本发明涉及天然产物或原料加工领域，具体涉及一种茶多酚提取方法和应用。
背景技术：
茶多酚(teapolyphenols)是茶叶中多酚类物质的总称，包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。主要为黄烷醇(儿茶素)类，儿茶素占60-80％。儿茶素类主要由egc、dlc、ec、egcg、gcg、ecg等几种单体组成。类物质茶多酚又称茶鞣或茶单宁，是形成茶叶色香味的主要成份之一，也是茶叶中有保健功能的主要成份之一。研究表明，茶多酚等活性物质具解毒和抗辐射作用，能有效地阻止放射性物质侵入骨髓，并可使锶90和钴60迅速排出体外，被健康及医学界誉为“辐射克星”。据相关资料显示，茶叶中的茶多酚(主要是儿茶素类化合物)有以下功能：
1、防治心血管疾病降血脂、预防肝脏及冠状动脉粥样硬化；
2、提高免疫能力；
3、抗脂质过氧化，预防衰老；
4、对重金属盐和生物碱中毒的抗解作用；
5、防辐射损伤，减轻放疗的不良反应；
6、防龋固齿和清除口臭的作用；
7、助消化作用；
8、有助于美容护肤。
茶多酚在常温下呈浅黄或浅绿色粉末，易溶于温水(40℃一80℃)和含水乙醇中；稳定性极强，在ph值4—8、250℃左右的环境中，1.5个小时内均能保持稳定，在三价铁离子下易分解。1989年被中国食品添加剂协会列入gb2760-89食品添加剂使用标准，1997年列为中成药原料。
目前对茶多酚的主要提取方法有三种，一种是乙酸乙酯提取，另一种是水提取，还有就是用乙醇提取。用乙酸乙酯提取茶叶中的茶多酚，产品颜色淡黄，但是乙酸乙酯是有机溶剂，有一定的毒性，不环保，并且得率不高，只有20％左右；用水提取茶多酚，很环保，但是得率很低，约15％，而且所提得的茶多酚颜色深绿。用乙醇提取茶多酚，颜色金黄，收率较高约30％左右。
技术实现要素：
本发明所解决的现有技术问题是：现有的茶多酚的提取方法众多，利用有机溶剂乙酸乙酯提取，得率低且不环保；利用水提取虽然环保，但是得率很低；单纯利用乙醇提取，收率相对较高，但是仍然不能满足茶多酚的提取效率的要求。
为此，本发明针对以上问题，提出了一种新的茶多酚的提取方法，综合利用醇提取，水提取的优势，结合复合酶解，通过多手段结合，来提取茶多酚，极大的提高了茶多酚的提取产率。
茶叶中的有效成分多存在于茶叶植物细胞的细胞质中。在提取过程中，溶剂需要克服来自细胞壁及细胞间质的传质阻力，来获得更多的茶多酚。细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质等物质构成的致密结构，通过选用合适的酶对茶多酚粉末进行预处理，能分解构成细胞壁中的纤维素、半纤维素及果胶，从而破坏细胞壁的结构，使得细胞壁局部产生坍塌、溶解、疏松，从而减少溶剂提取时来自细胞壁和细胞间质的阻力，加快有效成分溶出细胞的速率，提高提取效率，缩短提取时间。而且通过酶解，可以作用于目标产物，改善目标产物的理化性质，提高其在提取溶剂中的溶解度，减少溶剂的用量，降低成本；也可改善目标产物的生理生化功能，从而提高其效用。然后将酶解产物利用清水和醇提取，可以保证提取效率，而且安全环保，无毒副作用。
具体来说，本发明提出了如下技术方案。
本发明提供了一种茶多酚的提取方法，包括如下步骤：
(1)向含有茶多酚的原料中加入水和酶，进行酶解，过滤得到滤饼和第一提取液；
(2)向滤饼中加入乙醇进行提取，过滤得到第二提取液；
(3)合并第一提取液和第二提取液，然后分离得到茶多酚。
优选的，以上所述的提取方法中，步骤(1)中所述酶选自果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶中的一种或两种以上。
