专利名称：牛sry基因和酪蛋白检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因分析检测产品，更具体的说是适用于检测牛SRY基因和酪蛋白基因的 试剂盒。
背景技术：
牛胚胎的性别选择对于养牛业和牛奶生产意义重大。研究表明，SRY基因为母牛特有基 因，而酪蛋白基因则是公、母牛均携带的基因。
基因芯片是近几年在高科技领域内出现的最具时代特征的重大科技进展之一。它是将能 反映样本中大量基因信息的基因探针(寡核苷酸探针、cDNA克隆、PCR产物等)，有序固定 在固相支持物(如醛基、氨基、巯基、羧基等活性基团修饰的载玻片或硅片、尼龙膜、硝酸纤 维素膜)上形成阵列，通过与实际样本(或扩增产物)进行杂交反应，只需一次实验，就可高通 量获得所有待检基因的信息。这种平行检测、高信息通量的特点使其在基因表达、基因多态 性检测等方面的应用受到广泛重视。
利用芯片技术高通量地检测牛SRY基因，将酪蛋白基因作为对照基因同时检测，可以为 畜牧业育种提供一种准确、价廉的方法。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于提供一种用于高通量检测牛SRY基因和酪蛋白基因的检测试剂盒。 技术方案
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种高通量检测牛的SRY基因和酪蛋白基因的试 剂盒，试剂盒包含24种扩增管，不少于l张基因芯片，杂交液A和B。还可选择性的包含阳 性对照和阴性对照，Taq酶以及杂交显色试剂。
其中，所述的24种扩增管分为两组，每组12管； 一组扩增管中每管包含以下系列上游 引物(SP1-SP12)之一和公用下游引物(QP):
SP1: 5 ， tgctgctagcatgccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3 ，
SP2: 5， tgcagcatgctagccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3，
SP3: 5， tgcagcaacgttgccgagct cat ctg taa gcc ttt tec agt ca 3 ，
SP4: 5， tgcagctagcatcgcgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3，
SP5: 5 ， tgcagctgacatgccgaggt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3 ，
SP6: 5， tgcagctagcagtccgacct cat ctg taa gcc ttt tec tct ca 3，
SP7: 5， tgcagctggcataccgacga cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3，
SP8: 5， tgcagccagcatgtcgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3'
SP9: 5， tcgagctagactgccgacgt eat ctg taa gcc ttt tec agt ca 3'SP10 SP11 SP12 QP:
5， tgcagcctgattgccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec agt ca 3' 5' tgcagctagccgtacgacgt cat ctg taa gcc加tec act ca 3， 55 tgcagctacggtaccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 35 ;，aga cca gcc agg ace acg 3，
另一组扩增管中每管包含以下系列上游引物(CP1-CP12)之一和公用下游引物(WP):
CP1
CP2
CP3
CP4
CP5
CP6
CP7
CP8
CP9
CP10
CPU
CP12
WP:
5， tgctgctagcatgccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3， 5' tgcagcatgctagccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3， 5， tgcagcaacgttgccgagct ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3 5' tgcagctagcatcgcgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3' 5， tgcagctgacatgccgaggt ttt ctt tgt get tag gag cga ta 3' 5， tgcagctagcagtccgacct世ctt tgt get tag gag cca ta 3， 5， tgcagctggcataccgacga ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3， 5' tgcagccagcatgtcgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3' 5' tcgagctagactgccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3， 5， tgcagcctgattgccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3 ， 5' tgcagctagccgtacgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3' 5' tgcagctacggtaccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3， 5，cac ccc ttt gcc cag aca 3'
上述两组扩增管中系列上游引物(SP1-SP12和CP1-CP12)均由5'端20nt的编码序列和 3'端23nt的特异序列组成。
所述的基因芯片是将5'端带氨基修饰和16聚脱氧胸苷酸的捕获探针P1-P12分AB 二个 区域顺序固定于醛基修饰的载玻片上制成的。P1-P12的序列如下
