专利名称：N-[(2,3-二-2-呋喃喹啉-6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲醇在制备抗艾滋病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，涉及一种具有抗HIV活性的小分子化合物在制备 抗艾滋病药物中的应用。
背景技术：
人类免疫缺陷病毒(hiv)是一类特殊的逆转录病毒。它具有高度的变异性， 能特异地感染并杀伤主要免疫细胞群，能诱生增强性抗体。近年来，由于对hiv 感染的发病原因有了更多的了解，人们研制了新的更有效的药物，如蛋白酶抑制 剂(Pi)和非核苷类逆转录酶抑制剂(rmrti)。常用的抗hiv药物作用机制及应用 简述如下。
一、 蛋白酶抑制剂
蛋白酶抑制剂pi的作用机制蛋白酶对于gag， gagpol多聚蛋白和翻译后 加工、形成病毒核心的结构蛋白以及其他基本的酶类，都是十分必要的。hiv病 毒进入血液后，病毒表面的包膜蛋白gpl20和cd+4t淋巴细胞表面的cd4受体 结合，在gp41透膜蛋白的作用下，侵入细胞并脱壳。pi通过结合到病毒的蛋白 酶上,使病毒蛋白的长链不能裂开，病毒便不能发育成熟以至不再具有感染能力。 pi的临床应用现在应用于临床的pi主要有沙奎那韦、茚地那韦、利托那韦、 奈非那韦、安普那韦、替普那韦。还有一种新药bms232632正在进行临床试验， 它是具有二芳香取代基的氮杂二肽药物。
二、 核苷类逆转录酶抑制剂
核苷类逆转录酶抑制剂nrti的作用机制此类药是临床应用种类最多的一 类，大约有9种，包括azt, 3tc、去羟肌苷(didanosine， ddi)、扎西他滨 (zalcitabine， ddc〉、司他夫定(stavudine, d4t)、阿巴卡韦(abacavir)、阿迪 佛韦(adefovirdipivoail， pmea)、替诺佛韦(tenofovir， pmpa)及氟代拉米夫定 (ftc)等。azt、 ddc、 ddi、 d4t、 3tc及ftc均为双脱氧核苷(ddns)，它们对hiv一l复制的抑制是通过模拟核酸以阻止病毒dna双链的复制，对病毒而言，它们 缺乏必要的化学结构而不能连接后面的核酸。azt和d4t是病毒核酸天然底物脱
氧胸苷dt的类似物；ddc， 3tC和ftC是脱氧胞苷dc的类似物；ddi在吸收及磷
酸化前转换成双脱氧胸苷dda，因此可视为脱氧腺苷da类似物，这些双脱氧核 苷三磷酸盐是hiv—l逆转录酶竞争抑制剂。pmea、 pmpa为无环的核苷酸盐化合 物，它们也是通过未成熟病毒dna链的终结来抑制病毒复制。此外，pmea还有 免疫调节活性，如激活自然杀伤细胞(nk)和诱生干扰素的作用。阿巴卡韦通过独 特的细胞途径磷酸化为羟基环化三磷酸鸟苷，后者可终止病毒dna复制。
三、 非核苷类逆转录酶抑制剂
非核苷类逆转录酶抑制剂nnrti的作用机制此类药物主要有奈韦拉平 (nevirapine)、地拉韦啶(delavirdine)和依法韦司(efavirens)。它们与核苷类 似物不同，是作用于酶本身，它们能结合到病毒逆转录酶的活性点，通过抑制酶， 阻止病毒复制到dna。在其活化过程中不涉及细胞内的磷酸化过程，因而能更有 效、更迅速地发挥抗病毒作用，其有效指数可达1000以上。
nnrti的临床应用此类药因诱导产生耐药株的速度很快，具有交叉耐药性， 不单一治疗，应与其他的抗逆转录酶病毒药联合使用，治疗hiv—l感染。在联 合用药和短期使时nnrti在下列情况下具有较好的效果阻止母婴传播；接触者 的预防；急性hiv感染的治疗。
四、 其他药物
高效抗逆转录酶病毒治疗(haart)能抑制hiv感染者的hiv病毒的复制，以 及恢复其免疫功能,但hi v—1病毒还是能存在于循环系统和剩余的cd4t细胞中。 近年的研究证明在haart中联用免疫治疗能加强t细胞的反应。在某些病例中， 停止使用常规的抗hiv感染药后，仍保持对hiv进行免疫控制。而免疫治疗的目 标是消除被hiv感染的寄生组织。基于免疫的治疗措施包括同种异体或同基因骨 髓移植、淋巴细胞输注、治疗疫苗与细胞因子输注等几种措施的联合应用。早期 治疗除短暂的迟发型超敏反应增强外，并未发现其他对临床有益的证据，但在 haart时代，基于免疫的多种治疗措施可望改变疾病的进程。
目前在细胞因子治疗中，研究最多的是白细胞介素2(il—2)，它可活化t 细胞分泌，调节淋巴细胞增殖和成熟。在治疗疫苗中，研究较广的是疫苗remune，它是缺损膜蛋白的灭活全病毒 疫苗，目的在于刺激免疫系统杀伤hiv感染的细胞。
本领域公认联合用药比单一用药疗效更明显，目前用得最多的是多药联用 的鸡尾酒疗法，典型的抗aids方案至少有3个药组成 一至两种pi或一种nnrti ， 与两种核苷类似物联合应用。从cd4淋巴细胞计数的提高与抑制病毒复制两方面 看，三重治疗优于双重治疗。抗hiv感染药的研究、临床应用取得的进展，对 aids的控制和治疗具有重大意义。但是即使是使用最有效的治疗方案，其治疗 愈只占治疗人数的20% 50%，疗效不佳。另外，病毒耐药性与耐药病毒变异 的情况越来越多，因此需进一步研究新药及探讨更好的治疗方案。
发明内容
