一种基于纤维素酶辅助提取肉桂多酚的方法与流程

本发明属于肉桂多酚提取技术领域，尤其涉及一种基于纤维素酶辅助提取肉桂多酚的方法。

背景技术：

肉桂为樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥树皮，是我国卫生部公布的药食兼用植物材料，既在民间作为食用香料广泛使用，又在中医临床上作为药品使用。其味辛甘、大热，有补火助阳、引火归源、散寒止痛等功效。其所含化学成分有挥发油、酚类、有机酸、鞣质、多糖、甙、甾体、内脂、香豆精等。现代药理试验表明，肉桂多酚可增强胰岛素生物活性，具有降血糖及抗氧化等作用。纤维素酶是一组能够降解纤维素的酶的总称，可破坏细胞壁的致密结构，加速药材有效成分的溶出，因此纤维素酶在不少中草药有效成分的提取分离中都得到了应用。但目前尚未看到纤维素酶应用于肉桂多酚提取的相关报道。有文献报导了一种肉桂多酚的提取方法：Joseph等最早采用水煮法从肉桂中提取多酚。还有文献报导了一种肉桂多酚的提取方法：平华,张贵军等重复水煮法工艺,用正交法设计改良工艺条件,得到提取温度为60℃,加水量为12倍,提取时间为60min的结论。还有文献报导了一种肉桂多酚的提取方法：秦莹等采用乙醇-水混合溶剂体系提取,经多次实验得出乙醇与水的比例为10:90时提取效果最好的结论。还有文献报导了一种肉桂多酚的提取方法：Anderson等采用混合溶剂提取,后用LH-20葡萄糖凝胶柱分离,再通过液相制备柱的形式对肉桂多酚进行了提取、分离和鉴别。上述方法都存在不同程度的局限性。其中水提法简单无毒成本低易操作，是近年来常用的方法，但是其产率低是其最大的缺点，不适合大批量的生产，有必要开发一种更加简单易行且提取率增加的方法。

综上所述，现有的提取肉桂多酚的方法存在产率低，不适合大批量的生产。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于纤维素酶辅助提取肉桂多酚的方法，旨在解决现有的提取肉桂多酚的方法存在产率低，不适合大批量的生产的问题。

本发明是这样实现的，一种基于纤维素酶辅助提取肉桂多酚的方法，所述基于纤维素酶辅助提取肉桂多酚的方法加入占干燥肉桂粉总质量0.15％的纤维素酶酶解后加蒸馏水煎煮。

进一步，所述基于纤维素酶辅助提取肉桂多酚的方法，其特征在于，所述加入纤维素酶之前：

称取干燥肉桂粉，料液比1：25，pH5.2。

进一步，所述加蒸馏水煎煮后滤液合并后浓缩，得浸膏。

进一步，所述基于纤维素酶辅助提取肉桂多酚的方法提取温度100℃，提取时间60min。

进一步，于30℃条件下酶解60min后加蒸馏水煎煮。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述基于纤维素酶辅助提取肉桂多酚的方法的肉桂多酚提取方法。

本发明提供的基于纤维素酶辅助提取肉桂多酚的方法，用正交试验法对纤维素酶解法辅助提取肉桂多酚的工艺进行了优化，为研究开发肉桂提供科学依据。通过单因素及正交试验，对纤维素酶辅助提取肉桂多酚的工艺进行研究；确定肉桂多酚的最佳提取工艺参数为温度100℃、提取时间60min，料液比1:25、pH5.2，肉桂多酚的得率为3.23％，总多酚含量为35.2％，结果表明肉桂多酚有较强的抗氧化活性(IC50为41.02μg/mL)，浓度为200μg/mL时对羟自由基有最大清除率97.1％。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于纤维素酶辅助提取肉桂多酚的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的提取温度对得率的影响示意图。

图3是本发明实施例提供的提取时间对得率的影响示意图。

图4是本发明实施例提供的pH值对得率的影响示意图。

图5是本发明实施例提供的料液比对得率的影响示意图。

图6是本发明实施例提供的肉桂多酚和VC的还原能力测定示意图。

图7是本发明实施例提供的肉桂多酚对羟自由基的清除作用示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的基于纤维素酶辅助提取肉桂多酚的方法包括以下步骤：

