脂肪调节的制作方法

专利名称：脂肪调节的制作方法
技术领域：
本发明涉及脂肪的体内平衡和代谢，并涉及对体重的调节。
背景技术：
肥胖症，通常被定义为体重指数(BMI)等于或大于30 ，是一种 主要的健康问题，尤其是在工业化国家。估计目前肥胖症影响了2亿 5千万成年人，由于过重的青少15年成长为肥胖成人，数字预期还在 持续增长。如上所述，肥胖症与许多不利的健康影响有关，其中包括 糖尿病和心脏病的风险增加。腹部肥胖，是指多余的脂肪组织分布在 腹部区域，与糖尿病和心脏病(例如代谢综合征)的关系更为密切。 过量的脂肪与以下疾病的发病率升高有关心脏病发作、中风或其它 类型的心血管疾病；高血压、高胆固醇、糖尿病；癌症，包括绝经后 的乳腺癌和子宫内膜癌、结肠癌和肾癌；关节炎、胆道结石、睡眠性 呼吸暂停以及成人哮喘发作。所以此领域需要有能够有效调节脂肪代 谢和脂肪代谢过程的方减轻体重，并使相关疾病产生或发展的风险最 小。
鉴于与改变或受损的脂肪代谢和脂肪体内平衡有关的许多有害状 况，以及肥胖症和未调体重增加的发病率增加，需要有调节脂肪代谢 的方法。此领域还需要有通过调节脂肪的产生、利用和储存来调节体 重的方法。此外，此领域需要有治疗肥胖症的方法和化合物。发明概述
本发明涉及在受试者中调节脂肪代谢、实现脂肪体内平衡、调节 体重、减少脂肪储存和导致体重减轻的方法和化合物。还提供了用于 治疗或预防肥胖症，包括饮食导致的肥胖、与糖尿病有关的肥胖等， 的方法和化合物。
在各种实施方案中，所述受试者是细胞、组织或器官。在其它实 施方案中，所述受试者是动物，优选哺乳动物，更优选人。当受试者 是细胞时，本发明具体考虑该细胞可以是分离的细胞，原核或真核细 胞。当受试者是组织时，本发明具体考虑是内源性组织和体外组织， 如培养的组织。在优选的实施方案中，所述受试者是动物，具体是哺 乳动物类动物，包括大鼠、兔、牛、羊、猪、鼠、马和灵长类动物。 最优选实施方案中，所述受试者是人。
本发明提供调节受试者脂肪代谢的方法。
一方面，本发明方法包
括调节受试者的脂肪代谢，系通过稳定受试者的HIFcx从而调节其脂肪 代谢。在各个不同方面，HIFct是HIFlou HIF2a或HIF3a。在一优选 方面，稳定HIFa包括给予受试者有效量的能抑制HIF羟化酶活性的 化合物，从而稳定HIFa。
稳定HIFoc可用本领域技术人员已有和已知的方法来完成，可包 括采用与HIFa相互作用、结合或修饰HIFa的任何制剂或与HIFa相 互作用的因子，如以HIFa为底物的酶。在某些方面，本发明考虑提供 结构稳定的HIFa变体，如稳定的HIP突变蛋白等，或编码这种变体 的多核普酸。在其它方面，本发明考虑要稳定HIFa，包括给予能稳定
HIFa的任何制剂。该制剂可包括多核普酸多肽；抗体；其它蛋白质; 碳水化合物；脂肪；脂质；和有机及无机物质，如小分子等。在一优 选实施方案中，本发明考虑，例如通过给予受试者能稳定HIFa的任何 制剂来稳定该受试者的HIFa，其中所述的制剂是能稳定HIFa的化合 物，如小分子化合物。
本发明还涉及调节受试者脂肪代谢的方法，该方法通过给予受试 者有效量的本发明化合物来调节该受试者的脂肪代谢。在一优选方面， 本发明的化合物是能抑制HIF羟化酶活性的化合物。在最优选的方面，本发明的化合物是能抑制HIF脯氨酰羟化酶活性的化合物。在另一优 选方面，HIF羟化酶选自EGLN1 、 EGLN2禾B EGLN3 。
本发明还通过稳定受试者的HIFa，或给予受试者有效量的能调节 该受试者脂肪代谢过程的本发明化合物，提供调节受试者脂肪代谢过 程的方法。在各种实施方案25中，所述脂肪代谢过程选自脂肪摄入、 脂肪转运、脂肪储存、脂肪加工、脂肪利用和脂肪合成等。
在具体实施方案中，本发明的方法通过稳定受试者的HIFa，或通 过给予受试者有效量的能改变该受试者脂肪调节因子表达的化合物， 来改变该受试者脂肪调节因子表达。
在一实施方案中，本发明提供的方法，通过稳定受试者的HIFa， 或通过给予受试者有效量的能增加该受试者脂肪调节因子表达的化合 物，来增加该受试者脂肪调节因子表达。在其它实施方案中，所述脂 肪调节因子选自痩蛋白、载脂蛋白A-IV、胞质脂酰辅酶A硫酯酶-1 、 胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)-1 、肉碱乙酰基转移酶和PAI-1。 在一个特定的方面，所述脂肪调节因子表达的增加是持续升高的。
还考虑了改变脂肪形成因子的表达的方法。在一个实施方案中， 本发明包括增加受试者中DEC1/Stm13的表达的方法，所述方法包括 稳定受试者的HIFoc或给予所述受试者一种有效量的本发明的化合物， 从而增加受试者中DEC1/Stra13的表达。在另一个实施方案中，本发 明提供了降低受试者中过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-Y的表达 的方法，所述方法包括稳定受试者的HIFoc或给予所述受试者一种本 发明的化合物，从而降低受试者中即PPAR-Y的表达。
本发明提供了在受试者中实现脂肪体内平衡的方法。 一方面，本 发明的方法包括通过稳定受试者的HIFa在受试者中实现脂肪体内平 衡，从而在受试者中实现脂肪体内平衡。在另一方面，本发明的方法 包括通过给予所述受试者一种有效量的本发明的化合物在受试者中实 现脂肪体内平衡，从而在受试者中实现脂肪体内平衡。本发明提供了 调节受试者体重的方法。 一方面，本发明方法包括通过稳定受试者巧 的HIFa来调节受试者体重，从而调节受试者的体重。在另一方面，本 发明方法包括通过给予所述受试者一种有效量的本发明的化合物来调 节受试者体重，从而调节受试者的体重。本发明提供了减少受试者体脂肪的方法。 一方面，本发明方法包 括通过稳定受试者的HIF(X来减少受试者的体脂肪，从而减少受试者的 体脂肪。在另一方面，本发明方法包括通过给予所述受试者一种有效 量的本发明的化合物来减少受试者的体脂肪，从而减少受试者的体脂 肪。在各个不同方面，所述体脂肪是积累或积累的脂肪，所述减少是 储脂(即脂肪储存)减少。在其它方面，该方法被用于预防脂肪的积 累或积累，例如，防止储脂增加。再在其它方面，所述体脂肪是内脏 或腹部脂肪。
本发明提供了导致受试者体重减轻的方法。
一方面，本发明方法
包括通过稳定受25试者的HIFa使受试者体重减轻，从而导致体重减 轻。在另一方面，本发明方法包括通过给予所述受试者一种有效量的 本发明的化合物使受试者体重减轻，从而导致体重减轻。在一个优选 的方面，本发明的化合物是抑制HIF羟化酶活性的化合物。在一个实 施方案中，本发明提供了使受试者体重减轻而不伴随肌肉减少的方法。 在某些实施方案中，所述体重减轻是剂量依赖的。
本发明提供了在受试者中治疗或预防肥胖症的方法。 一方面，本 发明方法包括通过稳定受试者的HIFot来治疗或预防肥胖症，从而治 疗或预防肥胖症。在另一方面本发明方法包括通过给予所述受试者一 种有效量的本发明的化合物来治疗或预防肥胖症，从而治疗或预防肥 胖症。在某些方面，所述肥胖症是饮食导致的肥胖症。在其它方面， 所述肥胖症是与糖尿病相关的，例如由于肥胖而导致糖尿病的发病风 险增加，或是伴随该疾病或由于该疾病的发展而造成的肥胖症。
本发明提供了降低受试者的耗氧量的方法。 一方面，本发明方法 包括通过稳定受试者的HIFa来降低受试者的耗氧量，从而降低受试 者的耗氧量。在另一方面，本发明方法包括通过给予所述受试者一种 有效量的本发明的化合物来降低受试者的耗氧量，从而降低受试者的 耗氧量。在某些实施方案中，本发明的方法降低受试者的氧需求。在 各个其它方面，所述受试者是细胞、组织、器官、多器官系统或整个 生物体，包括动物，优选哺乳动物，最优选人类。此外，本发明的方 法例如可用于降低培养基中生长的细胞对氧气的需求或增加代谢效在一个实施方案中，本发明提供了在低氧条件下在受试者中产生 能量的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了使氧消耗发生代谢 变化，例如降低耗氧量的方法。特别考虑到获得和维持改变劳累程度 所需的使耗氧量最小化的方法。这些方法在提15高劳累程度中特别有
效，例如运动性追击(athleticpursuits)、强体力活动，比如在水下、 在高纬度下、在高胁迫条件下，例如战场条件等。
上述方法具体涉及本发明化合物的应用。在某些方面，本发明的 化合物选自化合物A 、B、C、D、E、F、G和H。 一方面， 所述化合物是2-酮戊二酸双加氧酶模拟物。再在另一方面，所述2-酮 戊二酸双加氧酶模拟物是被取代的杂环羧酰胺。本发明尤20其涉及某 些实施方案，其中，所述被取代的杂环羧酰胺选自喹啉、异喹啉、菲 咯啉、吡啶、嘧啶、卩-咔啉等。
在不同实施方案中，本发明提供了含有本发明化合物的制剂或药 物或药物组合物，提供了制造和使用此类制剂或药物或药物组合物的 方法。
在一个实施方案中，本发明包括在患有与脂肪体内平衡受损有关 的症状的受试者25中治疗或预防此类症状的方法，所述方法包括稳定 受试者的HIFot或包括给予所述受试者一种有效量的本发明的化合物， 从而治疗或预防受试者的此类症状。在不同实施方案中，所述与脂肪 体内平衡受损有关的症状是肥胖症，包括饮食导致的肥胖症；遗传导 致的肥胖症；与某些治疗性处理相联系而产生或发展的肥胖症，例如 胰岛素治疗等；高脂血症；低脂血症；胆固醇血症；或动脉粥样硬化。
在一个实施方案中，本发明包括在患有与脂肪代谢受损有关的症 状的受试者中治疗或预防此类症状的方法，所述方法包括稳定受试者 的HIF(x或包括给予所述受试者一种有效量的本发明的化合物，从而治 疗或预防受试者的此类症状。在不同实施方案中，所述与脂肪体内平 衡受损有关的症状是肥胖症，包括饮食导致的肥胖症遗传导致的肥 胖症；由于某些治疗性处理相联系而产生或发展的肥胖症，例如胰岛 素治疗等；高脂血症；低脂血症；胆固醇血症；或动脉粥样硬化等。
通过这里的描述，本发明的这些实施方案以及其它实施方案对于 那些精通此领域的技术人员而言是显见的。附图简述


图1中A、 B和C显示了用本发明的化合物处理后人类细胞培养 基中痩蛋白的水平。图中的细胞系是前脂肪细胞、脂肪细胞、人包皮 成纤维细胞(HFF)、人微血管内皮细胞(HMEC-1)、人脐静脉内皮 细胞(HUVEC)、人肝细胞癌细胞(Hep3B)、腺病毒-转化的胎肾上 皮细胞(293A)和宫颈上皮癌细胞(HeLa)。
图2显示用本发明的化合物治疗后，参与动物肝脏内脂肪代谢和 分布的蛋白质的编码基因的表达增加。A显示了各种脂肪代谢基因的 表达，其中包括载脂蛋白A-IV 、脂酰辅酶A硫酯酶、肉碱乙酰基转 移酶和胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP) -1 。 B显示了纤溶酶原激 活物抑制剂(PAI) -1基因的表达。
图3显示了参与对脂肪酸和甘油三酯的细胞应答的因子的编码基 因的表达的变化。A显示了用本发明的化合物治疗一段时间后 DEC1/Stra13的表达的变化。B显示，治疗后一些组织中DEC1/Stm13 的表达增加。C显示，用本发明的化合物治疗后过氧化物酶体增殖物 激活受体(PPAR)-y的表达降低。
图4显示了用不同剂量的本发明的化合物治疗后动物的体重和器 官重量的变化。A显示了用本发明的化合物治疗后动物体重增加的剂 量依赖性的延迟。B显示，动物体重减轻不是由于肌肉和/或生命器 官如心脏重量的损失。
图5显示了用本发明的化合物治疗的动物内脏脂肪剂量依赖性的 减少。
图6中A 、B和C分别显示了用本发明的化合物治疗后，由于饮 食导致肥胖的动物模型中体重增加和腹部脂肪垫重量的减少。
图7显示了用本发明的化合物治疗的糖尿病动物模型中血清甘油 三酯水平的降低。
图8中A和B分别显示了用本发明的化合物治疗的细胞中剂量依 赖性的HIF-la稳定。
图9中A和B显示了用本发明的化合物治疗的细胞中葡糖转运蛋 白-l(GluT-l)和醛縮酶的诱导。图10中A、 B和C显示，在用本发明的化合物治疗的动物中，分 别参与肾、肝和肺中葡萄糖调控的基因的表达增加。
图11显示了用化合物处理的宫颈腺癌(HeLa )和转化的胎肾 (293A )细胞中氧消耗的剂量反应。
发明详述
在描述本发明的组合物和方法之前，须理解本发明不限于所述的 具体方法学、程序、细胞系、试验和试剂，因为它们是可以改变的。 也应理解本文所用的术语目的是描述本发明的具体实施方案，不意味 着限制本发明的范围，本发明的范围由附属的权利要求书所限定。
必须指出，如本文和权利要求书中所用，单数形式的"一个"、"一 种"和"这个"包括复数参比物，除非文中另有说明。因此，如本文所述 和本领域技术人员所知，例如参比某"片段"包括多个这类片段；参比 某"化合物"指参比一个或多个化合物和其等价物。
除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属 领域任何普通技术人员所共同理解的相同含义。虽然类似于或等价于 本文所述的任何方法和材料可用于实施或测试本发明，但现在描述优 选的方法、装置和材料。本文所引用的所有出版物其内容纳入本文作 参考，目的是描述和公开这些出版物中报导的可能与本发明有关的方 法学、试剂和工具。本文中没有任何东西被认作允许本发明有权凭借 先20前发明发生于这种公开之前。
