一种喹噁啉-2-甲醛-1,4-二氧-亲和基质的制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物化学及层析领域，更具体涉及一种喹噁啉-2-甲醛-1,4-二 氧-亲和基质的制备方法，同时还涉及一种喹噁啉-2-甲醛-1，4-二氧-亲和基质的用途。
【背景技术】
[0002] 亲和层析技术（Affinity Chromatography, AC)是一种液相色谱方法，是利用生 物大分子与亲和色谱固定化配体之间存在的特异性吸附作用力，来进行选择性分离生物 大分子的方法（于世林，2008;Leslie et al.，2008)，是筛选配体结合蛋白的经典技术 (Hage, 1999)。亲和层析技术的最大优点在于它能够从粗提液中经过一次简单的处理便可 得到所需高纯度的活性物质（陈勇等，2001)。将药物分子固定到固相载体（如微珠）上， 与细胞蛋白质裂解液充分混合孵育，然后洗脱去除没有结合的蛋白质，再通过高离子强度 洗脱或是煮沸处理等方法将靶标蛋白与固相载体上的药物配体分离，这样上清液中的蛋 白质即为药物结合蛋白（周婦婦等，2011;〇3111：代03838 6七31.，1971)。因此，药物小分 子能否偶联到固相载体（即亲和基质）上形成固定化的配体是决定亲和色谱成功与否的 关键（Cautrecasas，1999)。运用亲和层析技术已成功鉴定出多种内源及外源性物质的结 合蛋白，如对植物生长与发育至关重要的脱落酸（Abscisic acid，ABA)的结合蛋白（Shen et al.，2006 ;Zhang et al.，2002)。高效的亲和层析方法不仅在药物与蛋白质的结合 (Joseph et al. ,2010)、药物革巴标的高通量筛选（Vuignier et al. ,2013)中具有广泛应 用，在蛋白复合物的分离及蛋白与蛋白相互作用网络方面同样扮演着重要角色（Azarkan et al. , 2007 ；Fukao, 2012)〇
[0003] 配体的固定化过程是运用亲和层析方法筛选药物结合蛋白的关键步骤 (Cautrecasas et al.,1971)，选择合适的亲和基质对于我们分离与鉴定生物活性化合物 的靶蛋白至关重要。常用的亲和基质主要有琼脂糖凝胶，但是琼脂糖等固相载体容易亲和 非特异性结合蛋白，不能有效分离与生物活性化合物特异性结合的蛋白质，使得靶蛋白鉴 定更加复杂（Kuramochi et al.，2008 ;Shimizu et al.，2000 ;Yamamoto et al.，2006)。 因此在将琼脂糖亲和珠与目标化合物进行偶联形成固定化配体（immobilized-ligand)的 过程中，连接臂的使用不仅能使药物与基质顺利偶联，提高配基的空间利用度，还可以避免 基质对革巴蛋白的空间干扰效应（Ziegler et al. ,2013)。脱落酸（Abscisic acid, ABA) 是一种对植物生长与发育至关重要的激素，Zhang等利用EAH-Sepharose 4B基质与ABA 进行偶联，通过亲和层析方法成功筛选到ABA的结合蛋白（Shen et al.，2006;Zhang et al.，2002)。AffiGel是一种琼脂糖衍生物，因其良好的亲水性质而减少非特异性结合蛋 白，使其成为应用最广泛的偶联基质（Takahashi et al.，2006)。但是因为大多数药物的 疏水性质，使得高亲水性和化学易碎性的AffiGel与药物在有机试剂的条件下偶联困难， 因此能稳定存在于有机试剂中的聚甲基丙烯酸酯衍生物亲和基质Toyopearl成为了很好 的替代产品。Takahashi等改进了 Toyopearl亲和基质使其具有如同AffiGel -样亲水 性的优点，同时能够稳定存在于有机试剂中，因而降低了非特异性结合蛋白的结合几率，同 时提高了偶联效率（Takahashi et al.，2006)。同时，一些高效能的亲和珠，如FG-beads， SG-beads，也用来改变配体偶联的条件，提高配体的偶联效率（Shimizu et al.，2000; Sakamoto et al.，2009; Ito et al.，2010)，从而筛选出目标化合物的结合蛋白。
