龋齿疫苗及制备方法

专利名称：龋齿疫苗及制备方法
技术领域：
本发明一般涉及到疫苗的技术，更特别为龋齿疫苗，并进一步疫苗的制备方法。
背景技术：
龋齿，或称为蛀牙，是一种慢性传染病，导致钙化组织的区域消融和破坏。如果不及时治疗，龋齿可以引起相当大的痛苦和不适，并最终失去牙齿。龋齿维持一个世界性的高患病率和使得治疗的费用非常高，是一个重大的公共卫生问题。变形链球菌(5被认为是造成人类龋齿的首要病源细菌。变形链球菌表达一种表面蛋白，指定为抗原I / II型，B，P1，或PAc。PAc于变形链球菌在牙齿表面的初始黏附和尔后变形链球菌在牙齿表面的聚集的过程中起作用；因此PAc被认为是一个关键的致病因子，促进龋齿的病理发生。由于其在变形链球菌的龋齿生成性(cariogenicity) 中的重要性，PAc是公认的研制防龋齿疫苗的目标。在一个早期的研究中，雷纳等(Lehneret al. (Immunization with Purified Protein Antigens from Streptococcus mutans Against Dental Caries in Rhesus Monkeys. Infection and Immunity 34, 407-415 (1981)))从细菌培养中直接纯化了蛋白抗原I，I / Π，Π，ΙΙΙ。纯化抗原与佐剂(弗氏不完全佐剂或氢氧化铝)肌注给药。抗原 I，I / II和抗原IK程度较轻)引起龋齿的显著减少，但是抗原III没有引起龋齿减少。对龋齿的保护主要是与血清和龈沟液中IgG抗体相关。在这项研究中使用的免疫计划下，血清IgA抗体的滴度在10 0.7和2.8之间。然而，在实验中使用的抗原的纯度是一个问题。 此外，声称的有效性可能得益于给药途径，即肌肉注射。由于变形链球菌的感染模式，粘膜免疫应是研制一种有效疫苗的优选。不幸的是， 许多研究都表明，当通过粘膜途径免疫时，没有一个合适的佐剂的PAc是一个弱的免疫原。 为了角军决这个问题，Saito 等(Protective Immunity to Streptococcus mutans Induced by Nasal Vaccination with Surface Protein Antigen and Mutant Cholera Toxin Adjuvant. Journal of Infectious Diseases 183, 823-826 (2OOl))从变形链球菌培养上清中纯化了 PAc。PAc和MCT的鼻腔免疫诱导PAc特异性IgA抗体，唾液中的滴度(， 6. 1+/-1. 7)和鼻洗液样本中的滴度(10 ，8. 2+/ -1.5)。通过PAc和MCT的鼻腔免疫诱导的抗原特异性免疫应答提供显著抑制变形链球菌的定植。然而，这项研究有严重缺陷。首先，使用的PAc抗原不是一个表达的重组蛋白；从细菌培养直接纯化不能排除显示的成效由污染造成的可能性；这与以上所述的莱纳研究相似。二，CT是有毒的；尽管它已经被研究多年，离人体应用仍然需假以时日。最后，防止龋齿的有效性并没有直接显示。综上所述，尽管先例中已经提示PAc可能是一个研发针对由变形链球菌引起的龋齿的疫苗的可能的抗原，但是对什么是一个针对变形链球菌引起的龋齿的有效黏膜疫苗并没有指导或提示。因此，迫切需要的是研发一个针对变形链球菌引起龋齿的有效黏膜疫苗。

发明内容
本发明提供了一种用于由变形链球菌感染引起的龋齿的疫苗组合物，该疫苗组合物包含从变形链球菌表面蛋白PAc派生的抗原和从鞭毛素派生的佐剂。本发明进一步提供制备疫苗组合物的方法。本发明还提供了通过给一个个体应用该疫苗组合物来预防或治疗由变形链球菌引起的龋齿的方法。下面结合附图和具体实施方式
进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施方式，任何在本发明基本精神上的改进或替代，仍属于本发明权利要求书中所要求保护的范围。