优选的，以上所述的提取方法中，步骤(1)中所述酶选自果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶中的两种以上。
优选的，以上所述的提取方法中，步骤(1)中所述蛋白酶为中性蛋白酶。
优选的，以上所述的提取方法中，步骤(1)中酶的加入质量，相对于含有茶多酚的原料的重量百分比为0.1％-1％，优选为0.3％-0.7％。
优选的，以上所述的提取方法中，以含有茶多酚的原料计，对应于每克含茶多酚的原料，步骤(1)所用到的果胶酶为30-300u，或者纤维素酶为35-350u，或者半纤维素酶为5-50u，或者蛋白酶为50-500u。
优选的，以上所述的提取方法中，步骤(1)中酶解温度为25-50℃，优选30-40℃。
优选的，以上所述的提取方法中，步骤(1)中酶解时间为35-70小时，优选为45-60小时。
优选的，以上所述的提取方法中，步骤(1)酶解之后，在85-100℃温度下进行灭活，然后再过滤得到滤饼和第一提取液。
优选的，以上所述的提取方法中，步骤(1)中相对于含有茶多酚的原料，水的质量与含有茶多酚的原料的质量比为3:1-10:1。
优选的，以上所述的提取方法中，步骤(2)中向滤饼中加入以体积含量计纯度为50-90％的乙醇，优选加入以体积含量计纯度为60-80％的乙醇。
优选的，以上所述的提取方法中，步骤(2)中加入乙醇，循环提取两次以上；优选加入乙醇提取三次或四次。
优选的，以上所述的提取方法中，步骤(2)中加入乙醇提取的温度为50-70℃，优选为55-60℃。
优选的，所述的提取方法中，在步骤(3)将第一提取液和第二提取液浓缩，然后利用大孔树脂分离得到茶多酚纯品。
优选的，以上所述的提取方法中，所述大孔树脂选自d101、ab-8、x-5、lx-60或dm-130中的一种或几种，优选为d101。
优选的，以上所述的提取方法中，将第一提取液和第二提取液浓缩之前，进行活性炭脱色处理。
优选的，以上所述的提取方法中，所述茶多酚的提取率为35％以上，优选为35％-45％，纯化后的茶多酚纯度在98％以上。
本发明还提供了一种利用以上提取方法制备得到的茶多酚，所述茶多酚的纯度在98％以上，所述茶多酚中ec、egc、egcg和ecg的含量占到茶多酚含量的85％以上。
另外，本发明还提供了以上所述的茶多酚在制备抗病毒、抗过敏药物领域和美容护肤保健品领域中的应用。
本发明所取得的有益效果是：本发明通过酶法结合水提和乙醇提取，作用于目标产物，改善目标产物的理化性质，提高其在提取溶剂中的溶解度，减少溶剂的用量，降低成本；而且安全环保，无任何毒副作用。由本发明的提取方法提取茶多酚，可以极大的提高茶多酚的提取效率，并且提高茶多酚的纯度，降低了茶多酚提取的成本，具有很重要的经济价值。
附图说明
图1为制备茶多酚的工艺流程图。
具体实施方式
如上所述，本发明先利用酶解法将含有茶多酚的原料进行酶解，破坏细胞壁，并且在酶解的同时，利用水提取部分茶多酚，然后再利用乙醇进一步提取茶多酚，将提取液浓缩后得到茶多酚粗提物。然后利用大孔树脂纯化得到茶多酚纯品。需要说明的是，本发明的方法在提取时，尽量避免碱性环境、氧化剂与高温。而且因为茶多酚自身的性质，即在冷水中溶解度不大，容易成为牛奶状液体与水分层，而在热水和乙醇中的溶解度非常好，所以在特定温度下，进行水提和醇提，可以得到茶多酚纯品。采用大孔树脂，得到表没食子儿茶素(egc)、表儿茶素(ec)、表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)、表儿茶素没食子酸酯(ecg)等几种单体。
