专利名称：：一种动物疫苗免疫增强剂及其生产方法
技术领域：
：本发明涉及一种动物疫苗免疫增强剂，具体地说是一种小分子肽，其对部分病毒和细菌疫苗具有显著的免疫增强效果。本发明还涉及制备该小分子肽的方法。
背景技术：
：目前我国动物疾病比较复杂，原有的疾病还未得到有效的控制，新的疫情又接踵而至，令人防不胜防，给养殖业带来了巨大的经济损失。免疫增强剂能显著提高机体免疫系统功能，增强疫苗的免疫效果，减少疾病发生，因而成为近年来研究的热点课题。免疫增强剂按其来源大体可分为以下几类①微生物类，如乳酸菌、小棒状杆菌、酵母细胞壁、灵芝菌丝体以及真菌中的一些菇类等，这类免疫增强剂主要作用于体液和网状内皮系统；②生物因子类，如胸腺因子、植物多糖、转移因子、等，这类免疫增强剂主要刺激T、B细胞分化和发育，快速诱导抗原在淋巴母细胞表面上的表达；③人工合成类，如左旋咪唑、脂质体、佐剂等，它们可使受抑制的吞噬细胞和淋巴细胞恢复功能或增强巨噬细胞的吞噬功能。左旋咪唑的一个重要特点是在机体免疫力正常时没有作用，而在免疫力低下时，尤其是细胞免疫功能低下或缺损时有恢复和增强其免疫功能的作用；④天然类，如蜂胶、中草药等，这类制剂可增加巨嗜细胞的吞噬功能而达到增强免疫功能的作用；⑤微量因子类，如硒、维生素E、维生素A等，它们通过抗氧化作用改变机体免疫细胞的相对数量来改善机体的免疫功能。目前已知的各种免疫增强剂(如左旋咪唑、脂多糖、脂质体、法氏囊素及一些细胞因子等)均因成本太高或者效果不稳定等原因而没有得到广泛应用。
发明内容本发明的目的在于针对上述不足提供一种廉价高效安全的动物疫苗免疫增强剂。本发明研究发现一种小分子肽能够增强动物疫苗免疫效果，该小分子肽序列为COOH-Gly-His-Lys-NH2或其串联重复序列，该小分子肽结构与鸡法氏囊素的分子结果相似，单分子排列顺序恰好相反，因而将其命名为类囊素(sBursin)。以一定浓度的类囊素加入到灭活好的ND(或禽流感H5、H9)抗原中，制成ND疫苗类囊素疫苗(或禽流感H5类囊素疫苗、H9类囊素疫苗)，免疫雏鸡后，不同日龄釆集分离血清，用血凝抑制试验(HI)测定血清效价。试验同时设定不含类囊素的阴性对照，以及未用疫苗免疫的空白对照，结果含类囊素的疫苗(无论是ND，还是AIH5或AIH9)比不含类囊素的疫苗平均效价高1.2滴度，免疫增强效果显著。本发明的另一个目的在于提供制备所述类囊素的方法，包括重组质粒的构建、基因工程菌的构建、类囊素的诱导表达以及分离纯化参照大肠杆菌某些核糖体蛋白质中密码子使用频率，选择Gly、His和Lys最常用的密码子GGT、CAC和AAA,按照氨基酸从N端到C端的合成规律，以5'-GGTCACAAA-3'作为类囊素基因。根据人工碱基合成的效率，本发明设计了9个类囊素的串连基因如序列表SEQIDNo.l所示，以下用(GGTCACAAA)9表示。根据载体的酶切位点，在(GGTCACAAA)9序列的上下游分别引入酶切位点，并在两侧各补加几个保护性碱基。本发明以pET32a为表达载体，在(GGTCACAAA)9序列的上下游分别引入45coRl(GAATTC)和5WI(GTCGAC)的酶切位点，同时两侧各补加4个保护性碱基，所合成的基因序列如下F:5，-TCAGGAATTC(GGTCACAAA)9GTCGACCCAC-3，为了使合成的寡核苷酸能变成双链，同时合成了相应的互补序列R:5，-GGTGGTCGAC(TTTGTGACC)9GAATTCCTGA-3，。将以上寡核苷酸等量混合后，在沸水中孵育10min后，立即用冰水冷却，然后转移到4'C水洛，再用Klenow酶处理未匹配的末端，得到9个类囊素的串联核苷酸双链。。将双链化的串连类囊素基因用五coJU和5WI双酶切后，与同酶处理的载体pET32a相连接。