专利名称：一种苯丙噻吩衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于化工领域及医药领域，涉及2- ({6_[ (3-羰基-4，5，6，7_四氢苯丙 噻吩-2-基)氨基]-6-氧代乙酰}胺)_4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻吩-3-甲酸在制备抗肿 瘤药物中的应用。
背景技术：
亲环素Cycliphilins(CyPs)是普遍分布的细胞内蛋白，在植物、细菌和哺乳 动物中均存在，具有高度保守性，最初是作为环孢素A的细胞受体被发现的。环孢素 A(CyclosporinA,CsA)是从真菌代谢产物中分离得到的含11个氨基酸的环状多肽，是一种 用于器官移植和自身免疫性疾病的免疫抑制剂，已被广泛用于临床，年销售额在50亿美元 以上。由于CsA用于临床以来表现出各种毒副作用，对患者及移植物存活率的影响越来越 引起人们的重视，许多科学研究者正在努力寻找与CsA作用类似的、毒副作用低的替代物。 目前CsA也已经开始用于肿瘤治疗当中，并且主要是与其它抗癌药物如紫杉醇、阿霉素、长 春新碱等搭配使用，增强这些药物的抗肿瘤活性(Clin Cancer Res. 11，2320-2326)。因为 环孢菌素A同时也是极为有效的免疫抑制剂，因此用于这些疾病的治疗时不可避免会带来 免疫抑制的副作用。克服免疫抑制的方法主要两种，一是对环孢菌素A的免疫抑制基团进 行修饰，或者从真菌中提取非免疫抑制的环孢菌素衍生物；另一种方法是根据CYP蛋白的 结构，筛选或设计新的非肽类小分子抑制剂。CyPs广泛分布于从微生物到哺乳动物的各类物种中。Cyclophilin A(CyPA)是首 先从牛的胸腺细胞中发现的CyP家族中第一个成员，并验证它具有PPIase活性(Science， 226,544-547 ；Nature 337,473-478)。重组人 T 细胞的 cyclophilinA(hCyPA)的三维 结构及它与CsA、四肽及一些二肽形成的复合物的三维结构已有报道(Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. Α. 88,9483-9487 ； J. Mol. Biol. 228,539-550 ； J. Mol. Biol. 234, 1119-1130.； Nature,353,276-279 ；Proc.Natl.Acad. Sci. U. S. A. 88,3324-3328；Biochemistry,35, 7362-7368)。CyPA与HIV相关蛋白质的复合物的结构也已报道(Cell，87，1285-1294 ； Structure 5，139-146)。CyP家族的其他成员与CyPA具有序列同源性及三维结构类似 的特性(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90，11850-11854 ；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 91， 5183-5186 ;J.Mol.Biol.331，45-56)。CyPJ是CyP家族的新成员，CYP-J cDNA长1. 25Kb，编码161个氨基酸，已从人的 胎脑cDNA文库中分离并鉴定(Cytogenet. Cell Genet. 92，231-236)。在氨基酸序列上与线 虫(C. elegans.) CYP10具有72%的同源性。其具体核苷酸和氨基酸序列详见NCBI网站上 基因登陆号为AF146799的基因报告。CYPJ蛋白能促进肝癌细胞的克隆形成率，可以促进肝 癌细胞物质的复制增殖，并且能促进肝癌肿瘤细胞生长，因此，可以作为筛选抗肝癌药剂的 靶标。恶性肿瘤已成为人类致死的最重要原因之一，但是目前市售的抗肿瘤药物均有各 种不良反应，因此，寻找新型的低副作用抗肿瘤药物成为生物医药领域的一大热点。
发明内容
本发明的目的是提供2- ({6_[ (3-羰基_4，5，6，7-四氢苯丙噻吩_2_基)氨 基]-6-氧代乙酰}胺)_4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻吩-3-甲酸的新的药物用途。具体涉及 2_ ({6-[ (3-羰基-4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻吩_2_基)氨基]_6_氧代乙酰}胺)-4，5，6， 7-四氢-1-苯丙噻吩-3-甲酸在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的抗肿瘤药物为针剂或者片剂。所述的抗肿瘤药物是抗肝癌药物或者抗肺癌 药物。本发明还提供了一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，即将2-({6-[(3_羰基_4，5，6， 7-四氢-1-苯丙噻吩-2-基)氨基]-6-氧代乙酰}胺)_4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻吩-3-甲 酸加入肿瘤细胞的培养液中。所述的肿瘤细胞可以是肝癌细胞或者肺癌细胞等。具体的说，所述的肿瘤细胞是 例如QGY细胞或者SK-Ifepl细胞的肿瘤细胞，或者例如SPCA-I细胞的肺癌细胞。加入FDl 的具体方法可以采用实施例4中所采用的方法，或者其它常规的操作。本发明的2-({6-[ (3-羰基-4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻吩-2-基)氨基]-6-氧 代乙酰}胺)_4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻吩-3-甲酸(即 2-({6-[(3-carboxy-4,5,6, 7-tetrahydro-l-benzothien-2-yl)amino]-6-oxohexanoyl}amino)—4，5,6,7-tetrahydro -l-benzothiophene-3-carboxylic acid)，在本发明中简称为 FDl0本发明的2- ({6-[ (3-羰基-4，5，6，7_四氢苯丙噻吩_2_基)氨基]_6_氧代 乙酰}胺)_4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻吩-3-甲酸，其分子量为504. 