图1给出了本发明所提取的工艺流程图，将茶叶粉碎，加入水和酶进行酶解，在酶解的同时，利用水提取部分茶多酚，过滤得到第一提取液和滤饼，向滤饼中加入乙醇继续进行提取，过滤得到第二提取液，合并第一提取液和第二提取液，进行浓缩脱色处理，然后经过大孔树脂吸附，分段接收，得到不同分子量的茶多酚单体物质，浓缩后烘干得到茶多酚纯品。采用本发明的方法，可以利用含有茶多酚的原料提取茶多酚，包括各种含有茶多酚的茶叶，包括但不限于绿茶、乌龙茶、红茶等，例如铁观音、碧螺春、龙井绿茶、黄山毛峰等。所述含有茶多酚的茶叶可以直接通过商购得到。
本发明具体提供了如下技术方案：
本发明提供了一种茶多酚的提取方法，包括如下步骤：
(1)向含有茶多酚的原料中加入水和酶，在25-50℃下进行酶解，过滤得到滤饼和第一提取液，其中所述酶的加入质量，相对于含有茶多酚的原料的重量百分比为0.1％-1％；
(2)向滤饼中加入50％-90％体积浓度的乙醇进行提取2-6次，过滤得到第二提取液；
(3)合并第一提取液和第二提取液，然后分离得到茶多酚。
其中，加入乙醇提取之后，过滤得到第二提取液和滤饼，然后再向滤饼中加入乙醇进行提取，以此重复2-6次，优选3-4次。采用乙醇进行多次提取，可以将茶多酚里面的有效成分提出，其中每次乙醇用量不受限制，以能充分使滤饼形成浆液提取茶多酚即可，优选滤饼与乙醇的质量比例为(1:5)～(1:8)。注意在多次提取时，可以适当减少乙醇的用量。
同时，通过本发明的提取方法，制备得到的茶多酚的纯度在98％以上，茶多酚中ec、egc、egcg和ecg的含量占到茶多酚含量的85％以上。本发明方法制备得到的茶多酚，可以利用茶多酚的抗氧化性质，应用于制备各种药物或者保健品领域，包括抗癌药物、防治心血管疾病的药物、抗血栓的药物、防治脑中风的药物等。同时可以制备成保健品，提高机体的免疫调节能力和抗过敏能力等等。
下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式进行说明。本发明实施例中所用到的原料、仪器及厂家等见表1。
表1实施例中所用的原料、仪器及厂家
表2实施例中所用到的原料信息
实施例一
实施例一提供了一种茶多酚的提取与纯化工艺流程，包括如下实验步骤：
(1)取干燥的碧螺春茶叶，粉碎，制得茶叶粉。然后取茶叶粉50g，加水300ml，然后加入0.1g半纤维素酶和0.05g纤维素酶，搅拌均匀后于35℃保温48小时；
(2)升温到90℃灭活，搅拌10min后，过滤，得到第一提取液和滤饼；
(3)向滤饼中加入体积分数为70％浓度的乙醇300g，然后于60℃提取1h，过滤得到滤液和滤饼；继续向滤饼中加入体积分数为70％浓度的乙醇300g，然后于60℃提取1h，依此重复提取3次；合并滤液得到第二提取液；
(4)将第一提取液和第二提取液合并，用活性炭脱色得到脱色后的提取液，分2部分分别进行步骤(5)和(6)的处理；
(5)取出脱色后的部分提取液，直接在60℃下进行减压浓缩，并在60℃真空下干燥，得到部分茶多酚粗提物；根据取出的部分提取液占提取液总量的比例，计算得到粗提物质量，同时按照如下公式计算粗提物提取率：
粗提物提取率(％)＝(粗提物质量)÷(投料重量)×100％(ⅰ)
然后将干燥得到的茶多酚粗提物，利用hplc检测粗提物中茶多酚的质量。具体的测定条件和测定方法如下：
准确称取以上制备得到的茶多酚粗提物样品5mg，以乙腈为溶剂配成浓度为1mg/ml的样品溶液，经0.45μm微孔滤膜后备用。
色谱条件：色谱柱为依利特sinochromods-bp(4.6mm×200mm，5μm)；uv检测波长为293nm；流动相为a纯水，b乙腈，为改善峰形，采用梯度洗脱0～10min10％～100％b，10～15min100～10％b；进样量5μl；柱温为室温。
