通过给予神经生长因子拮抗剂及其组合物来治疗骨关节炎疼痛的方法

专利名称：通过给予神经生长因子拮抗剂及其组合物来治疗骨关节炎疼痛的方法
技术领域：
本发明涉及抗-NGF抗体(如抗-NGF拮抗剂抗体)。本发明进一步涉及使用拮抗剂(如抗体)用于治疗及/或预防疼痛，包括手术后疼痛、风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛的用途。
背景技术：
神经生长因子(NGF)是第一个确认的神经营养素(neurotrophin),并已经完全定出其在周围和中枢神经的发育和存活中的作用。已经显示NGF是在周围交感神经和胚胎感觉神经元与基底前脑胆碱能神经元发育上关键性的存活和维持因子。Smeyne等人，Nature368 =246-249(1994)和 Crowley 等人，Cell 76:1001_1011 (1994)。NGF上调(up-regulate)神经肽在感觉神经元中的表达(Lindsay和Harmer, Nature 337:362_364 (1989)),并经由两个不同的膜-结合受体，TrkA酪氨酸激酶受体和P75共同神经营养素受体(有时分别称为"高亲和性"和"低亲和性"NGF受 体)调节其活性。p75受体在结构上与肿瘤坏死因子受体家族的其他成员有关(Chao等人，Science 232:518-521 (1986))。关于NGF的综述，参见 Huang 等人，Annu.Rev.Neurosc1.24:677_736 (2001) ；Bibel 等人，Genes Dev.14:2919-2937 (2000)。已经定出NGF的结晶结构和与trkA受体形成的复合物中的NGF的结晶结构。参见 Nature 254:411(1991) ；Mature 401:184-188(1996)。除了其在神经系统上的作用之外，NGF已经逐渐涉及神经系统以外的过程。例如，已经显示NGF促进了血管通透性(Otten等人，Eur J Pharmacol.106:199-201 (1984))，提高 T-和 B-细胞免疫反应(Otten 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 86:10059-10063 (1989))，诱导淋巴细胞分化和肥大细胞增殖，并引起从肥大细胞中释放出可溶性生物信号(Matsuda 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:6508-6512(1988) ；Pearce等人，J.Physiol.372:379-393 (1986) ;Bischoff 等人，Blood 79:2662-2669(1992);Horigome 等人，J.Biol.Chem.268: 14881-14887 (1993))。虽然已经显示外源添加 NGF，能够拥有全部的这些作用，但重要的是注意到在活体内在任何的这些过程中，仅罕有地显示内源的NGF是重要的(Torcia等人，Cel1.85(3):345_56 (1996))。因此，即使有也不清楚是何种因素可能抑制了内源NGF的生物活性。NGF由许多细胞类型产生，包括肥大细胞(Leon等人，Proc.Natl.Acad Sc1.USA 91:3739-3743 (1994))、B-淋巴细胞(Torcia 等人，Cell 85:345_356 (1996))、角化细胞(Di Marco 等人，J.Biol.Chem.268:22838_22846))、平滑肌细胞(Ueyama 等人，J.Hypertens.11: 1061-1065 (1993))、纤维母细胞(Lindholm 等人，Eur.J.Neurosc1.2:795-801 (1990))、支气管上皮细胞(Kassel 等人，Clin.Exp.Allergy 31:1432-40 (2001))、肾小球系膜细胞(Steiner等人，Am.J.Physiol.261:F792_798 (1991))和骨骼肌肌管(Schwartz 等人，J Photochem.Photobiol.B66:195-200 (2002))。已经在神经系统以外的各种细胞类型上找到NGF受体。例如，已经在人类单核细胞、T-和B-淋巴细胞及肥大细胞上找到TrkA。已经在人类患者和数种动物模式中观察到在增加NGF含量与炎症状况之间的关联。这些包括全身性红斑性狼疮(Bracc1-Laudiero等人，Neuroreport 4:563-565(1993))> 多发性硬化症(Bracc1-Laudiero 等人，Neurosc1.Lett.147:9-12 (1992))、牛皮癖(Raychaudhuri 等人，Acta Derm.1 ' enereol.78:84_86 (1998))、关节炎(Falcim 等人，Ann.Rheum.Dis.55:745_748 (1996))、间质性膀胱炎(Okragly等人，J.Urology 161:438-441 (1999))和哮喘(Braun 等人，Eur.J Immunol.28:3240-3251(1998))。同样地，在周围组织中升闻NGF含量与痛觉过敏和炎症反应有关，并已经在许多形式的关节炎中观察到。受风湿性关节炎侵袭的患者的滑膜，表达高量的NGF，而已经报告了在未发炎的滑膜中不可检测到NGF(Aloe等人，Arch.Rheum.35:351_355 (1992))。在以实验方式诱发风湿性关节炎的大鼠中，也看到类似的结果(Aloe等人，Clin.Exp.Rheumatol.10:203_204(1992))。已经在转基因关节炎老鼠中，报告了 NGF的含量升高，连同肥大细胞的数目增加(Aloe 等人，Int.J.Tissue Reactions-Exp.Clin.Aspects 15:139-143(1993))。PCT公开第WO 02/096458号公开了使用具有某些特性的抗-NGF抗体，治疗各种NGF相关病症，如炎症状况(例如风湿性关节炎)。已经报告了将经过纯化的抗-NGF抗体注射到带有人类肿瘤坏死因子-α (TNF-α)基因的关节炎转基因老鼠内，导致肥大细胞数目减少，并减少了在关节炎老鼠的滑膜中组织胺和物质P的含量(Aloe等人，Rheumatol.1nt.14:249_252 (1995))。已经显示外源给予NGF抗体，降低了发生在关节炎老鼠中的提高的 TNF-α 含量(Manni 等人，Rheumatol.1nt.18:97_102 (1998))。再者，已经在人类骨关节炎`软骨细胞中观察到NGF和高亲和性NGF受体(TrkA)的增加表达(Iannone 等人，Rheumatology 41:1413-1418 (2002))。已经报告了啮齿类抗-NGF拮抗剂抗体。参见，例如Hongo等人，Hybridoma(2000) 19(3):215-227 ；Ruberti 等人(1993)Cell.Molec.Neurobiol.13(5):559-568。然而，当为了治疗而将啮齿类抗体使用在人类上时，在大量接受治疗的个体中发展出人类抗-老鼠抗体反应。此外，已经发现老鼠抗体的效应物功能，在人类关系中是较低效力的。因此，人们非常需要一种抗-NGF拮抗剂抗体，包括人类化的抗-NGF拮抗剂抗体。在本文中公开的所有参考文献、出版物和专利申请，全部以引用的方式并入本文中。