除非另有说明，实施本发明将采用本领域技术内的化学、生物化 学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的常规方法。 这些技术在文献中有全面解释。见例如Gennaro, A.R主编的(1990)"雷 明顿药物科学,，,(Remington's Pharmaceutical Sciences),第18版，Mack Publishing Co .; Hardman, J.G., Limbird, L.E禾口 Gilman, A.G.，编(2001) "治疗的药理学基础"(The Pharmacological Basis of Therapeutics),第10 版；McGraw-Hill Co; Colowick， S等编的"免疫学方法"(Methods In Enzymology), Academic Press, Inc.; Weir， D.M禾口 Blackwell, C.C编
(1986)"试验免疫学手册"(Handbook of Experimental Innnunology)，第 I-IV巻，Blackwell Scientific Publications; Maniatis， T等编(1989)"分子克隆试验手册，，(Molecular Cloning : A Laboratory Manual), 第二版式 I-III巻，Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M等编， (1998)"分子生物学技术试验室精读课程"(Molecular Biology Techniques : An Intensive Laboratory Course), Academic Press ; Newton ,C.R.，禾Q Graham, A.，编(1997)"PCR (生物技术系列导 论)"(PCR(Introduction to Biotechniquew Series))第二f波，Springer Verlag。 定义
术语"脂肪调节"或"脂肪代谢的调节"本文用于指细胞、组织、器官、 器官系统或整个生物体通过改变例如脂肪代谢特异性方面的增加或减 少，来实现和/或维持脂肪体内平衡的过程。脂肪代谢包括凭借脂肪， 如甘油三酯、脂肪酸、胆固醇、脂质和磷酸酯的合成、转运、摄入、 加工、利用或储存的过程。脂肪代谢和调节的具体方面包括能促进血 液中脂肪的转运和运动及细胞保留或分泌脂肪的脂蛋白或酶的表达； 参与脂肪利用和形成的酶，包括如乙酰转移酶、氧化酶、脂氧合酶等 脂降酶和脂肪生成酶的表达和/或活性的改变；和体内如在组织中或 组织周围、脂肪垫等；或体液，或培养基，包括例如间质(即细胞外) 和细胞内液、血液、尿液等中脂肪分布的改变。
术语"代谢性疾病"和"代谢性障碍"可互换使用，指与脂肪调节的改 变或恶化相关的任何疾病。这类疾病包括但不限于动脉粥样硬化、心 脏病和肥胖症。术语"肥胖症"指体邮旨肪过多。肥胖可通过该领域技 术人员接受和利用的任何方法测定。目前接受的肥胖测量方法是体重 指数(BMI)，为体重的公斤数与身高的公20尺数平方相比的测量值。 通常20岁以上成人的BMI在18.5-24.9之间认为正常；BMI在 25.0-29.9之间认为过重BMI等于或超过30.0认为是肥胖，BMI在 40或超过40认为是病态肥胖(见例如Gallagher等(2000 ) Aln J Clin Nurt72:694 — 701 )。这些BMI范围基于体重对疾病的危险性增加 的作用。与过重和肥胖有关的一些常见疾病包括心血管疾病、高血压、 骨关节炎、癌症和糖尿病。虽然BMI与体脂肪有关，但BMI 25与实 际的体脂肪之间的关系随年龄和性别而不同。例如具有相同BMI的女 性体脂肪百分率可能比男性更高。肥胖的另一种测量方法是体脂肪百分率.现有的各种间接测量体 脂肪的方法包括皮肽褶皱测定、水密度测定、生物电阻分析(BIA)、 双能量X-线吸光测定、全身钾测定和体内中子活化测定。水光密度测 定，或流体静力称量(HW)，通过测定受试者在水中和空气中重量之
间的差异来测定全身体积。类似地，空气置换体积描技术记图(AP)通
过测定将受试者放在一空气体积固定的室中时引起的室体积减少，来 测定全身体积。然后用经过验证的预测公式计算出全身密度和组成。
BIA以小电流通过二电极间引起的电压下降来估计电阻或电流阻抗。 机体水和电解质组成的一种指标一电阻的水平，然后用于从开发的回 归公式估计痩肉组织含量和机体的水体积。假设瘦肉组织的含水组分 时，可用其它的回归公式估计机体痩肉量和脂肪量。女性体脂的百分 率通常约17-27%，虽然高达31%认为也可接受。男性体脂百分率一 般应为0-20 % ,虽然高达25%认为也可接受。
术语"HIFoc"指缺氧可诱导因子蛋白的Q亚基。HIFoc可以是人或 其它哺乳动物蛋白质，或其片段，包括人HIF-la (Genbank登录号 Q16665) 、 HIF-2a(Genbank登录号AAB41495)和HIF-3a( Genbank登 录号AAD22668);小鼠HIF-1 a(Genbank登录号Q61221)、 HIF-2a(Genbank登录号BAA20130和AAB41496)和HIF-3a(Genbank 登录号AAC72734);大鼠HIF-la(Genbank登录号CAA70701)、 HIF-2a(Genbank登录号CAB96612)和HIF-3a(Genbank登录号 CAB96611);和牛HIF-la(Genbank登录号BAA78675) 。 HIFa也可以 是任何非哺乳动物蛋白质或其片段，包括非洲爪蟾的HIF-la(Genbank 登录号CAB96628)、黑腹果蝇HIF-la(Genbank登录号JC4851)和鸡 HIF-la(Genbank登录号NoBAA34234) 。 HIFa的基因序列也可用常 规克隆技术获得，例如用上述HIFa基因序列的全部或部分作为探针来 回收和测定其它物种中的HIFa基因序列。
HIFa的片段包含由人HIF-la的氨基酸401-603区域(Huang等， 同上)、氮基酸531-575区域(Jiang等，J Bio Chem . 272 : 19253-260, 1997)、氨基酸556-575区域20 (Tanlmoto等，同上)、氨基酸557-571 区域(Srinivas等，Biochem Biophys Res Commun . 260 : 557-561 , 1999)、氨基酸556-575区域(Ivan等，Science. 292 : 464-468,2001)。另外，HIFa片段包括含有至少一个LXXLAP基序的任何片段，如存 在于HIFa天然序列中的L397TLLAP禾n L559EMLAP 。此夕卜，HIFa的 片段包括保留了 HIFa的至少一种功能和结构特征的任何片段。例如， 用于实施例14筛选试验的HIF肽可包含DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQIDN0:1)。
术语"HIF羟化酶"指能羟化HIFa蛋白质，特别是HIFa亚基中的氨基 酸残基的任何酶。所述氨基酸残基优选脯氨酸和/或天冬酰胺残基。
术语"HIF天冬酰胺酰基羟化酶"指能羟化HIF蛋白中任何天冬酰 胺残基的任何酶。优选被HIF天冬酰胺酸基羟化酶经化的天冬酰胺残 基包括例如HIF-la的N,残基或其它HIFa同工型中的同源性天冬 酰胺残。HIF天冬酰胺酰基羟化酶包括抑制HIF因子(FIH)、负责调 节HIFa反式激活的HIF天冬酰胺酰基羟化酶(Genbank登录号
AAL27308; Mahon等，Gene Dev . 15:2675-2686, 2001; Lando等， Science 295:858 -861, 2002;和Lando等，Gene Dev 16:1446-1471, 2002。 也参见Elkins等，J Bio Chem. C200644200, 2002)。
术语"HIF脯氨酰羚化酶"和"HIFPH"指能经化HIF蛋白中脯氨酸 残基的任何酶。优选被HIFPH羟化的脯氨酸残基包括基序LXXLAP 内发现的脯氨酸，如存在于人HIF-la天然序列中L397TLLAP和 L559EMLAP的脯氨酸。HIFPH包括Taylor (Gene 275:125-132, 2001) 所述的和Amvind及Koonin (Genome Biol 2:RESEARCH0007， 2001)、 Epstein等(Cell. 107:43-54, 2001)禾。Bmick及McKnlght (Science 294:1337-1340,2001)所鉴定的Egl-9 (EGLN)基因家族成员。HIFPH 酶的例子包括人SM-20(EGLNl)(Genbank登录号AAG33965; Dupuy 等。Genomics 69:348-54, 2000) EGLN2同工型1 (Genbank登录号 CAC42510; Taylor,同上)，EGLN2同工型2 (Genbank登录号 NP—060025)和EGLN3 (Genbank登录号CAC42511; Taylor,同上)；小 鼠EGLN1 ( Genbank登录号CAC42515 ) 、 EGLN2 (Genbank登录号 CAC42511)和EGLN3 (SM-20)(Genbank登录号CAC42517)和大鼠 SM-20 (Genbank登录号AAA19321)。此外，HIFPH可包括秀丽隐 杆线虫(Caenorhabditis elegans) EGL-9 (Genbank，登录号AAD56365)和黑腹果蝇CG1U4基因产物(Genbank登录号AAF52050) 。 HIF PH
也包括上述全长蛋白质的任何活性片段。
本文所用的术语"样品"可指从受试者直接或间接获得的任何材 料。可获得或衍生的样品例如体液、分沁物、组织、细胞或培养的细 胞，包括但不限于唾液、血液、尿液、血清、血浆、玻璃体液、滑 膜液、脑脊液、羊水和器官组织(如活检组织)；从细胞分离的染色体、 细胞器或其它膜；基因组DNA 、 cDNA 、 RNA 、 mRNA等；和清 除的细胞或组织，或这类细胞或组织的印迹或印制品。样品可产生自 任何来源，如人受试者或非人哺乳动物受试者等。也考虑样品来自任 何患病动物模型。样品可以是液体或可以固定或结合于一基质。样品 可以指适合于测定与代谢调节相关的转录物或蛋白质存在，或测定脂 肪和葡萄糖水平的任何物质。获得这类样品的方法是该领域技术水平 之内。
术语"受试者"指分离的原核或真核细胞，或培养的组织，尤其优 选所述受试者指动物、特别是哺乳动物，包括大鼠、兔、牛、羊、猪、 马和灵长动物，特别是人。

发明内容
本发明提供了用于调节脂肪代谢和实现脂肪体内平衡，以及用于 治疗或预防与脂肪的体内平衡和代谢的改变或受损有关的症状的发展 的风险最小化的方法和化合物。此类症状包括但不限于肥胖症等。这 里还提供了用于调节储脂水平；用于维持或减轻体重；以及用于调节 脂肪的加工、摄入、转运、储存、合成、利用和分布的方法和化合物。 本发明特别提供了用于治疗或预防肥胖症的方法，例如，防止或减少 体重增加和/或导致脂肪减少的方法。 一方面，这是通过药理学方法 实现的，该药理学方法使代谢转向利用脂肪和/或脂肪酸作为细胞的 主要能源。
本发明涉及到以下发现，即稳定缺氧可诱导因子的(X亚基(HIF(X) 可导致降低脂肪积累，以及稳定HIF(x调节脂肪代谢。本发明还提供了
减少脂肪组织形成和脂肪积累并有效调节脂肪代谢过程，例如脂肪的 转运、摄入、加工、利用、储存等的方法和化合物。缺氧可诱导因子(HIF)参与细胞、组织和器官对氧减少，即缺氧
的反应。已知暴露在低氧条件下，例如在高纬度地区，会造成食欲减
退和体重减轻(例如参见Fushiki等(1992) Can J Physiol Pharmacol 70:1522-1524; Gunga等，(2003) Eur J Appl Physiol 88:497-505;以及 Tschop禾卩Morrison (2001)，〖氐氧/人基因至lj床边(Hypoxia:From genes to the bedside)(RC Roach等编),Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY.) 。 HIFa在含氧量正常，即正常氧条件下降解，在缺氧 或低氧条件下，HIFa稳定。稳定时，HIFa与HIF卩结合产生一些下游 作用。最近确定羟化HIFa亚基中的特定残基可使HIFa定向降解，从 而防止了在正常氧环境下形成稳定的HIF复合物，确定了这种羟化是 由于某些HIF羟化酶活化所致(见例如Ivan等，Science 292: 464-468, 2001; Jaakkola等，Science 292:468-472, 2001; Epstein等，Cell 107:43-54, 2001; Bruick和McKnightSciene 294:1337-1340, 2001)。这 些HIF羟化酶属于2-酮戊二酸双加氧酶家族。这些酶是氧依赖性的， 在低氧或缺氧条件下，HIFoc残基的羟化受到抑制。已描述了可治疗性 稳定HIFcx和通过抑制HIFa经化来稳定HIFa (见国际公开号WO 03/049686，其内容纳入本文作参考)。 方法
