一次性抛弃型单元的形式提供，所述单元包含足以处理一次射精液的精子的结合剂。包被的磁性粒子可用于使用已知方法分离携带X-染色体或Y-染色体的精子，所述方法例如Safarik和Safarikova(J.Chromatography,722:33_53(1999))所公开的那些。例如，当结合剂为小鼠单克隆抗体时，可以使用包含偶联可磁化的聚苯乙烯/氧化铁颗粒的A蛋白的珠，例如MagaBeadsA蛋白(CortexBiochen.Inc.，SanLeandro,CA,USA)。使用标准化学，例如用DMP交联剂(二甲基吡唑(dimethylprimelinidate)〗HCl)，使结合剂与珠交联。其它的结构域/区域可用于将结合剂连接至固定化支持体，例如磁珠。优化由磁珠释放精子的条件，以便避免伤害精子。例如，可以使用低PH和高甘氨酸浓度。在某些实施方案中，所用的技术既由结合在支持体(例如磁珠)上的结合剂温和释放精子，又失活结合剂，由此阻止其重复作用。这可以通过例如在结合剂骨架的暴露部分提供蛋白酶识别位点(例如rhin03c蛋白酶)来实现。在将携带X-染色体或Y-染色体的精子结合到固定的结合剂并除去未结合的精子之后，使用蛋白酶切割高亲和力结合剂，由此破坏结合剂结合携带χ-染色体或Y-染色体的精子的能力，并释放精子。在切割后，使用离心洗涤精子，以由精子分离分子组分。蛋白酶识别位点可以与二硫键或工程改造的金属离子结合位点(例如钙、镁或锌)配对，以便利用还原或螯合帮助暴露蛋白酶识别位点和/或增加其切割速率。在替代的实施方案中，蛋白酶识别位点在将结合剂连接至固定化支持体的结构域/区域上提供。加入蛋白酶导致与结合剂结合的精子温和释放。在又一个实施方案中，可以使用单独的或组合的螯合反应和还原反应由结合剂释放精子。例如，可以使用被工程改造或选择而整合至结合剂的锌离子螯合，以由精子释放结合剂。同时，可以利用二硫键将结合剂连接至固定化支持体。随后，还原将允许由支持体除去结合剂。在一种方法中，螯合需要还原，由此防止所述系统的重复作用。本领域技术人员将认识到，其它方法可成功地用于由固定化结合剂温和释放精子。例如，生物素可用于精子结合位点。随后加入链霉抗生物素蛋白应除去生物素并释放精子。在一个实施方案中，使用磁珠分选一次射精液的装置具有下表2中所述的技术条件。表2牛细管中的精液L00E+07性控的携带χ的精子的细管/射精液的数目100如果回收50%的所需精子则开始所需要的总精子4.00E+09典型的公牛一次射精中的精子数1.00E+10所需的射精次数0.4细胞纯化效率0.7提取的精子数目1.43E+09珠/细胞比率6所需的珠数8·57E+09珠浓度/ml3.00E+10在该市售制剂中的体积(ml)10IOml中的总珠数3E+11用于单个牛性别确定装置的MagaBeads-A蛋白体积(ml)2.86E-01用于12000个牛性别确定装置的MagaBeads-A蛋白体积(ml)3.43E+03用于使用特异性结合剂分离携带X-染色体或Y-染色体的精子的替代方法包括(i)凝集，之后过滤；(ii)具有两个官能团(例如A蛋白和生物素)的非磁性珠所述珠如上所述使用，只是它们与包被链霉抗生物素蛋白或相似的生物素结合化合物的表面反应，而不是磁性分离；(iii)将抗体固定在允许柱层析类型方案的支持体上；和(iv)FAC。提供以下的实施例是为了阐述，而不是为了限制。实施例1通过生物信息学鉴别候选基因在基于基因组的方法中使用可公开获得的牛基因组(可在Ensembl站点上获得；最初于2006年8月14日发布；更新版于2007年2月发布)和可公开获得的人基因组，以鉴别在性控精子表面上的差异。具体地说，使用EnsemblBiomart工具(可在Ensembl站点上获得)和以下策略选择候选基因1)使用Biomart鉴别人X染色体基因的牛直系同源物，其具有跨膜结构域，并通过手工分析检查；2)通过Biomart鉴别牛基因组中存在于X染色体上的并具有跨膜结构域的基因，并通过手工分析检查(未测序的牛Y染色体)；和3)使用Biomart鉴别人Y染色体基因的牛直系同源物，其具有跨膜结构域，并通过手工分析检查(包含一种牛基因，该基因在牛中可能已经移动至X染色体)。在除去冗余的命中结果后，鉴别出总共216个候选基因。实施例2軒表汰終細■細■制_检查在实施例1中鉴别的每种候选基因，以观察是否有剪接变体，如果有，则选择所有转录物共有的外显子。