[0004] 喹赛多（Cyadox，CYA)作为一类新型喹噁啉-1，4-二氧化合物，在国内由华中农 业大学兽药研宄所首次合成，本实验室对其进行了广泛而且深入细致的研宄。喹赛多作为 喹噁啉类饲料添加剂，对猪、鸡、鱼等食品动物具有明显的抗菌促生长作用。与同类药物相 比，喹赛多毒副作用小，安全性高，属于实际无毒物质，且用药后吸收迅速，残留期短，具有 良好的应用前景。将喹赛多以饲料添加剂的形式添加于仔猪日粮当中，能够显著提高仔 猪体增重，并且其肝脏组织中表皮生长因子（EGF)和胰岛素样生长因子-l(IGF-l)信使 RNA(mRNA)的表达也得到显著性提高（p < 0. 05)，因此推测喹赛多可能是通过对动物体内 EGF和IGF-1等生长因子的转录调控而发挥作用（王国永，2004)。朱惠玲则从内分泌角度， 全面系统的研宄了喹赛多促进仔猪生长的作用机制。研宄推测喹赛多主要通过两种机制发 挥其促生长效应：一是通过提高血液中生长激素（GH)、胰岛素、性激素、IGF等激素水平，同 时降低皮质醇（C0R)与生长抑素（SS)浓度，从而加速体内同化作用，刺激骨骼肌蛋白的合 成，并抑制蛋白质的分解；二是通过提高EGF、IGF-1、胰岛素及胃泌素（Gas)水平，改善胃肠 道黏膜的结构与功能，从而促进营养物质的吸收与利用（朱惠玲，2007)。丁明星研宄也发 现喹赛多可以增加小肠绒毛膜表面积，促进营养物质的吸收（丁明星，2005)。戴梦红等应 用mRNA差异显示技术筛选出在喹赛多作用下，猪肝脏组织中差异表达的8条基因，包括锌 指蛋白（Zinc Finger CCHC3)、抗细胞衰亡因子1(DAD1)、补体C3(C3)、EGF和IGF-1等5条 与喹赛多作用正相关的基因，两条表达量上调但随着喹赛多剂量增加表达量不变的差异基 因，分别是转酮醇酶（TK)、ADP核糖聚合酶（PARP-1)，还有一条表达量与喹赛多剂量呈负相 关的新基因（戴梦红等，2009)。在此基础上，邢丹与郭菊就喹赛多作用下差异表达的8条 基因信号通路与表达调控进行了研宄，发现多条信号通路参与喹赛多对差异基因的表达调 控，其中磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K)与核转录因子-kB(NF-kB)信号通路是主要的调控 通路，发挥喹赛多的药理作用（郭菊，2012;邢丹，2012)。与此同时，利用双向电泳与生物 质谱技术筛选并鉴定了喹赛多在L-02细胞与猪原代肝细胞中相关蛋白质的表达，结果显 示这些差异蛋白主要参与三羧酸循环等与能量代谢相关的过程，从而发挥喹赛多药理作用 (刘亚辉，2012)。虽然喹赛多促生长作用机理得到了较为细致的诠释，但是其在细胞内作用 靶标一直未能确定。有文献报道，药物的作用靶标主要为蛋白质（邱宗荫等，2008)。党永 辉利用放射性同位素氚标记喹赛多，通过在体与离体实验筛选其在猪肝脏组织中的结合蛋 白，结果发现，氚标喹赛多在细胞核蛋白裂解液中随着孵育浓度的升高而趋于饱和，但是并 没有成功筛选到能与喹赛多特异性结合的蛋白质（党永辉，2012)。喹赛多作用细胞之后， 是否有特异性结合蛋白与之相互作用，打通下游信号通路，从而发挥其促生长的药理作用， 对我们研宄喹赛多的促生长机理具有重要意义。虽然喹赛多的促生长作用已在基因水平、 蛋白水平以及整体动物的水平得以阐释，但是喹赛多激发这些效应的基础是什么还不甚明 了。而药物与细胞内或细胞膜靶标之间的相互作用，是药物发挥作用的基础（周婷婷等， 2011)〇
[0005] 肝脏是药物代谢的主要器官，胥宁研宄喹赛多在动物体内的分布与消除规律发 现，在猪肝脏与肾脏中药物消除最慢（胥宁，2012)。通过前期在体与离体试验研宄发现，喹 赛多能够上调EGF、IGF-lmRNA的表达（党永辉，2012 ;王国永，2004)。L-02细胞系是从成 人正常肝脏分