发明内容
在本文中公开的本发明涉及对抗神经生长因子的抗体。另一方面，本发明是人类化的和亲和性成熟的抗体E3，其特异性地结合人类和啮齿类神经生长因子("NGF")。分别在

图1A(SEQ ID NO:1)和1B(SEQ ID NO:2)中示出E3的重链和轻链可变区域的氨基酸序列。在图1A和IB中以图示表示抗体E3的CDR部分(包括Chothia和Kabat⑶Rs)。在下文中也示出E3重和轻链的氨基酸序列，以及个别的衍生⑶Rs (参见下文的"抗体序列)。另一方面，本发明是包括抗体E3的片段或区域的抗体(在本文中可互换地称为"E3")。在一具体实施例中，该片段是在图1B中示出的抗体E3的轻链。在另一具体实施例中，该片段是在图1A中示出的抗体E3的重链。在另一具体实施例中，该片段含有一或多个得自抗体E3的轻链及/或重链的可变区域。在另一具体实施例中，该片段含有一或多个得自在图1A和IB中示出的抗体E3的轻链及/或重链的互补性决定区(CDRs)。另一方面，本发明是包括轻链的抗体，该轻链是由保藏编号为ATCC第PTA-4893号或ATCC第PTA-4894号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的。另一方面，本发明是包括重链的抗体，该重链是由保藏编号为ATCC第PTA-4895号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的。另一方面，本发明是包括(a)轻链和(b)重链的抗体，其中该轻链是由保藏编号为ATCC第PTA-4894号或ATCC第PTA-4893号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的，该重链是由保藏编号为ATCC第PTA-4895号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的(在本文中为了方便，将由已保藏的宿主细胞产生的多核苷酸(们)称为具有ATCC第PTA-4894号、PTA-4893和PTA-4895号的保藏编号)。另一方面，本发明·是包括轻链的轻链可变区的抗体，该轻链是由具有ATCC第PTA-4894号或ATCC第PTA-4893号的保藏编号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的。另一方面，本发明是包括重链的重链可变区的抗体，该重链是由具有ATCC第PTA-4895号的保藏编号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的。另一方面，本发明是包括(a)轻链的轻链可变区以及(b)重链的重链可变区的抗体，该轻链是由具有ATCC第PTA-4894号或ATCC第PTA-4893号的保藏编号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的，该重链是由具有ATCC第PTA-4895号的保藏编号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的。另一方面，本发明是包括一或多个CDR(S)的抗体，该CDR(S)是由(a)由具有ATCC第PTA-4894号的保藏编号的宿主细胞产生的多核苷酸及/或(b)由具有A·TCC第PTA-4895号的保·藏编号的宿主细胞产生的多核苷酸编码的重链编码的。在某些具体实施例中，该抗体包括人类重链IgG2a恒定区。在某些具体实施例中，该抗体包括人类轻链K恒定区。在某些具体实施例中，该抗体包括经过修改的恒定区，如在免疫学上为惰性的恒定区，例如不诱发补体调解的溶解，或不刺激抗体-依赖性细胞调解的细胞毒性(ADCC)。在其他具体实施例中，按照在Eur.J.1mmunol.(1999)29:2613-2624 ；PCT公开第PCT/GB99/01441号；及/或大不列颠联合王国第9809951.8号专利申请中的描述来修改该恒定区。在另外的具体实施例中，该抗体包括人类重链IgG2a恒定区，该恒定区包括下列的突变:A330P331至S330S331 (氨基酸编号参考野外型IgG2a序列)ο Eur.J.1mmunol.(1999)29:2613_2624。另一方面，本发明提供包括下列任一个或多个的多肽(其可以或可以不是抗体):a)在图1A和IB中示出的抗体E3的一或多个CDR(s) ；b)得自在图1A中示出的抗体E3的重链的CDR H3 ；c)得自在图1B中示出的抗体E3的轻链的CDR L3 ；d)得自在图1B中示出的抗体E3的重链的三个⑶Rs ；e)得自在图1A中示出的抗体E3的重链的三个⑶Rs ；以及f)得自在图1A和IB中示出的抗体E3的轻链的三个CDRs和得自其重链的三个CDRs。本发明还提供包括下列任一个或多个的多肽(其可以或可以不是抗体):a)衍生自在图1A和IB中示出的抗体E3的一或多(一、二、三、四、五或六)个CDR(S) ；b)衍生自得自在图1A中示出的抗体E3的重链的⑶R H3的⑶R ;及/或c)衍生自得自在图1B中示出的抗体E3的轻链的⑶R L3的⑶R。在某些具体实施例中，⑶Rs可能是Kabat⑶Rs、Chothia⑶Rs，或Kabat和Chothia⑶Rs的组合(在本文中称为"延伸"或"混合"的⑶Rs)。在某些具体实施例中，多肽(如抗体)与NGF (如人类NGF)结合。在某些具体实施例中，该多肽包括在本文中描述的任何CDR组态(包括组合、变体等等)。本发明一方面提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO:9组成的重链可变区，其中134是S、L、V、A或I ;且以N、T或S取代N35。在本文中为了方便，在提及氨基酸时，"取代"或"是"意指特定位置可选择的氨基酸(们)。取代或选择，显然可以是在SEQ ID或图中表示的氨基酸。另一方面，本发明 提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO:10组成的重链可变区，其中M50是M、1、G、Q、S或L ；A62是A或S ;且L63是L或V。