如果不存在合适的外显子，则选择每种转录物独有的外显子用于引物设计。采用外显子用于引物设计，而不是越过内含子，以使所有的引物在基因组DNA上都被检验。还设计对照引物，以确保在cDNA中没有基因组DNA。使用Primerf软件(可由SourceForge在线获得)和80_150bp的产物大小设计引物，用于实时PCR。所有的引物都使用Blast软件检查，以证实它们不能在基因组中的其它位置引发(即至少引物的3’末端碱基不能匹配)。然后在逆转录PCR研究中使用设计的引物，以分析候选基因在牛睾丸组织cDNA和牛基因组DNA中的表达。在初始的216种候选基因中，显示出136种在牛睾丸组织中表达。然后通过应用基于如下所述的表达和亚细胞定位的标准区分这些基因的优先顺序。圆形精细胞是正在发育的精细胞，其已经历减数分裂，且与成熟精子不同，其转录RNA。圆形精细胞(RS)分化为精子(成熟精子)，没有细胞分裂，因此代表鉴定精子中的表达基因的良好候选物。通过显示鼠精子表面上存在的蛋白和鼠RS中的mRNA表达之间的高度相关，证实了该方案的可行性。使用来自两个高质量出版物的数据进行该比较。第一个出版物(Stein等人，2006)通过使用膜纯化和质谱的组合组装了在精子表面膜上存在的82种蛋白。然后在第二个出版物(Shima等人，2004)提供的鼠RS中检验了这82种蛋白的mRNA表达。在这82种基因中，有71种基因的数据，在这71种中，67种以RNA水平表达基因(94%)。该结果证实，在RS中的mRNA表达是精子蛋白的良好间接量度。开发鼠数据组，以进一步考察已知在细胞表面上存在的基因产物在RS中的相对RNA表达量，并与候选物的鼠直系同源物的RNA表达水平相比较。该分析的结果示于图1，证实候选基因一般以比已知精子蛋白的随机选择低得多的水平表达(71种基因中约有30种有表达数据)。这些结果潜在地解释了为什么研究者迄今为止还不能发现携带X染色体或Y染色体的精子之间的表面差异，并表明这样的差异将需要非常灵敏的工具来检测和开发。这些结果还允许基于相对表达量区分候选基因的优先顺序。除一种基因以外，Stein等人(出处同上)检测的蛋白具有大于40的RNA表达水平，因此该数值被用作针对最佳候选物的阈值。基于鼠直系同源物，高优先级的候选基因(在图1中以框表示)全部具有40或以上的相对表达水平。已知由精子上的抗体检测的其它蛋白检验表明表达水平范围为9-1000(参见表3)。表3在精子上检测的蛋白质及其在鼠RS中的mRNA表达<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>PMID=Medline(uniquePublicMedlineidentifier)实施例3基于亚细胞定位区分候选基因的优先顺序候选基因在圆形精细胞中的低表达水平提示，如果候选基因仅存在于非细胞表面的膜上，那么这些候选物应被给予较低的优先级。此举的原因在于由于候选物已低表达，其又伴有蛋白在表面上仅以低百分率存在将使候选物非常难以检测。因此检验候选基因或其在其它物种中的直系同源物，以测定基因产物的亚细胞位置。如果得到蛋白处于非细胞表面的膜系统上的证据，那么将给予该候选物较低优先级。该数据与圆形精细胞表达数据组合，产生4种不同优先级的基因类别，I类为最高优先级。在以下表4中标示的每种I类牛候选基因均具有以下特征■鼠直系同源物基因在鼠圆形精细胞中于阈值水平(参见上文)之上表达；■所述基因在公牛睾丸组织中表达；■基因产物非常可能存在于细胞膜中；和■已知基因产物存在于细胞表面上，或者没有证据表明基因产物不存在于细胞表面上。表4:1类候选牛基因<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>基于与不同哺乳动物直系同源物的比较，发现在SEQIDNO:1-42中提供的某些序列可能预测错误。修改后的更精确的序列提供于SEQIDN0:137-158。对应于候选牛基因的人基因标示于表5。表5:1类候选人基因<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>对应于候选牛基因的马基因在表6中标示。表6:1类候选马基因<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>除了3种基因以外，所有的I类候选基因均选自人、牛或马的X染色体。