根据本发明的优选实施方案现在参考附图加以描述，其中相似参考数字代表相似元素。图1显示了纯化的PAc和FLIC; (A)I道免疫印迹纯化的PAc，用HRP-交联的抗 His标签的抗体检测；2道纯化的重组PAc的考马斯亮蓝染色，SDS - PAGE ； (B)3道重组FLIC的考马斯蓝染色，SDS - PAGE; 4道免疫印迹纯化的FLIC，用HRP-交联的抗His 标签的抗体检测。图2是一个图表，显示血清抗PAc IgG，血清抗PAc IgA和唾液抗PAc IgA抗体的滴度，四组小鼠滴鼻免疫=(I)PBS ； (2) 10微克PAc ； (3) 10微克PAc + 1微克FLIC; (4) 10微克PAc + 5微克FLIC，其中数据表示为均值士标准差。图3是一个图表，显示(a)血清抗-PAc IgG，(b)血清抗PAc IgA和(c)唾液抗 PAc IgA的滴度，四组大鼠滴鼻免疫(1 )PBS ;(2)5微克FLIC; (3)20微克PAc + 5微克 FLIC; (4) 40微克PAc + 5微克FLIC，其中数据表示为均值士标准差。图4显示了三个示范图片，说明(A)大鼠正常磨牙的中位数矢切片(右颂骨舌侧部分)及(B)大鼠龋磨牙的中位数矢切片(右舌侧下颂骨的一部分)，大鼠经变形链球菌 Ingbritt的挑战和感染，其中在图片中的箭头表示不同程度的龋齿。(C)大鼠磨牙的中位数矢切片(右舌侧下颂骨的一部分)，大鼠经20微克PAc + 5微克FLIC免疫，随后用变形链球菌hgbritt挑战。偶尔可观察到轻度龋斑和其中一个由箭头所示。图5包含两个图表，显示(A)四组大鼠龋齿的整体得分，每个点代表一只大鼠的龋水平和(B)四组大鼠磨牙的不同部分的龋齿的凯斯(Keyes)得分，四组大鼠滴鼻免疫(1) PBS; (2) 5 微克 FLIC; (3) 20 微克 PAc + 5 微克 FLIC; (4) 40 微克 PAc + 5 微克 FLIC。 得分值表示为均值加上标准偏差值。*与阴性对照组有显着性差异(P <0. 05)。**与阴性对照组有显着性差异(P <0.01)。***与阴性对照组有显着性差异(P <0.001)。符号 EZ3,搪瓷病变;_，牙本质病变轻微;Θ，中度牙本质病变。图6显示pET28a-KF_PAc质粒构建的示意图。图7显示pET28a-KFD2_PAc质粒构建的示意图。图 8 显示纯化了的 PAc，KF-PAc 和 KFD2_PAc 的(A) SDS-PAGE 图及(B) Western Blot 图。图9是一个图表，显示血清抗PAc IgG，血清抗PAc IgA和唾液抗PAc IgA抗体的滴度，其中数据表示为均值士标准差。
图10包括三个图表，显示(A)血清抗PAc IgG，(B)血清抗PAc IgA和(C)唾液抗 PAc IgA抗体的滴度，其中数据表示为均值士标准差。图11包括三个图表，显示(A)血清抗PAc IgG，(B)血清抗PAc IgA和(C)唾液抗 PAc IgA抗体的滴度，其中数据表示为均值士标准差。图12是一个图表，显示五组大鼠龋齿的凯氏(keyes)得分，每个点代表一只大鼠的龋患水平得分值表示为均值士标准偏差值。
具体实施例方式本发明可参考以下详细描述的某些实施例而更容易理解。在这个申请书的通篇中，在出版物被引用，这些出版物的披露的全部成为本申请书的一部份，为了更充分地描述了与本发明相关的技术状态。本发明的应用将使用，除非另有说明，分子生物学(包括重组技术)，微生物学，细胞生物学，生物化学和免疫学的常规技术，这些技术为该领域的一般人员所熟知。这些技术在文献中有详细的解释，例如，M^ecWar Cloning: A Laboratory Mannual, second edition (Sambrook et al. , 1989)； Current Pro toco Is in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al. , eds. , 1987)·。本发明的一个方面提供针对变形链球菌感染引起龋齿的作为预防或治疗药剂使用的疫苗。在一个实施例中，本发明的疫苗包括来自变形链球菌的表面抗原(PAc)和作为佐剂的鞭毛素。在某些实施例中，PAc和鞭毛素分开表达，然后在利用它们制造疫苗时再混合；在某些实施例中，PAc和鞭毛素作为一个单一的重组蛋白表达，例如PAc插入鞭毛素的高变域或替换鞭毛素的部分或全部高变域；在某些实施例中，PAc和鞭毛素被标记或交联上互补性基团，使这两种分子非常接近；在某些实施例中，PAc和鞭毛素交联；在某些实施例中，PAc和鞭毛素吸附到一个载体上，使这两种分子非常接近。在某些实施例中，PAc抗原是全长蛋白(SEQ ID NO. 2)。在某些实施例中，PAc抗原是一个全长蛋白的编辑版本，包括主要的抗原表位。编辑版本指一个或多个PAc的主要抗原表位在一个重组蛋白表达，其中抗原表位直接耦合或被一些氨基酸分开，只要能够维持其抗原构象即可。整个申请书中使用的“变种”，是指一种多肽，具有功能的，并与在序列表中确定的序列至少有90%的同源性，更优选至少有95%的身份。例如，对于PAc，PAc的一个变种，是指一种多肽，能用于诱导针对PAc的免疫反应，并与SEQ ID NO. 1序列至少有90%的同源性。