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO:11所组成的重链可变区，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是D、N或G ;且其中YllO是Y、K、S、R或T。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO:11所组成的重链可变区，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO:11所组成的重链可变区，其中 G98 是 G、S、A、C、V、N、D 或 T ;其中 G99 是 G、S、A、C、V、N、D 或 T ;其中 YlOO 是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO:12组成的轻链可变区，其中S26是S或F ；D28是D、S、A或Y ;且H32是H、N或Q。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO:13组成的轻链可变区，其中151是1、T、V或A ;且S56是S或T。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO:14组成的轻链可变区，其中S91是S或E ；K92是K、H、R或S ;且其中Υ96是Y或R。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括由SEQ ID NO:14组成的轻链可变区，其中S91是S或E ；Κ92是任何氨基酸；且其中Υ96是Y或R。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO:9中示出的氨基酸序列，其中134是S、L、V、A或I ;且吧5是队1'或5。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO:10中示出的氨基酸序列，其中M50是M、1、G、Q、S或L ；A62是A或S ;且L63是L或V。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID N0:11中示出的氨基酸序列，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是D、N或G ;且其中YllO是Y、K、S、R或T。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID N0:11中示出的氨基酸序列，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID N0:11中示出的氨基酸序列，其中 G98 是 G、S、A、C、V、N、D 或 T ;其中 G99 是 G、S、A、C、V、N、D 或 T ;其中 Yl00 是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO:12中示出的氨基酸序列，其中S26是S或F ；D28是D、S、A或Y ;且H32是H、N或Q。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO:13中示出的氨基酸序列，其中151是1、T、V或A;且S56是S或T。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO:14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E ；K92是K、H、R或S ;且其中Υ96是Y或R。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括在SEQ ID NO:14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E ；Κ92是任何氨基酸；Τ93是任何氨基酸；且其中Υ96是Y或R。另一方面，本发明提供多肽(如抗体，包括人类化抗体)，其包括具有下述区域的重链可变区:SEQ ID NO:9的CDRl区，其中134为S、L、V、A或I ;且N35是N、T或S ;SEQ IDNO:10 的 CDR2 区，其中 M50 是 M、1、G、Q、S 或 L ；A62 是 A 或 S，且 L63 是 L 或 V ;以及 SEQ IDNO:11的CDR3区，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是D、N或G ;其中YllO是Y、K、S、R或T。在一些具体实施例中，该重链可变区包括SEQ ID N0:11的CDR3区，其中YlOO是Y、L或R;其中YlOl是Y或W;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;其中YllO是任何氨基酸。在另外的具体实施例中，该重链可变区包括SEQ ID N0:11的⑶R3区，其中G98 是 G、S、A、C、V、N、D 或 T ;其中 G99 是 G、S、A、C、V、N、D 或 T ;其中 YlOO 是 Y、L 或 R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106 是 Y、R、T 或 M;其中 Y107 是 Y 或F ;其中 F108 是F 或 W ;其中 D109 是 S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。在一些具体实施例中，该多肽(如抗体)还包括抗体轻链可变区。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括具有下述区域的轻链可变区:SEQID NO:12 的 CDRl 区，其中 S26 是 S 或F ;D28 是D、S、A 或 Y ;且H32 是H、N或 Q ;SEQ ID NO:13的CDR2区，其中151是1、T、V或A;且S56是S或T;以及SEQ ID NO: 14的CDR3区，其中S91是S或E ;K92是K、H、R或S ;且其中Y96是Y或R。在一些具体实施例中，该轻链可变区包括SEQ ID N0:14的⑶R3区，其中S91是S或E;K92是任何氨基酸；T93是任何氨基酸；且其中Y96是Y或R。在一些具体实施例中，该多肽(如抗体)还包括抗体重链。