对照品：准确称取茶多酚标准品5mg，用乙腈配成一系列的浓度梯度标准品储备液，经0.45μm微孔滤膜后进样，得到不同浓度的对照标准品。
采用hplc的方法计算得到的茶多酚主质量，然后利用如下公式计算粗提物中茶多酚主含量：
粗提物中茶多酚主含量(％)＝(粗提物中茶多酚主质量)÷(进样质量)×100％(ⅱ)
(6)取出脱色后的部分提取液，然后在60℃下减压浓缩去除80％的液体，将剩余液体通过d101大孔树脂分离提纯20min，得到纯化后的茶多酚，在60℃真空下干燥得到纯化后茶多酚主质量。然后取纯化后茶多酚5mg，然后按照步骤(5)所示的hplc的方法测定茶多酚的含量，然后利用如下公式计算得到纯化后茶多酚主含量：
纯化后茶多酚主含量(％)＝(hplc检测的纯化后茶多酚主质量)÷(进样质量)×100％(ⅲ)
实验平行测定三次，然后分别取平均值，测定结果见下表3。
实施例二
实施例二提供了一种茶多酚的提取与纯化工艺流程，包括如下实验步骤：
(1)取干燥的碧螺春茶叶，粉碎，制得茶叶粉。然后取茶叶粉50g，加水300ml，然后加入0.1g果胶酶、0.1g纤维素酶、0.1g半纤维素酶和0.1g蛋白酶，搅拌均匀后于40℃保温60小时；
(2)升温到90℃灭活，搅拌10min后，过滤，得到第一提取液和滤饼；
(3)向滤饼中加入体积分数为80％浓度的乙醇300g，然后于55℃提取0.5h，过滤得到滤液和滤饼；继续向滤饼中加入体积分数为80％浓度的乙醇300g，然后于60℃提取0.5h，依此重复提取4次；合并滤液得到第二提取液；
(4)将第一提取液和第二提取液合并，用活性炭脱色得到脱色后的提取液，分2部分分别进行步骤(5)和(6)的处理；
(5)取出脱色后的部分提取液，直接在60℃下进行减压浓缩，并在60℃真空下干燥，得到部分茶多酚粗提物；根据取出的部分提取液占提取液总量的比例，计算得到粗提物质量，按照与实施例一相同的方法计算得到粗提物提取率。
然后将干燥得到的茶多酚粗提物，利用与实施例一相同的方法检测粗提物中茶多酚的质量。并按照与实施例一相同的公式计算粗提物中茶多酚主含量。
(6)取出脱色后的部分提取液，然后在60℃下减压浓缩去除80％的液体，将剩余液体通过d101大孔树脂分离提纯20min，得到纯化后的茶多酚，并在60℃真空下干燥得到纯化后茶多酚主质量。然后按照与实施例一相同的方法和公式，计算纯化后茶多酚主质量以及纯化后茶多酚主含量。
测定结果见表3。
实施例三
实施例三提供了一种茶多酚的提取与纯化工艺流程，包括如下实验步骤：
(1)取干燥的碧螺春茶叶，粉碎，制得茶叶粉。然后取茶叶粉50g，加水300ml，然后加入0.1g果胶酶、0.1g纤维素酶、0.1g半纤维素酶和0.2g蛋白酶，搅拌均匀后于25℃保温70小时；
(2)升温到90℃灭活，搅拌10min后，过滤，得到第一提取液和滤饼；
(3)向滤饼中加入体积分数为90％浓度的乙醇300g，然后于70℃提取1.5h，过滤得到滤液和滤饼；继续向滤饼中加入体积分数为90％浓度的乙醇300g，然后于70℃提取1.5h，依此重复提取3次；合并滤液得到第二提取液；
(4)将第一提取液和第二提取液合并，用活性炭脱色得到脱色后的提取液，分2部分分别进行步骤(5)和(6)的处理；
(5)取出脱色后的部分提取液，直接在60℃下进行减压浓缩，并在60℃真空下干燥，得到部分茶多酚粗提物；根据取出的部分提取液占提取液总量的比例，计算得到粗提物质量，按照与实施例一相同的方法计算得到粗提物提取率。
然后将干燥得到的茶多酚粗提物，利用与实施例一相同的方法检测粗提物中茶多酚的质量。并按照与实施例一相同的公式计算粗提物中茶多酚主含量。