两篇论文提及的两种例外情况均为趋化因子受体，两篇论文的作者观察到，当用对趋化因子受体(CCR3&CX3CR1)特异性的抗体染色精子时，仅50%的精子染色(Muciaccia等人，FasebJ.19:2048_2050(2005)；Zhang等人，Hum.Reprod.19409-414(2004))这两种趋化因子受体均紧密聚簇在牛染色体22上，在研究它们的启动子区域后，发现GATA-KX-编码的转录因子)有可能结合并控制它们的表达(DeVries等人，J.Biol.Chem.27811985-11994(2003)；Garin等人，Biochem.J.368753-760(2002)；Vijh等人，Genomics80:86-95(2002)；Zimmermann等人，Blood96:2346-2354(2000))。另一种例外的kel是二硫键连接的XK蛋白的配偶体(Lee等人，Semin.Hematol.37113-121(2000)；Russo等人，Biochim.Biophys.Acta146110-18(1999)；Russo等人，J.Biol.Chem.27313950-13956(1998))。Stein等人(Proteomics6:3533-3543(2006)；另参见Baker等人，Proteomics81720-1730(2008))的蛋白质组研究已表明，本申请公开的一种候选基因的小鼠直系同源物(pgrmcl；小鼠蛋白ENSMUSG00000006373；牛蛋白ENSBTAG00000019552，SEQIDNO13)存在于精子膜上。另外，业已表明，使用本申请所述方法鉴别的另一个I类候选抗原的小鼠直系同源物(小鼠蛋白ENSMUSG00000031130牛蛋白ENSBTAG00000005616；SEQIDNO2)在发育中的精子上表达(Fathi等人，J.Biol.Chem.268:5979_59841993))。实施例4产牛抗体樹剂和测Ii式所表达伯基因在精子表g上的存斯獻兄I类候选基因的获得使它们能被进行仔细检验以确定在它们的预测序列中的潜在错误。基于和其它哺乳动物直系同源物的比较，发现几种候选基因具有潜在的预测错误，通过克隆cDNA的任一个部分或完整可读框，并测序这些区域，产生并测试新基因模型。在膜中的I类候选蛋白的构型由文献确定或建模，并用于选择肽(用于产生抗体)。对于每种I类候选基因，制订特别的策略，以显示所述蛋白质存在于精子表面上，并验证基因产物针对携带X-染色体或Y-染色体的精子是特异性的。在以下表7中显示的这些策略包括使用牛和/或人精子，由市售获得抗体和/或通过基于两种不同的肽的方案产生获得抗体，并针对候选基因中的三种，表达和纯化重组蛋白。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>产生肽的抗体经常具有一定的效价范围，且不一定识别天然蛋白或在SDS-PAGE凝胶上变性的蛋白。另外，内在膜蛋白(大部分I类候选物)经常难以溶解，并因此难以进入PAGE凝胶系统(Peirce等人，Mol.Cell.Proteomics356-65(2004)；Santoni等人，Electrophoresis21=3329-3344(2000))我们对这些问题的解决方案如下每种蛋白产生多个肽-抗体，并使用各种检测技术检测这些抗体，例如直接细胞表面结合(流式细胞术)、细胞裂解测定、抗体精子捕获、蛋白质印迹和/或固定的精细胞的免疫组织化学。在另一个克服产生肽的抗体的某些问题的策略中，使用质谱检测候选精子表面蛋白。这些实验具有两个目标首先，确定精子中是否存在任一种候选基因；其次，如果存在，则确定候选物是否在质膜上，确定在携带X染色体或Y染色体的精子之间的分布，并证实结合物质的身份。为达到高测定通量，在有可能的情况下使用机器人站连同96/384孔板进行设置和进行测定。a)抗体和/或抗血清的牛产使用以下描述的策略设计用于生产针对SEQIDNO:1_9、11_14和17-21的I类候选抗原的抗体的肽。以下为用于肽选择/设计的两种设计策略。在第一种策略中，应用标准肽设计规则设计优先结合表面暴露表位的肽，然而，如果不能获得足够的表面表位，则使用胞质表位。