一方面，本发明提供了通过稳定受试者的HIFa来减少脂肪组织形 成和脂肪积累、动用脂肪储存、调节脂肪代谢和实现脂肪体内平衡的 方法。在另一个方面，所述方法包括通过在受试者中抑制HIFa的羟化 作用来减少脂肪组织形成和脂肪积累、动用脂肪储存、调节脂肪代谢 和实现脂肪体内平衡。在一个优选的方面，本发明的方法包括通过在 受试者中抑制至少一种HIF羟化酶的活性来减少脂肪组织形成和脂肪 积累、动用脂肪储存、调节脂肪代谢和实现脂肪体内平衡。在一个最 优选的方面，所述方法包括通过抑制HIF脯氨酰羟化酶的活性来减少 脂肪组织形成和脂肪积累、动用脂肪储存、调节脂肪代谢和实现脂肪 体内平衡。
稳定HIFa可用该领域技术人员己有的和知道的方法之一实施，可 能包括采用能5与HIFa相互反应或结合或修饰HIFa的任何制剂，或 能与HIFa相互反应的因子，包括例如，以HIFoc为底物的酶。在某些方面，本发明提供结构稳定的HIFa变体，如稳定的HIF突变蛋白等， 或编码这种变体的多核昔酸(见例如美国专利No . 6 ， 562 , 799和6 , 124,131和6,432,927)。在其它方面，本发明考虑稳定HIFa包括 给予能稳定HIFoi的制剂。该制剂可由多核昔酸组成，如反义序列(见 国际公开号W0 1003/0 45440);多肽；抗体；其它蛋白质；碳水化合 物；脂肪；脂质；和有机及无机物质，如小分子等。在一优选项实施 方案中，本发明通过给予受试者能稳定HIFa的制剂来稳定HIF(x，其 中所述制剂是一种化合物，例如能稳定HIFa的小分子化合物等。
在其它实施方案中，本发明的方法包括通过抑制至少一种选自2-酮戊二酸双加氧巧酶家族的酶活性来稳定HIFoi。在一优选项实施方案 中，所述酶是HIF羟化酶，如EGLN-1 、 EGLN-2 、 EGLN-3 (见 Taylor . Gene 275:125-132 , 2001; Epstein等，Cell 107:43-54 , 2001: Bmick和McKnightSciene 294:1337-1340, 2001; Mahon等，同上；以 及Lando等，同上。然而特别考虑所述酶选自2-酮戊二酸双加氧酶家 族的酶，包括例如原胶原赖氨酰羟化酶(LH)-l， -2和-3;原胶原脯 氨酰3-羟化酶、原胶原脯氨酰4-羟化酶a( I)和a(II)、胸腺嘧啶7-羟化 酶、天冬氨酰(天冬酰胺酰)卩-羟化酶、s-N-三甲基赖氨酸羟化酶和？ 丁酸甜菜碱羟化酶等。(见例如Majamaa等。Biochem J. 229:127-133, 1985 ; Myllyharju和Kivirikko . EMBO J. 16:1173-1180, 1997; Thornburg等，32:14023-14033,1993和Jia等，Proc Natl Acad Sci USA 91:7227-7231, 1994)。
在某些实施方案中，所述方法包括通过抑制HIFa的某些残基，如 脯氨酸残基、天冬酰胺残基等的经化来减少脂肪组织形成和脂肪积累、 动用脂肪储存、调节脂肪代谢并实现脂肪体内平衡。在一优选实施方 案中，所述残基是脯氨酸残基。在具体实施方案中，所述残基可以是 HIF-la中的氏。残基或其它HIFa同工型中的同源脯氨酸，或HIF-la 中的P4。2残基或其它HIFa同工型中的同源脯氨酸等。在其它实施方案 中，本发明方法可包括抑制HIFot的天冬酰胺残基，如HIF-la的N, 残基或其它HIFa同工型中的同源天冬酰胺残基的羟化。
化合物
16一方面，本发明提供了通过给予受试者本发明的化合物来减少脂 肪组织形成和脂肪积累、动用脂肪储存、调节脂肪代谢并实现脂肪体 内平衡的方法。本发明的化合物可以是能抑制或调节2-酮戊二酸双加 氧酶活性的任何化合物。2-酮戊二酸双加氧酶包括但不限于羟化酶。可 羟化靶底物残基的羟化酶包括例如脯氨酰、赖氨酸、天冬酰胺酰(天 冬酰胺、天冬氨酰)羟化酶等。羟化酶有时可通过靶底物来描述，如 HIF羟化酶、原胶原羟化酶等；和/或通过底物中的靶残基来描述，如 脯氨酰羟化酶、赖氨酰羟化酶等；或通过底物和残基来描述，如HIF脯 氨酰羟化酶、原胶原脯氨酰羟化酶等。代表性的2-酮戊二酸双加氧酶 包括但不限于HIF羟化酶，包括HIF脯氨酰羟化酶，如EGLN1 、EGLN2 禾口EGLN3、 HIF天冬酰胺酰羟化酶，如HIF抑制因子(FIH)等；原 胶原羟化酶如原胶原赖氨酰羟化酶、原胶原脯氨酰羟化酶如原胶原脯 氨酰3-羟化酶、原胶原脯氨酰4-羟化酶a (I)禾na(II)等；胸腺嘧啶7-羟化酶；天冬氨酰(天冬酰胺酰)卩-羟化酶；s-N-三甲基赖氨酸羟化酶 和Y-丁酸甜菜碱羟化酶等。虽然酶活性可包括与任何2-酮戊二酸双加 氧酶相关的活性，但特别考虑能羟化底物中的氨基酸残基。虽然特别 包括羟化底物中的脯氨酸和/或天冬酰胺残基，但也考虑经化其它氨 基酸。
在某些实施方案中，本发明的化合物是抑制羟化酶活性的化合物。 在优选实施方案中，本发明的化合物是抑制HIF羟化酶活性的化合物。 在不同实施方案中，所述活性是由于HIF脯氨酰羟化酶，例如EGLN1、 EGLN2或EGLN3等。在其它实施方案中，所述活性是由于HIF天冬 酰胺酰羟化酶，例如但限于FIH 。
一方面，显示对一种或多种2-酮戊二酸双加氧酶有抑制活性的本 发明化合物，也可能显示对一种或多种其它2-酮戊二酸双加氧酶有抑 制活性，如能抑制HIF羟化酶活性的化合物也可能抑制胶原脯氨酰羟 化酶；能抑制HIF脯氨酰羟化酶的化合物也可能抑制HIF天冬酰胺酰 羟化酶的活性。
一方面，本发明提供了通过给予受试者本发明的化合物来减少脂 肪组织形成和脂肪积累、动用脂肪储存、调节脂肪代谢并实现脂肪体 内平衡的方法。本发明的化合物是能抑制HIF羟化酶活性的小分子化合物。在优选实施方案中，本发明的化合物是抑制HIF脯氨酰羟化酶 活性的化合物。可直接或间接抑制，可以是竞争性或非竞争性抑制等。 特别提供本发明的示范性化合物和鉴定本发明其它化合物的方法。
一方面，本发明提供了通过给予受试者本发明的化合物来减少脂 肪组织形成和脂肪积累、动用脂肪储存、调节脂肪代谢并实现脂肪体 内平衡的方法。本发明的化合物可用于调节体重或促进体重减少，例 如在过重或肥胖受试者中。此外，所述化合物可用于治疗与脂肪代谢 有关的疾病或病症，其中包括但不限于动脉粥样硬化、肥胖症等。
一方面，本发明提供了使用本发明的化合物的预防或治疗疾病的 方法，所述方法包括给予有此需要的患者有效量的所述化合物或其药 学上可接受的盐或前药，可单独给予或与药学上可接受的赋形剂联用。 在一个实施方案中，可根据倾向性的情况，例如难以控制体重或肥胖 症，施用所述化合物。
所述化合物可与各种其它治疗方案联合施用。在一个实施方案中， 所述化合物与另一种治疗剂一起施用或代替这种治疗剂，所述治疗剂 有相同或不同的作用方式，例如糖皮质激素，外源胰岛素，如人重组 胰岛素，PPARy激动剂，如噻唑烷二酮类，或食欲抑制剂。
脂肪调节因子的表达
本发明方法提供了改变参与脂肪代谢(例如体脂肪的转运、摄入、 利用、合成、加工和储存)的调节因子的表达的方法。 一方面，该方 法可补偿调节这种过程的身体的天然机制的缺陷，例如由于改变了瘦 蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1 、胰岛素等生理因子的产生和 /或的应答。在另一方面，该方法可调节，例如提高或降低，调节因 子的水平和/或活性，例如与脂肪的转运、摄入和利用有关的转录调 节因子，如DEC1/Stra13 、过氧化物酶体增殖物相关受体(PPARs)等。
瘦蛋白是体重的关键调节物，对食物摄入和能量消耗产生影响。 尽管脂肪细胞是20产生瘦蛋白的主要来源，但包括胎盘、骨骼肌、胃 粘膜和乳房上皮在内的其它组织也产生瘦蛋白。(参见例如，Ahima和 Flier (2000) Ann. Rev Physiol. 62:413-437; Fantuzzi禾口 Faggioni (2000) J Leukocyte Biol 68:437-446。)由于长期摄入过量食物导致瘦蛋白缺陷 小鼠(ob/ob)极端超重，给予ob/ob小鼠外源瘦蛋白将显著减少食物摄入和体重减轻。(zhang等，(1994) Nature 372:425-431; Pelleymounter 等，(1995) Science 269:540-543; Halaas等，(1995) Science 269:543-546; andCampfield等，(1995) Science 269:546-549。)类似地，痩蛋白受体 缺陷小鼠(db/db)也是超重的。同时，上调PAI-1 ，具有抗肥胖效应的 主要应激诱导基因，将有益于与脂肪体内平衡有关的疾病，如肥胖症 和糖尿病。
由于本发明的方法和化合物可增加瘦蛋白的表达，故该方法和化 合物可用于调节脂肪代谢、能量利用和饱腹感。该方法尤其可用于防 止受试者的体重增加。此外，本发明的方法和化合物能增加纤溶酶原 激活物抑制剂(PAI)-1的表达。因此，该方法还可用于调节受试者的体 重，尤其是有益于与脂肪体内平衡有关的疾病，如肥胖症和糖尿病。
称为PPAR的配基激活转录因子的家族调节对脂肪酸和甘油三酯 的细胞应答。已知果蝇多毛/分裂转录阻遏物的增强子家族的成员 DEC1/Stra13可抑制例如PPAR-y2转录因子的表达，这种转录因子是 脂肪细胞分化必需的且与肥胖症和2型糖尿病有关。(参见例如，Yim
等，(2002) Dev Cell 2:331-341; Giusti等，(2003) Diabetes 52:1673-1676: 以及Muller等，(2003) Diabetes 52 : 1864 — 1871 。)因此，通过调
节脂肪形成因子，包括参与脂肪摄入和细胞加工的因子，来调节 DEC1/Stra13和/或PPARs ，例如PPAR-Y2，将提供其它好处。
由于本发明的方法和化合物调节包括DEC1/Stra13和过氧化物酶 体增殖物相关受体(PPAR)在内的参与对脂肪水平的细胞应答的因子 的水平，故该方法和化合物可用于调节参与对脂肪的细胞应答，尤其 是参与细胞摄入和处理脂肪酸和甘油三酯的基因的表达。
本发明提供了协同调节基因的方法，该基因的产物参与脂肪代谢。 这种基因包括巧但不限于，与膳食脂肪的摄入和转运、脂肪的重新合 成和转运以及脂肪加工(断裂)、利用等有关的基因，包括例如，甘 油3 —磷酸酰基转移酶(GPAT)、长链脂肪脂酰辅酶A合酶、肉碱 乙酰基转移酶等。治疗性上调脂肪代谢酶和产生饱腹感的因子将有效 减少脂肪储存、减轻体重，从而对患有肥胖症等代谢疾病的患者产生 有益效果。再在另一个实施方案中，本发明的方法提供了基因的协同调节，所述基因的产物参与脂20肪转运。这些基因包括但不限于载脂
蛋白(Apo)A-IV。
例如，辅酶A硫酯酶(CTE)和肉碱乙酰基转移酶(CAT)调节 细胞的脂酰辅酶A水平。(vanderLiej等，(2000) Mol Genet Metab 71:139-153; Huhtinen等，(2002) J Biol Chem 277:3424-3432)。长链月旨 酰辅酶A酯被用于甘油三酯的合成和(3-氧化。此外，长链脂酸辅酶A 酯可激活过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)-a的活性，从而影响基 因转录。ApoA-IV是乳糜微粒和高密度脂蛋白(HDL)颗粒的成分， 当过表达时促进胆固醇从载满胆固醇的细胞流出(Cohen等，(1997) J Clin Invest 99:1906-1916。 ) ApoA-IV的过表达也可防止动脉粥样硬化。 (Duverger等，(1996) Science 273:966-968。也可参见例如Ordovas等， (1989) J Biol Chem 264:16339-16342; Otha等，(1985) J Clin Invest 76:1252-1260;以及Verges (1995) Diabetes Metab 21:99-105。)因此， 增加参与脂肪调节的基因，例如CTE-1和ApoA-IV (目前已用本发 明的化合物和方法证实)的表达可直接或间接调节脂肪的代谢和转运。