另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括:(a)重链可变区，包括:SEQ ID NO:9的CDRl区，其中134是S、L、V、A或I ;且吧5是N、T或S ;SEQ ID NO:10的CDR2区，其中 M50 是M、1、G、Q、S 或 L;A62 是 A或 S，且L63 是L 或 V;以及 SEQ ID NO:11 的 CDR3 区，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是D、N或G ;其中YllO是Y、K、S、R或T ;以及(b)轻链可变区，包括:SEQ ID NO:12 的 CDRl 区，其中 S26 是 S 或 F ;D28 是 D、S、A 或 Y ;且 H32 是 H、N 或 Q ;SEQ ID NO:13 的CDR2区，其中151是1、T、V或A;且S56是S或T;以及SEQ ID NO: 14的CDR3区，其中S91是S或E K92是K、H、R或S ;且其中Y96是Y或R。在一些具体实施例中，该轻链可变区包括SEQ ID NO:14的⑶R3区，其中S91是S或E ；K92是任何氨基酸；Τ93是任何氨基酸；且其中Υ96是Y或R。在一些具体实施例中，该重链可变区包括SEQ ID NO: 11的⑶R3区，其中YlOO是Y、L或R;其中YlOl是Y或W;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;其中YllO是任何氨基酸。在其他的具体实施例中，该重链可变区包括 SEQ ID NO:11 的 CDR3 区，G98 是 G、S、A、C、V、N、D 或 T;其中 G99 是 G、S、A、C、V、N、D或T ;其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。在一些具体实施例中，该多肽还包括抗体轻链。另一方面，本发明提供多肽(如抗体，包括人类化抗体)，其包括:在SEQ ID NO:9中示出的氨基酸序列，其中134是S、L、V、A或I ;且吧5是N、T或S ;在SEQ ID NO: 10中示出的氨基酸序列，其中M50是M、1、G、Q、S或L ；A62是A或S，且L63是L或V ;以及在SEQIDNO:11中示出的氨基酸序列，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ; 其中D109是D、N或G ;其中YllO是Y、K、S、R或T。在一些具体实施例中，该多肽包括在SEQ ID NO: 11中示出的氨基酸序列，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106 是 Y、R、T 或 M ;其中 Y107 是 Y 或 F ;其中 F108 是 F 或 W ;其中 D109 是 S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。在其他的具体实施例中，该多肽包括在SEQ ID NO:11中示出的氨基酸序列，其中G98是G、S、A、C、V、N、D或T ;其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T ;其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。在一些具体实施例中，该多肽(如抗体)还包括还包括抗体轻链可变区。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括:在SEQ ID N0:12中示出的氨基酸序列，其中S26是S或F ;D28是D、S、A或Y ;且H32是H、N或Q ;在SEQ ID NO:13中示出的氨基酸序列，其中151是1、T、V或A;且S56是S或T;以及在SEQ ID NO: 14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E ；K92是K、H、R或S ;且其中Υ96是Y或R。在一些具体实施例中，该多肽包括在SEQ ID NO: 14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E ;K92是任何氨基酸；T93是任何氨基酸；且其中Y96是Y或R。在一些具体实施例中，该多肽(如抗体)还包括还包括抗体重链可变区。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括:(a)在SEQ ID NO:9中示出的氨基酸序列，其中134是S、L、V、A或I ;且吧5是N、T或S ;在SEQ ID NO:10中示出的氨基酸序列，其中M50是M、1、G、Q、S或L;A62是A或S，且L63是L或V;以及在SEQ ID NO:11中示出的氨基酸序列，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是D、N或G ;且其中YllO是Y、K、S、R或T ;以及(b)在SEQ IDNO:12中示出的氨基酸序列，其中S26是S或F ；D28是D、S、A或Y ;且H32是H、N或Q ;在SEQ ID NO: 13中示出的氨基酸序列，其中151是1、T、V或A ;且S56是S或T ;以及在SEQID NO: 14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E ；K92是K、H、R或S ;且其中Υ96是Y或R0在一些具体实施例中，该多肽包括在SEQ ID Ν0:14中示出的氨基酸序列，其中S91是S或E ；Κ92是任何氨基酸；Τ93是任何氨基酸；且其中Υ96是Y或R。在一些具体实施例中，该多肽包括在SEQ ID NO: 11中示出的氨基酸序列，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N 、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。在其他的具体实施例中，该多肽包括在SEQ ID N0:11中示出的氨基酸序列，其中G98是G、S、A、C、V、N、D或T ;其中G99是G、S、A、C、V、N、D或T ;其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是S、A、C、G、D、N、T或G ;且其中YllO是任何氨基酸。在一些具体实施例中，该多肽还包括还包括抗体轻链可变区。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括具有下列区域的重链可变区:(a)SEQ ID NO:9 的 CDRl 区，其中 134 是 S、L、V、A 或 I ;且 N35 以 N、T 或 S 取代；(b) SEQ IDNO:10 的 CDR2 区，其中 M50 是 1、G、Q、S 或 L ;A62 是 A 或 S，且 L63 是 L 或 V ;以及(c) SEQID NO:11的CDR3区，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是D、N或G ;其中YllO是Y、K、S、R或T ;其中该抗体与NGF结