简而言之，用于设计肽的方案如下选择N-末端、C-末端和连接跨膜结构域的小环(其已被作图在序列上；预期信号序列从所述序列中除去以用于肽选择)；并选择具有以下特征的序列具有合适的亲水性(_0.5至0.5)，不以谷氨酸或谷氨酰胺开始，不具有任何cys残基，不具有可能的糖基化位点且不与其它蛋白密切相关。所有的肽通常都在C-末端具有接头(GSGC)，以能够特异性偶联至载体蛋白、ELISA板和/或琼脂，用以亲和纯化抗血清。然而，对于处于蛋白的最C-末端的肽，将接头CGSG加至N-末端。在第二种策略中，依据Anderson等人(J.ProteomeRes.3:235_244(2004))的方法设计用于SISCAPA技术的肽。基本上该技术为ELISA，检测阶段为质谱。在设计和生产肽后，将肽缀合至载体KLH，并使用标准技术免疫兔，以生产抗血清。还可以将肽缀合至第二种载体，以用作多种测定中的阳性对照。或者，可以使用具有共价连接的马来酰亚胺基团(cys反应基团)的ELISA板。对于每种候选基因，将两种肽同时免疫入兔中，每对肽免疫两只兔子。该方法用于动物时是有效的，使获得具有所需活性的抗体的可能性最大化，且用亲和纯化抗体获得单特异性抗血清(Larsson等人，J.Immunol.Methods315110-120(2006)；Uhlen禾口Ponten，Mol.Cell.Proteomics4:384—393.(2005))。通过ELISA测试抗血清对免疫肽的识别。简而言之，纯化的肽通过每个肽上的游离巯基(cys残基)特异性结合ELISA板。游离巯基与具有马来酰亚胺表面的ELISA微量滴定板(Corning)反应，由此允许所述肽经巯基不可逆结合。在肽结合后，对所述肽滴定抗血清(预免疫的和最终抽血的)。随后加入缀合HRP的抗兔抗体，并使用OPD显色信号。结果表明，对于用于免疫的54种肽，对25种肽获得了具有0.001或以下的特异性肽结合效价的抗血清。利用标准技术在具有通过游离巯基特异性附着的肽的柱子上纯化效价低于0.001的抗血清。脱盐的抗体用于随后的测定。b)抗体与候诜基因产物的结合如下测定抗体对候选基因产物的特异性。克隆大部分候选物的基因，以便使它们能够用作阳性对照。购买或克隆基因，然后将基因转移至Invitrogen表达载体pcDNA3.2/V5-DEST。这些质粒用于通过磷酸钙方法瞬时转染HEK293T细胞。在48-72小时后，由培养皿上刮下细胞，用于流式细胞术研究，或者直接用于产生完整的细胞裂解物。能够比较模拟物转染的HEK细胞或用适宜的表达载体转染的HEK细胞并随后用候选抗体进行流式细胞分析使得可以证实所述抗体对候选基因产物是特异性的。结果概述于以下表8。表8依据流式细胞术显示出特异性结合瞬时转候选物染的HEK293T细胞的抗体鉴定CCR3(SC32777；SC7897；MAB155)CX3CR1(SC20432；SC30030)BRS3(SC33404)FAMllA(GN21352)VSIGl(VSIG)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>C)针对结合候诜基因产物的物质的测定由于产生肽的抗体结合靶蛋白的性质难以预测(即抗体是否将识别天然蛋白和/或变性形式)，所以使用多种测定。检查抗体或其它物质与候选基因产物的结合的测定包括以下测定，其通过起始物质和所用的测定进行分类(参见图2)·I类测定使用流式细胞术、细胞裂解和/或免疫纯化进行的完整精子测定；·II类测定使用免疫组织化学型方案和/或流式细胞术读取的固定化精子测定；和·III类测定精子表面膜蛋白制备，之后为蛋白质印迹、SISCAPA和/或iTraq方案。I类测定这些测定使用新鲜的或由在液氮中冷冻的等份试样融化的活精子。牛精子通过Percoll梯度纯化，以产生存活的、高活力的、形态正常的且可育的精子群(Samardzija等人，Anim.Reprod.Sci.91:237_247(2006)；TrentalanceandBeorlegui,Andrologia34397-403(2002))。该程序先前已用于新鲜精子和冷冻精子。I类测定利用上述抗体/结合齐U，检测包含流式细胞术，AlexaFluor缀合的二抗(InvitrogenCorp.，Carlsbad,CA)作为报告体系统，用顺磁珠免疫捕获精子，还进行免疫沉淀，之后通过质谱检测释放的胰蛋白酶消化的蛋白。