因此，本发明的方法和化合物可调节参与脂肪代谢的因子的水平， 并可用于调节受试者的脂肪代谢。 一方面，本发明的方法调节参与甘 油三酯的产生和/或利用的蛋白质的表达。治疗性上调脂肪代谢酶将 有效减少脂肪储存、减轻体重，从而对患有肥胖症等代谢疾病的患者 产生有益效果。此外，本发明的方法和化合物可调节载脂蛋白等参与 脂肪转运的因子的水平。因此，本发明的方法可用于调节脂肪酸和甘 油三酯在细胞间，包括肌肉、肝脏、心脏和脂肪间的加工和转运。改 变转运过程还涉及脂肪的使用，有利于脂肪的利用超过储存。
本发明特别考虑了选择性设计前药化合物，以使它们被特定器官 摄取后被活化。例如，由于肝脏制造许多参与脂肪体内平衡的蛋白质， 本发明考虑在该方法中选择性地靶向肝脏。可利用在肝特异性酶的作 用下由无活性形式转变为活性形式的化合物在肝脏中选择性上调基 因，例如ApoA-IV。例如，可用相应的醇代替活性化合物上的羧酸。 肝脏中醇脱氢酶(ADH)的活性将这种化合物转变为活性形式。由于 其它器官缺乏ADH活性，化合物仅在肝脏中被选择性地活化。类似地，本发明所使用的化合物可以靶向到其它器官，例如脂肪组织、肾脏、 骨骼肌、心脏等。
能量产生中的代谢变化
身体从脂肪酸和碳水化合物的利用中获得能量。葡萄糖和脂肪酸 都可在摄入后立即被用作能量，但储存超过当前能量需求的消耗量存 以供以后使用。由于只有有限量的葡萄糖可作为糖元被储存，大多数 葡萄糖被转化成脂肪酸并储存在脂肪组织中。因此，月旨肪组织含有 生物体储存的主要能量。此外，脂肪组织不仅是作为能量储备的来源， 而且也提供多种内分泌和体温调节功能，并且参与葡萄糖代谢的调节。 如上所述，肝脏也参与脂肪和葡萄糖的代谢，在维持这些生命营养素 的适当水平中发挥决定性和重要的作用。尽管葡萄糖是神经元和红血 细胞的主要燃料，但其它大多数组织以脂肪酸作为其基本能量需求。 当正常的血糖水平降低时，肝脏分解糖元同时脂肪组织分解甘油三酯 以分别为血液提供葡萄糖和脂肪酸。胰岛素是这种代谢平衡的重要调 节物，它刺激脂肪和肌肉摄入葡萄糖、刺激糖元合成和脂肪生成。较 低的胰岛素水平将减少胰岛素敏感组织中摄入葡萄糖，促进肝脏内的 糖异生和糖元分解，减少糖元合成并促进储存的脂肪酸从脂肪中转移。
可以改变身体的能量产生以将需要脂肪的途径作为能量来源。在 低血糖水平或葡萄糖调节受损，如糖尿病的情况下，使用脂肪作为能 源可为大多数组织提供替代燃料，从而有效限制需要葡萄糖的器官可 以得到的葡萄糖的量。此外，提高脂肪作为能量被利用可减少储脂， 从而使体重减轻，例如在肥胖个体中，或防止和糖尿病等长至有关的 肥胖产生或发疹。本发明提供了通过调节脂肪代谢，例如通过增强脂 肪调节因子等的表达，来提高脂肪利用、减少脂肪储备以及防止多余
的脂肪积累的方法和化合物(参见例如下文的实施例3 、 5和6 )。 因此， 一方面，本发明方法和化合物提供了代谢变化以增强身体利用 脂肪作为能源，即使代谢朝向利用脂肪作为能源的方向变化，即从脂 肪产生能量。
出于上述原因，在协调葡萄糖转运、糖酵解和糖异生中出现调节 脂肪生成酶(参见例如实施例3)。例如，给以前禁食的动物提供高糖、 低脂饮食导致增加参与脂肪酸和甘油三酯生物合成以及糖酵解的酶，并增加由葡糖转运蛋白摄入的葡萄糖。(参见例如，Sul和Wang(1998) AnnuRevNutr 18:331-351。)因此，在特定的实施方案中，本发明的 方法提供了基因的协同调节，该基因的产物参与葡萄糖的摄入和利用 口这种基因包括但不限于包括磷酸果糖激酶、烯醇化酶、乳酸脱氢酶、 醛縮酶和己糖激酶在内的糖酵解酶以及葡糖转运蛋白(GluT)。糖 酵解增加导致葡萄糖的摄入和利用增加，这与血糖水平降低相关联。 由于本发明的方法可同时用于增强脂肪巧调节因子的表达和增加身体 利用脂肪作为能源的能力，因此，木发明提供了同时实现和/或保持 葡萄糖和脂肪的体内平衡的保护机制。因此，本发明的方法和化合物 特别适用于治疗和预防例如糖尿病等葡萄糖和脂肪调节被改变或受损 的症状，这一点可由升高的葡萄糖水平和肥胖或有肥胖趋势得到证明， 可有因果关系。
此外，转向糖酵解增加、无氧过程以及脂肪酸利用增加可有效减 少净氧气消耗。(参见例如实施例12。)能量利用的代谢变化和相伴 的体重减轻与高纬度下的低氧条件将导致体重减轻且尤其表现为体脂 减少的报道相一致。(参见例如，Fushiki等，同上；Gunga等，同上； 以及Tschop和Morrison,同上。)例如，该方法可用于保持或增强身 体产生能量的能力。在例如低氧条件下或在需要增强身体维持和/或 提高强体力活动等条件下需要这样。因此， 一方面，本发明提供了使 耗氧量发生代谢变化，即在未对细胞的生存力产生任何影响的情况下 使细胞的氧消耗发生剂量依赖性降低的方法和化合物。本发明考虑到， 转向厌氧能量产生，比需氧呼吸效率低的过程将增加身体转向脂肪作 为能源的需求，从而引起其它代谢转变，例如转变为以脂肪作为主要 能源。
在一个实施方案中，本发明考虑了使受试者的需氧代谢降低同时 增加厌氧代谢的方法，所述方法包括(a)改变糖酵解因子的表达；和 (b)以协同方式改变脂肪调节因子。在不同实施方案中，所述糖酵解因 子选自PFK-P 、 PFK-L 、烯醇化酶-1 、 GluT-l 、乳酸脱氢酶、醛縮 酶-1 、己糖激酶-1 、 IGFBPd禾BIGF ，且所述脂肪调节因子选自瘦蛋 白、载脂蛋白A-IV 、胞质脂酰辅酶A硫酯酶一l 、胰岛素样生长因
22子结合蛋白(IGFBP)-1 、肉碱乙酰基转移酶、PAI-1 、 DEC1/Stra13和 PPAR卞
本发明特别考虑了一种协同治疗方法，该方法施用了一种本发明 的化合物以同时5实现至少一种脂肪调节因子和至少一种葡萄糖调节 因子的协同上调。
尽管本发明决不限于下面描述的典型方法，但考虑了增加脂肪作 为能源的利用，这可由例如体脂减少(参见例如实施例5和6等)和 甘油三酯短期增加(参见例如实施例13)，有效降低净能量效率，使 受试者消耗更多的卡路里以产生能量，从而导致体重减轻得到证实。 甘油三酯水平的长期降低(参见例如实施例8)可支持该理论，证明本 发明方法调节脂肪代谢过程的最终作用是使身体实现并保持脂肪体内 平衡。因此， 一方面，本发明提供了降低受试者能量效率，从而导致 体重减轻的方法，该方法包括稳定受试者的HIFa。
治疗方法
技术领域：
本发明提供了用于治疗与脂肪的代谢和体内平衡有关的代谢障碍 的方法和化合物。此外，本发明提供了用这里所述的化合物治疗具有 高可能性产生代谢障碍的患者，例如有高动脉粥样硬化、糖尿病等高 危个体的方法。动脉粥样硬化和糖尿病的风险因子包括，例如高脂血 症和腹部肥胖症。
受试者的代谢状态受某些因子的生理控制，这些因子响应关键代 谢物的血浆水平并改变适当控制营养物利用和储存的全套基因的表 达。例如，脂肪组织的代谢体内平衡需要葡萄糖和甘油三酯的摄入和 储存以及脂肪酸释放之间的平衡。本发明提供了调节受试者代谢状态 的方法和化合物，其中，所述受试者可以是生长在培养基中的细胞或 动物细胞，优选所述动物是哺乳动物，更优选所述哺乳动物是人。
脂肪代谢改变或受损，或脂肪储备过量或不足，可导致脂肪储备 过量、肥胖(包括腹部肥胖)、使糖尿病加剧；在消耗或低脂肪储备， 免疫功能受损，以及其它代谢异常的情况下。
肥胖症，尤其是腹部肥胖或向心性肥胖，在2型糖尿病患者中非 常普遍。脂肪细胞是胰岛素的主要靶器官；脂肪细胞也分泌若干生物 产物，如瘦蛋白、肿瘤坏死因子一。和游离脂肪酸，它可调节胰岛素的分泌和作用。因此，脂肪组织过剩将导致胰岛素耐性。例如，编码
痩蛋白的基因中的功能突变与啮齿动物易患糖尿病有关。(Chen等， (1996) Cell 84:491-495。)
一些与脂肪调节有关的其它蛋白质似乎也提供糖尿病和血管疾病 中的好处。例如，ApoA-IV具有抗动脉粥样硬化特性较之野生型小 鼠，缺乏PAI-1的小鼠在高脂饮食下比较难以控制体重、使体重增长 过快。(参见例如，Cohen等，(1997) J Clin Invest 99:1906-1916: Verges (1995) Diabetes Metab 21:99-105; Ostos等，(2000) Atherosclerosis 153:209-217;以及Morange等，(2000) Arterioscler Thromb Vase Biol 20:1150-1154。)此夕卜，PAI隱l的表达受原恶病质(pro-cachectic )细 胞因子TNF-a和噬喹啉酮类型抗糖尿病化合物的增强。(Cigolini等， (1999) Atherosclerosis 143:51-90;以及Ihara等，(2001 ) FASEB J 15:1233-1235。)此外，胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)-1等蛋白 质的表达将增强胰岛素敏感性并导致体脂减少。
肥胖还与交感神经系统的活性增强、血管收縮药内皮縮血管肽-l 的血浆水平升高和胰岛素诱导的内皮依赖性血管舒张降低有关。此外， 脂肪细胞可分泌血管源性肽，如血管紧张肽原。2型糖尿病、内脏肥 胖、高动脉压和脂质紊乱ipid disorder)可属于一种由具有代偿性高胰 岛素血症的胰岛素敏感性降低引起的综合征，它们将15造成显著的冠 心病风险。(Muller-Wieland等，(1998) Basic Res Cardiol 93:131-134。)
因此，本发明的方法可用于药理学上稳定HIFa，从而抑制食欲并 随后导致与低氧环境刺激有关的体重减轻。本发明证实，这里描述的 方法导致体脂选择性减少，这种减少是肉眼可见的，其表现有动物模 型中腹部脂肪垫的消失和器官相对重量的增加。这些效果可在遗传正 常的动物上观察到，这说明该方法能够适当地上调所有必需有效减少 体脂肪量的因子。
由于本发明的方法可有效调整脂肪调节的各个方面，包括脂肪的 转运、摄入、加工、利用和储存，这些方法可用于治疗或预防与脂肪 调节有关的疾病。所述疾病包括但不限于肥胖症、动脉粥样硬化等。 已知过量的脂肪和脂质产生与糖尿病发展有关的风险，用该方法进行 治疗可有效降低糖尿病的可能性、频率或严重性。此外，已知游离脂
24肪酸或脂质水平的高血清水平增加胰岛素耐性，进一步恶化糖尿病的 病理生理学。
本发明的化合物和方法可用于调节体重、导致体重减轻或减少， 但不会同时使肌肉流失。特别地，本发明的方法可用于减少内脏脂肪 水平和积累。而且，本发明的方法可能减少脂肪形成并调节脂肪储存， 从而有效控制体重增加。该方法可用于治疗脂肪代谢紊乱或有助于维 持正常体重。此外，即便在摄入过量卡路里的情况下本发明的方法和
化合物也可有效减轻体重。因此，药理调节HIF的稳定性提供了一种
新的治疗方法，该方法可治疗或预防与脂肪调节有关的并发症、疾病
和病理，例如肥胖。通过增加抗脂肪生成因子，例如瘦蛋白、PAI-1 、 ApoA-IV和IGFBP,HIF的稳定有利于治疗糖尿病和有关并发症。 药物制剂和给药途径
如该领域所熟知，本发明的组合物可直接传递或从含赋形剂的药 物组合物形成传递。本发明的治疗方法可包括给予患有代谢性疾病， 具体是与脂肪调节相关的疾病(如动脉粥样硬化、肥胖、糖尿病等， 或有患这类疾病危险的受试者)治疗有效量的本发明化合物。在一优 选实施方案中，所述受试者是哺乳动物，在最优选的实施方案中，所 述受试者是人。
化合物或药物的有效量，如剂量，不难用常规试验确定，可作为 有效和方便的给药途径和适当的制剂。该领域已有各种制剂和药物输 递系统(见Gennaro主编，(2000)雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences )，同上；禾口 Hardman , Limbird以及Gilman编 的治疗的药理学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics, 2001 ， 同上)。
合适的给药途径可包括，例如，口服、直肠、局部、鼻内、肺内、 眼内、肠道内和肠胃道外给药。主要的肠胃道外给药途径包括静脉内、 肌肉内和皮下给药。第二种给药途径包括腹膜内、动脉内、关节内、 心内、脑池内、皮内、病灶内、眼内、胸膜内、鞘内、子宫内和心室 内给药。应优选要治疗的指征与药物的物理、化学和生物学性能一起， 规定制剂类型和所用的给药途径，以及是否局部或全身输递。本发明化合物的药物剂型可以即释、控释、缓释或靶向药物输递 系统提供。常用的剂型包括例如，溶液、悬浮液、(小)乳液、软膏、 凝胶和贴片、脂质体、片剂、糖衣丸、软或硬胶囊、栓剂、卵状小体、 植入物、无定形或结晶形粉末、气溶胶和冻干制剂。取决于使用的给 药途径，可能需要特殊装置来施加或给予药物，例如，注射器和针头、 吸入器、泵、注射笔、涂药器或专用瓶。药物剂型常包含药物、赋形 剂和容器/密封系统。可在本发明的化合物中加入一种或多种称为无 活性成分的赋形剂，以改善或有利于制造、稳定性、药物的给药和安 全性，可提供一种实现药物所需释放方式的工具。因此，加入该药物 中的赋形剂的类型取决于多种因素，例如药物的理化性能、给药途径 和制造方法。药学上可接受的赋形剂该领域己具有，包括各种药典中