合另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括具有下列区域的轻链可变区:(a)SEQ ID NO:12 的 CDRl 区，其中 S26 是 S 或F ;D28 是D、S、A或Y ;且H32 是H、N或Q ;(b)SEQ ID NO:13 的 CDR2 区，其中 151 是 1、T、V 或 A ;且 S56 是 S 或 T ;以及(c) SEQ ID NO:14的⑶R3区，其中K92是K、H、R或S ;且其中Y96是Y或R ;其中该抗体与NGF结合。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其包括(a)重链可变区，包括:(i) SEQ IDNO:9 的 CDRl 区，其中 134 以 S、L、V、A 或 I 取代;且 N35 以 N、T 或 S 取代；(ii) SEQ ID NO:10 的 CDR2 区，其中 M50 是 1、G、Q、S 或 L ;A62 是 A 或 S，且 L63 是 L 或 V ;和(iii)SEQ IDNO:11的CDR3区，其中YlOO是Y、L或R ;其中YlOl是Y或W ;其中G103是G、A或S ;其中T104是T或S ;其中S105是S、A或T ;其中Y106是Y、R、T或M ;其中Y107是Y或F ;其中F108是F或W ;其中D109是D、N或G ;其中YllO是Y、K、S、R或T ;以及(b)轻链可变区，包括:(i)SEQ ID NO:12 的 CDRl 区，其中 S26 是 S 或 F ;D28 是 D、S、A 或 Y ;且 H32 是 Η、N或 Q;(ii)SEQ ID NO: 13 的 CDR2 区，其中 151 是 1、T、V 或 A ;且 S56 是 S 或 T ;和(iii)SEQID NO:14的CDR3区，其中S91是S或E ;K92是K、H、R或S ;且其中Υ96是Y或R ;其中该
抗体与NGF结合。除非另行提到，在一位置的氨基酸选择(例如取代)与在任何其他位置的氨基酸选择无关。在一些具体实施例中，多核苷酸(如抗体)与NGF(如人类NGF)结合。在一些具体实施例中，该多肽包括包括在本文中描述的任何CDR组态(包括组合、变体等等)。从本文中的说明，显然在本文中可变区的编号使用连续编号。本领域技术人员了解一些现有的抗体编号系统(如Kabat和Chothia编号)，以及如何将连续编号转换成其他的编号系统，如Kabat编号或Chothia编号。另一方面，本发明提供包括选自SEQ ID NO:46或50的氨基酸序列(如⑶R3序列)的多肽(如抗体)。在另外的具体实施例中，该多肽还包括还包括一或多个在SEQ IDNO:3、4、5、6、7和8中示出的氨基酸序列。在另外的具体实施例中，该多肽还包括还包括一或多个在SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14和15中示出的氨基酸序列。另一方面，本发明提供包括选自下列的氨基酸序列(如⑶R区，如⑶R Hl及/或CDR Η2 区)的多肽(如抗体):(a) SEQ ID NO:28 及 / 或 29 ; (b) SEQ ID NO:30 及 / 或 31 ;
(c)SEQ ID N0:32及 /或 33 ;(d)SEQ ID NO:34 及 / 或 35 ; (e) SEQ ID NO:36 及 / 或 37 ;(f) SEQ ID NO:38及/或39 ;以及(g) SEQ ID N0:40和41。在一些具体实施例中，该多肽包括选自SEQ ID NO:28、30、32、34、36、38和40的氨基酸序列(如CDR Hl区)。在一些具体实施例中，该多肽包括选自SEQ ID NO:29、31、33、35、37、39和41的氨基酸序列(如CDRH2区)。在另外的具体实施例中，该多肽还包括还包括一或多个在SEQ ID N0:3、4、5、6、7和8中示出的氨基酸序列。在另外的具体实施例中，该多肽还包括一或多个在SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14和15中示出的氨基酸序列。另一方面，本发明提供包括选自下列的氨基酸序列(如⑶R区，如⑶R LI及/或CDR L2 区)的多肽(如抗体):(a) SEQ ID NO:18 及 / 或 19 ; (b) SEQ ID NO:20 及 / 或 21 ;和(c)SEQ ID N0:22及/或23。在一些具体实施例中，该多肽包括选自SEQ ID NO:18,20和22的氨基酸序列(如⑶R LI区)。在一些具体实施例中，该多肽包括选自SEQ ID NO:19、21和23的氨基酸序列(如CDR L2区)。在另外的具体实施例中，该多肽还包括一或多个在SEQ ID N0:3、4、5、6、7、8中示出的氨基酸序列。在另外的具体实施例中，该多肽还包括一或多个在SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14和15中示出的氨基酸序列。另一方面，本发明提供包括选自下列的氨基酸序列(如⑶R区，如⑶R L3及/或CDR H3 区)的多肽(如抗体):(a) SEQ ID NO:51 及 / 或 52 ; (b) SEQ ID NO:55 及 / 或 56 ;
(c)SEQ ID N0:57及 /或 58 ;(d)SEQ ID NO:59 及 / 或 60 ; (e) SEQ ID NO:61 及 / 或 62 ;(f) SEQ ID NO:63及/或64。在一些具体实施例中，该多肽包括选自SEQ ID NO:51、55、57、59、61和63的氨基酸序列(如⑶R L3区)。在一些具体实施例中，该多肽包括选自SEQ IDN0:52、56、58、60、62和64的氨基酸序列(如CDR H3区)。在另外的具体实施例中，该多肽还包括一或多个在SEQ ID NO:18、19、30和31中示出的氨基酸序列。在另外的具体实施例中，该多肽还包括一或多个在SEQ ID N0:3、4、5、6、7和8中示出的氨基酸序列。在另外的具体实施例中，该多肽还包括一或多个在SEQ ID NO:9、10、11、12、13、14和15中示出的氨