连接产物按常规方法转化BL21(DE3)宿主菌。挑取转化菌落，扩大培养后提取质粒，酶切初步鉴定后送交测序，获得的重组质粒即为pET32a-sBursin。将在LB培养液中隔夜培养的重组菌按1%体积接种到2YT培养基中继续培养4h，用IPTG(终浓度为lmmol/L)诱导4h后收获细菌。用超声波或液氮冻融将细菌破碎后，收集裂解，初步纯化的裂解物经定量后即为本增强剂产品。应当理解，考虑到密码子的简并性，本领域技术人员可以依据转化宿主密码子的偏爱性，在不改变表达类囊素氨基酸序列的条件下，对类囊素编码基因进行修改，并将所得基因通过适当的方法制备重组表达载体，并转化宿主得到基因工程菌。然而这些并没有改变本发明的实质，均应落入本发明的保护范围。本发明所获得的重组类囊素对体外多种动物的淋巴细胞具有明显的刺激活性，对鸡新城疫(ND)疫苗、禽流感H5、禽流感H9疫苗具有明显的免疫增强活性。按照本发明所提供的方法，能够获得低廉高效安全的生物免疫增强剂，为类囊素的产业化提供可能。图1为重组质粒pET32a-sBursin经EcoiI和Sa/1单酶切和双酶切的电泳结果，其中l是sBursin(9重复串连)克隆前片断(含酶切位点和保护性碱基共约100bp);2是MarkerDL2000;3是pET32a-sBursin经五coRI和Sa/I双酶切；4是pET32a-sBursin经」EcoRI酶切；5是pET32a-sBursin经5bt/1酶切；6是pET32a-sBursin经五coRI和fe/I双酶切；图2是类囊素对家兔脾细胞的刺激活性曲线；图3是类囊素对小鼠脾细胞的刺激活性曲线；图4是类囊素对鸡法氏囊细胞的刺激活性曲线；图5是普通鸡5曰龄免疫ND活苗免疫对比结果；图6是普通鸡12曰龄免疫ND活苗免疫对比结果；图7是普通鸡ND灭活苗免疫对比结果；图8是普通鸡H9灭活苗免疫对比结果；图9是普通鸡H5灭活苗免疫对比结果；图IO是SPF鸡ND灭活苗免疫对比结果；图11是SPF鸡H5灭活苗免疫对比结果；图12是SPF鸡H9灭活苗免疫对比结果；图13是SPF鸡ND活苗免疫对比结果。图14是表达蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图，其中泳道1为蛋白分子量标准，泳道2、3是空载体表达产物，泳道4、5是重组载体表达产物(即类囊素)。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。依据大肠杆菌对不同Gly、His、Lys的偏爱性，设计能表达该三肽的基因5，-GGTCACAAA-3，，并将9个同样的该基因串连。串连后的基因通过限制性内切酶(五coRl和)克隆进pET32a载体质粒中,转化大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌，并通过序列测定筛选阳性克隆。获得的重组菌命名为E.coliBL21/pET32a-sBursin。(该菌株已于2007年9月26日送交中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCCNo.2188)。该菌株在适宜的培养基上传100代后，遗传性状仍很稳定。动物试验表明重组菌裂解物的提取物对动物疫苗具有明显的免疫增强作用。具体方法如下1重组菌的构建1.1类囊素(COOH-Gly-His-Lys-NH2)基因序列的确定根据大肠杆菌对密码子的偏嗜性，设计5，-GGTCACAAA-3'作为类囊素的编码基因，大肠杆菌对该基因具有良好的表达效率。1.2类囊素基因串连序列的合成1.2.1设计串连基因序列根据人工碱基合成的效率，本发明设计了9个类囊素的串连基因，如序列表SEQIDNo.l所示。