本发明的目的是提供具有抗HIV活性的小分子化合物在制备抗艾滋病药物 中的应用。尤其涉及N- [(2,3-二-2-呋喃喹啉-6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲醇在 制备抗艾滋病药物中的应用。
该抗艾滋病药物可以为针剂或者片剂。即可以将有效治疗量的N- [(2,3_二 -2-呋喃喹啉-6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲醇与合适的药学上可接受的载体联用。
本发明还提供了一种抑制艾滋病毒的方法，即将N- [ (2， 3-二-2-呋喃喹啉 -6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲醇加入含有艾滋病病毒的溶液中。
上述方法中，加入的N- [(2，3-二-2-呋喃喹啉-6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲 醇终浓度不小于23u M。
本发明的N- [(2，3-二-2-呋喃喹啉-6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲醇尤其适用 于cyp表达量高、活性强的病毒毒株。
本发明提供的 一 种具有抗HIV活性的小分子化合物，N-[ (2, 3-di-2-furylquinoxalin-6-yl)amino](dimethylamino)methanol ( N-[(2, 3-二-2-呋喃喹啉-6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲醇)。简称为FD12。
FD12分子量为324，其结构式为
5本发明还包括对上述结构式所代表的化合物进行常规替代所得到的化合物。
鉴于抑制CypA活性的物质可能干扰HIV-1病毒的复制，本发明针对CypA的 活性位点设计了若干小分子抑制剂。由于是针对细胞耙点设计的药物，而细胞耙 点相对于病毒靶点来说突变速率相对较慢，因此不易形成耐药性，适合AIDS患者 终身用药的需求。
首先，本发明对CypA小分子抑制剂进行了虚拟筛选。
Cyclophilin A (CypA， PPIA)基因在人类基因组数据库中已经被登录，其录 入号为NM—021130。在PDB蛋白结构数据库中，检索到了人类CypA蛋白的X光衍 射晶体结构(PDB代码1CWA)。这个结构是CypA与其天然抑制剂环孢菌素A (CsA) 的复合物晶体结构。从这个结构中，确定了CypA的活性位点，并且确定了活性位 点中，能够被CsA所抑制的若干关键氨基酸位点。根据这些结构信息，本发明针 对CypA活性位点，对若干小分子数据库进行了筛选。用于筛选的小分子数据库主 要包括SPECS和CNPD。最后，筛选出了本发明的FD12。整个计算过程是在中科院 上海药物所64CPU-SGI ORIGN3800计算机和上海超算中心392CPU-神威I超级计 算机上进行的。
其次，本发明利用BIAcore分子互作仪验证虚拟筛选结果 BIAcore分子互作仪是基于表面等离子共振技术来实现跟踪生物分子间的相 互作用，无需任何标记物，因此最大限度的保证了实验结果的真实性。实验时， 将目的生物分子(CypA蛋白)固定在传感芯片表面，然后将小分子化合物溶于溶 剂并且流过芯片表面。监测器能实时跟踪检测溶液中的分子与芯片表面目的生物 分子结合、解离整个过程的变化。通过BIAcore的结合数据，最终确定了 12个能够与CypA发生结合的小分子化合物，并且计算出了这些小分子化合物与CypA结 合的平衡一解离常数KD。
再次，本发明利用酶活实验证明小分子化合物对CypA酶活抑制的能力，从而 寻找出CypA的抑制剂。
现有技术公开了有关测定CyP活性的方法，其中，以a-胰凝乳蛋白酶活性测 定法(a-chymotrypsin-coupled enzymic assay)最常用。其原理是含脯氨酸的 寡肽底物，如 N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe 对硝基苯胺 (N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phep-nitroanilide)在溶液中其顺式、反式结构处 于平衡，CyP能催化该底物发生顺反异构作用，即催化脯氨酸由顺式变为反式； 当其处于反式结构时，C端p-nitroanilide被a-胰凝乳蛋白酶裂解，释放出色 素基团对硝基苯胺，在390nm连续测定吸光值的变化即可得知CyP的PPIase活性。
本发明以不加小分子抑制剂的反应作为对照反应，测定各个小分子配体在不 同浓度下对酶活反应的抑制率，从而计算出各个小分子配体的ICs。值(nM)。结 果显示，本发明的FD12的ICs。值小于100，说明了本发明的FD12具有抑制CyP 的PPIase活性的作用。
最后，本发明还测定了 CypA小分子抑制剂对HIV—1病毒复制的影响。
化合物抗HIV-l病毒增值测试简单的说，就是利用双抗夹心法测定每个孔 内p24蛋白产生的量。以空白对照孔的光吸收值为参照，计算各个化合物抑制 HIV-1病毒p24蛋白的抑制率。结果显示，FD12具有抑制HIV—1病毒复制的能力， 可以作为新的抗艾滋病药物进行开发。利用FD12抑制HIV—1病毒，溶液中加入 的FD12终浓度不小于23 u M 。