PI: 5 ，NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgctgctagcatgccgacgt 3'
P2: 5 ， NH3 _TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagcatgctagccgacgt 3'
P3: 5' NH3 .tttTTTTTTTTTTTTT tgcagcaacgttgecgagct 3'
P4: 5' NH3 _TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctagcatcgcgacgt 3'
P5: 5 ， NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctgacatgccgaggt 3'
P6: 5 ， NH3 _TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctagcagtccgacct 3'
P7: 5， NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctggcataccgacga 3'
P8: 5, NH3画ttttTTTTTTTTTTTT tgcagccagcatgtcgacgt 3 ，
P9: 5' NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tcgagctagactgccgacgt 3'
P10: 5， NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagcctgattgccgacgt 3'
Pl 1: 5， NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctagccgtacgacgt 3'
P12: 5，鹏-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctacggtaccgacgt 3，
以上捕获探针的序列与相应的上游引物的编码序列一致。
所述的杂交液A和B中分别含有5'端带有生物素或荧光基团标记X的识别探针A和B，识别探针A和B的序列如下-
识别探针A: 5，X- agttc gee acc ttt cgt ctt cgt 3， 识别探针B: 5'X- attct gga ggg atg ttt tgt ggg 3，
本发明还提供了一种试剂盒的使用方法，包括以下步骤
(1) 制备多个牛的染色体DNA;
(2) 在试剂盒中每对扩增管中各加入一个牛的染色体DNA作为扩增模板，用聚合酶链反 应(PCR)方法扩增牛的SRY基因和酪蛋白基因的基因片段；
(3) 将所得两组扩增管的扩增产物变性后，分别取一定体积加入杂交液A和B中混匀；
(4) 将上述杂交液A和B分别与基因芯片的捕获探针A和B阵列杂交；
(5) 检测基因芯片A和B阵列的杂交信号。
制备用于PCR扩增的染色体DNA的方法有很多，可以从全血中制备、也可以从组织样 本中制备。具体方法可参阅文献(丁振诺，苏明权主编.《临床PCR基因诊断技术》，世界图书 出版公司.1998年第一版)。
用PCR方法扩增染色体基因特定片段的方法己经是本领域公知技术。其中本发明涉及的 扩增体系和扩增程序可根据有关文献(KB穆里斯，F.费里，R.吉布斯等主编《PCR聚合酶链 式反应》，科学出版社)方法由使用者独立完成。
识别探针A和B在合成时，其5'端带标记基团，所述标记基团包括伹不限于地高辛分 子(DIG)、生物素分子(Bio)、荧光素及其衍生物分子(FITC等)、其他荧光分子(如Cy3、 Cy5 等)、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。这些标记及其标记方法以及各标记物的检 测方法都已是本领域众所周知的常规技术，也可以参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射 性操作手册》；J.萨姆布鲁克，E.R弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主编，《分子克隆实验指南》，科学出 版社，1995年；马立人，蒋中华主编，《生物芯片》，北京化学工业出版社，2000， 1-130。
扩增产物的变性可采用常规变性方法如加热至94 98。C，并保温2 10min，然后迅速置 冰上。
杂交液与基因芯片杂交时，可以先将基因芯片与预杂交缓冲液进行预杂交。
本发明扩增产物与基因芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，本领域一般人 员依据经验容易确定有关缓冲液、探针和样品浓度、预杂交温度、杂交温度以及时间等的最 适条件。或者也可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克，E.F. 弗里奇，T.曼尼阿蒂斯主编，《分子克隆实验指南》，科学出版社，1995年。
然后根据标记信号在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息。本发明所述检测基 因芯片杂交信号的方法是基于与抗生物素抗体或亲合素或链亲合素复合在一起的碱性磷酸酶 或辣根过氧化物酶催化的四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP)或四 甲基联苯胺(TMB)的显色反应。具体方法可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作 手册》。若扩增产物用荧光基团标记，也可以直接用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪 Scanarray3000等)获取待测信息。
有益效果本发明提供的试剂盒，可用于检测牛SRY基因和酪蛋白基因，这可用于牛胚胎早期性别 的高通量检测，为畜牧生产中种牛的筛选提供必要信息。
本发明的上述以及其他的特征、本质和优势将通过下面结合附图对实施例的说明而 变得更加明显，在附图中相同的附图标记表示相同的特征，其中 图1:本发明试剂盒的检测原理示意图2:用本发明试剂盒检测12只牛SRY基因和酪蛋白基因所得结果。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例进一步描述本发明的技术方案。