(6)取出脱色后的部分提取液，然后在60℃下减压浓缩去除80％的液体，将剩余液体通过x-5大孔树脂分离提纯20min，得到纯化后的茶多酚，并在60℃真空下干燥得到纯化后茶多酚主质量。然后按照与实施例一相同的方法和公式，计算纯化后茶多酚主质量以及纯化后茶多酚主含量。
测定结果见表3。
实施例四
实施例四提供了一种茶多酚的提取与纯化工艺流程，包括如下实验步骤：
(1)取干燥的碧螺春茶叶，粉碎，制得茶叶粉。然后取茶叶粉50g，加水300ml，然后加入0.1g果胶酶和0.1g纤维素酶，搅拌均匀后于50℃保温35小时；
(2)升温到90℃灭活，搅拌10min后，过滤，得到第一提取液和滤饼；
(3)向滤饼中加入体积分数为50％浓度的乙醇300g，然后于50℃提取2h，过滤得到滤液和滤饼；继续向滤饼中加入体积分数为50％浓度的乙醇300g，然后于50℃提取2h，依此重复提取2次；合并滤液得到第二提取液；
(4)将第一提取液和第二提取液合并，用活性炭脱色得到脱色后的提取液，分2部分分别进行步骤(5)和(6)的处理；
(5)取出脱色后的部分提取液，直接在60℃下进行减压浓缩，并在60℃真空下干燥，得到部分茶多酚粗提物；根据取出的部分提取液占提取液总量的比例，计算得到粗提物质量，按照与实施例一相同的方法计算得到粗提物提取率。
然后将干燥得到的茶多酚粗提物，利用与实施例一相同的方法检测粗提物中茶多酚的质量。并按照与实施例一相同的公式计算粗提物中茶多酚主含量。
(6)取出脱色后的部分提取液，然后在60℃下减压浓缩去除80％的液体，将剩余液体通过ab-8树脂分离提纯20min，得到纯化后的茶多酚，并在60℃真空下干燥得到纯化后茶多酚主质量。然后按照与实施例一相同的方法和公式，计算纯化后茶多酚主质量以及纯化后茶多酚主含量。
测定结果见表3。
实施例五
实施例五提供了一种茶多酚的提取与纯化工艺流程，包括如下实验步骤：
(1)取干燥的碧螺春茶叶，粉碎，制得茶叶粉。然后取茶叶粉50g，加水300ml，然后加入0.1g果胶酶、0.2g纤维素酶、0.1g半纤维素酶和0.1g蛋白酶，搅拌均匀后于55℃保温4小时；
(2)升温到90℃灭活，搅拌10min后，过滤，得到第一提取液和滤饼；
(3)向滤饼中加入体积分数为70％浓度的乙醇300g，然后于80℃提取1h，过滤得到滤液和滤饼；继续向滤饼中加入体积分数为70％浓度的乙醇300g，然后于60℃提取1h，依此重复提取3次；合并滤液得到第二提取液；
(4)将第一提取液和第二提取液合并，用活性炭脱色得到脱色后的提取液，分2部分分别进行步骤(5)和(6)的处理；
(5)取出脱色后的部分提取液，直接在60℃下进行减压浓缩，并在60℃真空下干燥，得到部分茶多酚粗提物；根据取出的部分提取液占提取液总量的比例，计算得到粗提物质量，按照与实施例一相同的方法计算得到粗提物提取率。
然后将干燥得到的茶多酚粗提物，利用与实施例一相同的方法检测粗提物中茶多酚的质量。并按照与实施例一相同的公式计算粗提物中茶多酚主含量。
(6)取出脱色后的部分提取液，然后在60℃下减压浓缩去除80％的液体，将剩余液体通过d101大孔树脂分离提纯20min，得到纯化后的茶多酚，并在60℃真空下干燥得到纯化后茶多酚主质量。然后按照与实施例一相同的方法和公式，计算纯化后茶多酚主质量以及纯化后茶多酚主含量。
测定结果见表3。
实施例六
实施例六提供了一种茶多酚的提取与纯化工艺流程，包括如下实验步骤：
(1)取干燥的碧螺春茶叶，粉碎，制得茶叶粉。然后取茶叶粉50g，加水300ml，然后加入0.1g果胶酶、0.1g纤维素酶和0.1g蛋白酶，搅拌均匀后于35℃保温48小时；
(2)升温到90℃灭活，搅拌10min后，过滤，得到第一提取液和滤饼；