在某些实施例中，融合蛋白包括一个可裂解连接件，置于PAc和纯化标签之间，能够通过对融合蛋白的化学或酶处理而去除融合蛋白的标签。很明显，可裂解连接件可以根据用户的愿望置于融合蛋白中的任何位置。在表达载体中，可裂解连接件包括一个DNA序列，其编码可在其C -端由化学或酶裂解的一个氨基酸或氨基酸序列。用于裂解蛋白的化学试剂的例子包括溴化氰，2-(2 nitrophenylsulfenyl)-3-溴 -3'-methylindolinium (BNPS-skatole)，羟胺，和类似物。溴化氰在蛋氨酸残基的C -末端裂解蛋白。BNPS-skatole在一个色氨酸残基的C -末端切割。羟胺在ASN - Z基团的C -末端切割，其中Z是甘氨酸，亮氨酸，或丙氨酸。
用于裂解蛋白的酶试剂的例子包括胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，胃蛋白酶，纤维蛋白溶酶，凝血酶，肠激酶，和类似物。每一个在其识别的特定氨基酸序列进行切割。例如，肠激酶识别氨基酸序列-(Asp)n-赖氨酸，其中η是一个从2到4的整数。在某些实施例中，融合蛋白包括一个或多个其它纯化标签。例如，6个组氨酸残基融合到PAc的N -或C-端，允许由Ni2+柱来纯化PAc。纯化后，可以通过化学或酶法裂解去掉6个组氨酸残基。事实上，任何已知的纯化标签都是合适的，这里包括myc基因标记，标志肽，KT3表位，α-微管蛋白表位，T7基因10蛋白肽标签，谷胱甘肽-S -转移酶(GST)， 链球菌标签，牛胰胰蛋白酶抑制剂(ΒΡΤΙ)，麦芽糖结合蛋白(ΜΒΡ)。如上所述，表达载体的克隆，构建和扩增技术是众所周知的。因此，PAc或FLIC表达载体按常规程序构建；为了不掩盖本发明，没有提供进一步的细节。粘膜表面是身体的最重要保护屏障，这是由于主要亚型S-IgA，共同粘膜免疫系统(CMIS)的产品。有几个用于局部免疫的粘膜途径，包括口腔，胃灌注，鼻腔，肺，阴道和直肠。与其它粘膜途径相比，滴鼻免疫具有更多的优点，如更方便的给药和更容易引发黏膜反应，尤其是在口腔中。鼻腔给药是一种方便的投送途径和已被证明在防龋齿疫苗接种中有效诱导唾液IgA反应。本文所用“疫苗”指一个用于在个体中诱发免疫反应的抗原制剂。疫苗可以有一个以上的成分是抗原。本文所用“非蛋白载体”指不是蛋白质的载体，可以用来展示多个PAc和鞭毛素抗原表位。“微载体”一词是指微粒组合物，不溶于水，其大小小于150，120或100微米左右， 更常见的小于约50-60微米左右，并可能小于约10微米左右或甚至小于约5微米左右。 微载体包括“nanocarriers”，这些微载体的大小小于1微米左右，优选地小于500纳米左右。微载体包括生物相容性自然发生的聚合物，合成聚合物或合成的共聚物组成的固相颗粒等颗粒。固相微载体可以由在生理条件下不蚀或非降解的聚合物或其它材料形成，如聚苯乙烯，聚丙烯，硅胶，陶瓷，聚丙烯酰胺，金，乳胶，羟基磷灰石，及铁磁和顺磁材料。可生物降解的固相微载体可以由在生理条件下降解的聚合物(例如，聚(乳酸)，聚(乙醇酸)及其共聚物如聚(D，L -乳酸-CO -乙醇酸)或可蚀的(例如，聚(如邻酯3，9 - diethylidene -2 ,4,8, 10 - tetraoxaspiro [5，5] —^一烷(DETOSU)或聚(酐)，如聚癸二酸(酐)，)等形成。微载体通常是球形的形状，但偏离球形的微载体这也是可以接受的(例如，椭圆形，杆状形等)。微载体也可能是液相(例如，油或脂为主)，如脂质体，无抗原的iscoms (免疫刺激复合物，由胆固醇，磷脂和佐剂活性的皂甙形成的稳定复合物)，或在水包油型或油包水的乳化液中的水滴或胶束，如MF59。可生物降解的液相微载体通常采用一种可生物降解的油，其中一些是众所周之，包括角鲨烯和植物油。本文所用的“nonbiodegradable” 一词是指一个微载体在哺乳动物正常生理条件下不被降解或侵蚀。一般地，一个微载体被认为是nonbiodegradable，如果它在正常人血清中37°C孵化72小时后没有被降解(即失去低于 5%它的质量或聚合物的平均长度)。“个体”或“主体”是脊椎动物，如鸟类，优选地是哺乳动物，如人类。哺乳动物包括但不仅限于人类，非人类灵长类动物，农场动物，运动的动物，实验动物，啮齿类动物(如小鼠和大鼠)和宠物。
一种物质的“有效量”或“足够量”指它的量足以达到所需的生物效应，如有利的结果，包括临床结果，正因为如此，一个“有效量”依赖于它被应用的环境。在本发明的背景下，包含所需抗原组合物的有效量的一个例子是一个足以在个体中引起免疫反应的量。一个有效量可以分一次或多次给予。“刺激”免疫反应，如体液或细胞免疫反应，是指反应的增加，可能来自反应的诱导