1.2.2设计合成带有酶切位点的串连基因序列参照pET32a载体的酶切位点，在(GGTCACAAA)9基因序列的上、下游分别加入五coRl(GAATTC)和5WI(GTCGAC)的酶切位点，同时两侧各补加3个保护性碱基，所合成的基因序列如下F:5，-TCAGGAATTC(GGTCACAAA)9GTCGACCCAC-3，。为了使合成的寡核苷酸能变成双链，同时合成了相应的互补链，序列如下R:5，—GGTGGTCGAC(TTTGTGACC)9GAATTCCTGA1.2.3单链寡核苷酸的双链化由于基因的克隆和表达需要双链，为了获得双链的串连类囊素基因，将F和R单链在Klenow酶的作用下，连接过夜。1.3串连类囊素基因的克隆将双链化的串连类囊素基因用&oRl和^/I双酶切后，与同酶处理的载体pET32a相连接。连接产物按常规方法转化BL21宿主菌。1.4筛选随机挑取4生长出的菌落，扩大培养后提取质粒，用酶切初步鉴定为阳性的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，结果筛选到2株阳性菌株，命名为E.coliBL21/pET32a-sBursin。2重组菌的特性检查2.1形态和生化特性检查革兰氏染色为阴性，呈典型的大肠杆菌形态。2.2培养特性检查在pH6.47.4的LB琼脂或其他适宜培养基上生长良好。2.3基因特性检查目的基因的分子检测或鉴定可通过PCR、酶切或序列测定完成，具体方案如下2.3.1PCR鉴定2.3.1.1引物由于克隆片断较小，因此在用PCR鉴定时，本项目设计引物针对了pET32a载体多克隆位点上、下游的部分核酸进行，具体引物序列设计如下上游引物F:5'—TTCGAACGCCAGCACATG—3'下游引物R:5'-TTGTTAGCAGCCGGATCTC—3'用TE缓冲液配制成40(miol/L储存浓度。2.3.1.2PCR反应体系dNTP(25mmol/Leach)4pL10xBuffer(含Mg2+)5pLF引物l|iLR引物lpL模板lpLTaq酶(5U/pL)0.5jaL38.5pL模板的制备从在固体培养基平板上挑取单菌落，加100mL灭菌双蒸水，在沸水洛中加热5分钟后，取lpL作为模板。2.3丄3PCR反应程序95。C5min94°C30s72°C30s72°ClOminPCR反应结束后，取10MLPCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。2.3丄4结果判断预期的PCR产物为223bp,如果电泳条带与预期吻合，可初步判为阳性，反之为阴性。2.3.2.酶切鉴定2.3.2.1试验材料质粒提取试剂盒(博大泰克生物基因技术有限公司)，五coRI和&/I限制性内切酶，DNAMarkerDL2000(宝生物工程有限公司)，琼脂糖(上海生工生物工程技术有限公司)，水浴锅、核酸电泳仪等。2.3.2.2试验方法菌种繁殖及质粒提取接种单个重组菌于5ml含100吗/ml氨卞青霉素(Amp)的LB培养基中，37i:振荡培养过夜，次日按照质粒提取试剂盒说明书提取质粒，简略步骤如下收集1.5ml菌液的沉淀与1.5mlEppendorf离心管中，加入100pl溶液I,振荡至彻底悬浮，加入15(Hil溶液n,立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。随后将离心管放置冰上2分钟，加入150^il溶液m,立即温和颠倒离心管数次，置室温放置5分钟。12000rpm离心12分钟，转移上清到转移的离心吸附柱后，分别用420pil结合缓冲液盒75(Hil漂洗液洗涤离心吸附柱，用5(^l洗脱液洗出质粒。