专利名称：：用于预防口腔龋齿的IgY抗体清洁剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种口腔清洁剂，尤其涉及一种防龋齿抗体IgY清洁剂，用于预防口腔龋齿。
背景技术：
：龋齿(俗称蛀牙)是指牙齿组织逐渐毁坏崩解形成缺损的一种疾病。龋病是人体最常见的牙齿疾病。病患率一般为70%左右，有些地方高达90%以上。世界卫生组织把它与癌症,心血管病一起列为重点防治的三大非传染性疾病。龋齿不仅使牙齿崩溃缺损还能继发牙髓组织根尖周围组织的疾病，甚至使髓骨受感染引起骨髓发炎等并发症。以至影响全身健康。预防龋齿可以从两方面着手一是增强牙齿的硬度和钙化程度，以抵御牙菌斑产酸对牙齿的腐蚀，如含氟牙膏、含氟漱口水等.由于氟有副作用，而儿童使用漱口水易将其吞下。因此，许多国家禁止儿童使用含氟漱口水。二是持续有效的抑制牙菌斑的形成，从根本上预防龋齿。医学研究人员发现引起龋齿的主要致病菌是变异链球菌，这种细菌易粘附在牙齿表面形成牙菌斑，继而通过代谢活动产生酸，酸使牙矿物质溶解形成齿洞而形成蛀牙。使用抗菌素可以杀灭变异链球菌，但也会杀灭口腔内部的正常寄生菌群，影响口腔菌群的生态平衡。经常使用抗菌素还会使细菌产生耐药性。近几年，抗变形链球菌IgY作为一种抑制牙菌斑的新型防龋齿物质受到广泛关注。抗变形链球菌IgY是用变形链球菌(^/^^ococcwmwto"s)免疫蛋鸡，从鸡蛋黄中提取的抗体。它对变形链球菌有特异的结合能力，它能强效抑制变异链球菌，进而抑制牙菌斑的形成，达到有效防龋的目的。该抗体安全、无毒副作用，也不会杀灭口腔内其他正常寄宿菌，而影响口腔菌群的生态平衡。此外，其还能形成的蛀牙细菌无法生存的口腔生态环境，产生持久特效作用。国外研究表明使用抗变形链球的单克隆抗体喷于牙齿上，产生的保护作用长达二年，用抗变形链球菌的鸡蛋黄抗体IgY喷于牙齿上，连续用两个月，作用效果可达半年。由于儿童手部肌肉发育3不完全，不能有效刷牙，儿童通常也不愿意刷牙，目前也没有预防龋齿，尤其是适用于儿童的防龋齿口腔喷剂。
发明内容本发明的一个目的在于提供一种口腔清洁剂，用于预防口腔龋齿。本发明的另一个目的在于提供一种口腔清洁喷雾剂，用于口腔龋齿，尤其是儿童的口腔龋齿预防。本发明的另一个目的在于提供一种口腔清洁喷雾剂，该制剂能使IgY抗体在常温下保存。变异链球菌按其血清型可分为a、b、c、d、e、f、g和h等几类，但是对口腔中变异链球菌的检测表明，c型菌株约占口腔变异链球菌总量的60—90%，d型菌株约占口腔变异链球菌总量的10%，其它几种血清型变异链球菌的检出率很低。因此，c型和d型变异链球菌是引起龋齿的主要血清型，本发明选择c型和d型变异链球菌作为抗原菌体。然后将c型和d型变异链球菌免疫产蛋母鸡，然后用聚乙二醇(PEG)法纯化，得到IgY抗体。免疫所用的c型和d型变异链球菌通过如下方法培养，先用BHI或TTY培养基，在37'C温度条件下，分别培养c型和d型变异链球菌48小时，然后将培养后的c型和d型变异链球菌分别用5,000rpm离心5分钟，收集菌体，用pH值为6.0，浓度为0.2M的磷酸缓冲液洗菌3次。5(TC热处理25分钟，分别制得c型变异链球菌(20亿/ml)和d型变异链球菌(20亿/ml)液，按体积比3:l的比例混合，制备成免疫原。变异链球菌免疫产蛋母鸡的方法为每次取抗原1.0ml，对产蛋母鸡进行皮下注射，免疫三次，每次间隔时间为二周。IgY抗体的纯化步骤为用蛋黄筛分离免疫母鸡产蛋的蛋黄，加入等体积的PBS(pH7.2)搅拌混匀制备蛋黄液，加入与蛋黄液等体积7%(w/w)PEG(PEG8000)搅拌混匀，室温放置30分钟。8，000rpm离心30分钟，弃沉淀。上清为分离纯化的IgY。IgY抗体的检测以ELISA(上海市农业科学院)测抗体IgY活性。4测抗体浓度总蛋白含量=(OD280/1.4);IgY含量-总蛋白含量XIgY纯度。一种口腔清洁剂，包括抗体IgY和Cl一C30的醇。其中，C1一C30的醇为碳原子数1一30的单元醇或多元醇。所述的碳原子数1—30的单元醇为其碳链上只具有一个羟基，如乙醇、丙醇或丁醇等。所述的碳原子数1一30的多元醇为其碳链上至少具有二个羟基，如乙二醇、丙二醇或丙三醇等。