所列出的那些(见美国药典(USP)、日本药典(JP)、欧洲药典(EP) 和英国药典(BP);美国食品药品管理局(www.fda.gov)的药物评价 和研究中心(CEDR)的出版物，例如，惰性成分指南(Inactive Ingredient Guide )1996，和药物添加剂手册(Handbook of Pharmaceutical Additives ): Ash禾卩Ash编；2002, Synapse Information Resources Inc., Endicott NY;
可用该领域熟知的任何方法制备本发明化合物的药物剂型，如常 规的混合法、过筛、溶解、融化、制粒、糖衣丸制备、制片、悬浮、 挤压、喷雾干燥、研磨、乳化、(纳米/微米)包裹、陷夹或冻干加 工。如上所述本发明的组合物可包含一种或多种生理上可接受的无活 性成分，以有利于将活性分子加工成制剂用于药物用途。
适当的制剂取决于所需的给药途径。对于静脉注射，例如，该组 合物可配制成水溶液，如果需要，可采用生理相容性缓冲剂，包括例 如，磷酸、组氨酸或柠檬酸来调节制剂的pH ，和采用张力调节剂如 氯化钠或葡萄糖。对于经粘膜或鼻内给药，优选半固体、液体制剂或 贴片，可含渗透增强剂，这类渗透增强剂是该领域通常知道的。对于 口服给药，可将该化合物配制成液体或固体剂型，和即释或控释/缓 释制剂。适合受试者口服的剂型包括片剂、丸药、糖丸、硬和软壳胶 囊、液体、凝胶、糖浆、巧糖浆、悬浮液和乳液。该化合物也可配制在直肠组合物中，如栓剂或保留灌肠剂中，如含有常规栓剂基质如可 可脂或其它甘油。
可采用赋形剂，包括填充剂、崩解剂、粘合剂(干或湿的)、溶 解阻滞剂、润滑剂、助流剂、防粘剂、阳离子交换树脂、润湿剂、抗 氧化剂、防腐剂、着色剂和芳香剂。这些赋形剂可以是合成或天然来 源的。这类赋形剂的例子包括纤维素衍生物、柠檬加酸、磷酸二钙、 明胶、碳酸镁、月桂酸硫酸镁/钠、甘露醇、聚乙二醇、聚乙烯毗咯 烷酮、硅酸盐、二氧化硅、苯甲酸钠、山梨醇、淀粉、硬脂酸及其盐、 糖(即葡萄糖、蔗糖、乳糖等)、滑石粉、西黄著胶浆、植物油(氢 化的)和蜡。乙醇和水可作为制粒助剂。在某些情况下，需要用例如 掩蔽气味的膜、抗胃酸膜、或释放延缓膜来包裹片剂。常常联用天然 和合成的聚合物与着色剂、糖、有机溶剂和水来包裹片剂，产生糖丸。 当胶囊优选与片剂时，药粉、悬浮液或溶液可以相容的硬或软壳胶囊 来输递。
在一实施方案中，可局部，例如通过皮肽贴片、半固体或液体制 剂，如凝胶、(微)乳剂、软膏、溶液、(纳米/微米)悬浮液、或 泡沫给予本发明的化合物。可采用例如，渗透促进剂适当选择和组 合亲脂性、亲水性和两性赋形剂，包括水、有机溶剂、蜡、油、合成 和天然的聚合物、表面活性剂、乳化剂，通过调节pH 、采用络合剂， 来调节药物对皮肽和其下组织的渗透。可采用其它技术，如离子电渗 疗法，来调节本发明化合物对皮肽的渗透。优选经皮或局部给药，例 如在需要最低限度全身接触的情况下局部输递药物。
对于吸入给药或鼻内给药，本发明的化合物可以溶液、悬液、乳 液或加压包装的半固体气溶胶形式或通常采用推进剂的喷雾器，如甲 垸和乙烷、二氧化碳或任何其5它合适的气体产生的卤化碳方便地传 送。对于局部气溶胶，可采用丁烷、异丁垸和戊烷类碳氢化合物。就 加压气溶胶而言，可通过提供一输递确定量气溶胶的阀门来确定适当 的剂量单位。可配制用于吸入器或吹入器中的胶囊和例如明胶盒。这 些胶囊或盒通常含有化合物的混合粉末和适合的粉末基质，如乳糖和 淀粉。通常以单位剂型，如在安瓶、注射器、注射笔或多剂量容器(常 含有防腐剂)中，提供配制的用于胃肠道外注射的除菌组合物。此组 合物可采取悬液、溶液或油性乳液或水性载体形式，可含有配制试齐IJ， 如缓冲剂、渗透剂、粘性增强剂、表面活性剂、悬浮和分散剂、抗氧 化剂、生物相容性聚合物、鳌合剂和防腐剂。取决于注射部位，载体 可含水、合成的油或植物油、和/或有机共溶剂。某些情况下，如冻 干产品或浓縮产品时，可在给药之前重建或稀释胃肠道外给药制剂。 可提供本发明化合物控释或缓释的长效制剂，可包含纳米/微米粒或 纳米/微米级或非微化晶体的可注射悬浮液。聚合物，除该领域熟知 的那些外，如聚(乳酸)聚(羟乙酸)，或其共聚物或用作控释/缓 释基质。可以植入物和需要切割的泵形式提供其它长效输递系统。
本领域熟知适合静脉注射本发明分子的载体，包括能形成离子化 化合物的含碱如氢氧化钠的、作为渗透剂的蔗糖或氯化钠的水基溶液， 例如，含磷酸或组氨酸的缓20冲液。可加入共溶剂，如聚乙二醇。这 些水基系统能有效溶解本发明的化合物，在全身给药时产生低毒性。 溶液系统的组分比例可相当不同而不破坏溶解性和毒性特征。另外， 组分的同一性可以改变。例如，可采用低毒的表面活性剂，如聚山梨 酯或波洛沙姆，可加入聚乙二醇或其它共溶剂、生物相容性聚合物如 聚乙烯毗咯垸酮，其它糖和多元醇来代替葡萄糖。
对于目前治疗方法所用的组合物，起初可用本领域熟知的各种技 术估计治疗有效剂量。动物研究所用的最初剂量可根据细胞培养试验 确定的有效浓度而定。适合人用的剂量范围可用动物研究和细胞培养 所获得的数据确定。
本发明的化合物或药物的有效率或治疗有效量或剂量，指该化合 物或药物可导致受试者的症状缓解或生存延长的量或剂量。这类分子 的毒性和治疗效果可通过在细胞培养或试验动物中进行标准的药学程
序来确定，例如，通过测定LD50 (导致50。％群体死亡的剂量)和ED50 (50%群体治疗有效的剂量)来确定。毒性和疗效的剂量比值是治疗指 数，可用LD50/ED50比值表示。优选显示高治疗指数的制剂。
有效量或治疗有效量是研究者、兽医、医生或其它临床人员所寻 找的组织、系统、动物或人诱发生物学或医学反应的所述化合物或药物组合物的量，例如能调节脂肪代谢、减少体脂、调节体重、治疗或 预防糖尿病等疾病。
优选的剂量应在包括ED50并有小或没有毒性的循环浓度范围 内。剂量可在此范围内根据所用的剂型和/或给药途径而变化。应按 照本领域已知方法根据受试者状况的特征选择精确的制剂、给药途径、 剂量和剂量间隔。
可个别调整剂量和间隔以提供能充分获得所需效果，如调节脂肪 代谢、减轻体重、减少脂肪储备等的血浆水平的活性部分，即最低有
效浓度(MEC)。各化合物的MEC不同但可从例如体外数据和动物试 验估计。需要获得MEC的剂量取决于个体的特征和给药途径。就局部 给药或选择性摄入而言，药物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。
可根据多种因素，包括待治疗受试者的性别、年龄和体重、疾病 的严重程度、给药方式和医生的判断确定给予的制剂或组合物的量。
如果需要，木发明的组合物可以装在含一个或多个单位剂型(含 有活性成分)的填装或分散装置中。例如，这种填装或装置可包括金 属或塑料箔，如起泡填装物或玻璃和橡皮塞如小瓶中。该填装或分散 装置可装有给药说明书。也可制备用相容性药学载体配制的含本发明 化合物的组合物，置于适当的容器中，贴上治疗某种标明疾病的标签。
化合物及其筛选方法
技术领域：
本发明的化合物是能抑制羟化酶活性的化合物，具体说，其中的 羟化酶活性是2 -酮戊二酸双加氧酶的活性。更优选羟化酶活性是HIF 羟化酶的活性。最优选羟化酶活性是HIF脯氨酰羟化酶的活性。
本发明的方法是依靠稳定HIFa以实现受试者的特殊效果的方法。 优选通过给予受试者能稳定HIFa以实现受试者的特殊效果的化合物 来完成本发明的方法。最优选通过给予本发明的化合物来完成该方法。
本发明的化合物示范性用于本发明与稳定HIFa有关的方法中。尤 其是本发明提供能抑制羟化酶活性和/或HIFa羟化、稳定HIFct等的 化合物，和筛选及鉴定其它30化合物的方法。本发明的化合物包括能 抑制羟化酶活性的化合物，其中优选的经化活性是2-酮戊二酸双加氧 酶的活性。更优选羟化酶活性是HIF羟化酶的活性。HIF羟化酶可经 化HIF蛋白，优选HIF(x亚基中的任何氨基酸，包括例如，脯氨酸或天冬酰胺残基等。在一特别优选的实施方案中，所述羟化酶活性是HIF 脯氨酰羟化酶和/或HIF天冬酰胺酰羟化酶的活性。
本领域知道2-酮戊二酸双加氧酶的抑制剂。例如，己鉴定到前胶 原肺氨酰4-羟化酶的儿种小分子抑制剂(见例如Majamaa等，Eur J Biochem 138:239-245， 1984;Majamaa等，Biochem J 229:127-133,〗985; Kivirikko和Myllyharju, Matrix Biol 16:357-368, 1998; Bickel等， Hepatology 28:404-411， 1998; Friedman等，Proc Natl Acad Sci USA 97:4736-4741， 2000; Franklin等，Biochem J 353:333-338， 2001;所有文 献的内容都纳入本文作参考)。也已鉴定到HIF羟化酶的小分子抑制 剂(见国际公开号WO 02/074981, WO 03/049686和WO 03/080566， 所有文献的内容纳入本文作参考)。本发明特别考虑采用能用本领域 己知方法鉴定的这些和其它的化合物。
2-酮戊二酸双加氧酶家族中的所有酶对于它们的羟化酶活性都需 要氧、Fe2+、 2-酮戊二酸和抗坏血酸(见例如Majamaa等，Biochem J 229:127-133, 1985; Myllyharju和Kivirikko EMBO J 16:1173-1180， 1997; Thomburg等，32:14023-14033, 1993;和Jia等，Proc Natl Acad Sci USA 91:7227-7231,1994)。因此，本发明的化合物包括但不限于铁鳌合 剂、2-酮戊二酸模拟物和修饰的氨基酸如脯氨酸或天冬酰胺同类物。
在具体的实施方案中，本发明提供使用2-酮戊二酸的结构模拟物。 这种化合物可竞争性抑制耙2-酮戊二酸双加氧酶与2-酮戊二酸的反 应，并非竞争性地与铁的反应(Majamaa等1984，同上；Majamaa等， 1985，同上)。特别考虑采用例如Majamaa等，同上；Kivirikko禾口 Myllyharju, Matrix Biol 16:357-368, 1998; Bickel等，Hepatology 28:404-411, 1998; Friedman等，Proc Natl Acad Sci USA 97:4736-4741, 2000; Fra週n， Biochem Soc Trans 19:812-815, 1991; Franklin等， Biochem J 353:333-338, 2001和国际公开号WO 03/049686中所述的化 合物，以上所有文献的内容纳入本文作参考。
示范性的化合物包括菲咯啉，其包括但不限于美国专利5,916,898 和6,200,974;国际公开号WO 99/21860中所述的那些；杂环羰基甘氨 酸，包括但不限于美国专利5,719,164和5,726,305中所述取代的喹啉 -2-羧酰胺及其酯；美国专利6,093,730中所述取代的异喹啉-3-羧酰胺及其酯；欧洲专利EP0650961和美国专利5,658,933中所述的3-甲氧 基吡啶羰基甘氨酸及其酯；美国专利5,620,995和6，020，350屮所述的 3-轻基吡啶羰基甘氨酸及其酯;美国专利5,607,954、 5,610,172和 5,620,996中所述的5-磺胺羰基吡啶羧酸盐及其酯。这些专利中列出的 所有化合物，特别是权利要求化合物中列出的那些化合物和工作实施 例的最终产物都纳入本申请书中作参考。
因此，本发明的优选化合物包括，例如杂环酰胺。特别优选的杂 环酰胺包括，例如异喹啉、喹啉、吡啶、噌啉、咔啉等。优选化合物 的其它结构类型包括葱醌、氮杂芴、氮杂菲咯啉、苯并咪唑、苯并 呋喃、苯并吡喃、苯并噻吩、儿茶酚、苯并二氢毗喃-4-酮、(x-二酮、 呋喃、N-羟基酰胺、N-羟基脲、咪唑、吲唑、吲哚、异噻二唑、异噻 唑、异恶二唑、异恶唑、(x-酮酸、a-酮酰胺、a-酮酯、a-酮亚胺、恶二 唑、草酰酰胺、恶唑、恶唑啉、嘌呤、吡喃、吡嗪、吡唑、吡唑啉、 哒嗪、吡啶、喹唑啉、菲咯啉、四唑、噻二唑、噻唑、噻唑畔木、噻吩 和三唑。
以下用于本发明实施例中的示范性化合物表明了本文所述本发明 的方法[(7-氯-3-羟基-喹啉-2-羰基)-氨基]-乙酸(化合物A)， [(1-氯-4-羟基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸(化合物B)， [(4-羟基-7-苯氧基-异喹 啉-3-羰基)-氨基-乙酸(化合物C),4-氧-l,4-二氢-[1,10]菲咯啉-3-羧酸 (化合物D), [(1-氯-4-羟基-7-甲氧基-异喹啉-3-羰基)-氨基]-乙酸(化合 物E)， [(3-羟基-6-异丙氧基-喹啉-2-羰基)-氨基]-乙酸(化合物F)， [(3-羟基-吡啶-2-羰基)-氨基]-乙酸(化合物G)，禾呕7-苄氧基-1-氯-4-羟基-异喳啉-3-羰基)-氨萄-乙酸甲酯(化合物H)。
可采用各种测定和筛选技术，包括下述的那些，来鉴定本发明的 化合物，即能制羟化酶活性的化合物。这些化合物适合用于本发明方 法中。适合用于本发明方法中的其它化合物，即能稳定HIFa的化合物 可由该领域技术人员用已有的试验和筛选方法作鉴定。