基酸序列。另一方面，本发明提供包括一或多个在SEQ ID NO:61、63、18、19、30和31中示出的氨基酸序列(如CDR区)的多肽(如抗体)。本发明一方面提供抗-NGF抗体(如拮抗剂抗体)，其以高亲和性与NGF (如人类NGF)结合。在一些具体实施例中，高亲和性是(a)以低于大约2nM(如大约1ηΜ、800ρΜ、600pM、400pM、200pM、100pM、90pM、80pM、70pM、60pM、50pM 或更低)的 KD，及 / 或比大约6χ1θ 更慢的 kQff 与 NGF 结合；并 / 或(b)以大约 200pM、150pM、100pM、80pM、60pM、40pM、20pM、IOpM或更低的IC5tl (在大约15pM NGF的存在下)，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活；并/或(c)以大约50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM、2pM、lpM或更低的IC5(I(在大约1.5pM NGF的存在下)，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活；并/或(d)以大约150pM、125pM、100pM、80pM、60pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM或更低的IC5tl (在大约15pM NGF的存在下)，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的大鼠NGF-依赖性存活；并/或(e)以大约30pM、25pM、20pM、15pM、10pM、5pM、4pM、3pM、2pM、lpM 或更低的 IC5tl(在大约 1.5pM NGF 的存在下)，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的老鼠NGF-依赖性存活；并/或(f)并以比trkA受体更高的亲和性与NGF结合。另一方面，本发明提供多肽(如抗体)，其中该多肽(a)以低于大约2nM(如大约111] 、800 ]\1、600 ]\1、400 ]\1、200 ]\1、100 ]\1、90 ]\1、80 ]\1、70 ]\1、60 ]\1、50 ]\1或更低)的 KD，及 / 或比大约θχΙΟ 更慢的koff与NGF(如人类`NGF)结合；并/或(b)以大约200pM、150pM、100pM、80pM、60pM、40pM、20pM、10pM 或更低的 IC5tl(在大约 15pM NGF 的存在下)，抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活；并/或(c)以大约50pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM、2pM、lpM或更低的IC5tl (在大约1.5pM NGF的存在下)，抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活；并/或以比trkA受体更高的亲和性与NGF结合。在一些具体实施例中，该多肽(a)以比大约2nM更低的Kd与NGF结合；并/或(b)以大约IOOpM或更低的IC5tl抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中在大约15pM NGF的存在下测量该IC5tl ;并/或(c)以大约IOpM或更低的IC5tl抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中在大约1.5pM NGF的存在下测量该IC5(I。在一些具体实施例中，该多肽(a)以比大约IOOpM更低的Kd与NGF结合；并/或(b)以大约20pM或更低的IC5tl抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中在大约15pM NGF的存在下测量该IC50 ;并/或(c)以大约2pM或更低的IC5tl抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中在大约1.5pM NGF的存在下测量该IC5(I。从本文中的说明，显然明确地排除在本发明之外的是由与老鼠单克隆抗体911的氨基酸序列相同的氨基酸序列所组成的多肽具体实施例。在图1A和1B，以及在SEQ ID NO:9-14中，示出Mab 911的衍生⑶R序列。在一些具体实施例中，本发明提供任何上述的多肽或抗体，其中该多肽(如抗体)是经过分离的。在一些具体实施例中，该多肽(抗体)实质上是经过纯化的。在另外的具体实施例中，该多肽(如抗体)是亲和性成熟的。在其他的具体实施例中，该抗体是拮抗剂抗体。在一些具体实施例中，该多肽(抗体)包括人类框架(framework)序列。在另外的具体实施例中，该多肽(抗体)包括一或多个非人类框架残基。在一些具体实施例中，该多肽(抗体)以2nM或更低的Kd与NGF (如人类NGF)结合。在一些具体实施例中，相对于非人类氨基酸序列(如可变区序列，如CDR序列，如框架序列)，该多肽包括一或多个(如2、
3、4、5、6、7、8或更多个)人类氨基酸取代。在一些具体实施例中，相对于双亲(parent)多肽氨基酸序列(如抗体911氨基酸序列，如任一或多个的SEQ ID NO:9-14)，该多肽包括至少1、至少2或更多，如至少3、4、5、6或更多个氨基酸取代。在一些具体实施例中，相对于双亲抗体(如Mab 911)亲和性，已经改变了(在某些具体实施例中，增加了)该抗体的结合亲和性。在其他的具体实施例中，该抗体的结合亲和性比trkA受体对NGF (如人类NGF)的结合亲和性更低。在一些具体实施例中，该多肽可以是抗体。在一些具体实施例中，该抗体是人类抗体。在其他的具体实施例中，该抗体是人类化抗体。在另外的具体实施例中，该抗体是单克隆抗体。在一些具体实施例中，该抗体是亲和性成熟的抗体。本发明提供多核苷酸(包括经过分离的多核苷酸)，包括编码任何上述具体实施例的多核苷酸。另一方面，本发明提供经过分离的多核苷酸，包括编码抗体E3(在本发明中可称为"E3")的片段或区域的多核苷酸。在一具体实施例中，该片段是如同在图1B中示出的抗体E3的轻链。在另一具体实施例中，该片段是如同在图1A中示出的抗体E3的重链。在另一具体实施例中，该片段含有一或多个得自抗体E3的轻链及/或重链的可变区。