质粒的酶切和电泳鉴定质粒提取完毕后，分别按下列体现进行酶切消化体系I:重组质粒6nl10xBufferH2|il五coRI酶0.5jli1M酶0,5nlH20体系n:重组质粒6|il10xBufferH2pl￡coRI酶0.5plH2011，体系III:重组质粒6pl10xBufferH2^il5WI酶0.5jalH2011.5pl同时取未重组的pET32a载体用￡coRI和Sa/I双酶切作阴性对照，反应体系如下:pET32a质粒6^110xBufferH2pl五coRI酶0，S"/1酶0.5^1H20lljil将以上各体系分别混匀后，于37t:水洛消化1小时后，用1.2%琼脂糖凝胶100V进行电泳，1小时后取出观察结果。2.3.2.3结果判定酶切电泳的结果如图1所示。相对于载体而言，用EcoRI和S"/1双酶切的目的片断在紫外光下条带非常弱，因此酶切需要用0.5)ig以上的质粒，同时观察结果时需要仔细分辨。电泳时间超过l小时，有利于区分重组质粒和非重组的载体大小。酶切电泳结果符合图1结果的，判为阳性，否则为阴性。2.3.3.测序鉴定一种简单而方便的鉴定方法就是通过序列测定进行鉴定，方法如下-.2.3.3.1细菌培养挑取单个重组克隆，接种到5ml含10(Hig/ml氨卞青霉素(Amp)的LB培养基中，37"C振荡培养过夜。2.3.3.2测序测定取0.5ml菌液无菌分装到1.5ml的Eppendorf管中，送交测序(上海生工)。2.3.3.3序列分析将测序结果与预期序列进行比对，序列测定结果与预期一致，表明筛选得到的基因工程菌为阳性克隆。3表达产物的分离纯化ii3.1菌液的制备将工程菌种划线接种于含氨节青霉素的SOB平板培养基，37°C过夜，选取光滑圆润的单个菌落，接种于4个含氨节青霉素的25毫升SOB液体培养基内，3(TC条件下在摇床摇动过夜，然后将其转移至4个含氨节青霉素的250亳升SOB液体培养基内，37"C条件下在摇床摇动2.5小时，然后将上述1升培养物接种于含氨节青霉素的9升SOB液体培养基内，在15升发酵罐中37'C培养至细菌进入平台期。3.2包涵体蛋白的提取,纯化和鉴定(1)将100ml诱导后的重组菌，分装于50ml的离心管中，4000rpm/min离心30min，弃掉上清。(2)每管加入细胞裂解液10ml，充分混勾后，将两管的菌液合并到一个100ml。的小烧杯中。加入0.1g/ml的溶菌酶20|il、O.lmmol/Lol/L的PMSF和5pl的Aprotinin(胰蛋白酶抑制剂)，室温置磁力搅拌器上搅拌30min。(3)将小烧杯放在冰水混合物中进行超声裂解，超声功率为200W,工作10s,间歇10s,共进行20个循环；如果菌液粘稠，那么继续超声几次，直到菌液变清亮为止。(4)将超声后的菌液分装于离心管中，4°C,8000rpm离心10min,保留上清和沉淀，取200nl的上清，加入50(il的蛋白上样缓冲液，即为超声裂解上清的样品。(5)用20ml冰冷的溶液2(洗涤液)将超声后的沉淀重悬，混勻，室温下缓慢摇动，作用10min后，4°C，8000rpm离心10min。共进行三次，最后一次洗涤离心后，倒掉上清，保留沉淀。(6)用20ml的溶液3(洗涤液)将沉淀重悬，混匀。进行与(5)相同的操作，沉淀即为SDS-PAGE提取的包涵体。(7)用20ml溶液4(包涵体溶解液)溶解沉淀，取200(11的溶解液，加入50pl的上样缓冲液，即为包涵体的样品。各取上述的菌液上清样品，超声波裂解的上清样品和包涵体样品各取IOjliI，用12。/。的SDS-PAGE电泳检测结果，电泳完成后，用考马斯亮兰染色液染色，脱色后，用凝胶成像系统拍照。结果如图14所示，表达产物大小与预期相一致。