63，结构式为 其相关信息如下化合物Id :AE-848/37174063，MDL 号MFCDO1464830，分子式C24H28N206S2。先前对于本发明的FDl的研究主要集中在其是一种CypJ抑制剂，BIAcore分子 互作仪验证其能与CypJ结合，其平衡-解离常数KD(M) :6.97Χ10_5。其次，通过α-胰 凝乳蛋白酶活性测定法(α -chymotrypsin-coupled enzymic assay)测得本发明的 2_ ({6-[ (3-羰基-4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻吩_2_基)氨基]_6_氧代乙酰}胺)-4，5，6， 7-四氢-1-苯丙噻吩-3-甲酸，其酶活抑制IC50值(μΜ)为74. 8士 1.44。进一步的研究表明，本发明的CypJ小分子抑制剂FDl对肿瘤细胞生长有抑制作 用。
本发明测定了 FDl对肿瘤细胞的杀伤情况，结果显示，FDl对肿瘤细胞SK-Ifepl和 SPCA-I细胞有一定程度的杀伤力。此外，FDl还能够有效降低QGY细胞的克隆形成率。因此，本发明的FDl能够抑制CYPJ的活性或者表达量，对于CYPJ表达量高的肿瘤 细胞杀伤效果更好。本发明的小分子化合物可以采用各种常规的制备方法制备。例如，采用人工化学 合成的方法。利用本发明小分子化合物，通过各种常规筛选方法，可筛选出与FDl发生相互作 用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。本发明及其抑制剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效 果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH 通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而 有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌 内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。以本发明的FDl为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组 合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限 于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发 明的人FDl可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过 常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物 组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量， 例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的FDl还可与其他治 疗剂一起使用。当本发明的FDl被用作药物时，可将治疗有效剂量的FDl施用于哺乳动物，其中该 治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克 体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应 考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明提供了小分子化合物2-({6-[(3_羰基-4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻 吩-2-基)氨基]-6-氧代乙酰}胺)-4，5，6，7_四氢-1-苯丙噻吩-3-甲酸在制备抗肿瘤 药物中的应用。该化合物能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。FDl是针对细胞靶点CYPJ设计 的药物，不易形成耐药性，而且，对于高表达CYPJ蛋白的肿瘤细胞效果特别明显。因此，本 发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物进行开发，抑瘤效果明显，特异性好。因此，本发 明的FDl可以作为新的抗肿瘤药物进行开发，为治疗和治愈肿瘤提供了一种新的途径和手 段。
具体实施例方式实施例ICypJ小分子抑制剂的虚拟筛选在PDB蛋白结构数据库中，检索到了人类CYPA蛋白的X光衍射晶体结构(PDB代 码-ACWA)。这个结构是CYPA与其天然抑制剂环孢菌素A(CsA)的复合物晶体结构。从这 个结构中，确定了 CYPA的活性位点，并且确定了活性位点中，能够被CsA所抑制的若干关 键氨基酸位点。根据CYPJ与CYPA高度同源的序列，我们与中国科学院上海药物所合作，
5建立了 3D结构模型，并且在此后的蛋白结晶及结构解析时也得到了证实(CYPJ PDB代码 1XYH)。针对CypJ活性位点，对若干小分子数据库进行了筛选。用于筛选的小分子数据库 主要包括SPECS和CNPD。最后筛选到了本发明的FD1。整个计算过程是在中科院上海药物 所64CPU-SGI 0RIGN3800计算机和上海超算中心392CPU-神威I超级计算机上进行的。实施例2利用BIAcore分子互作仪验证虚拟筛选结果BIAcore分子互作仪是基于表面等离子共振技术来实现跟踪生物分子间的相互作 用，无需任何标记物，因此最大限度的保证了实验结果的真实性。实验时，将目的生物分子 (CypJ蛋白)固定在传感芯片表面，然后将小分子化合物溶于溶剂并且流过芯片表面。监测 器能实时跟踪检测溶液中的分子与芯片表面目的生物分子结合、解离整个过程的变化。