S101：称取干燥肉桂粉，料液比1：25，pH5.2；

S102：加0.15％纤维素酶于30℃条件下酶解60min后加蒸馏水煎煮，提取温度100℃，提取时间60min，滤液合并后浓缩，得其浸膏。

下面结合试验对本发明的应用原理作详细的描述。

l材料与方法

1.1材料、试剂与设备

肉桂：产地广西，经宜春学院陈武教授鉴定为樟科植物肉桂(Cinnamomum cassia Presl)的干燥树皮，洗净、干燥、粉碎备用。

纤维素酶：北京双旋微生物培养基制品厂生产，活性1200IU/g；没食子酸对照品：中国药品生物制品检定所；Folin-Ciocalteus phenol reagent：Sigma公司；碳酸钠：分析纯，天津市大茂化学试剂厂。

紫外分光光度计：美国尤尼克公司，UV-2000；数显恒温水浴锅：江苏省金坛市环宇科学仪器厂，HH-6；电热恒温干燥箱：上海精密仪器仪表有限公司，DHG-9023A；旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂，RE-3000；电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司，BSA223S；离心机：上海安亭科学仪器厂，TGL-16。

1.2方法

1.2.1多酚标准曲线的制作

精密称取没食子酸10mg，置100mL量瓶中，加入超纯水制成0.1mg/ml的溶液，作为对照品溶液。分别精确吸取1mL对照品溶液或样品溶液，加1mL1mol/L的Folin-ciocalteu显色剂，然后加入1mol/L Na₂CO₃溶液3mL，混匀，室温静置15min，反应液用蒸馏水定容至10mL，于725nm处测定其吸光度值。用1mL蒸馏水代替对照品溶液，同法操作作为空白溶液。其线性回归方程为：Y＝7.0457X--0.0433(R²＝0.9959)。

1.2.2肉桂多酚的制备

精密称取干燥肉桂粉，加0.15％纤维素酶于30℃、pH4.5条件下酶解60min后加蒸馏水煎煮，滤液合并后浓缩，得其浸膏，按绘制标准曲线的方法操作，测定总多酚含量并计算总多酚得率。

1.2.3单因素试验及正交实验

在肉桂多酚的提取过程中，以提取温度、提取时间、料液比、pH值为主要因素进行单因素试验及正交实验。

1.2.4肉桂多酚抗氧化活性研究

1.2.4.1还原能力的测定

吸取不同质量浓度的肉桂多酚水溶液lmL，依次加入0.2mol/L的PBS溶液(pH6.6)2.5mL、1％的K₃[Fe(CN)₆]溶液l mL，混匀后50℃水浴保温20min，流水冷却，加入l0％的TCA溶液5mL，混匀后静置10min，加入0.1％的FeC1₃溶液0.5mL最后加蒸馏水2.5mL，混匀静置l0min，在波长700nm处测吸光度，以蒸馏水作为空白。用相同质量浓度的VC溶液为对照。

1.2.4.2对羟自由基清除率的测定

吸取不同质量浓度的肉桂多酚溶液2mL，加入2mL 6mmol/L FeSO₄、2mL6mmol/L水杨酸-乙醇溶液和2mL 6mmol/L H₂O₂溶液，37℃恒温反应30min，然后在波长510nm处测定吸光度，并按相同方法测定未加入肉桂多酚的溶液吸光度A₀，未加入H₂O₂的溶液的吸光度A_x0，均以蒸馏水为参比溶液。