II类测定使用免疫组织化学的基本原理在于固定可以改变蛋白表位，并可以产生某些在天然蛋白中没有的表位。在使用前，牛精子在Percoll梯度上纯化，然后固定在不同的固定剂范围(3-4)内。再使用上述抗体/结合剂，以流式细胞仪或基于ELISA板的形式读取结合数据。III类测定III类测定可能对检测低丰度抗原最敏感。在Percoll梯度上再次纯化牛精子，然后通过两种不同的技术制备精子质膜蛋白组分。第一种方法生物素化完整精子的表面，质膜蛋白随后在天然抗生物素蛋白上分离，并用于多种测定(Zhao等人，Anal.Chem.761817-1823(2004))。还可以使用第二种方法，其用于质膜蛋白制备，包括更传统的氮空腔/沉淀和去垢剂溶解(Lalancette等人，Biol.Reprod.65:628_636(2006))。使用两种不同的膜蛋白分离技术，因为所有方法对不同蛋白的分离都具有一定选择性。在富集精子质膜后，在以下的三种测定中使用样品()蛋白质印迹蛋白质印迹的关键问题是使足量的富集质膜蛋白加入PAGE凝胶，同时仍使凝胶良好解析并提供足够的灵敏度。在将质膜富集样品加载到PAGE凝胶上之前，可以使用进一步的简单分级分离，例如使用离心柱进行简单的大小截流，例如保留IOKd以上的物质。还可以使用去垢剂/相分离选择某些类型的膜蛋白，例如一步或多步(Santoni等人，Electrophoresis21=3329-3344(2000))总之，目标是建立基于知识的富集(使用候选基因信息)，而不产生额外的样品，因此可针对不同处理分组候选基因。在一个实施方案中，首先用几种抗体免疫沉淀蛋白，然后使用蛋白质印迹鉴别捕获蛋白。(ii)SISCAPASISCAPA技术的概述示于图3。与标准技术的主要差异在于将使用不同的起始物质，即与人胞质蛋白相对的精子质膜，省略同位素标记肽。SISCAPA技术设计用于特异性鉴别和定量人胞质中的蛋白，所述蛋白被多种代谢或病症改变(Anderson等人，2004，出处同上)。该强大的技术具有几个优势使用抗体富集样品肽，因此减少了质谱分析的复杂性；针对肽产生的抗体几乎总能识别所述肽，其与亲代蛋白不同；掺杂的肽(spikedpeptides)(就Anderson实验而言为同位素标记)允许质谱仪明确地鉴别肽，且还定量内源蛋白。在本研究中，使用与用于免疫的肽相同的肽实施SISCAPA方法，而不是使用同位素标记的肽。该肽用作标准品，以在质谱仪中确定所述肽的飞行特征。用于本研究的肽具有GSGC接头，然而其将在碱性残基之后，因此用胰蛋白酶消化所述肽将提供精确的肽作为质谱仪的内标；起始样品的胰蛋白酶消化也具有显著优势，尤其是对于其中消化肽能够溶解和分离的膜蛋白，采用疏水性亲代蛋白的任务明显更难；和应用于抗体的样品量不受限，因此能使非常大量的精细胞质膜(>IO8个细胞等效物)通过抗体，这又提供了可能非常高灵敏度的技术。liiiliTRAQAppliedBiosystemsiTRAQ试剂是一组复合的四同重元素试剂，其为胺特异性的，产生质量相同的标记肽，因此就单MS模式而言也是相同的，但其产生强的、诊断性的、低质量的MS/MS标签离子，允许同时定量多达4种不同的样品。利用改进的片段化模式简化蛋白鉴别，MS或MS/MS模式没有信号拆分，将多个蛋白质组样品混合在一起而不会增加MS和MS/MS数据的复杂性。本研究使用如在图4中所示的iTRAQ技术。与用于本研究的其它技术相反，首先通过流式细胞仪将精子分为携带X染色体或Y染色体的两个群。然后这些分拣的样品与iTRAQ试剂一起使用。实施例5结合精细胞的抗体和通过流式细胞术分析对于本申请公开的10种候选基因，如下使用流式细胞仪显示出对候选蛋白特异性的抗体结合人、牛或这二者的精子。通过离心在PerCollTM(GEHealthcare)不连续密度层上纯化新鲜精子。在洗涤后，精子的目测显微镜观察显示出基本上纯的精子群。来源于单次射精液的人精子具有总计数40-120XIO6个精子的浓度范围(20-60X106/ml)，活动力目测评价平均>60%。牛精子平均浓度为1.5X109/ml，总计数约IOXlO9个精子，活动力目测评价平均大于70%。使用InvitrogenLIVE/DEAD精子活力试剂盒(SYBR-14/碘化丙锭)评价纯化的精子的活力。一般而言，据精子活力试剂盒(SpermViabilityKit)评价，精子显示出大于80%的活力。