/或提高°本文所用，并在行内广为理解，“治疗”是一种方法去获得有益的或预期的结果， 包括临床结果。对于这项发明，有益的或所需的临床效果包括，但不局限于，减轻或改善一个或多个症状，感染的程度逐渐降低，稳定(即不恶化)感染，改善或缓解的状态传染病的状态，并缓解(不论是部分或全部)，无论是检出或检测不到。“治疗”，也意味着与如果不接受治疗的预期生存相比延长生存期。根据本发明，疫苗组合物的“剂量”，是在一个特定的时间点给予的疫苗组合物的量。一个“剂量”也可能是使用缓释配方和/或设备逐步给予个体的疫苗组合物的量。在本发明的某些实施例中，疫苗组合物的两个或更多剂量在不同时间点给予个体。根据本发明，PAc的“免疫有效量”是指一个PAc的量，在一个处理的个体中引起针对随后挑战的变形链球菌的完全或部分的免疫力。完全或部分的免疫力，无论是定性或定量，可以通过观察在被挑战后，比较未接种疫苗个体与接种疫苗个体的龋齿的临床症状。 如果接种疫苗的个体被挑战后的的临床症状与未接种疫苗的个体被相似或相同挑症状相比是减少，减轻或消除，给予接种疫苗的个体的PAc量被视为一个“免疫有效量”。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学名词具有通常理解的相同含义
PAc的剂量是0. 1至60微克。优选地，PAc剂量是0. 25微克至15微克。更优选地，剂量为1至3微克。本发明的疫苗可能进一步包括另一个佐剂。合适的佐剂的非限制性例子包括角鲨烷和角鲨烯(或其他动物源性油)；嵌段共聚物；清洁剂如吐温80; Quil，矿物油如Drakeol 或Marcol，植物油如花生油；棒状杆菌衍生佐剂，如短棒状杆菌，牛分枝杆菌(卡介苗，卡介苗或卡介苗)；白细胞介素如白细胞介素-2和白细胞介素12 ；单核细胞介素如白细胞介素 1，肿瘤坏死因子；干扰素如Y干扰；表面活性物质如十六烷胺，十八烷胺，十八烷基氨基酸酯，溶血卵磷脂和多元醇；油乳剂；和矿物质如磷酸铝，氢氧化铝或明矾凝胶。本发明的治疗组合物可与辅料配制，要处理的对象对辅料耐受。这些辅料包括水， 生理盐水，林格氏(Ringer’ s)液，葡萄糖溶液，汉克氏(Hank’ s)溶液，和其他水性生理平衡盐溶液。辅料还可以含有少量添加剂，如提高等张和化学或生物稳定性的物质。缓冲液的例子包括磷酸盐缓冲液，碳酸氢盐缓冲液，Tris缓冲液，而稳定剂的例子包括A1/A2稳定剂。以有效的方式来给予治疗组合物的可接受的方案包括个人剂量的大小，剂量的数目，给药频率，及给药模式。本领域的技术人员可以确定方案，其例子在本文中已有披露。给予被定义为引入物质到个体的身体，包括口腔，鼻腔，眼，直肠，阴道和肠外途径。组合物可单独或与其他药物相结合而通过任何给药途径来给予，包括但不限于皮下 (SQ)，肌肉注射(IM)，静脉注射(IV)，腹腔(IP)，皮内(ID)，通过鼻腔，眼或口腔粘膜(IN)或口头。
在本发明的背景下，给予病人的剂量应足以在一段适当的时间内达到有利于病人的反应。被给予的制剂的数量可能取决被治疗的个体，包括年龄，性别，体重和一般健康状况。本发明的免疫治疗组合物可用于预防或治疗性地免疫个体如人类。然而，也包括其他动物，优选地，脊椎动物包括驯化动物如家畜和伴侣动物。在本发明中优选地使用的药学上可接受的载体可能包括非水溶液的无菌水溶液， 悬浮液，和乳液。非水溶剂的例子包括丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。水溶性载体包括水，酒精/水溶液，乳液或悬浮液，例如盐水和缓冲介质。 肠外用载体包括氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸林格氏溶液或固定油。 静脉用载体包括液体和营养补充剂，电解质补充剂如林格氏葡萄糖，和类似物。防腐剂和其他添加剂也可以存在，例如，抗菌剂，抗氧化剂，螯合剂，和惰性气体和类似物。提供下面的例子的唯一目的是为了说明本发明的原则或实施；它们绝不是旨在限制或缩小本发明的范围。例1 细菌
在厌氧条件下，变形链球菌Ingbritt在脑心浸液培养液(BHI)于37°C培养18小时， 培养物用于感染或在-70°C下保存于甘油-BHI培养液，直到使用。重组PAc和FLIC的表达与纯化