图1示出了本试剂盒采用的工作原理含编码序列的上游引物与公用下游引物对模板 DNA进行特异扩增后产生的扩增产物M，其3'端的编码序列C与固定在芯片L上的特异性 捕获探针P互补(每一样品对应不同的捕获探针，用于区别不同样品的扩增产物)，其扩增片 段的检测位点序列与识别探针A或B (带Biotin标记，用于SRY基因鉴定)互补。
将各样品扩增产物混合后变性(平行做两管)，然后分别加入含Biotin标记识别探针A 和B的杂交液中混匀，在同一张芯片上A、 B两个不同的反应区(两个反应区的阵列及各信 号点分别对应的探针一致)中进行杂交反应。每个样品对应的扩增产物，其3'端会与芯片上 的捕获探针杂交，若该扩增片段中含有与杂交液A或B中带Biotin标记的识别探针A或B 互补的序列，则与该Biotin标记的识别探针A或B杂交，使扩增产物带上Biotin标记。将 Biotin标记进行显色处理，即可检测到信号。否则检测不到信号。根据芯片上同一样品对应 的A和B两个阵列上检测位点的信号强度来判断每一样品的基因。
图2是按照以下具体方法实施获得的检测结果。
1. 取待检12头牛基因组DNA;
2. PCR扩增用水溶解引物并稀释至10umol/L的使用液浓度。将购置的Taq酶、IOX缓 冲液(Tiangen)， dNTP (上海生工生物工程技术服务有限公司)，纯水以及绵羊基因组DNA 按以下配方配制PCR扩增体系10 XBuffer 2.5 nl; 25mM dNTP 0.2 pi; 25mM MgCl2 1.5|xl; DMSO 1.5pl; 200mg/ml BSA0.1pl; DDW 13.2 pi; Primers lpl; Taq酶l|nl; Temp 3|al。用PCR 扩增仪(Tc-25/HPCR扩增仪，杭州大和热磁电子有限公司)按以下程序扩增94°C， 5 min; 然后按94。C25sec, 53。C25sec， 72。C25sec做40个循环，最后72。C5min。
3. 杂交方法采用上海百傲科技有限公司的杂交试剂盒(产品编号BST05010，包含预 杂交液，杂交缓冲液，洗液l，反应舱)进行杂交。取各管PCR扩增产物各4^1，分别加至两 个0.2ml的薄壁管中，98。C热变性5分钟，取出后迅速放入冰盒，-20°C放置。取出基因芯片， 做好样品编号，在A、 B杂交舱中各加满预杂交溶液(约11(^1)，于46'C静置5分钟，将反 应舱中的溶液吸除干净；从杂交缓冲液A、 B瓶中各吸出70fil杂交缓冲液(检测探针的浓度 为100pM)，分别加到己变性的PCR扩增混合物中，混匀，将液体对应加满到A、 B杂交舱
7(约llOpl)中(加液时应注意无气泡产生)；将基因芯片迅速放入46'C恒温箱中，保温30min。 同时取1.5ml离心管，从洗液1瓶中吸出700nl洗液1，于46。C恒温箱中预热；从恒温箱中 取出基因芯片，吸除A、 B杂交舱中溶液；在A、 B杂交舱中加入ll(^l已预热的洗液l， 46 'C保温5min，然后吸除。再重复此步骤两次。
4. 显色方法采用上海百傲科技有限公司的显色试剂盒(产品编号BST06010，包含
抗体液，洗液2，洗液3，显色液)进行显色。在A、 B杂交舱中加入洗液2溶液110^1，室温 放置2min;吸除a、 B杂交舱中溶液，向杂交舱中加入抗体液溶液IIOjjI,室温放置20min; 吸除A、 B杂交舱中溶液，向杂交舱中加入洗液2溶液llOpl，室温静置2min。再重复此步 骤一次；吸除A、 B杂交舱中溶液，向杂交舱中加入洗液3溶液110nl，室温放置lmin;吸 除A、 B杂交舱中溶液，向杂交舱中加入显色液溶液110nl， 46'C避光放置40min。
5. 检测方法吸除A、 B杂交舱中溶液，小心揭除杂交舱，将显色载玻片显色区小心用 蒸馏水冲洗一下，置46'C烘干；将显色载玻片面朝下扣在BaiO BE-2.0生物芯片识读仪(Ca估 BSE 01011 )的片槽上检领3，具体操作见仪器使用说明。检测图像经Array Doctor 2.0软件分析 可自动输出检测结果
1号，2号，5号，6号，9号，10号样本为公牛； 3号，4号，7号，8号，11号，12号样本为母牛；
上述实施例是提供给熟悉本领域内的人员来实现或使用本发明的，熟悉本领域的人员可 在不脱离本发明的发明思想的情况下，对上述实施例做出种种修改或变化，因而本发明的保 护范围并不被上述实施例所限，而应该是符合权利要求书提到的创新性特征的最大范围。
权利要求
1. 一种检测牛的SRY基因和酪蛋白基因的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含24种扩增管，不少于1张基因芯片，杂交液A和B。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包含阳性对照和阴性对照。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包含Taq酶。
4. 根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于该试剂盒还包含杂交显色试剂。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于将所述的24种扩增管分为两组，每组12 管； 一组扩增管中每管包含以下系列上游引物(SP1-SP12)之一和公用下游引物(QP):SP1: 5, tgctgctagcatgccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3 ， SP2: 5， tgcagcatgctagccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 31 SP3: 5' tgcagcaacgttgccgagct cat ctg taa gcc ttt tec agt ca 3' SP4: 5， tgcagctagcatcgcgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3， SP5: 5， tgcagctgacatgccgaggt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3， SP6: 5， tgcagctagcagtccgacct cat ctg taa gcc ttt tec tct ca 3， SP7: 5 ， tgcagctggcataccgacga cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3 ， SP8: 5， tgcagccagcatgtcgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3， SP9: 5' tcgagctagactgccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec agt ca 3' SP10: 5' tgcagcctgattgccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec agt ca 3' SP11: 5' tgcagctagccgtacgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3' SP12: 5， tgcagctacggtaccgacgt cat ctg taa gcc ttt tec act ca 3， QP: 5，aga cca gcc agg acc acg 3'另一组扩增管中每管包含以下系列上游引物(CP1-CP12)之一和公用下游引物(WP)-CP 1: 5' tgctgctagcatgccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3'CP2: 5， tgcagcatgctagccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3，CP3: 5， tgcagcaacgttgccgagct ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3CP4: 5， tgcagctagcatcgcgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3，CP5: 5， tgcagctgacatgccgaggt ttt ctt tgt get tag gag cga ta 3'CP6: 5， tgcagctagcagtccgacct ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3'CP7: 5， tgcagctggcataccgacga ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3'CP8: 5， tgcagccagcatgtcgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3'CP9: 5' tcgagctagactgccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3'CP10: 5， tgcagcctgattgccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3，CP 11: 5 ， tgcagctagccgtacgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3 ，CP 12: 5， tgcagctacggtaccgacgt ttt ctt tgt get tag gag cca ta 3，WP: 5，cac ccc ttt gcc cag aca 3'上述两组扩增管中系列上游引物(SP1-SP12)均由5'端20nt的编码序列和3'端21nt的 特异序列组成。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的基因芯片是将5'端带氨基修饰和16 聚脱氧胸苷酸的捕获探针P1-P12分AB 二个区域顺序固定于醛基修饰的载玻片上制成的。 P1-P12的序列如下PI: 5 'Nro-TTTTTTTTTTTTTTTT tgctgctagcatgccgacgt 3 ， P2: 5 ， NH3-TmTTTTTTTTmT tgcagcatgctagccgacgt 3 ，P4: 5， NH3-TmTTTTTTTTTTTT tgcagctagcatcgcgacgt 3，P5: 5， NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctgacatgccgaggt 3'P6: 5'NH3-T^TTTTTTTTTTTTTtgcagctagcagtccgacct3,P7: 5' NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctggcataccgacga 3 ，P8: 5， MD-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagccagcatgtcgacgt 3，P9: 5' NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tcgagctagactgccgacgt 3'Pll: 5' NH3-TTTTTTTTTTTTTTTT tgcagctagccgtacgacgt 3' P12: 5'NH3-TmTTTTTmTTTT tgcagctacggtaccgacgt 3'以上捕获探针的序列与相应的上游引物的编码序列一致。
7. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的杂交液A和B中分别含有5'端带 有生物素或荧光基团标记X的识别探针A和B,识别探针A和B的序列如下识别探针A: 5'X匿agttc gcc acc ttt cgt ctt cgt 3' 识别探针B: 5'X-attctggagggatgttttgtggg3，。
8. —种试剂盒的使用方法，包括以下步骤(1) 制备多个牛的染色体DNA;(2) 在试剂盒中每对扩增管中各加入一个牛的染色体DNA作为扩增模板，用聚合酶链反 应(PCR)方法扩增牛的SRY基因和酪蛋白基因的基因片段；(3) 将所得两组扩增管的扩增产物变性后，分别取一定体积加入杂交液A和B中混匀；(4) 将上述杂交液A和B分别与基因芯片的捕获探针A和B阵列杂交；(5) 检测基因芯片A和B阵列的杂交信号。
全文摘要
本发明提供了一种高通量检测牛的SRY基因和酪蛋白基因的试剂盒。该试剂盒包含24种扩增管，不少于1张基因芯片，杂交液A和B。本发明的产品可用于牛胚胎早期性别的高通量检测，为畜牧生产中种牛的筛选提供必要信息。
文档编号C12Q1/68GK101463386SQ20081009131
公开日2009年6月24日 申请日期2008年4月2日 优先权日2008年4月2日
发明者刘守仁, 刘福元, 滨 朱, 华 杨, 敏 沈, 王新华, 钟发刚 申请人:新疆农垦科学院;上海百傲科技有限公司