4重组菌裂解物(类囊素)对淋巴细胞的作用4.1实验方法4丄1淋巴细胞的制备无菌操作，分别取家兔、小鼠的脾脏，取SPF鸡的法氏囊，用平头镊子挤压出组织细胞并用PH7.2-7.6Hanks液稀释数倍，用200目铜网过滤上述脾细胞悬液，过滤液分成两份，其中一份用45倍体积的红细胞裂解液处理片刻，然后加入5倍体积无Ca++、Mg++Hanks液，混匀1,500r/min离心10min，吸弃上清，重复洗涤2次，台盼蓝拒染法计数，用10。/o小牛血清RPMI1640培养液(含双抗)调整细胞浓度分别为2xl(^细胞/mL和lxl(^细胞/mL，同上分装96孔细胞培养板。另一份用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，同上细胞记数并分装细胞培养板。向上述细胞培养板孔中加入10吗类囊素，每一浓度设三个复孔，并用三个不同个体进行重复实验，37。C或41°C，5。/。C02中培养64~66h。4丄23H-TdR掺入和刺激指数统计分析细胞培养终止前16小时，每孔加入0.5pCi3H-TdR。培养结東后，用多头细胞收集器将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，依次用PBS、5%三氯醋酸和无水乙醇洗涤细胞各三次。P-液闪仪测定每孔细胞的每分闪烁次数(cpm值)，并计算刺激指数(SI)。SI=(测定孔的cpm值一机器本底cpm值)/(阴性对照孔cpm值一机器本底cpm值)。由于三个不同个体进行的重复实验基本吻合，SI最终值选取三个不同个体中的一个个体的三次重复实验的SI平均值表示。4.2实验结果4.2.1对家兔脾细胞的刺激用MTT法测定类囊素对家兔脾细胞的免疫刺激活性，结果加类囊素的试验组显著高于不加类囊素的对照组(图2)。4.2.2对小鼠脾细胞的刺激用MTT法测定类囊素对昆明系小鼠脾细胞的免疫刺激活性，结果加类囊素的试验组显著高于不加类囊素的对照组(图3)。4.2.3对SPF鸡法氏囊的刺激活性用MTT法测定类囊素对SPF鸡法氏囊细胞的免疫刺激活性，结果加类囊素的试验组显著高于不加类囊素的对照组(图4)。5重组菌裂解物(类囊素)对疫苗的免疫增强作用一、材料1、1曰龄黄鸡350只2、海兰胚80枚，SPF鸡胚70胚、1日龄SPF鸡150只3、免疫增效剂—pET32a-sBursin—，为方便起见，将其命名为XIO。4、其它一次性耗材注射器、离心管、抗原、一次性血凝板。二、方法二1、ND(LaSota株)抗原的制备及EID50的测定。2、将免疫增效剂以生理盐水稀释成2ml，类囊素蛋白浓度约为500ug/ml，约1500羽份。将类囊素添加到ND活疫苗的稀释液中，或者将其添加到ND灭活疫苗的水相中，按照ND活疫苗和灭活疫苗的常规免疫方法进行点眼滴鼻或肌肉注射。3、分组情况3.1普通鸡分组情况(注每组免疫30只，其它疫苗不免疫)表l普通鸡的免疫组别免疫种类免疫天龄(天)免疫剂量(ml)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>1MPF鸡分组情况(每组"只)表2SPF鸡的免疫<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>各组于免疫后7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、56日分别釆血测H5、H9、ND的抗体效价。以后视情况每1530曰采血一次。三、结果及分析1、普通鸡结果表3普通鸡免疫结果.<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注活表示为活疫苗免疫，灭表示为灭活苗免疫，-表示未测。用SPSS软件进行分析结果(参见图59)表明(l)用ND活苗免疫与ND+X10活苗免疫组间抗体滴度无差异，与空白对照组有显著差异。