PVAXl是在临床试验中由美国食品和药物管理局批准的唯一载体。所使用的PAc和鼠伤寒沙门菌鞭毛素的基因和蛋白质由SEQ ID NO l(PAc编码序列)，SEQ ID NO 2 (PAc蛋白质)，SEQ ID NO 3 (鞭毛素编码序列)，SEQ ID NO 4 (鞭毛素蛋白)。使用常规重组技术，由核苷酸(657-2694)编码的PAc片段(AA219-680)和FLIC从相关的菌株进行扩增并克隆到表达质粒pET28a中，分别得到pET28a-PAc或pET28a_FLIC。重组 PAC和FLIC蛋白C -末端与6HisTag融合便利纯化。表达质粒pET28a_PAc或pET28a_FLIC 分别转化到大肠杆菌BL21 (DE3)，单阳性克隆进行了核实。转化菌在添加了 50微克/ ml 卡那霉素Luria-Bertani (LB)培养液中在37°C培养过夜；0. 5毫摩尔异丙基-D-半乳糖苷(IPTG)诱导对数生长期细菌。表达的重组蛋白由亲和色谱法在Ni - NTA柱(QIAGEN)纯化，纯化的蛋白由Bradford法进行定量，并通过Western blot证实，采用小鼠抗HigTag抗体(QIAGEN)和第二辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(Pierce)。Western blot检测采用 SuperSignal化学发光底物(Pierce)，由一个Versadoc3000成像仪成像(BIO - RAD)。污染的内毒素和脂多糖(LPS)的去除使用AffinityPak Detoxi凝胶内毒素卸下凝胶(Pierce)。 最终的蛋白质制剂的内毒素和内毒素的含量用Limulus法(Associates of Cape Cod)进行了测定，其值为<0.001 EU/微克。例2 小鼠的免疫
对于剂量效应，4组8周龄雌性BALB / c小鼠(N = 5)滴鼻(i. η.)免疫3次，间隔为 24天(1外83，(2)10微克？4(，(3)10微克？4(3+1微克？1^1(，或(4)10微克卩八(3 + 5微克 FLIC，每只老鼠的体积为10μ1，所有的蛋白质溶解在PBS。最终免疫4周后，收集血清和唾液。从麻醉动物放血，然后血液样本离心获得血清。唾液样本收集，在腹腔(IP)注射(小鼠50 μ L，大鼠250 μ L)200微克/毫升卡巴(Sigma)，以刺激流量。抗体分析之前唾液样本需要离心。血清和唾液样本在-70°C保存，直到它们用ELISA法测定。
8
对于长期效应，3组8周龄雌性BALB / c小鼠(N = 5)滴鼻(i. η.)免疫3次，间隔为24天(l)PBS，(2) 10微克PAc，或(3) 10微克PAc +5微克FLIC ；每只老鼠的体积为 10 μ L，所有的蛋白质溶解在PBS。最终免疫后，在指定时间，血清和唾液样本的收集如上所述。对于大鼠的剂量效应，4组雌性Wistar大鼠(N = 5)滴鼻(i. η.)免疫3次，间隔 24 天=(I)PBS ； (2) 5 微克 FLIC; (3) 20 微克 PAc+5 微克 FLIC; (4) 40 微克 PAc +5 微克 FLIC,每只大鼠的体积为10μ 1，所有的蛋白质溶解在PBS。唾液和血液样本在第3，6，9，10 周收集。例3实验大鼠模型
六组雌性Wistar大鼠(N = 5)，18日龄断奶和喂食致龋饲料，Keyes 2000。20至22日龄，添加抗生素(氯霉素，氨苄青霉素，羧苄青霉素，1. 0克/公斤饲料或水)，，暂时抑制口腔菌群，促进致龋细菌定植。24至26日龄，用预先浸泡细菌溶液的试子，通过口腔以lxl09CFU 的变形链球菌Ingbritt挑战大鼠。牙齿表面的细菌样本进行了检查，以验证每只大鼠感
^fe ο治疗研究计划如下。0-3天，适应性喂养；第4-8天，喂养抗生素，消除口腔内的细菌；第9-14天，种植变形链球菌到牙齿；第14天，首免；第39和64天，加强免疫。预防研究计划如下。0-3天，适应性喂养；第3天，首免；第28和52天，加强免疫；第35-40 天，喂养抗生素，消除口腔内的细菌；第41-46天，种植变形链球菌到牙齿。按照上述计划， 四组大鼠分别滴鼻免疫=(I)PBS ； (2) 5微克FLIC ； (3) 20微克PAc +5微克FLIC; (4)40 微克PAc +5微克FLIC。例4抗体分析