在另一具体实施例中，该片段含有一或多个得自如同在图1A和IB中示出的抗体E3的轻链及/或重链的互补性决定区(⑶Rs)。另一方面，本发明是经过分离的多核苷酸，包括编码抗体E3的多核苷酸。在一些具体实施例中，该多核苷酸包括在图2和3中示出的任一多核苷酸或两者。另一方面，本发明是经过分离的多核苷酸，其编码具有ATCC PTA-4893或ATCCPTA-4894保藏编号的E3轻链。另一方面，本发明是经过分离的多核苷酸，其编码具有ATCCPTA-4895保藏编号的E3重链。另一方面，本发明是经过分离的多核苷酸，包括(a)在具有ATCC PTA-4893或PTA-4894保藏编号的多核苷酸中编码的可变区，以及(b)在具有ATCCPTA-4895保藏编号的多核苷酸中编码的可变区。另一方面，本发明是经过分离的多核苷酸，包括(a) —或多个在具有ATCC PTA-4893或PTA-4894保藏编号的多核苷酸中编码的⑶R ;及/或(b) —或多个在具有ATCC PTA-4895保藏编号的多核苷酸中编码的⑶R。另一方面，本发明提供编码任何在本文中描述的抗体(包括抗体片段)或多肽的多核苷酸。另一方面，本发明提供包括任何在本文中公开的多核苷酸的载体(包括表达和选殖载体)和宿主细胞。从在本文中的说明，显然明确地排除在本发明之外的是由与老鼠单克隆抗体911的多核苷酸序列相同的多核苷酸序列所组成的多核苷酸具体实施例。在图1A和1B，以及在SEQ ID NO:9-14中，示出Mab 911的衍生CDR序列。另一方面，本发明是包括 编码E3轻链的多核苷酸和编码E3重链的多核苷酸的宿主细胞，其中该多核苷酸(们)编码具有ATCC第PTA-4893号及/或PTA-4894号保藏编号的E3轻链，且该多核苷酸编码具有ATCC第PTA-4895号保藏编号的E3重链。在一些具体实施例中，该宿主细胞包括多核苷酸，其包括(a)在具有ATCC第PTA-4893号或PTA-4894号保藏编号的多核苷酸中编码的可变区，及/或(b)在具有ATCC第PTA-4895号保藏编号的多核苷酸中编码的可变区。在一些具体实施例中，该宿主细胞包括编码(a) —或多个在具有ATCC第PTA-4893号或PTA-4894号保藏编号的多核苷酸中编码的CDR ;及/或(b) —或多个在具有ATCC第PTA-4895号保藏编号的多核苷酸中编码的CDR的多核苷酸。在一些具体实施例中，该宿主细胞是哺乳动物细胞。另一方面，本发明是与抗体E3结合的NGF的复合物。另一方面，该复合物是经过分离的。另一方面，该复合物实质上是经过纯化的。另一方面，本发明是与在本文中描述的抗体或多肽结合的NGF的复合物。另一方面，该复合物是经过分离的。另一方面，该复合物实质上是经过纯化的。另一方面，本发明是包括在本文中描述的多肽(包括抗体，如抗体E3)或多核苷酸的医药组合物，如包括抗体E3或包括抗体E3的片段的抗体的医药组合物，以及在药学上可接受的赋形剂。另一方面，本发明是产生抗体E3的方法，包括制备包括编码抗体E3的表达载体的宿主细胞，在容许抗体E3产生的条件下培养该宿主细胞或其后代；并纯化抗体E3。在一些具体实施例中，该表达载体包括在图2和3中示出的多核苷酸序列之一或两者。另一方面，本发明是产生抗体E3的方法，包括使编码E3轻链的多核苷酸和编码E3重链的多核苷酸在适当的细胞中表达，其中编码E3轻链的多核苷酸具有ATCC第PTA-4893号及/或ATCC第PTA-4894号保藏编号，且编码E3重链的多核苷酸具有ATCC第PTA-4895号保藏编号；通常接着回收及/或分离该抗体。另一方面，本发明提供产生任何在本文中描述的多肽(如抗体)的方法，借着使一或多个编码该抗体(其可以单一轻或重链分别表达，或可从一载体中表达轻链和重链两者)的多核苷酸在适当的细胞中表达，通常接着回收并/或分离感兴趣的抗体或多肽。

另一方面，本发明是使用在本文中公开的任何多肽(包括抗体，如抗体E3)来拮抗NGF (如人类NGF)生物活性的方法。在一具体实施例中，该方法包括使人类神经生长因子与在本文中描述的任何多肽(包括抗体E3)接触，借此拮抗、降低、阻断或压抑NGF活性(如人类神经生长因子活性)。另一方面，本发明是使用在本文中描述的任何多肽(包括抗体，如抗体E3)来检测NGF的方法。借着检测在NGF和在本文中描述的任何多肽(如抗体E3)之间的复合物，来检测NGF的存在。当在本文中使用"检测"一词时，包括有或无参考对照组的定性及/或定量检测(测量含量)。另一方面，本发明是利用给予有效含量的包括抗体E3或在本文中描述的任何多肽(包括抗体)或多核苷酸具体实施例的组合物，来治疗疼痛的方法。在一些具体实施例中，该疼痛是手术后的疼痛。另一方面，本发明是利用对个体给予有效含量的抗-NGF拮抗剂抗体，在该个体中预防或治疗风湿性关节炎疼痛的方法。根据本发明，已经显示抗-NGF拮抗剂抗体能够抑制或阻断与风湿性关节炎有关的疼痛。在一些具体实施例中，在给予抗-NGF拮抗剂抗体之后大约24小时内减轻了该疼痛。在一些具体实施例中，在给予抗-NGF拮抗剂抗体之后大约4天内减轻了该疼痛。在一些具体实施例中，在个体中观察到改善炎症状况的迹象之前，或在没有改善的迹象时，减轻该疼痛。
另一方面，本发明提供在个体中减少风湿性关节炎疼痛的发生、改善风湿性关节炎疼痛、抑制风湿性关节炎疼痛、减轻风湿性关节炎疼痛及/或延迟风湿性关节炎疼痛之发作、发展或进行的方法，该方法包括对该个体给予有效含量的抗-NGF拮抗剂抗体。另一方面，本发明提供在个体中治疗与风湿性关节炎有关的炎症恶病质(体重减轻)的方法，包括给予有效含量的抗-NGF拮抗剂抗体。另一方面，本发明是借着对个体给予有效含量的神经生长因子的拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)，在个体中预防或治疗骨关节炎疼痛的方法。另一方面，本发明提供在个体中减少骨关节炎疼痛的发生、改善骨关节炎疼痛、抑制骨关节炎疼痛、减轻骨关节炎疼痛及/或延迟骨关节炎疼痛之发作、发展或进行的方法，该方法包括对该个体给予有效含量的NGF抑制剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。另一方面，本发明提供在患有骨关节炎的个体中改善物理功能的方法，该方法包括对该个体给予有效含量的NGF抑制剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。