(3)向滤饼中加入体积分数为15％浓度的乙醇300g，然后于80℃提取2h，过滤得到滤液和滤饼；继续向滤饼中加入体积分数为15％浓度的乙醇300g，然后于80℃提取2h，依此重复提取3次；合并滤液得到第二提取液；
(4)将第一提取液和第二提取液合并，用活性炭脱色得到脱色后的提取液，分2部分分别进行步骤(5)和(6)的处理；
(5)取出脱色后的部分提取液，直接在60℃下进行减压浓缩，并在60℃真空下干燥，得到部分茶多酚粗提物；根据取出的部分提取液占提取液总量的比例，计算得到粗提物质量，按照与实施例一相同的方法计算得到粗提物提取率。
然后将干燥得到的茶多酚粗提物，利用与实施例一相同的方法检测粗提物中茶多酚的质量。并按照与实施例一相同的公式计算粗提物中茶多酚主含量。
(6)取出脱色后的部分提取液，然后在60℃下减压浓缩去除80％的液体，将剩余液体通过d101大孔树脂分离提纯20min，得到纯化后的茶多酚，并在60℃真空下干燥得到纯化后茶多酚主质量。然后按照与实施例一相同的方法和公式，计算纯化后茶多酚主质量以及纯化后茶多酚主含量。
测定结果见表3。
实施例七
实施例七提供了一种茶多酚的提取与纯化工艺流程，包括如下实验步骤：
(1)取干燥的碧螺春茶叶，粉碎，制得茶叶粉。然后取茶叶粉50g，加水300ml，然后加入0.2g果胶酶、0.1g纤维素酶、0.1g半纤维素酶和0.1g蛋白酶，搅拌均匀后于35℃保温48小时；
(2)升温到90℃灭活，搅拌10min后，过滤，得到第一提取液和滤饼；
(3)向滤饼中加入体积分数为30％浓度的乙醇300g，然后于60℃提取1h，过滤得到滤液和滤饼；继续向滤饼中加入体积分数为30％浓度的乙醇300g，然后于60℃提取1h，依此重复提取4次；合并滤液得到第二提取液；
(4)将第一提取液和第二提取液合并，用活性炭脱色得到脱色后的提取液，分2部分分别进行步骤(5)和(6)的处理；
(5)取出脱色后的部分提取液，直接在60℃下进行减压浓缩，并在60℃真空下干燥，得到部分茶多酚粗提物；根据取出的部分提取液占提取液总量的比例，计算得到粗提物质量，按照与实施例一相同的方法计算得到粗提物提取率。
然后将干燥得到的茶多酚粗提物，利用与实施例一相同的方法检测粗提物中茶多酚的质量。并按照与实施例一相同的公式计算粗提物中茶多酚主含量。
(6)取出脱色后的部分提取液，然后在60℃下减压浓缩去除80％的液体，将剩余液体通过d101大孔树脂分离提纯20min，得到纯化后的茶多酚，并在60℃真空下干燥得到纯化后茶多酚主质量。然后按照与实施例一相同的方法和公式，计算纯化后茶多酚主质量以及纯化后茶多酚主含量。
测定结果见表3。
表3不同实施例所制得的茶多酚的检测结果
从表3可以看出，利用本发明实施例一到实施例五的方法提取制备得到茶多酚，茶多酚粗提物提取率相较于实施例六和实施例七，提取率更高，均在30％以上，提取率甚至达到将近40％。而且能够保证粗提物中茶多酚的主含量在91％以上，纯化后茶多酚主含量在98％以上。因此，采用本发明的实施例中给出的方法，使得茶多酚产品的产率提高，可以降低茶多酚的提取成本。应用于生产时，可以极大的降低成本。实施例六和实施例七降低了提取时醇的浓度，导致所制备得到的粗提物的产率仅在25％左右，相较于实施例一到实施例五，提取率要低的多。实验过程中发现，乙醇提取的浓度对于茶多酚的提取效率非常关键。当乙醇浓度低时，提取率显著降低。本发明实施例给出的提取工艺，通过稍高浓度的乙醇可以极大的提高醇提的效率，大大降低茶多酚的提取成本，给生产带来极大的经济价值。
以上所述，仅是本发明实施的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等，均需要包含在本发明的保护范围之内。