对于小鼠样本，用ELISA检测特异唾液分泌型IgA (S - IgA)和血清IgG和IgA。聚苯乙烯96孔酶标平底微孔板(Greiner，德国)，100微升PAC (5微克/毫升，碳酸盐缓冲液，pH值9.6)包被，371，3小时。在4°C用含牛血清白蛋白(BSA)封闭过夜后，洗板3 次，连续稀释的唾液或血清加入到每孔，并在37°C孵育2小时。用含0. 05%吐温20的PBS (PBST)洗板6次；每孔加入100微升的碱性磷酸酶偶联的羊抗鼠IgG和羊抗鼠IgA (稀释 1:2000，SouthernBiotech)。用PBST洗板6次后，每孔加入100 μ L磷酸盐底物(P -硝基苯磷酸盐)。在37°C孵育后30分钟后，记录在405 nm的光密度(0D值405)。最高稀释度的吸光度与阴性对照(没有样品)的吸光度相比超过> 0. 1，此最高稀释度定义为终点滴度。对于大鼠样本，聚苯乙烯96孔酶标平底微孔板(Greiner，德国)，100微升PAC (5 微克/毫升，碳酸盐缓冲液，PH值9. 6)包被，37°C，3小时。在4°C用含1 %牛血清白蛋白 (BSA)封闭过夜后，洗板3次，连续稀释的唾液或血清加入到每孔，并在37°C孵育2小时。 每孔再用PBST洗涤，然后加入100 μ L羊抗鼠IgG或IgA (1:1000, Sigma公司)，在37°C孵育2小时，再度洗涤。下一步，每孔加入100 μ L碱性磷酸酶标记的兔抗鼠IgG (1:10,000; S0uthernBi0tech)，37°C孵育5小时，其次是磷酸盐底物(P _硝基苯磷酸盐)，37°C孵育30 分钟。在405 nm读取光密度(OD)值。最高稀释度的吸光度与阴性对照(没有样品)的吸光度相比超过> 0. 1，此最高稀释度定义为终点滴度。例5大鼠龋齿评估
收集的血清和唾液样本后，处死大鼠，下颚被拆除，清理，并用紫脲酸铵染色。磨牙洗净，切片和龋齿程度用凯斯(Keyes)方法确定。龋损的延伸和深度记分为搪瓷(E)，浅表性牙本质(Ds)，和温和牙本质(Dm)参与。龋损的整体得分为E，DS和DM分数的总和。例6 统计分析
统计差异采用Student t检验进行分析。所有的动物实验至少重复3次，并以代表性的实验结果显示。例7 结果
重组PAc和FLIC被纯化和用抗PAc和抗His - tag的抗体核实，一个85 kD的条带(图 1，泳道1)和52 kD的条带(图1，泳道4)。参照图2，此图显示小鼠的抗体滴度，小鼠经滴鼻免疫(1)PBS，(2) 10微克PAc， (3) 10微克PAc +1微克？1^1(，或(4)10微克？4(3 +5微克FLIC。结果表明，FLIC是一个强有力的增强剂，增加血清和唾液中抗PAc抗体滴度，更重要的是，在FLIC存在下，PAc能够诱导血清和唾液中高水平的特异性抗PAc IgG和IgA抗体。参考图3，此图显示四组大鼠的血清抗PAc的IgG，血清抗-PAC IgA和唾液抗PAc IgA抗体滴度，大鼠分别滴鼻免疫=(I)PBS ;( 2) 5微克FLIC; (3) 20微克PAc +5微克 FLIC; (4)40微克PAc +5微克FLIC，数据表示为平均值士标准差。大鼠的结果与从小鼠的结果相似，显示FLIC是一个强有力的增强剂，促进血清和唾液中抗PAc抗体滴度，更重要的是，在FLIC存在下，PAc能够诱导血清和唾液中高水平的特异性抗PAc IgG和IgA抗体。参考图4，有两个示范照片说明(a)大鼠正常磨牙的中位数矢切片(右上颂舌侧部分)及(b)感染变形链球菌Ingbritt大鼠龋坏磨牙的中位数矢切片(右下颂骨舌侧部分)， 在图片中的箭头表示不同程度的龋齿。明显的，因为在受感染的大鼠上诱导了人工龋齿，所以大鼠模型是有用的。参考图5，有两个图形显示(A)四组大鼠龋齿的整体得分，每个点代表每只大鼠的龋损水平和(B)在四组大鼠磨牙不同部位的龋齿的凯斯(Keyes)得分，其中四组大鼠分别滴鼻免疫=(I)PBS ； (2)5 微克 FLIC; (3)20 微克 PAc +5 微克 FLIC; (4)40 微克 PAc +5 微克FLIC。数值表示为平均值加上标准偏差值。*与阴性对照组有显着性差异(P <0.05)。 **与阴性对照组有显著性差异(P <0.01)。***与阴性对照组有显著性差异(P <0.001)。 符号―，搪瓷病变;_，牙本质病变轻微;Θ，中度牙本质病变。至于整体龋损(图5Α)，第3和4组大鼠通过滴鼻途径免疫，比第1和2组较少的病变。在第4组和第1组(P <0.01)，第4组和第2组(P <0. 001)，第5组和第1组(P <0.001)， 第5组和第2组(P <0. 001)之间有显著差异。通过滴鼻途径免疫40微克PAc和5微克 FLIC的大鼠显示最少病变。关于搪瓷，浅表性牙本质，中度牙本质病变，也有显著差异(图 5Β)。至于搪瓷病变(Ε)，在第4组和第1组(P <0.001)，第4组和第2组(P <0.001)，第5 组和第1组(P <0. 001)，第5组和第2组(P <0. 001)之间有显着性差异；对于浅表性牙本质病变(DS)，在第4组和第1组(P <0.05)，第4组和第2组(P <0. 01 )，第5组和第1组(P <0.01)，第5组和第2组(P <0.001)之间有显著差异。由于中度牙本质病变的低龋坏评分， 这些组之间没有统计上的显著差异，但我们依然可以看到与其它3组相比，第4和5组的平均得分较低。第1，2，3，和4组的龋平均分数分别为54. 2，54. 4，28和23. 8。因此，第4和5组大鼠分别有48%和56%减少。