另外，通过LyS0trackerTM(Invitr0gen)分析表明，低于20%的精子是顶体反应性的，该比例等于由精子活力分析获得的死亡总数。通过标准技术进行纯化精子的抗体染色。简而言之，将纯化的精子与它们的一抗温育，洗涤，并用AlexaFluor488缀合的二抗标记。在分析前，还用碘化丙锭染色细胞。通过碘化丙锭染色排除死亡的精子，对于每个分析，在Becton-DickinsonFACScalibur中收集30，000个事件。这些研究的结果概述于下表9和10。在显示出候选抗体与精子的特异性结合时，对1个以上个体的精液样品也实现了这一点。表9候选物流式细胞术显示结合人精子I流式细胞术显示结的抗体数/测试抗体数合人精子的抗体的鉴定<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表10<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>显示出特异性结合的精细胞的百分率随下表11中所示的抗体而变化。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>对于显示出较高结合百分率的实例，即XK、CCR3、FMRlNB和L1CAM，在双峰分布中有明显的抗体结合证据，第一个峰与二抗唯一的峰一致，第二个分布具有约1-100倍以上的荧光。显示出较低细胞结合百分率的抗体表现出荧光分布的时滞(相对于二抗唯一的峰)，具有1-10倍以上的荧光。这些结果与使用抗⑶55抗血清作为已知结合精子表面的抗体获得的数据相反。该抗体特异性结合71%的精子，然而，对单独的二抗以及一抗和二抗一起来说，均存在单模式结合分布，不过对于后一结合来说，整个峰由于较大的荧光而迁移。由于抗体结合随着可用的结合位点的数目和抗体的亲合力而变化，所以低于50%的细胞结合抗体可能表明，在精子表面上存在非常低的分子表达(采用所用的试剂在检测以下)和/或不是所有的精子都携带候选抗原。一般而言，结合人精子的抗体比结合牛精子的抗体多。该结果应当是可预期的，因为大部分抗体针对人蛋白产生。候选蛋白一般在人和牛之间是高度保守的，然而氨基酸序列的微小变化(取决于表位)可以降低抗体对蛋白的亲合力。实施例6^mmmMMmmmm^M^mmM如下通过蛋白质印迹检验针对候选基因产物的抗体结合精细胞制备物的能力。对纯化的精子进行超声，通过离心除去核，通过超离心分离总的膜组分。在8%Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上分离来自膜组分的蛋白，并转移至硝酸纤维素膜(NC；Invitrogeni_Blot)。用脱脂奶封闭NC膜，与对目标蛋白特异性的一抗温育，然后与缀合辣根过氧化物酶的二抗温育。用化学发光的ECL蛋白质印迹底物显色印迹，并使用LAS-3000成像系统(Fuji)检测信号。在蛋白质印迹中，使用对人kel特异性的抗体AF914，检测刚好跑在IOOkD之下的条带。该条带出现在加载0.8XIO8个人精子的膜制备物的泳道上。几乎同样大小的条带也出现于加载HEK细胞的全细胞裂解物的蛋白质印迹中，所述HEK细胞用表达人kel基因的pCDNA载体转染。相比之下，未转染的HEK细胞的全细胞裂解物没有显示出抗体特异性结合将在兔中制备的针对牛EFBm基因的重组胞外结构域的抗体用于探测牛精子的蛋白质印迹。在这些实验中，将由IXIO9个人精子得到的膜制备物在SDS-PAGE上跑电泳，印迹到硝酸纤维素上，并使用抗EFBm抗体检测EFBm蛋白。精子膜泳道显示出于50kd存在条带。用免疫前抗血清探测的相同泳道没有显示出相似的条带。在氨基酸水平上96%相同的人EFBm已显示出跑到50kD处(PMID17567680)。实施例7证实已鉴别出精子件别特异件抗原如下证实已通过多个测定中的“命中结果”鉴别出性别特异性抗原的指示。该确证包括两个方面首先，识别预期的分子；其次，识别的蛋白实际上位于细胞表面上，而且所述蛋白隔离携带X染色体或Y染色体的精子。以上的某些测定强有力地表明了所需特征，例如用完整的精子免疫纯化表明所述分子是表面暴露的。然而，所述技术未表明隔离X染色体或Y染色体。该特征可通过流式细胞术、PCR和/或如下所述的FISH分析确定。