通 过BIAcore的结合数据，本发明的2- ({6-[ (3-羰基-4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻吩_2_基) 氨基]-6-氧代乙酰}胺)-4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻吩-3-甲酸与CypJ结合的平衡-解 离常数 KD (M) :6. 97X10_5。实施例3利用酶活实验证明小分子化合物对CypJ酶活抑制的能力测定CyP活性的方法很多，但以α _胰凝乳蛋白酶活性测定法 (α-chymotrypsin-coupled enzymic assay)最常用。其原理是含脯氨酸的寡肽底物，如 N-琥拍酰-Ala-Ala-Pro-Phe 对硝基苯胺(N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Ph印-nitroanilide) 在溶液中其顺式、反式结构处于平衡，CyP能催化该底物发生顺反异构作用，即催化脯氨酸 由顺式变为反式；当其处于反式结构时，C端p-nitroanilide被α-胰凝乳蛋白酶裂解，释 放出色素基团对硝基苯胺，在390nm连续测定吸光值的变化即可得知CyP的PPIase活性。本发明以不加小分子抑制剂的反应作为对照反应，测定小分子配体在不同浓度下 对酶活反应的抑制率，从而计算出小分子配体的IC5tl值。本发明的2-({6-[(3-羰基-4， 5,6,7-四氢-1-苯丙噻吩-2-基)氨基]-6-氧代乙酰}胺)-4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻 吩-3-甲酸(Interchim公司)其酶活抑制IC50值(μ M)为71. 4士2. 35。实施例4MTS法测定FDl对肿瘤细胞的生长抑制作用人肝癌细胞株SK-Ifepl细胞(ATCC公司)3X IO3/孔接种至96孔板，培养24小 时使之贴壁后加入FDl (Interchim公司)，设6个浓度梯度，每个浓度设3个复孔。细胞在 37°C,5%C02条件下培养72小时后，倒掉培养液，用MTS试剂盒(Promega公司)测定细胞 存活率，测试方法为将细胞用无血清培养基洗一遍，按照ΙΟΟμ I/well的量加入预先配制 好的MTS显色溶液(IOml无血清培养基中加入2ml溶液1和100 μ 1溶液2，充分混勻)。将 一个没有细胞的孔设为本底孔，用以校正溶液的背景光吸收。把细胞放入细胞培养箱中继 续培养2 4小时，然后用酶标仪读取光吸收值(参考波长630-700nm，测定波长490nm)， 计算细胞存活率，以测定孔光吸收值/对照孔光吸收值作为细胞存活率的数值。结果加入了 2-({6-[(3_羰基-4，5，6，7_四氢-1-苯丙噻吩-2-基)氨基]_6_氧 代乙酰}胺)-4，5，6，7_四氢-1-苯丙噻吩-3-甲酸后，SK-Ifepl细胞的数量约为对照的 70%。用同样的方法处理SPCA-I细胞，结果SPCA-I细胞的数量约为对照的75%。实施例5FD1对克隆形成率的影响QGY细胞(ATCC公司)1000个/皿接种于60mm细胞培养皿，一组加入FDl，另一组 加入DMSO作为对照。连续培养15-20天时间，中间酌情换液。用室温1 XPBS洗一次，加2ml预冷的甲醇4°C固定lOmin。弃去固定用的甲醇，用预冷的1 XPBS洗一次，加GIMESA染 色剂，室温染色lOmin，清水洗3遍，去浮色，拍照、计数。 根据细胞数目确定克隆大小，大于200个细胞的称为大克隆，100-200个细胞之间 的称为中克隆，50-100个细胞之间的称为小克隆。比较大中克隆之间的差异，重复2次每 次三皿取平均值，加入FDl后QGY细胞所形成的克隆数显著少于加入DMSO后所形成的克隆 数。这些结果提示，FDl能抑制细胞克隆形成。
权利要求
2 ({6 [(3 羰基 4，5，6，7 四氢 1 苯丙噻吩 2 基)氨基] 6 氧代乙酰}胺) 4，5，6，7 四氢 1 苯丙噻吩 3 甲酸在制备抗肿瘤药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗肝癌药物。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抗肿瘤药物是抗肺癌药物。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，该抗肿瘤药物为针剂或者片剂。
5.一种抑制肿瘤细胞增殖的方法，其特征在于，将2-({6-[(3_羰基-4，5，6，7-四 氢-1-苯丙噻吩-2-基)氨基]-6-氧代乙酰}胺)-4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻吩-3-甲酸 加入肿瘤细胞的培养液中。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是肝癌细胞或者肺癌细胞。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是H印G2细胞或者SK-Hepl 细胞。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞是SPCA-I细胞。
全文摘要
本发明属于基因工程和化学领域，涉及FD1在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明提供了小分子化合物2-({6-[(3-羰基-4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻吩-2-基)氨基]-6-氧代乙酰}胺)-4，5，6，7-四氢-1-苯丙噻吩-3-甲酸(FD1)在制备抗肿瘤药物中的应用。该化合物能够明显抑制肿瘤细胞的增殖。FD1是针对细胞靶点CYPJ设计的药物，不易形成耐药性，而且，对于高表达CYPJ蛋白的肿瘤细胞效果特别明显。因此，本发明的小分子化合物作为新的抗肿瘤药物进行开发，抑瘤效果明显，特异性好。
文档编号A61P1/16GK101919842SQ20091005290
公开日2010年12月22日 申请日期2009年6月11日 优先权日2009年6月11日
发明者余龙, 张明君, 陈帅 申请人:复旦大学