OH清除率(％)＝[A₀-(A_x-A_x0)]/A₀×100％

2结果与分析

2.1提取温度的影响

选择料液比为1：10，提取时间1小时，自然pH的条件下，提取温度对肉桂总多酚得率的影响见图2。

由图2可见，随着提取温度的升高，肉桂总多酚得率不断增高。当提取温度达到100℃时得率最高。所以，提取温度100℃为好。

2.2提取时间的影响

选择料液比为1：10，提取温度100℃，自然pH的条件下，提取时间对肉桂总多酚得率的影响见图3。

由图3可见，随着肉桂总多酚提取时间的延长，肉桂总多酚的得率出现上升，60min达到最高，此后缓慢下降。因此最佳提取时间为60min。

2.3pH值的影响

在提取温度100℃，提取时间60min，料液比1：10时，不同pH的条件对肉桂总多酚得率的影响见图4。

由图4可见，随着pH值的升高肉桂总多酚得率缓慢上升，pH5.0时达到最高，此后迅速下降，pH7.0时得率几乎只有最高值的一半。因此，弱酸性环境有利于肉桂多酚的提取，最佳提取pH为5.0。

2.4料液比的影响

在提取温度100℃，提取时间60min，pH5.0的条件下不同料液比对肉桂总多酚得率的影响见图5。

由图5可见，随着溶剂量的增加，提取效果不断增高，当料液比为1：50时，肉桂总多酚得率最高，但当料液比超过1：16时，肉桂总多酚得率增加较小，综合考虑成本因素选择1：16作为提取的最佳料液比。

2.5正交试验设计

根据单因素试验结果，选取提取温度、提取时间、料液比、pH值为考察因素，各取3个水平，选用L₉(3⁴)正交表进行试验。以肉桂总多酚得率为指标，正交试验水平因素见表1，试验结果见表2。

表1正交试验因素水平表

表2 L₉(3⁴)正交试验设计及结果

由表2可知，4个因素对总多酚得率的影响主次顺序为：C>D>A>B即：料液比>pH值>提取温度>提取时间；最佳工艺参数为C₃D₂A₃B₂，即：料液比为1：25，pH5.0，提取温度100℃，提取时间60min。经验证试验表明：加水量为肉桂粉的25倍，pH5.2，提取温度100℃，提取时间60min平均进行3组，测得肉桂总多酚的平均得率为3.23％，其RSD为0.51％，总多酚含量为35.2％，优选条件的重现性良好。

2.6方差分析

由表3方差分析结果表明：由F比可知各因素对试验结果影响的程度是料液比>pH值>温度>提取时间，即影响最大的是料液比，其次是pH值，然后是提取温度、提取时间，这与上面结果分析一致。

表3方差分析

2.7肉桂多酚抗氧化活性测定

2.7.1肉桂多酚的还原能力

还原能力是抗氧化性强弱的重要指标，因此可通过对还原能力的测定了解肉桂多酚抗氧化活性的大小。

由图6可知，肉桂多酚和VC的还原能力均随浓度的增大而增强，在相同质量浓度的条件下，肉桂多酚的还原力强于VC，说明肉桂多酚有较强的还原能力，其IC₅₀(A_700nm为0.5时的样品质量浓度)为41.02μg/mL。

2.7.2对羟自由基的清除

由图7可知。肉桂多酚对羟自由基具有明显的清除作用，在多酚质量浓度为25μg/mL～200μg/mL时，清除率随质量浓度的增加而增大，在200μg/mL时有最大清除率97.1％，说明肉桂多酚是一种有效的羟自由基清除剂。

3结论

经上述研究表明：纤维素酶辅助提取肉桂多酚工艺合理可行、操作简便、成本较低、效果较好，总多酚得率较高。料液比、pH值、提取温度、提取时间4个因素对总多酚得率有较大影响。料液比是影响提取率的主要因素，pH值是居中因素，提取温度、提取时间是次要因素，经单因素试验和正交试验对提取工艺的优化，肉桂多酚最佳提取工艺条件为为料液比1：25，pH5.2，提取温度100℃，提取时间60min。肉桂总多酚得率为3.23％，总多酚含量为35.2％。

抗氧化试验表明，肉桂多酚的还原能力随浓度的增大而增强，在相同的质量浓度条件下，肉桂多酚的还原力要强于VC；肉桂多酚对羟自由基的最大清除率为96.3％，具有良好的清除作用，并有明显的量效关系。因此，肉桂多酚有望开发成为一种优良的天然抗氧化剂。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。