在使用流式细胞术时，以Johnson等人(Johnson，Anim.R印rod.Sci.60-6193-107(2000))所用的方法检验精子大小分布。对于通过PCR分析，对X和Y染色体特异性的引物与实时PCR—起用于定量性染色体与精细胞的分布(Alves等人，Theriogenology59:1415-1419(2003)；Kageyama等人，J.Vet.Med.Sci.66509-514(2004)；Parati等人，Theriogenology662202-2209(2006))。诸如蛋白质印迹和SISCAPA的其它技术表明了由所述物质结合的分子的身份。a)流式细胞术在本实验设计中，精子用已显示出结合精子的候选抗体染色，用缀合AlexaFluor的二抗(Invitrogen)识别一抗。细胞同时用Hoechst33342_染料(基于DNA含量用于精子的流式细胞术性别分选的染料)染色。该方案允许精子针对DNA含量和结合剂识别染色(Johnson等人，Hum.R印rod.81733-1739(1993))。用特异性结合X-染色体特异性抗原的候选抗体标记的精子，将富集携带X-染色体的精子(即结合更多的Hoechst染料的那些)。b)流式细胞仪分拣结合实时PCR在本研究中，将在流式细胞仪上结合候选抗体的精子分选为两个群中，即染色和非染色精子。由两个群体制备DNA，每个样品中的X-染色体和Y-染色体的量通过实时PCR测定，例如通过使用QuantifilerDuoDNA定量试剂盒(AppliedBiosytems)。该方案能够提供在两个群体中存在的X染色体和Y染色体的精确的相对量。该方案的变型是使用候选结合抗体和磁珠，以将精子分选入两个群(结合和非结合)中，然后使用流式细胞仪检测DNA含量(并因此测定XY比率)，或使用实时PCR，以表明选定细胞上的χ-染色体和Y-染色体的比率。c)FISH(荧光原位杂交)分析能够测定候选的抗体结合精子中的XY比率的方法是使用对X-染色体和Y-染色体具有特异性的FISH探针。在该方案中，首先使精子结合第一候选抗体，接着结合荧光标记的二抗。随后固定细胞，透过，并用FISH探针染色。在洗涤步骤后，在荧光显微镜下观察细胞，确定对候选抗体阳性的精子的XY染色比率。尽管已参照本发明的具体实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应当理解，在不偏离本发明的精神实质和范围的情况下，可以实施多种改变，并可以以等价方案替换。另外，可以实施许多修改，以适应具体的环境、材料、物质组成、方法、一个或多个方法步骤，以用于实施本发明。所有这些修改都属于随附的权利要求的范围。所有的出版物、专利申请和在该申请中提及的专利都通过引用整体结合到本申请中，其程度如同将每个单独的出版物、专利申请或专利分别加以具体单独说明通过引用整体结合到本申请中。SEQIDNO:1_202列示于所附的序列表。用于随附的序列表的核苷酸序列的编码，包括符号“n”，符合WIPO标准ST.25(1998)，附件2，表1。权利要求一种用于分离精液样品中携带X-染色体和Y-染色体的精子的方法，所述方法包括(a)使所述精液样品与至少一种特异性结合X-染色体或Y-染色体特异性抗原的结合剂接触一定时间，所述接触时间足以在结合剂和携带X-染色体或Y-染色体的精子之间形成缀合物；和(b)分离抗体-精子缀合物与未结合的精子，其中所述X-染色体或Y-染色体特异性抗原包含选自以下的序列(i)SEQIDNO1-21、43-89、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164和183-201；(ii)与SEQIDNO1-21、43-89、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164和183-201的序列具有至少85％、90％或95％同一性的序列；和(iii)由在严格杂交条件下与SEQIDNO22-42、90-136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165-182或202的序列杂交的多核苷酸序列编码的序列。2.权利要求1的方法，其中所述结合剂为抗体或其抗原结合片段。3.权利要求2的方法，其中所述结合剂为Fab或scFv。4.权利要求2的方法，其中所述抗体选自说明书表1中标示出的抗体。