本发明的小分子化合物通过购买可以获得,也可以采用各种常规的方法制备。 例如2, 3-(2-二呋喃)一6—氨基喹喔啉与二甲氨基甲酰氯以二氯甲烷为溶剂在室 温下迅速搅拌即可生成N-[(2,3- 2_二呋喃喹啉-6-基)氨基]-(N' ，N' -二甲氨 基)-甲酰胺。
上述得到的N-[(2，3- 2-二呋喃喹啉-6-基)氨基]-(N， ，N， -二甲氨基)-甲 酰胺经LiAlH/THF还原即可得目标化合物(即N- [(2， 3- 2-二呋喃喹啉-6-基) 氨基]-(二甲氨基)-甲醇)。
7本发明FD12及其抑制剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提 供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水 性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被 配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常 规途径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部 给药。
以本发明的FD12为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。该类 药物组合物含有治疗有效量的蛋白质和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体 包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物 制剂应与给药方式相匹配。本发明的FD12可以被制成针剂形式，例如用生理盐 水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之 类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和 胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克 /千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的FD12还可与其他治疗剂一起使 用。
本发明中，用FD12制备的抗艾滋病药物可以是针剂或者片剂。当本发明的 FD12被用作药物时，可将治疗有效剂量的该化合物施用于哺乳动物，其中该治疗 有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千 克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约l毫克/千克体重。当然，具体剂 量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
艾滋病(AIDS)是一种由艾滋病病毒，即人体免疫缺陷病毒(human imraunodeficiencyvirus，简称HIV)侵入人体后破坏人体免疫功能，使人体发 生多种不可治愈的感染和肿瘤，最后导致被感染者死亡的一种严重传染病。被称 为"当代瘟疫"和"超级癌症"的艾滋病已引起世界卫生组织(WHO)及各国政 府的高度重视，无论是人员和经费的投入均放在首位，我国已将其列入乙类法定 传染病，并为国境卫生监测传染病之一。然而，到目前为止，尚无可以治愈该病 的有效药物。本发明提供了N- [(2，3-二-2-呋喃喹啉-6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲醇在制备抗艾滋病药物中的应用。该化合物能够抑制CypA,其酶活抑制IC5。
8值(MM)达到3. 47±0. 92，对HIV-1病毒p24蛋白亦有明显抑制作用。将N- [(2, 3-二-2-呋喃喹啉-6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲醇加入含有艾滋病病毒的溶液中即 可抑制艾滋病病毒的复制。本发明的小分子化合物FD12具有抑制HIV—1病毒复 制的能力，而且是针对细胞靶点设计的药物，不易形成耐药性，适合AIDS患者 终身用药的需求。因此，本发明的FD12可以作为新的抗艾滋病药物进行开发，为 治疗和治愈艾滋病提供了一种新的途径和手段。
具体实施例方式
实施例1利用BIAcore分子互作仪验证虚拟筛选结果
BIAcore分子互作仪是基于表面等离子共振技术来实现跟踪生物分子间的相 互作用，无需任何标记物，因此最大限度的保证了实验结果的真实性。实验时， 将目的生物分子(CypA蛋白)固定在传感芯片表面，然后将小分子化合物溶于溶 剂并且流过芯片表面。监测器能实时跟踪检测溶液中的分子与芯片表面目的生物 分子结合、解离整个过程的变化。通过BIAcore的结合数据，我们最终确定了 12 个能够与CypA发生结合的小分子化合物，并且计算出了这些小分子化合物与CypA 结合的平衡一解离常数KD。本发明的FD12其平衡解离常数KD (M)为 KD=3.19±0. 22X10—6， Chi2=0.427。其中，Chf是BIAcore统计软件中用于检测实 验误差的一个数据。