测定通常可提供与反应底物的消耗，或与反应产物的产生有关的 可检测信号。检测例如可包括荧光团、放射性同位素、酶偶联物和 本领域熟知的其它可检测标记。结果可以是定量或定性的。标记物可有利于反应产物的分离，如生物素或组氨酸标记可通过沉淀或亲和层 析从其它反应成分中纯化。
本领域中羟化酶活性的测定法是标准的。这类测定能直接或间接 测定羟化酶活性。例如， 一种测定能测定酶底物，如耙蛋白、合成肽 模拟物、或其片段中存在的经化残基，如脯氨酸、天冬酰胺等(见
Palmerini等，J Chromatogr 339:255-292, 1985)。还原一种化合物中存 在的羟化残基如脯氨酸或天冬酰胺表明一种化合物能抑制羟化酶活 性。或者所述测定法能测定羟化反应的其它产物，如2-酮戊二酸形成 的琥珀酸(见Cunliffe等，BiochemJ 240:617-619) 。 Kaule和G丽ler (AnalBiochem 184:291-297, 1990)描述了一种测定2-酮戊二酸产生琥 珀酸的示范性方法。
上述这些方法可用于鉴定能调节HIF羟化酶活性的化合物。实施 例8中描述了示范性方法(见上)。靶蛋白可包括HIF(x或其片段， 如H1P( 556-575 );例如实施例9，中所述测定用的典型底物为 DLDLEMLAPYIPMDDDFQL(SEQIDNO: 1)。所述酶包括，例如获 自任何来源的HIF脯氨酰羟化酶(见GenBank，登录号AAG33965 等)、HIF天冬氨酰羟化酶(见GenBank，登录号AAL27308等)。 所述酶可存在于细胞粗制裂解液中，或是部分纯化形式。例如，在Ivan 等，(Science 292:464-465， 2001和Proc Natl Acad Sci USA 99:13459-13464,2002)和Hirsila等(J Bio Chem 278:30772-30780， 2003)中描述了测定HIF羟化酶活性的方法；国际公开号WO03/049686 中描述了其它方法。测定和比较缺少和存在所述化合物的情况下的酶 活性将鉴定能抑制HIFa羟化的化合物。
HIFa稳定性和/或HIF激活的测定可包括直接测定样品中的 HIFa (见实施例8，同上)、通过测定与vonHippelLindau蛋白质相 关的HIFa减少(见国际公开号W0 15 00/69908 )、或HIF应答性耙 基因或报导构建物的活化(见美国专利5,942,434)来间接测定HIFa。 测定和比较缺少和存在所述化合物的情况下HIF和/或HIF —应答 性靶蛋白质的水平将鉴定能稳定HIFa和/或活化HIFa的化合物。
通过阅读本文内容本领域普通技术人员不难实施本发明的这些和 其它实施方案。
32实施例
明。提供这些:施例只是为了说明:发明2权利要求。本发明不限于 目的是说明本发明一个方面的示范性实施例所述的范围。功能上相等 的任何方法都在本发明的范围内。本领域技术人员懂得按照以上描述 和附图可对本发明作出本文所述以外的各种修改。这类修改是在附加 的权利要求书的范围内。 实施例1 :试验材料
通常采用本领域技术人员已知的标准化学方法合成本发明的化合 物。用高效液相色谱分析化合物的纯度，室温避光保存。在制备不同
用途的制剂时，采用PULVERISETTE 7行星式微磨机(Fritsh GMBH , Germany)以750rpm使化合物微粉化悬浮20分钟便于形成均匀粒径。 制备立即使用的微粉化合物C的悬浮液或口服管饲法。给药期间 将化合物悬浮在含0.5 %羧甲基纤维素(CMC; Spectrum Chemical Gardena CA ), 0.1 %聚山梨酯80 (Mallinckrodt Baker, Inc. , Phillipsburg NJ)的水溶液中，用磁搅拌器或旋转振荡器持续搅拌。计算悬液的浓 度达到给定体积中的剂量水平。在可供选择的方法中，秤重化合物并 置于适当大小的明胶胶囊中用于口服，对照动物接受同样大小的空胶 囊；或将化合物随意溶于代替水的100mM组氨酸(Mallinckrodt Baker) 溶液中。
对于注射给药，先将化合物与等摩尔量的氢氧化钠混合于10%葡 萄糖(Spectrum)或25mM组氨酸混合等渗氯化钠(Mallinckrodt Baker)的水溶液中。
实施例2 :增加所选细胞类型中瘦蛋白的体外表达 用以下方法检测了本发明的方法和化合物对脂肪调节的作用，尤 其是对脂肪代谢和饱腹感相关因子的表达的作用。将人HeLa (宫颈上 皮癌)、293A (腺病毒-转化的胎肾上皮;Qbiogene, Carlsbad CA)、 Hep3B (肝细胞癌)、HFF (包皮成纤维细胞)、HMEC-1 (微血管 内皮)、HUVEC (脐静脉内皮)和脂肪细胞分别接种到24孔培养平 皿，每孔100, 000个细胞，并在37。C、 20% 02、 5%(302中培养1 天，培养基如下HeLa 、 293A和Hep3B在含有1% FBS禾口10/^青霉素-链霉素的DMEM中培养；HMEC-1禾n HUVEC在内皮生长培养基 (EGM-2; Cambrex， Walkersville MD)中培养，HFF在含有10% FBS 和1X青霉素-链霉素的DMEM中培养，脂肪细胞在脂肪细胞培养基 (Zen-Bio， Research Triangle Park NC)中培养。用上述新鲜的培养基 替换培养基，出了将HeLa 、 293A 、 Hep3B和HFF培养基中的血清 水平降至0.5% FBS。加入载体对照(0.5 % DMSO)或化合物B并再 将细胞培养3天。然后收获无细胞上清并采用QUANTIKINE免疫测定 (R&D Systems, Inc., Minneapolis MN)根据制造商的说明书定量瘦蛋 白的水平。
如图1A所示，用本发明的化合物处理后，在脂肪细胞中观察到痩 蛋白的表达增加，但未在其它细胞类型中观察到。
在另一个试验中，将前脂肪细胞置于24孔平板，每孔45,000个 细胞，并在前脂肪细胞培养基(Zen-Bio)中培养3天。然后将培养基 换成分化培养基(Zen-Bio)并用载体对照(0.5% DMSO)或浓度为 25或50pM的化合物B处理细胞最多12天。每3天更换一半培养基， 产生无细胞培养物上清，并采用QUANTIKINE免疫测定(R&D Systems)根据制造商的说明书分析瘦蛋白分泌的水平。
如图ffi所示，与用载体对照处理的细胞相比，用化合物B处理 前脂肪细胞产生了瘦蛋白分泌的剂量依赖性增加，且瘦蛋白的水平持 续增加到12天。
在一个类似的试验中，将脂肪细胞接种到24孔平板中的脂肪细胞 培养基(Zen-Bio) 中，每孔IOO，OOO个细胞，并用载体对照、25pM 的化合物A 、化合物E和化合物F,或25或50pM的化合物B处理。 每3天更换一半培养基，产生无细胞培养物上清，并采用QUANTIKINE 免疫测定(R&Dsystems)根据制造商的说明书分析瘦蛋白分泌的水 平。
如图1C所示，与用载体对照处理的细胞相比，用本发明的化合 物处理脂肪细胞中产生了瘦蛋白的分泌增加，且瘦蛋白的水平持续增 加到12天。
痩蛋白是一种参与脂肪调节和代谢物的转运、储存、加工、利用 等，以及食欲抑制等的调节因子。本发明的化合物和方法调节脂肪蛋白表达的能力提示该化合物和方法可用于调节脂肪代谢，并且可用于 某些受试者，以减轻或防止体重增加，甚至减轻体重。 实施例3 :参与脂肪调节的因子的表达增加
用以下方法分析了木发明的化合物和方法调节脂肪代谢的能力， 尤其是增加参与脂肪转运、利用和储存的因子的表达的能力。为确定
一定时间内的基因诱导模式，从Simonsen. Inc获得雄性Swiss Webster 小鼠(30-32克)24只，并用口管词4ml/kg体积的0.5 %羧甲基纤维素
(CMC: Sigma扁Aldrich， St. Louis MO) (Omg/kg)或1.25%的化合物B (25mg/ml，用0.5% CMC配)(100mg/kg)治疗。在最后服药后4 、 8 、 16 、 24 、 48和72小时，用异氟烷麻醉动物。然后处死小鼠，分离 得到肾、肝、脑、肺和心脏的组织样品并储存在一 80 °C的RNALATER 溶液(Ambion)中。
用以下方法分离RNA:各器官切成50mg切片，加入875微升 RLT缓冲液(RNEASY试剂盒Qiagen Inc.， Valencia CA )，用转子-定子式POLYTRON匀浆器(Kinematica, Inc., Cincinnati OH)匀浆化切 片20秒。微离心匀浆液3分钟沉淀不溶性物质，将上清转移到一新试 管中，用RNEASY试剂盒(Qiagen)按制造商说明书分离RNA 。 RNA 洗脱在80微升水中，用RIBOGREEN试剂(Molecular Probes, Eugene OR)定量。然后用DNA-FREE试剂盒(Ambion Inc., AustinTX)按制 造商说明书除去RNA中的基因组DNA。测定260和280吸光度确定 RNA的纯度和浓度。
或者切割组织样品并在TRIZOL试剂(Invitrogen Life Technologies: Carlsbad CA)中用转子-定子式POLYTRON匀浆器(Kinematica)匀浆 化。匀浆液置室温，加入0.2体积的氯仿，强烈搅拌样品。室温培育混 合物几分钟，然后4 °C 12，000xg离心15分钟。收集水相加入0.5体积 的异丙醇。混合样品室温培养10分钟，4 °C 12,000xg离心10分钟。 弃去上清，沉淀用75。/。EtOH洗涤，4。C 7,500g离心5分钟。用 DNA-FREE试剂盒(Ambion Inc., Austin TX)按制造商说明书除去RNA 中的基因组DNA 。测定260和280吸光度确定RNA的纯度和浓度。
用0.3M乙酸钠(pH5.2) 、 50ng/ml糖原和2.5体积的乙醇，-20 °C沉淀RNA —小时。离心样品用80%冷乙醇洗涤沉淀，干燥，重悬于水中。用T7-(dT) 24第一链引物(Affymetrix, Inc. , Santa Clara CA) 和SUPERSCRIPT CHOICE系统(lnvitrogen)按照制造商说明书合成 双链cDNA。用等到休积25 :14:1的酚氯仿异戊醇和PHASE LOCK GEL插入物(Brinkman, Inc., WestburyNY)抽提最终的cDNA。收集 水相，用0.5体积的7.5M乙酸铵和2.5体积的乙醇沉淀cDNA。或者， 用GENECH1P样品清除模块(Affymetrix)接制造商说明书纯化 cDNA 。
用BIOARRAYHIGHYIELDRNA转录标记试剂盒(Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale NY)按制造商说明书在体外翻译反应中 从cDNA合成生物素标记的cRNA。用GENECHIP样品清除模块
(Affymetrix)接制造商说明书纯化最后标记的产物并片段化。
在1 X杂交缓冲液(lOOmM MES, lM[Na+]， 20mM EDTA, 0.01% Tween20)中加入5吗探针，100吗/ml鲱鱼精子DNA , 500(ig/ml乙 酰化BSA，0.03nM对照寡B2 (Affymetrix)禾口 1 X GENECHIP真核杂 交对照物(Affymetrix)，制备杂交混合物。将此杂交混合物依次在99°C 和45i:培育5分钟，然后离心5分钟。将鼠基因组U74AV2阵列
(MG-U74AV2; Affymetrix)置于室温，然后与lx杂交液45。C摇动 预杂交10分钟。该缓冲然后用80微升杂交混合物置换，以60rpm 45°C将该阵列与计量平衡液杂交16小时。杂交后用6xSSPE,0.1% Tween20洗涤阵列一次，然后洗涤并用R-藻红蛋白偶联的链霉亲和素
(Molecular Probes, Eugene OR)、生物素化羊抗链霉亲和素抗体
(Vector Laboratories, Burlingame CA)禾口 GENECHIP Fluidics Station 400仪器(Affymetrix)按照制造商的micro — lvl程序(Affymetrix) 染色。用GENEARRAY扫描仪(Affymetrix)和微阵列组软件
(Affymetrix)分析此阵列。
鼠基因组U74AV2阵列(Affymetrix)代表了 Mouse UniGene Database build 74 (National Center for Biotechnology Information, BethesdaMD)中的所有序列(约6000个)已经功能性特征分析，禾口 约6000个未注释的表达序列标记(EST)簇。
如图2A所示，用本发明的化合物处理后，参与脂肪代谢和转运 的蛋白质的编码基因的表达在肝脏中以协同的方式增加。转录模式在图2A中表示，包括(1)载脂蛋白A-IV, (2)胞质脂酰辅酶A硫酯 酶-1, (3)胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)-1 ,以及(4)肉碱乙 酰基转移酶。在所显示的时间曲线屮，这些蛋白质的mRNA水平最早 出峰，然后在24小时后回到对照水平。图2B显示了PAI-1的特定表 达时间曲线，结果是类似的，尽管在用本发明的化合物处理后表达的 诱导比较早。