上述口腔清洁剂，还包括制剂学上常用的香精、乙醇、矫味剂和抑菌剂。这些辅料可以在本发明所述的口腔清洁制剂中单独使用或组合使用，结合具体的制剂类型如乳剂、膏剂、凝胶剂和喷雾剂等，单独或组合使用上述辅料。矫味剂一般选择糖类，也称碳水化合物，包括生物化学上的单糖、二糖、多聚糖和寡聚糖等。所述的单糖是碳原子数3—6的多羟基醛或多羟基酮，如果糖、葡萄糖、核糖和半乳糖等。所述的二糖(disaccharide)是由两个单糖单元通过糖苷键形成，如蔗糖、乳糖和麦芽糖。由2—10单糖通过糖苷键形成的寡聚糖(oligosaccharide)，如低聚异麦芽糖、低聚木糖或低聚半乳糖)。10个以上单糖通过糖苷键形成的多聚糖(polysaccharide)。另一种口腔清洁剂，按重量百分比计，含有0.05%—0.5%抗体18￥、8%_21%C1-C30的多元醇、0.2—1%抑菌剂和5°/。一10%矫味剂。另一种口腔清洁剂，按重量百分比计，含有0.05。/。一0.5n/。抗体IgY、5%—15%丙三醇、3%—6%山梨醇、0.2—1%抑菌剂和5%—10°/。矫味剂。本发明所述的口腔清洁剂，其剂型选择水包油(oil-in-water,O/W)乳剂、以水凝胶为载体的凝胶剂和以胶基为载体的制剂。水包油(oil-in-water，0/W)乳剂，即将疏水相(如有机相)均匀分散于水中而形成的稳定的乳状液。分散过程中可以使用乳化剂以利于疏水相的均匀分散，还可以使用匀浆器已使乳液快速形成。水凝胶(Hydrogd)是是水溶性或亲水性的高分子，通过一定的化学交联或物理交联，并以水为分散介质的凝胶。亲水性高分子包括多糖类，如淀粉、纤维素、海藻酸、透明质酸和壳聚糖等，多肽类，如胶原、聚L一赖氨酸和聚L一谷胺酸等，以及丙烯酸及其衍生物，如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺和聚N-聚代丙烯酰胺等。胶基的基本成分包括橡胶，如天然橡胶，枇杷，明胶或苯乙烯一丁二烯橡胶、丁基橡胶和聚异丁烯等；酯类，如松香甘油酯和松香等；蜡，主要有石蜡或微晶蜡；脂肪，主要为氢化植物油*，乳化剂，主要为卵磷脂;填充物，主要为碳酸钙和滑石粉。本发明所述的口腔清洁剂可制成各种剂型，如配置成溶液后装入普通容器中，作为随时使用的含漱水；或装入带压力装置的瓶中作为喷雾剂，而在需要时随时随地喷入口腔；也可作刷牙液，在吃过食物之后或睡觉醒来之后用牙刷沾上刷牙；乳剂、膏剂和凝胶剂还可作为刷牙时的牙膏使用，还能杜绝牙膏中的固体粉料(既通常所说的磨料)对牙齿的磨损伤害作用；以胶基为载体制成口香糖，可含于口中咀嚼，而起到清洁口腔预防龋齿的作用。一种口腔清洁喷雾剂，包括抗体IgY、C1一C30的多元醇、矫味剂和乙醇。另一种口腔清洁喷雾剂，按重量百分比计，其水溶液中含有0.05%—0.5。/。抗体IgY、8%—21%Cl—C30的多元醇、5—10°/。矫味剂和5%—15%乙醇。另一种口腔清洁喷雾剂，按重量百分比计，其水溶液中含有0.05%_0.5。/o抗体IgY、5%—15%丙三醇、3%_6%山梨醇、5—10%木糖和5%—15%乙醇。上述口腔清洁喷雾剂，还包括重量百分比0.2%—1%抑菌剂，所述抑菌剂选自于苯甲酸钠、BHT或间甲酚。此外，为了适应儿童的使用，还可以在喷雾剂中加入食用香精。上述配制的喷雾剂装入喷雾瓶后，抗体IgY能够在常温下稳定保存1年以上。本发明技术方案实现的有益效果-本发明选择C型和d型变异链球菌作为抗原菌体，既避免了多种血清型混合菌作为抗原时，主要血清型菌效用降低的问题；也避免了当单一血清型菌作为抗原时，交叉免疫反应范围偏窄的问题。本发明通过选择适当的辅料及其用量组合，以及选择适当的IgY抗体浓度，使得制成的喷雾剂装入喷雾瓶后，其中IgY抗体能够在常温下稳定保存1年以上。具体实施例方式以下详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛一奥德里奇(Sigma—Aldrich)。实施例lIgY抗体的制备用BHI或TTY培养基，在37'C温度条件下，分别培养c型和d型变异链球菌(上海交通大学口腔研究所)48小时，将培养后的c型和d型变异链球菌分别用5,000rpm离心5分钟，收集菌体，用pH值为6.0、浓度为0.2M的磷酸缓冲液洗菌3次。