例8 pET28a-KF-PAc 质粒构建
KF-PAc的核苷酸序列(SEQ ID NO 5)和氨基酸序列(SEQ ID NO 6)，其中KF表示来源于大肠杆菌的鞭毛素(SEQ ID NO 15显示KF核苷酸序列；SEQ ID NO 16显示KF氨基酸序列)。首先PCR扩增出KF和PAc片段，其中，KF的上游引物为5，GCGCCATG GCACAAGTCATTAATACC 3，(SEQ ID NO 7)，下游引物为5，AACAAGCTTACCCTGCAGCAGAGACAGAAC 3，(SEQ ID NO 8),上下游分另Ij 引入了 Nco I和Hind III两个酶切位点(下划线处表示酶切位点)；PAc的上游引物为5，TCAAAGCTTGGAACCAATGCTGCCAATC 3，(SEQ ID NO 9)，下游弓| 物为5， ACGTCTCGAGCTCATAAGTT GGCTCAACAG 3，(SEQ ID NO 10)，上下游分别引入了 Hind III 和Xho I两个酶切位点。选择pET28a作为载体，将两个片段依次连入载体中，连接产物转化BL21(DE3) star ；挑取阳性克隆进行酶切及测序鉴定，将正确的重组质粒命名为 pET28a-KF-PAc,其表达产物KF-PAc的C-端带有6聚组氨酸标签。质粒构建示意图如图 6，其中KF片段包含1494碱基，编码498个氨基酸(1-498)，PAc片段包含2085碱基，编码 695个氨基酸(501-1195) ；KF和PAc片段之间包含2个氨基酸组成的连接。例9 pET28a-KFD2-PAc 质粒构建
KFD2-PAc的核苷酸序列(SEQ ID NO 11)和氨基酸序列(SEQ ID NO 12)。首先PCR扩增出 PAc 片段，上游引物为5，TATAGCTAGCGGA ACCAATGCTGCCAATC 3，(SEQ ID NO 13)，下游引物为5’ ATTAGGATCCGTCGTCTCATAAGTTGGCTC 3’ (SEQ ID NO 14)，分别在上下游引入了 Nhe I和BamH I两个酶切位点(下划线处表示酶切位点)，然后将片段连入构建好的质粒 pET28a-KFD2中，连接产物转化BL21 (DE3) star ；挑取阳性克隆进行酶切及测序鉴定，将正确的重组质粒命名为pET28a-KFD2-PAc，其表达产物KFD2_Pac的C-端带有6聚组氨酸标签。质粒构建的示意图如图7 ；其中PAc片段包含2061碱基，编码687个氨基酸(174-860)。图 8 显示纯化了 的 PAc，KF-PAc 和 KFD2_PAc 的(A) SDS-PAGE 图及(B) Western Blot 图。例 10
五组小鼠滴鼻免疫(I)PBS ； (2) 1微克PAc ； (3) 1微克PAc + 0. 7微克KF ； (4) 1. 7 微克KF-PAc ;(5) 1.4微克KFD2-PAC。免疫三次后，抗体分析如例4。图9是一个图表，显示血清抗PAc IgG，血清抗PAc IgA和唾液抗PAc IgA抗体的滴度，其中数据表示为均值士标准差。例 11
11组大鼠滴鼻免疫=(I)PBS ； (2) 1微克PAc + 0. 7微克KF ； (3) 1. 4微克KFD2-PA。； (4)2. 5 微克 PAc + 1.8 微克 KF ； (5)3. 5 微克 KFD2-PA。； (6)5 微克 PAc +3. 5 微克 KF ； (7) 7 微克 KFD2-PAc ； (8)10 微克 PAc + 7 微克 KF ； (9) 14 微克 KFD2_PAc ； (10)20 微克 PAc + 14微克KF ;(11)28微克KFD2-PAC。免疫三次后，抗体分析如例4。图10包括三个图表，显示(A)血清抗PAc IgG，(B)血清抗PAc IgA和(C)唾液抗PAc IgA抗体的滴度，其中数据表示为均值士标准差。例12
五组大鼠滴鼻免疫(I)PBS ； (2) 5微克PAc ； (3) 5微克PAc + 3. 5微克KF ； (4) 8. 5 微克KF-PAc ； (5)7微克KFD2-PAC。免疫三次后，抗体分析如例4。图11包括三个图表，显示(A)血清抗PAc IgG，(B)血清抗PAc IgA和(C)唾液抗PAc IgA抗体的滴度，其中数据表示为均值士标准差。