(2)H5灭活苗与H5+X10灭活苗免疫组间抗体滴度有显著差异，H5+X10组显著高于H5灭活苗组。(3)H9灭活苗与H9+X10灭活苗免疫组间抗体滴度有显著差异，H9+X10组显著高于H9灭活苗组。(4)ND灭活苗与ND+X10灭活苗免疫组间抗体滴度有显著差异，ND+X10组显著高于ND灭活苗组。2、SPF鸡结果表4SPF鸡的免疫结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>空白(H5结果)0.671.170.671.00(H9结果)1.331.831.67U72(ND+X10灭)0.807.738.4710.133(ND灭)0.477.139.679.804(H5灭)1.737.339.3311.605(H5+X10灭)1.007.738.8711.406(H9+X10灭)1.937.008.8011.217(H9灭)2.077.3310.3611.938(ND+X10活)4.306.806.009(ND活)4.806.606.70用SPSS软件进行分析结果(参见图10~13)表明(1)用ND活苗免疫与ND+X10活苗免疫组间抗体滴度无差异，与空白对照组有显著差异。(2)H5灭活苗与H5+X10灭活苗免疫组间抗体滴度无差异。(3)H9灭活苗与H9+X10灭活苗免疫组间抗体滴度基本无差异，仅在免疫后21天时，H9灭活苗比H9+X10灭活苗高，差异显著。(4)ND灭活苗与ND+X10灭活苗免疫组间抗体滴度基本无差异，仅在免疫后21天时，ND灭活苗比ND+X10灭活苗高，差异显著。上述结果表明本发明类囊素具有显著的免疫增强作用。17序列表〈110〉广东大华农动物保健品有限公司<120>—种动物疫苗免疫增强剂及其生产方法<130〉<160〉1<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉81<212>醒〈213>人工序列<400〉1ggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaaggtcacaaaggtcac肌aggtcacaaaggtcac60aaaggtcacaeiaggtcacaaa8权利要求1.一种小分子肽，其为具有氨基酸序列COOH-Gly-His-Lys-NH2的单体或者多个该序列首尾相连的串联体。2、如权利要求1所述的小分子肽，其为9个COOH-Gly-His-Lys-NH2首尾相连的串联体。3、编码权利要求1或2所述小分子肽的基因。4、如权利要求3所述的基因，其具有序列表SEQIDNo.l所示的核苷酸序列。5、含有权利要求3或4所述基因的表达载体。6、如权利要求5所述的表达载体，其衍生于pET32a。7、含有权利要求5或6所述表达载体的宿主。8、大肠埃希氏菌(Esc/zen'c/w'acoli)BL21(pET-sBur)CGMCCNo.2188，其含有权利要求5所述的表达载体。9、一种制备权利要求l或2所述小分子肽的方法，其特征在于培养权利要求7所述的宿主，并诱导表达。10、含有权利要求1或2所述小分子肽的免疫增强剂。全文摘要本发明提供了一种免疫增强剂—类囊素，其是一种小分子肽，该小分子肽为具有氨基酸序列COOH-Gly-His-Lys-NH<sub>2</sub>的单体或者多个该序列首尾相连的串联体。本发明免疫增强剂对体外多种动物的淋巴细胞具有明显的刺激活性，对鸡新城疫(ND)疫苗、禽流感H5、禽流感H9疫苗具有明显的免疫增强活性。文档编号C12N15/11GK101255189SQ20081009042公开日2008年9月3日申请日期2008年4月7日优先权日2008年4月7日发明者丁家波申请人:广东大华农动物保健品有限公司