实施例2利用酶活实验证明小分子化合物对CypA酶活抑制的能力 测定CyP活性的方法很多，但以a -胰凝乳蛋白酶活性测定法(a -chymotrypsin-coupledenzymic assay)最常用。其原理是含脯氨酸的寡肽底物， 如N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe对硝基苯胺(N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-nitroanilide)在溶液中其顺式、反式结构处于平衡，CyP能催化该底物发生 顺反异构作用，即催化脯氨酸由顺式变为反式；当其处于反式结构时，C端 p-nitroanilide被a-胰凝乳蛋白酶裂解，释放出色素基团对硝基苯胺，在390nm
连续测定吸光值的变化即可得知CyP的PPIase活性。
我们以不加小分子抑制剂的反应作为对照反应，测定各个小分子配体在不同 浓度下对酶活反应的抑制率，从而计算出各个小分子配体的ICs。值。本发明的FD12 其酶活抑制ICs。值(MM)为3.47士0.92。实施例3化合物抗HIV-1病毒增值测试
MT-2细胞种于96孔板中，每孔1(^个。培养基为含10X胎牛血清的RPMI 1640 培养基。HIV-1病毒以100个50X组织感染当量来感染细胞，同时加入不同浓度梯 度的化合物培养过夜(以不加化合物的孔为空白对照)。次日，更换不含小分子 化合物的新鲜培养基。第四天，取100uL培养液上清，加入5X体积的Triton—X100 处理后得到病毒裂解液，然后用ELISA方法测定p24蛋白含量(p24是HIV-l的外壳 蛋白，可以作为衡量病毒粒子数量的指标)。简单的说，就是利用双抗夹心法测 定每个孔内p24蛋白产生的量。将抗HIV免疫球蛋白包板过夜(pH 9. 6碳酸缓冲液， 4° C)，然后加入含4X脱脂奶粉的PBS封闭；加入100uL病毒裂解液后于37。 C孵 育1个小时，用预冷PBS冲洗若干次；加入辣根过氧化物酶标记的抗p24单克隆抗 体，用TMB显色一刻钟；然后加入1N的硫酸溶液终止反应，在酶标仪上读取450咖 时的光吸收值。
以空白对照孔的光吸收值为参照，计算各个化合物抑制HIV-l病毒p24蛋白 的抑制率。抑制率％ = [1 - (E - N)/(P - N)] X 100%。 E代表化合物存 在时P24+细胞数量,P和N分别代表阳性对照(不加化合物)和阴性对照(既
不加病毒也不加化合物)。
结果结果FD12抑制HIV-l病毒p24蛋白产生的IC5Q值如下(ug/ml): 25.34±2.11。
权利要求
1.N-[(2，3-二-2-呋喃喹啉-6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲醇在制备抗艾滋病药物中的应用。
2. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，所述的抗艾滋病药物含有有效治疗量的N- [(2， 3-二-2-呋喃喹啉-6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲醇与合适的药学上可接受的载体。
3. 如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，该抗艾滋病药物为针剂或者片剂。
4. 一种抑制艾滋病毒的方法，其特征在于，将N- [(2,3-二-2-呋喃喹啉-6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲醇加入含有艾滋病病毒的溶液中。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，加入的N- [(2,3-二-2-呋喃喹啉-6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲醇终浓度不小于23u M。
全文摘要
本发明属生物医药领域，涉及一种具有抗HIV活性的小分子化合物在制备抗艾滋病药物中的应用。本发明提供了N-[(2，3-二-2-呋喃喹啉-6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲醇在制备抗艾滋病药物中的应用。该化合物能够抑制CypA活性，其酶活抑制IC<sub>50</sub>值(μm)达到3.47±0.92，对HIV-1病毒p24蛋白亦有明显抑制作用。将N-[(2，3-二-2-呋喃喹啉-6-基)氨基]-(二甲氨基)-甲醇加入含有艾滋病病毒的溶液中即可抑制艾滋病病毒的复制。该化合物具有抑制HIV-1病毒复制的能力，而且是针对细胞靶点设计的药物，不易形成耐药性，适合AIDS患者终身用药的需求。
文档编号A61K31/4709GK101590056SQ20091005326
公开日2009年12月2日 申请日期2009年6月17日 优先权日2009年6月17日
发明者龙 余, 唐丽莎, 胡海荣, 赵雪梅, 帅 陈 申请人:复旦大学