这些数据显示，本发明的方法和化合物可通过增加与脂肪的储存、 摄入、转运、合成、加工和利用直接(例如ApoA-IV、肉碱硫酯酶、 肉碱乙酰基转移酶、PAI等)或间接(例如IGFBB-1等)相关的因子 的体内表达增加来调节脂肪代谢。本发明的方法和化合物可在治疗上 用于治疗或预防与高胆固醇有关的症状(例如动脉粥样硬化等)以及 与脂肪代谢受损有关的症状。
实施例4 :参与脂肪细胞分化的调节因子的表达改变 为进一歩研究本发明的方法和化合物对脂肪代谢和脂肪形成相关 基因的表达的作用，在按照实施例3的描述进行的试验中分析了特定 的脂肪形成因子。如图3A所示，在用化合物B处理的动物的肝脏中 DEC1/Stra13的表达一开始增加，然后在给药72小时后逐渐回归基线。 已知DEC1/Stra13代表了脂肪细胞分化所必须的PPAR-Y2核激素受 体的表达(参见例如，Yun等，同上；Giusti等，同上；以及Muller巧 等，同上。)因此，由于DEcl/Stra13的表达增加，PPAR-Y的表达则 会降低，降低细胞对脂肪酸的应答，尤其是延迟脂肪细胞的分化和脂 肪组织的形成。
为进一步研究本发明的方法和化合物对脂肪形成因子的表达的作 用，将12只雄性Swiss Webster小鼠(30-32克，获自Simonsen， Inc.) 每天一次用口管饲4ml/kg体积的0.5。/。CMC(0mg/kg/天)、化合物 D (25mg/ml，用0.5。/。CMC配)(100mg/kg/天)、或化合物B (7.5 和25mg/ml，用0.5% CMC配，分别30和100mg/kg /天)治疗4天。 在最后服药后4小时，麻醉并处死小鼠，分离得到约150mg脂肪、心 脏、肾、肝、肺和肌肉，并储存于-2(TC的RNALATER溶液(Ambion)。 按照上文实施例3的描述进行RNA分离和基因表达分析。如图3B所示，施用化合物D或化合物B导致包括脂肪、肾、肝和肌肉在内的一些组织中DEC1/Stra13的表达增加。化合物B还增加 肺和心脏中DEC1/Stra13的表达(图3B )。此外，在治疗4天后表 达的增加仍很明显。此外，如上所述，给予化合物D或化合物B导 致例如心组织中PPAR-y的表达降低(图3C )。这些数据显示，本发明的方法和化合物可通过改变参与细胞对脂 肪的应答，包括甘油三酯的合成、利用、转运和储存的因子的表达来 调节脂肪代谢。特别地，本发明的方法和化合物可用于调节脂肪细胞 的分化并减少脂肪脂肪储备。实施例5 :体重和脂肪的体内调节按照以下方法评定了本发明的化合物的方法对体重和脂肪的调节 的作用，例如对脂肪储存的作用。通过口管饲给予50只获自Simonsen， Inc.的雄性Sprague Dawley大鼠(6-7周龄)0.5% CMC (Sigma-Aldrich) 或20 、60 、 100 、 200mg/kg体重的化合物B，每天一次，连续14天。 监测动物的体重变化和看得见的毒性和死亡信号。第巧5天，让动物 禁食过夜但可无限制饮水，用异氟垸麻醉动物。将约lml的一份全血 样品收集到含EDTA的试管中作血液学分析，将约lml的第二份样 品收集到不抗凝的试管中作血清化学分析。血样分析由IDEXX( West Sacramento， CA)进行。收集血样后，切取隔膜并处死动物。记录各动 物的显微镜观察结果，并收集肝、肾、心脏、脾、肺、胃、小肠和大 肠以供生物化学和/或组织学评估。如图4A所示，用本发明化合物治疗的动物体重增加呈剂量依赖 性减少。动物检査表明，生长没有总体上延缓，因为治疗动物的大多 数器官绝对重量与对照的未治疗动物各器官重量相比，没有显著性差 异。例如，化合物治疗动物的心脏绝对重量与为治疗的对照相比，无 统计学显著差异(图4B)。然而，相对器官重量(表示为总体重分数 的器官相对重量)与未治疗对照相比，治疗动物中有显著差异。与对 照动物相巧比，治疗的动物中的相对心脏重量显著增加(p =0.036，单 向图氏差异分析(one-way ANOVA/Tukey's test))。由于器官的绝对重量没有显著减少，故受治疗动物的总体生长过 程没有延缓。另外，由于相对器官重量显著增加，故其它组织显然选择性损失。如图5所示，在用化合物治疗的动物中，看到内脏(腹) 脂肪呈剂量依赖性减少。上组的箭头显示用低剂量化合物治疗动物中 存在的内脏脂肪垫，而下组显示用高剂量化合物治疗的动物完全缺少 脂肪垫。这些结果表明，本发明的方法和化合物可用于调节体重。特别地， 本发明的方法和化合物可用于防止或减少增重，且不会同时使肌肉减 少。这些化合物和方法可用于调整脂肪调节，例如通过减少腹部脂肪 或内脏脂肪的储存。实施例6 :降低饮食诱导肥胖动物模型的体重增加用下述方法分析了本发明的化合物和方法对脂肪调节，例如脂肪 的摄入和储存等，以及对体重调节的作用。饲喂高脂食物发生严重肥 胖、高血糖症和高胰岛素血症的C57BL/6J小鼠是饮食诱导肥胖、2型 糖尿病和葡萄糖耐受受损的一种模型。将购自Jackson Laboratory ( Bar Harbor ME)的40只雄性C57BL/6J小鼠分成以下试验组组h载体 对照动物，饲喂标准的小鼠口粮(n=10);组2:载体对照动物，饲喂 高脂小鼠口粮(研究饮食45%脂肪)(n=10);组3:动物饲喂高脂小 鼠口粮并口饲管给予75mg/kg/天的化合物E(n二10);组4:动物饲 喂高脂小鼠口粮和口饲管给予75mg/kg /天的化合物A (n = 10)。此饲 养方案持续进行28天，每周测定体重。然后处死动物，收集它们的器 官和脂肪垫并秤重。如图6A所示，饲喂高脂饮食(组2)的动物体重显著高于饲喂标 准口粮(组l)的动物(P<0.05)。然而，饲喂高脂饮食但用化合物E 或化合物A治疗的动物(分别为组3和组4)显示体重增加明显为少(P<0.05)。事实上，尽管高脂饮食，用化合物治疗动物的体重与饲 喂正常饮食动物(组3和组4与组l比较)的基本上相同。类似地， 如图6B所示，饲喂高脂食物的动物(组2)腹部脂肪垫比饲喂标准口 粮的动物(组l )和10饲喂高脂食物并用本发明化合物治疗的动物(组3和组劝显著增加。如图6B所示，饲喂高脂食物并用化合物治 疗的动物的脂肪垫重量与正常饮食动物的基本相同。图6C显示，对 垫的重量以及包括肾、肝和心脏在内的其它器官的重量的特定效果在 所有试验组中基本相同。39这些结果表明，观察到的用或未用化合物的高脂饮食饲喂的动物 体重之间的差异归因于脂肪储存的减少，而不是生长速度的减少。此 外，这些数据显示，用木发明的化合物治疗动物，消除了与高脂饮食 相关的体重增加。此外，对各组的表达曲线进行分析证明，本发明的 化合物可使在组2的动物中被上调的基因，例如脂肪酸结合蛋白-3和线粒体RNA解偶联蛋白-1的表达正常化(数据未显示)。因此，即便在摄入有害饮食的情况下，本发明的化合物也可用于治疗性地减轻 体重。此外，用本发明的方法和化合物调节体重增加，提示这类化合 物可用于治疗性促进肥胖病人的体重减轻。实施例7 :肥胖小鼠的体重减轻按以下方法研究了给予本发明化合物对体重减轻的作用。从Jackson Laboratory (Bar Harbor ME)获得C57BL/6J小鼠。饲喂高脂食 物发生严重肥胖、高血糖症和高胰岛素血症的C57BL/6J小鼠是饮食诱 导肥胖、2型糖尿病和葡萄糖耐受受损的一种模型。给小鼠饲喂高脂食 物8周后变成肥胖。将肥胖小鼠分成二试验组组l动物为对照的肥 胖小鼠，组2动物为用本发明化合物治疗的肥胖小鼠。该研究中也包 括另一组年龄相配的非肥胖小鼠。每天用本发明化合物或用载体对照 治疗动物。21天内每周二次测定小鼠体重。第21天秤重小鼠并处死。 分离腹部脂肪垫、肝、'肾和心脏并秤重作分析。给予化合物后体重减轻表明本发明的化合物可用于治疗性减少肥 胖病人的体重。实施例8 :血清甘油三酯的长期降低按照以下方法，用糖尿病小鼠模型研究了给予本发明的化合物对 血清甘油三酯水平的作用。得到20只雄性db/db小鼠(Harlan， Indianapolis IN)，这种小鼠携带痩蛋白受体中纯合失能突变，随意提 供载体(lOOmM组氨酸)或化合物A (0.5 mg/ml，用lOOmM组氨酸 配制)的饮水8周。然后对动物禁食一夜，在全身麻醉的情况下从尾 静脉采集血样并将血样置于血清分离试管。按照Quality Clinical Labs (Mountain View CA)的方法进行血样分析。db/db小鼠的甘油三酯水平比正常小鼠至少高1.5-2倍，且水平 随着年龄逐渐地增加。(参见例如，Nishina等，(1994) Metabolism43:549-553;以及Tuman和Doisy (1977) Diabetologia 13:7-11 。)如图 7所示，在试验结束时对照db/db小鼠的甘油三酯水平几乎为 120mg/dL 。然而，用本发明的化合物处理的动物的卄汕三酯水平约为 85mg/dL ，明显低于对照。甘汕三酯水平升高与心血管疾病的风险增 加有关，且升高的甘油三酯也是代谢综合征的一个构成原因。由于在 通常与甘油三酯升高有关的条件下，例如糖尿病、x综合征、大血管 疾病(macrovascular disease)或其它血脂疾病，本发明的化合物和方 法可有效减低或维持甘油三酯水平，因此，本发明的方法可有效治疗 有这些疾病风险或接近这些疾病风险的个体。实施例9 :鉴定稳定HIFa和抑制HIF羟化酶活性的化合物 本发明的化合物可用于本方法稳定HIFa 、抑制HIF羟化酶活性 和/或HIFa羟化作用等。因此，例如可通过它们稳定HIFa能力来鉴 定化合物。如下检测了用本发明的方法和化合物对HIFct的稳定。将衍 生自腺病毒转化的胎肾上皮(239A)、宫颈上皮腺癌(Hda)、肝细 胞癌(Hep3B )、鳞状上皮癌(SSC-25)的人细胞和肺成纤维细胞(HLF) 组织(见美国典型培养物保存中心，Manassas VA;和Qbiogene , Carlsbad CA)分别接种在100mm培养皿中，在37 °C 、 20% 02、 5%(3 02下培养，培养基为HeLa细胞为Dulbecco改进的Eagle培 养基(DMEM),2 X胎牛血清(FBS);HLF细胞为DMEM , 10 % FBS ; 293细胞为DMEM,5。/。FBS;Hep3B细胞为极限必需培养基(MEM ), Earle's BSS ( Mediatech Inc . Hemdon vA ) , 2mM L-谷氨酰 胺，0.1非必需氨基酸，lmM丙酮酸钠，10%FBS。当细胞层达到铺 满时，用OPTI-MEM培养基(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA)替换原培养基，在37。C、 20% 02、 10%(302下培养细胞层约 24小时。然后在现有培养基中加入本发明化合物(化合物B 、D 、F 、 G或H)或载体对照(0.5-1.0% DMSO)，继续培养过夜。培养后取出培养基，离心并保存待分析。用冷磷酸缓冲盐水(PBS) 洗涤细胞二次，然后用1.0ml的10mMTris(pH7.4), lmMEDTA, 150mM NaCl, 0.5% IGEPAL (Sigma-Aldrich , St. Louis MO)和蛋白酶 抑制剂混合物(Roche Molecular Biochemicals)冰上裂解细胞15分钟。 4°C 3,000xg离心细胞裂解物5分钟，收集胞质组分(上清液)。重悬细胞核并用lOOjil 20mM HEPES (pH 7.2), 400mM NaCl, ImM EDTA, ImM 二硫苏糖醇和蛋白酶混合物(Roche Molecular Biochemicals)裂 解，4。C 13000xg离心5分钟，收集核蛋白组分(上清液)。根据蛋白质浓度标准化核组分，加到4-12。/。TG凝胶上，在还原 条件下分级。在500mA 1.5小时，将蛋白质转移到PVDF膜(Invitrogen Corp., Carlsbad CA)上。用T-TBS， 2%牛奶室温封闭该膜1小时，与 用T-TBS, 2%牛奶1: 250稀释的小鼠抗人HIF-la抗体(BD Biosciences, Bedford MA)培育过夜。用SUPERSIGNAL WEST化学发光底物(Pierce, RockfordIL)显色印迹。如图8A所示，本发明的代表性化合 物(化合物D)稳定了各种细胞类型中的HIFa，使细胞内积累了 HIFa。或者，用核抽提试剂盒(ACtive Motif, Car 。 badCA )制备核组 分，并用TRANS AM H1F — 1 ELISA试剂盒(Active Motif )按照制 造商说明书分析HIF —la 。如图SB所示，上皮细胞(293A )和肝 细胞(H印3B )用本发明各种化合物(化合物B 、 F 、 G和H ) 处理，与载体处理的对照细胞相比，显示了HIFA的稳定和积累。