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述结合剂结合在固体支持体上。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述结合剂提供在一个或多个磁珠的表面上，并通过施加磁场分离抗体_精子缀合物和未结合的精子。7.权利要求1-6中任一项的方法，其中步骤(b)包括使精液样品与特异性结合所述特异性结合X-染色体或Y-染色体特异性抗原的结合剂的第二种结合剂接触，并且所述第二种结合剂固定在基体上。8.权利要求1-7中任一项的方法，其中提供具有蛋白酶识别位点的结合剂，所述方法进一步包括使所述抗体-精子缀合物在与未结合的精子分离后与蛋白酶接触，从而由抗体-精子缀合物释放出分离的精子。9.权利要求1-8中任一项的方法，其中由所述精液样品富集携带X-染色体的精子。10.一种用于分离精液样品中携带X-染色体和Y-染色体的精子的试剂盒，所述试剂盒包含(a)装有至少一种对X-染色体或Y-染色体特异性抗原具有特异性的结合剂的容器，其中所述X-染色体或Y-染色体特异性抗原包含选自以下的序列(i)SEQIDN0:1-2U43-89、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164和183-201；(ii)与SEQIDNO:1-21、43-89、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164和183-201的序列具有至少85%、90%或95%同一性的序列；和(iii)由在严格杂交条件下与SEQIDNO:22-42、90-136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165-182或202的序列杂交的多核苷酸序列编码的序列；和(b)使用所述试剂盒的说明书。11.权利要求10的试剂盒，所述结合剂为抗体或其抗原结合片段。12.权利要求11的试剂盒，其中所述结合剂为Fab或scFv。13.权利要求11的试剂盒，其中所述抗体选自说明书表1中标示出的抗体。14.权利要求10-13中任一项的试剂盒，其中所述结合剂结合在固体支持体上。15.权利要求10-14中任一项的试剂盒，其中所述结合剂提供在一个或多个磁珠的表面上。16.一种组合物，所述组合物包含按照权利要求中1-9任一项的方法制备的分离精子。17.一种用于富集精液样品中的携带X-染色体或Y-染色体的精子的方法，所述方法包括使精液样品与至少一种特异性结合X-染色体或Y-染色体特异性抗原的结合剂接触一定时间，所述接触时间足以在所述结合剂和携带χ-染色体或Y-染色体的精子之间形成缀合物，其中所述携带χ-染色体或Y-染色体的精子与所述结合剂的结合有效降低所述精子的活动率和活力中的至少一种，且其中所述χ-染色体或Y-染色体特异性抗原包含选自以下的序列(i)SEQIDNO:1-21、43-89、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164和183-201；(ii)与SEQIDNO:1-21、43_89、138、140、142、144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164和183-201的序列具有至少85%、90%或95%同一'性的序列；和(iii)由在严格杂交条件下与SEQIDNO:22-42、90-136、137、139、141、143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165-182或202的序列杂交的多核苷酸序列编码的序列。18.权利要求17的方法，其中所述结合剂与细胞毒素结合。全文摘要本发明提供用于分离例如精液样品中携带X染色体和Y染色体的精子的材料和方法。所述方法包括使精液样品与结合剂接触，所述结合剂例如为抗体，其特异性结合对X-染色体或Y-染色体特异性的抗原。还提供用于所述方法的试剂盒。文档编号A61K39/395GK101821623SQ200880108067公开日2010年9月1日申请日期2008年7月23日优先权日2007年7月23日发明者K·赫森,S·雷夫利奇申请人:安德罗珍尼克斯有限公司