例 13
五组大鼠滴鼻免疫(I)PBS ； (2) 5微克PAc ； (3) 5微克PAc + 3. 5微克KF ； (4) 8. 5 微克KF-PAc ； (5) 7微克KFD2-PAC。先感染再免疫，感染剂量为2xl09CFU，感染后12周计算得分，龋齿分析如例5。图12是一个图表，显示五组大鼠龋齿的凯氏(keyes)得分，每个点代表一只大鼠的龋患水平得分值表示为均值士标准偏差值。
权利要求
1.用于由变形链球菌感染引起的龋齿的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗包括从变形链球菌表面蛋白PAC派生的抗原；从鞭毛素派生的佐剂；药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述抗原是由SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 1的部分编码的PAC多肽或由SEQ ID NO. 2代表的PAC多肽变种；所述PAC多肽或变种包含至少一个抗原表位。
3.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述抗原是由SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 1的部分编码的PAC多肽或由SEQ ID NO. 2代表的PAC多肽变种；所述多肽或变种是一个交接至少两个分散的抗原表位的重组多肽。
4.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述鞭毛素是由SEQID NO. 3或SEQ ID NO. 3 一个或多个部分编码的多肽或由SEQ ID NO. 4代表的鞭毛素变种。
5.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述鞭毛素是由SEQID NO. 3或SEQ ID NO. 3—个或多个部分编码的多肽或由SEQ ID NO. 4代表的鞭毛素变种，所述多肽或变种包含在鞭毛素高变域中的缺失。
6.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述抗原PAc和佐剂鞭毛素是分别表达的重组蛋白。
7.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述抗原PAc和佐剂鞭毛素表达为一个单一的重组蛋白，优选的PAC被插入到鞭毛素的高变域或替代部分或全部的鞭毛素高变域。
8.根据权利要求7所述疫苗组合物，其特征在于，所述抗原PAc和佐剂鞭毛素表达为一个单一的重组蛋白如SEQ ID NO 6。
9.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述抗原PAC被插入到鞭毛素的高变域或替代部分或全部的鞭毛素高变域。
10.根据权利要求9所述疫苗组合物，其特征在于，所述抗原PAC被插入到鞭毛素的高变域如 SEQ ID NO 12。
11.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述PAc和鞭毛素带有标签或与互补性基团共轭而使这两个分子非常接近。
12.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述PAc和鞭毛素共轭在一起。
13.根据权利要求1所述疫苗组合物，其特征在于，所述PAc和鞭毛素结合到一种载体上，而使这两个分子非常接近。
14.使用根据权利要求1所述疫苗组合物来治疗个体中由变形链球菌感染引起的龋齿。
15.根据权利要求1所述治疗，其特征在于，所述个体是人。
全文摘要
本发明提供了一种用于由变形链球菌感染所造成的龋齿的疫苗组合物，该疫苗组合物包括从变形链球菌表面蛋白PAC派生的抗原和从鞭毛素派生的佐剂。本发明进一步提供制备疫苗组合物的方法。本发明还提供了通过将该疫苗组合物应用到个体来预防或治疗由变形链球菌引起的龋齿的方法。
文档编号A61P31/04GK102488898SQ201110438088
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者孙颖, 杨菁毅, 石伟, 鄢慧民 申请人:中国科学院武汉病毒研究所