本发明涉及苹果属植物海棠果多酚的提取方法技术，具体地说是一种海棠果多酚的提取方法，为冻干超声提取及固相萃取纯化的方法。
背景技术：
：海棠果是我国地方农家苹果资源的主要组成，因其风味独特，营养价值丰富，含丰富的多酚，含量比栽培苹果高两倍，具有预防高血压、抗肿瘤、抗衰老、抗心脑血管疾病、抗基因突变、抗辐射、抗过敏、防龋齿、增强肌力。但是新鲜海棠果产品的附加值低，并且货架期时间短，难以长距离运输。因此，发展我国海棠果的加工业，开展海棠果产品的开发研究，突破加工的薄弱环节，对促进我国海棠果加工业、提高经济效益具有十分重要的意义。通常苹果和海棠果的多酚提取有机溶剂超声提取为主，辅助使用滤膜和树脂过滤，其优点是操作简单，适用于大量果实多酚的提取；缺点是果实样品定量不可控，提取纯度有待提高，海棠果实提取时因去除果心，果肉氧化迅速，定量准确性不高，常用的膜和树脂过滤得到的多酚纯度不高。这种提取方法对于大量的工业生产来说尚可，但是对于实验室进行科学研究来说，这种方法果实材料定量不准确、提取多酚纯度较低。如何实现海棠果多酚提取的快速，并能准确定量、获得纯度较高的多酚，便于进行海棠果多酚的科学研究，构建海棠果多酚冻干超声提取及固相萃取纯化的方法急需解决。技术实现要素：为了能够获得海棠果多酚，本发明提出了一种海棠果多酚的提取方法。该方法通过冻干超声提取及固相萃取纯化步骤，实现海棠果多酚保质保量的提取，解决海棠果多酚提取的技术问题。本发明解决技术问题所采用的方案是：（1）原料预处理：将原料海棠果洗净、切成果粒；（2）冻干：将海棠果粒放入真空冻干机中真空冻干；（3）粉碎：将真空冻干海棠果粒用匀浆机粉碎，时间为20～40s；（4）一次提取：将粉碎的海棠果放入超声设备中,加入料液比为1:8～1:15的乙醇溶液；加压超声处理,达到超声时间后,取出料液；（5）取料液：将料液在3000r/min下离心15-25min,通过吸取装置吸取澄清料液；（6）二次提取：重复步骤（4）；（7）取料液：重复步骤（5），并将两次料液合并；（8）浓缩、回收：将合并的料液,利用旋转蒸发器进行真空浓缩,得到海棠多酚浓缩液；（9）纯化：将海棠多酚浓缩液经过固相萃取小柱,填充料为大孔共聚物,进行吸附,并用乙醇溶液进行洗脱,得海棠多酚洗脱液；（10）浓缩、干燥：利用真空浓缩仪对海棠多酚洗脱液进行真空浓缩，得到海棠果多酚提取物成品。积极效果：本发明的一种海棠果多酚冻干超声提取及固相萃取纯化的方法，操作方便、条件可控、提取定量准确、提取多酚纯度高，便于海棠果多酚的快速提取，在一定程度解决了海棠果多酚提取不易定量、纯度不高、操作不能精确控制的问题。适宜作为海棠果多酚提取方法应用。具体实施方式一种海棠果多酚的提取方法，其具体实施包括以下步骤：（1）原料预处理：将原料海棠果洗净、切碎为长宽高各不超过10mm的果粒；（2）冻干：将海棠果粒放入真空冻干机，在≤20pa、温度-45～-55℃条件下将海棠果粒真空冻干；（3）粉碎：将真空冻干海棠果粒用匀浆机粉碎，时间为20～40s；（4）一次提取：将粉碎的海棠果放入超声设备中,加入料液比为1:8～1:15的65％-85％乙醇溶液；加压超声处理,超声频率为99khz,超声功率为850w-1250w；超声时间为20～40min,超声温度为35℃～55℃,达到超声时间后,取出料液；（5）取料液：将料液在3000r/min下离心15-25min,通过吸取装置吸取澄清料液；（6）二次提取：重复步骤（4）；（7）取料液：重复步骤（5），并将两次料液合并；（8）浓缩、回收：将合并的料液,利用旋转蒸发器进行真空浓缩,得到海棠多酚浓缩液；（9）纯化：将海棠多酚浓缩液经过固相萃取小柱,填充料为大孔共聚物,进行吸附,并用80～100％甲醇溶液进行洗脱,得海棠多酚洗脱液；（10）浓缩、干燥：利用真空浓缩仪对海棠多酚洗脱液进行真空浓缩，得到海棠果多酚提取物成品。实施例：以窄叶海棠、扁果海棠和八棱海棠3份海棠果的果实为材料，见表1，将海棠果洗净、切碎为长宽高各不超过10mm的果粒，将海棠果粒放入真空冻干机，在≤20pa、温度-45～-55℃条件下将海棠果粒真空冻干，冻干后用匀浆机粉碎20～40s；将粉碎的海棠果各称取5.00g,放入超声设备中,设置3个料液比为1:5、1:10和1:15的65％-85％乙醇溶液；加压超声处理,超声频率为99khz,超声功率为850w-1250w；超声时间为20～40min,超声温度为35℃～55℃,达到超声时间后,取出料液；将料液在3000r/min下离心15-25min,通过吸取装置吸取澄清料液；重复超声提取和取料液，并将两次料液合并，将合并的料液,利用旋转蒸发器进行真空浓缩,得到海棠多酚浓缩液，设置两个纯化方式为固相萃取小柱和大孔吸附树脂进行吸附,并用80～100％甲醇溶液进行洗脱,得海棠多酚洗脱液，再利用真空浓缩仪对海棠多酚洗脱液进行真空浓缩，得到海棠果多酚提取物成品,用福林酚法测定所得多酚的质量，过程设置为单因素试验，不同料液比大孔共聚物纯化为一组，筛选出的料液比与两种纯化方式为一组，过程经定量检测相同质量海棠果所得多酚的质量。所得结果经方差分析，料液比间多酚得率1:10和1:15的较1:5差异显著，1:10和1:15间差异不显著，即料液比1:10和1:15的多酚提取得率最高，考虑成本则以料液比1:10为优，纯化方式大孔共聚物和大孔吸附树脂间差异显著，以大孔共聚物的多酚得率最高。综合以上形成海棠果多酚提取的方法。所形成的该方法在一定程度上解决了海棠果多酚不易定量的问题，提高了提取多酚的得率，为相关研究和生产提供解决方案。表1.3份苹果种质资源材料编号名称所属种1窄叶海棠m.angustifolia(ait.)michx.2扁果海棠m.platycarparehd.3八棱海棠m.robusta(carr.)rehd.表2.不同料液比海棠果多酚提取的比较表3.不同纯化方式对海棠果多酚得率比较当前第1页12