50'C热处理25分钟，分别制得c型变异链球菌(20亿/ml)和d型变异链球菌(20亿/ml)液，按体积比3:1的比例混合，制备成免疫原。每次取抗原l.Oml，对产蛋母鸡(来亨鸡)进行皮下注射，免疫三次，每次间隔时间为二周。第一次免疫母鸡20天后收集鸡蛋，用蛋黄筛分离蛋黄，加入等体积的PBS(pH7.2)搅拌混匀制备蛋黄液，加入与蛋黄液等体积7%PEG(PEG8000)搅拌混匀，室温放置30分钟。8000rpm离心30分钟，弃沉淀。上清为分离纯化的IgY。以ELISA(上海市农业科学院)测抗体IgY7活性。测抗体浓度总蛋白含量-(OD280/1.4);IgY含量-总蛋白含量XIgY纯度。实施例2口腔清洁喷雾剂的制备在容器中，按重量百分比分别加入下列试剂，用去离子水补足余量。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>加蒸馏水补足100ml，用SD病毒灭活法进行灭活，用0.22um的膜过滤除菌。将溶液装入小型携带式喷雾罐中喷雾使用。实施例3口腔清洁喷雾剂的制备在容器中，按重量百分比分别加入下列试剂，用去离子水补足余量。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>加蒸馏水补足余量，用SD病毒灭活法进行灭活，用0.22um的膜过滤除菌。将溶液装入小型携带式喷雾罐中喷雾使用。实施例4水包油乳剂的制备按重量百分比分别加入下列试剂:IgY0.1%甘油10%山梨醇5%苯甲酸钠1%薄荷香精0.5%以及重量百分比20%碳酸氢钙、油性成分(硬脂酸10%，甘油单硬脂酸2%，蜂蜡8%)和0.5。/。乳化剂Tween-80,最后用蒸馏水补足余量并制成水包油乳膏。实施例5水凝胶的制备按重量百分比分别加入下列试剂IgY0.1%甘油10%山梨醇5%苯甲酸钠1%薄荷香精0.5%以及重量百分比40%碳酸氢钙，2%羧甲基纤维素，最后用蒸馏水补足余量并制成水凝胶。剂试剂试9实施例6胶基体的制备借鉴口香糖的制备方法，先按重量百分比分别加入下列试剂-IgY0.1%甘油10%山梨醇5%苯甲酸钠1%薄荷香精0.5%再加入重量百分比10%碳酸氢钙，重量百分比25%胶基，最后用基料和蒸馏水补足余量并制成胶基体。剂试10权利要求1.一种用于预防口腔龋齿的清洁剂，其特征在于包括抗体IgY和C1-C30的醇。2.根据权利要求l所述的用于预防口腔龋齿的清洁剂，其特征在于还包括制剂学上常用的香精、乙醇、矫味剂和抑菌剂。3.—种水包油乳剂，其特征在于包括权利要求1所述的用于预防口腔龋齿的清洁剂。4.一种水凝胶制剂，其特征在于包括权利要求1所述的用于预防口腔龋齿的清洁剂。5.—种胶基为载体的制剂，其特征在于胶基中加入权利要求1所述的用于预防口腔龋齿的清洁剂。6.—种用于预防口腔龋齿的清洁剂，其特征在于包括抗体IgY、Cl一C30的多元醇、矫味剂和乙醇。7.—种用于预防口腔龋齿的喷雾剂，其特征在于，按重量百分比计，其水溶液中含有0.05%—0.5。/。抗体IgY、8。/。一21%C1—C30的多元醇、5—10%矫味剂和5%—15°/。乙醇。8.根据权利要求7所述的用于预防口腔龋齿的喷雾剂，其特征在于所述的多元醇选自于丙三醇和山梨醇。9.根据权利要求7所述的用于预防口腔龋齿的喷雾剂，其特征在于所述的矫味剂选自于木糖。10.根据权利要求7—9之一所述的用于预防口腔龋齿的喷雾剂，其特征在于所述制剂还含有0.2—1%的抑菌剂。全文摘要一种用于预防口腔龋齿的IgY抗体清洁剂，包括以c型和d型变异链球菌免疫产蛋母鸡制得的IgY抗体和C1-C30的醇。配合以其它辅料，制得的喷雾剂装入喷雾瓶后，其中IgY抗体能够在常温下稳定保存1年以上。解决了由于儿童手部肌肉发育不完全，不能有效刷牙，以及儿童因不愿意刷牙而产生的儿童口腔预防龋齿问题。文档编号A61K8/02GK101579293SQ20091005316公开日2009年11月18日申请日期2009年6月16日优先权日2009年6月16日发明者凯赵申请人:凯赵