例如也可通过它们调节HIF特异性脯氨酰羟化酶活性的能力来鉴 定用于本发明的化合物。可采用基于2-氧[l-"C]戊二酸的羟化-偶联脱 羧的测定法来鉴定HIF脯氨酰羟化酶活性的调节(见Hirsila等，JBio Chem 278:30772-30780， 2003)。该反应在25'C、 l.Oml反应体积中进 行，其中含10-100微升洗涤剂如Triton-X-100、获自表达内源性HIF脯 氨酰羟化酶或重组HIF脯氨酰羟化酶的细胞的溶解细胞提取液、 0.05pM底物月太如DLDLEMLAPYIPMDDDFQL (SEQ ID NO: 1)、 0.005fiMFeSO4 0.16iiM2-氧[l-"C]戊二酸、2jiM抗坏血酸、60|ig过氧 化物酶、0.1nM二硫苏糖醇和50pMTris-盐酸缓冲液，调pH到7.8。 37'C进行酶反应20分钟。该反应产生的14C02被捕俘在悬褂于反应混 合物上方大气中浸泡碱液的滤纸上，并在液闪计数器中计数。实施例10 :参与葡萄糖摄入和利用的调节因子的表达由于本发明的化合物和方法可调节脂肪代谢，这与葡萄糖的调节 紧密协调的，所以分析了所述化合物和方法对葡萄糖摄入和代谢的作 用。人SSC-25 (鳞状细胞癌)或大鼠H9c2 (心室心肌细胞)细胞在 37°C、 10。/。C02条件下在含有10X胎牛血清的DMEM的100mm培养皿中生长至铺满。细胞然后用PBS洗涤两次并与载体对照、化合物D(IO和25fiM)或化合物C(5、 10和20(iM) —起培养16小鼠。将 平板置于冰上除去培养上清液，加入裂解缓冲液-1 (LB-1: 10mMTris pH7.4, 1mMEDTA， 150mM氯化钠，0.5%1GEPAL)。刮下收集细胞 裂解物冰上培育15分钟，然后4 。C 3,000xg离心5分钟。收集代表胞 质组分的上清液，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS —PAGE ) 在还原条件下分离胞质蛋白，每泳道加等量的蛋白质。在150V下进行SDS-PAGE2小时，将蛋白质转移到PVDF膜上， 在4"C、 400mA 1.5小时。膜在封闭缓冲液中培育2小时或过夜，用 T-TBS洗一次，然后加入用封闭缓冲液稀释到工作浓度的抗GluT-l抗 体(Alpha Diagnostics) 。 4°C轻搅拌培育过夜。用T-TBS洗膜4次， 接着与封闭缓冲液中稀释的偶联第二抗体室温培育1小时。用T-TBA 洗膜4次，然后用X-光胶片和ECL SUPERSIGNAL WEST或PICO化 学发光底物(Pierce Chemical Co. RockfordIL)按照制造商说明书显影 和观察。图9A显示化合物D和化合物C分别提高了 SSC-25和H9c2细 胞中GluT-l的蛋白质水平，GluT-l是调节葡萄糖摄入的主要可诱导的 葡萄糖转运蛋白。这些结果说明，本发明的化合物可方法可能提高参 与葡萄糖摄入的蛋白质的表达，从而提供了增加葡萄糖摄入的治疗途 径。在所述方法和化合物对葡萄糖调节的作用的进一步分析中，将人 293A细胞铺满接种在含5。/。FBS和1X青霉素-链霉素的DMEM培养 基的35mm培养皿中，37°C， 10%CO2条件下培养1天。将培养基换 成Opti-Mem培养基，继续培养18-24小时。然后在培养基中加入载 体对照或化合物B，再培养24、 48或72小时。将平板置于冰上除去 培养上清液，加入裂解缓冲液-1 ( LB-1: 10mM Tris pH7.4, lmM EDTA, 150mM氯化钠，0.5%IGEPAL)。收集细胞裂解物，收集胞质组分， 并按上述方法采用SDS-PAGE分离胞质蛋白质。分离后，将蛋白质转 移到PVDF膜上，在4。C、 400mA 1.5小时。膜在封闭缓冲液中培育2 小时或过夜，用T-TBS洗一次，加入用封闭缓冲液稀释到工作浓度的 抗醛縮酶。4。C轻搅拌培育过夜后用T-TBS洗膜4次，接着与封闭缓冲液中稀释的偶联第二抗体室温培育l小时。用T-TBA洗膜4次，然后用X-光胶片和ECL SUPERSIGNAL WEST FEMTO或PICO化学发光底物(Pierce Chemical Co. RockfordIL)按照制造商说明书显影和观察。
如图9B所见，用化合物B处理24 、 48禾卩72小时的细胞中醛縮酶的表达随时间而增加，而用载体对照处理的培养物显示醛縮酶表达不增加。化合物B处理的培养物未显示(3-微管蛋白表达增加，表明醛縮酶的增加是特异性的，与蛋白质表达的总体增加无关。
这些结果表明本发明的化合物和方法可改变葡萄糖的调节，并提示用本发明的化合物处理可通过调节脂肪和葡萄糖的体内平衡而可能使能量产生发生代谢转变。
实施例ll :提高参与葡萄糖调节的调节因子的表达
为证明所述化合物和方法可在体内改变葡萄糖的摄入和利用，进一步分析在上述实施例3中得到的样品以鉴定糖酵解基因诱导模式随时间的变化。如图10A 、 10B和10C所示，编码参与葡萄糖调节的酶的基因表达在用化合物B处理后以协同方式增加。图10A，10B和10C提供的转录模式包括血小板类型的磷酸果糖激酶(PFK)-P(l)、肝脏类型的PFK-L(2)、烯醇化酶-1(3)、葡萄糖转运蛋白(GluT)-l(4)、乳酸脱氢酶-1(5)、醛缩酶-1(6)、和己糖激酶-1(7)。在时间曲线中，大多数mRNA水平在给予化合物后早期达到峰值，24-48小时后回到对照水平。另外，不同器官之间编码糖酵解酶的基因表达相类似，但肾(图10A )肝(图10B )和肺(图10C )在特定mRNA相对表达水平的增加和增加的持续时间上有差异。这些差异部分与向各组织提供重要能源，特别在应激时提供能源的糖酵解作用程度不同有关。这些结果表明，本发明的化合物可特异性诱导糖酵解作用，这些作用可因组织而不同。
实施例12 :对氧消耗的影响
脂肪和葡萄糖产生能量通常是有氧呼吸发生的。然而，在低氧条件下，能量的利用会发生变化以补偿减低的氧水平。通常，基于氧利用率，厌氧糖酵解增加，脂肪酸氧化被最大程度地利用。总之，对氧气的满足净能量要求的需求应该降低。就改变能量利用而言，为确定本发明的方法是否降低细胞对氧的需求，进行了以下试验。人293A和HeLa细胞(美国模式培养物保藏所)在含有高葡萄糖(Mediatech, Inc.，HerndonVA)禾n 1X胎牛血清的DMEM培养基中于37。C和10%CO2下分别生长至铺满。收集细胞并以500,000细胞/ml的密度悬浮于培养基中，在96孑L Oxygen Biosensor平-板(BD Biosciences, Bedford MA)的每个孔中加入0.2 ml细胞悬液。Oxygen Sensor平板(BD Biosciences,Bedford MA)含有一种在没有氧气时荧光性更强的钉络合物。因此，当平板中存在耗氧细胞时荧光读数升高，这改变了较低的氧饱和度和较高荧光之间的平衡。
在一式三份组的孔中加入lOjil以下物质1) 0.5 %DMS0 (载体对照)；2) 200|iM十二烷基硫酸钠(SDS;作为无氧气消耗的阳性对照)3)5、25或50刚化合物B;4)10、100或1000mM甲磺酸去铁胺(DFO);和5)仅培养基。同时，将0.2ml单独的培养基或含有100 mM SDS的培养基在不含细胞的孔中培养以提供合适的背景平板荧光的对照。
将培养物再培育72小时，然后在FL600荧光计(Biotek Instruments,Inc., WinooskiVT)上测量平板的荧光，激发波长为485nm，发射波长为590nm 。将数据作为荧光的函数进行制图，并用EXCEL软件(Microsoft Corp., Bellevue WA)进行描述性统计学分析。
与用载体对照处理的细胞相比，用本发明的化合物处理的HeLa和293A细胞都显示了剂量荧光的依赖性的减少，表明氧消耗降低(见图11)。降低的氧消耗不是由于细胞活性或生存力损失，提示可能有细胞毒性，这可用WST-1比色测定法(Roche)来测定。利用其它细胞类型进行的其它试验和终点确认氧消耗的降低与该化合物的细胞毒性无关。
这些数据说明，用本发明的化合物处理各种组织来源的细胞将使细胞代谢发生转变从而降低净氧消耗。
实施例13:血浆甘油三酯的短期增加
按照实施例5的描述处理SpragueDawley大鼠并收集样品。血样分析显示，采用剂量为60、 100和200mg/kg的化合物B ，本发明的方法使血浆甘油三酯显著升高。然而为观察到血浆胆固醇有相应的升高。因此，甘油三酯水平的升高似乎是由于代谢转向利用脂肪储备来提供能量需求。此外，在没有需氧TCA以循环时糖酵解的任何增加可能产生甘油三酯作为副产物。
除了本文所示和描述的以外，本领域技术人员懂得可根据上述描写对本发明作各种修改。这些修改都在本发明权利要求的范围内。
本文引用的所有参考文献的内容纳入本文作参考。序列表
〈110〉 法布罗根股份有限公n](FIBROGEN, INC.)
P D S尔内(Four譜，Patrick D.)V 众策尔-普+尔(Guenzlpi'-'Pukal1， Volkmar)
〈120〉 脂肪调节
<130〉 FP0602. 2 PCT
<150〉 60/431,351
<151> 2002-12-06
<150> 60/476,331
<151〉 2003-06-06
<150> 60/476, 726
〈15i> 2003-06-06
〈150〉 未知
<151> 2003-12-04
<160> 1
<170〉 Patentln version 3. 2
<210> 1
<211〉 19
<212〉 PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Asp Leu Asp Leu Glu Met Leu Ala Pro Tyr lie Pro Met Asp Asp Asp15 10 15
Phe Gin Leu
SATT
YBW
克劳斯(Klaus, Stephen)i水(Lin, Al Y.)
尼人(Neff, Thomas B.)两利(Seeley, Todd W.)
权利要求
1、稳定HIFα的化合物用于制造治疗或预防肥胖症的药物的用途，其中所述化合物是取代的喹啉-2-羧酰胺。
2、 如权利要求l所述的用途，其中所述化合物抑制HIF羟化酶。
3、 如权利要求l所述的用途，其中所述化合物抑制HIF脯氨酰基羟化酶。
4、 如权利要求1所述的用途，其中所述取代的喹啉-2-羧酰胺是喹 啉-2-羰基-氨基-乙酸。
5、 稳定HIFoc的化合物用于制造药物的用途，所述药物用于在一 个体中a. 调节体重；b. 减少体脂肪；或c. 引起减重，其中所述化合物是取代的喹啉-2-羧酰胺。
6、 如权利要求5所述的用途，其中所述化合物抑制fflF羟化酶。
7、 如权利要求5所述的用途，其中所述化合物抑制HIF脯氨酰基 羟化酶。
8、 如权利要求5所述的用途，其中所述取代的喹啉-2-羧酰胺是喹 啉-2-羰基-氨基-乙酸。
9、 如权利要求5所述的用途，其中所述体脂肪是内脏的脂肪或腹 部的脂肪。
10、 稳定HIFa的化合物用于制造药物的用途，所述药物用于在一 个体中a. 调节脂肪代谢过程；b. 实现脂肪体内平衡；c. 改变脂肪调节因子的表达；d. 导致脂肪利用中代谢转变；e. 降低耗氧量；f. 导致代谢转向厌氧代谢；或g. 降低需氧代谢和增加厌氧代谢；其中所述化合物是取代的喹啉-2-羧酰胺。
11、 如权利要求10所述的用途，其中所述化合物抑制HIF羟化酶。
12、 如权利要求IO所述的用途，其中所述化合物抑制HIF脯氨酰基羟化酶。
13、 如权利要求10所述的用途，其中所述取代的喹啉-2-羧酰胺是 喹啉-2-羰基-氨基-乙酸。
14、 如权利要求IO所述的用途，其中，所述脂肪代谢过程选自脂 肪摄入、脂肪运转、脂肪储存、脂肪加工、脂肪合成或脂肪利用。
15、 如权利要求IO所述的用途，其中，所述脂肪调节因子选自瘦 蛋白、载脂蛋白A-IV、胞质脂酰辅酶A硫酯酶-1、胰岛素样生长因子 结合蛋白、肉碱乙酰基转移酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1、 DEC1/Stra13 或过氧化物酶体增殖物激活受体-Y。
全文摘要
本发明提供了稳定HIFα的化合物制备调节脂肪代谢并实现脂肪体内稳定的药物的用途，还提供了其制备用于调节体重、减少体脂肪和导致体重减轻的药物的用途，以及其制备用于治疗或预防肥胖症和用于预防或治疗与脂肪代谢有关的疾病如肥胖症、糖尿病、动脉粥样硬化等的药物的用途，其中所述的稳定HIFα的化合物是取代的喹啉-2-羧酰胺。
文档编号A61K31/47GK101518533SQ20091000517
公开日2009年9月2日 申请日期2003年12月5日 优先权日2002年12月6日
发明者A·Y·林, P·D·富尔内, S·J·克劳斯, T·B·尼夫, T·W·西利, V·京策尔-普卡尔 申请人:法布罗根股份有限公司