另一方面，本发明提供在患有骨关节炎的个体中改善僵硬的方法，该方法包括对该个体给予有效含量的NGF抑制剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)。在一些具体实施例中，该个体为人类。在一些具体实施例中，为了治疗骨关节炎疼痛，抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率是在每天一次和每10周一次之间，或是更低的频率。另一方面，本发明提供包括任一或多个在本文中描述的组合物的试剂盒和组合物。这些试剂盒，通常是在适当的包装中并提供适当的说明书，适用在本文中描述的任何方法。本发明也还提供任何适合在本文中描述的任何用途的组合物和试剂盒，无论是在医药品的用途，及/或用来制造医药品的前后文中。附图简要说明图1A显示E3抗体的重链可变区的氨基酸序列(标示为"6"和"5+亲和性成熟H3")。分别借着加下标线的原文和粗斜体的原文来描述Chothia⑶Rs和Kabat⑶Rs。图1A也显示下列重链可变区氨基酸序列的直线排列:(1)老鼠911抗体的⑶Rs Hl (SEQ IDNO:9),H2(SEQ ID NO: 10)及 H3 (SEQ ID NO: 11) ; (2) VH4-59 人类生殖种系接受者序列(标示为"VH4-59"或"2" ) (SEQ ID NO:69) ； (3)以老鼠抗体911的衍生CDRs移植的接受者序列(标示为"CDR移植"或"3" ) (SEQ ID NO:70) ; (4)⑶R移植的接受者序列，包括V71K取代(标示为"3+—框架突变"或"4" ) (SEQ ID NO:71) ； (5)含有亲和性成熟CDRs Hl和H2的纯种系(标示为"5"或"4+亲和性成熟H1，H2" ) (SEQ ID NO -J2);以及抗体E3 (如上述)(SEQ ID NO:1)。图1B显示E3抗体的轻链可变区的氨基酸序列(标示为"5"或"4+亲和性成熟L3")。分别借着加下标线的原文和粗斜体的原文来描述Chothia⑶Rs和Kabat⑶Rs。图1B也显示下列轻链可变区氨基酸序列的直线排列:(I)老鼠911抗体的⑶Rs LI (SEQ IDNO:12)，L2(SEQ ID NO: 13)及L3 (SEQ ID NO: 14) ; (2) 08人类生殖种系接受者序列(标示为"08"或"2" ) (SEQ ID NO:73) ； (3)以老鼠抗体911的衍生⑶Rs移植的接受者序列(标示为"CDR移植"或"3" ) (SEQ ID NO:74) ; (4)CDR移植的接受者序列(标示为"3+亲和性成熟LI，L2"或"4" ) (SEQ ID NO:75) ； (5)含有亲和性成熟CDRs LI和L2的纯种系(标示为"5"或"4+亲和性成熟L3");以及抗体E3(如上述)(SEQ ID NO:2)。
图2显示包括编码抗体E3的重链可变区的多核苷酸序列的多核苷酸序列(SEQ IDNO:76)。图3显示包括编码抗体E3的轻链可变区的多核苷酸序列的多核苷酸序列(SEQ IDNO:77)。图4是在各种浓度的人类和大鼠NGF的存在下，表示E13.5神经元的NGF-依赖性存活的图表。X轴代表NGF浓度(纳克/毫升)且Y轴代表计算出的神经元。图5为在0.04纳克/毫升人类NGF (约1.5pM ;在下图中示出)或0.4纳克/毫升人类NGF(约15pM ;在上图中示出)的存在下，比较各种Fabs的NGF阻断效力的图表。在各种浓度的Fab E3 ;老鼠911Fab ;和Fab H19-L129与Fab 8L2-6D5中，评估E13.5老鼠三叉神经元的存活。在每个NGF浓度下，计算每个Fab的IC5tl(以pM计)，并在表9中示出。Fab E3在15pM人类NGF的存在下以大约21pM的IC50，并在1.5pM人类NGF的存在下以大约1.2pM的IC5tl，强有力地阻断了人类NGF-依赖性的三叉神经元存活。Fab 3C和H19-L129也强有力地阻断了人类NGF-依赖性的三叉神经元存活。在两图中，X轴代表抗体浓度(nM)且Y轴代表计算出的神经元。1.5pM的NGF约为IC5tl,而15pM则代表NGF的饱和浓度。图6为在0.04纳克/毫升大鼠NGF(约1.5pM ;在下图中示出)或0.4纳克/毫升大鼠NGF(约15pM ;在上图中示出)的存在下，比较各种Fabs的NGF阻断效力的图表。在各种浓度的Fab E3 ;老鼠Fab 911 ;和Fab H19-L129与Fab 8L2-6D5中，按照上述评估E13.5老鼠三叉神经元的存活。在每个NGF浓度下，计算每个Fab的IC5tl (以pM计)，并在表9中示出。Fab E3在15pM大鼠NGF的存在下以大约31.6pM的IC5(I，并在1.5pM大鼠NGF的存在下以大约1.3pM的IC5tl，强有力地阻断了人类NGF-依赖性的三叉神经元存活。Fab 3C和H19-L129也强有力地阻断了大鼠NGF-依赖性的三叉神经元存活。1.5pM的NGF约为IC5(I，而15pM则代表NGF的饱和浓度。在两图中，X轴代表抗体浓度(nM)且Y轴代表计算出的神经元。图7是表示在手术后24小时评估静止疼痛，并显示以0.02毫克/千克、0.1毫克/千克、0.6毫克/千克或I毫克/千克的抗-NGF抗体E3治疗降低了疼痛的图表。"表示与阴性对照组有统计学上的显著差异(P < 0.5)。图8是表示在手术后24小时评估静止疼痛，并显示以0.5毫克/千克的抗-NGF抗体E3治疗，当在手术后2小时注射，显著(p<0.05)地降低了静止疼痛的图表。图9是显示人类NGF与老鼠抗体911 (Fab)的结合亲和性的BIAcore分析的结果的图表。老鼠抗体911以3.7nM的Kd, 8.4xl0^5s^的koff和2.2xl04Ms^的kon与人类NGF结
合
图10是显示人类NGF与抗体E3 (Fab)(称为"3E Fab")的结合亲和性的BIAcore分析的结果的图表。E3抗体以0.07nM的Kd (并以大约6.0xlO^s^1的km和大约4.2xl0^5s^的kf)与人类NGF结合。图11是表示抗体E3阻断NGF与其受体trkA和p75的交互作用的图表，借着在NGF和trkA (以黑色圆形表示)以及NGF和p75(以空心正方形表示)之间检测到的结合百分比来评估。X轴代表抗体3E (Fab)的浓度，而Y轴代表NGF结合(最大值RU的百分比)。增加Fab 3E的浓度，阻断了 NGF与p75和trkA两者的交互作用，可借着减少的信号来表示(以RU来测量)。当抗体E3 (Fab)浓度等于NGF浓度时，没有观察到任何NGF结合(以信号为O来表不)。图12是表示完整抗体E3和Fab E3的人类NGF阻断能力的图表。在人类NGF和各种浓度的Fab E3及抗体E3的存在下，评估E13.5老鼠三叉神经元的存活。X轴代表NGF结合位置(nM)，而Y轴代表三叉神经(TG)元的标准化计数。当将完整抗体和Fab的浓度对NGF结合位置的数目标准化(Fab有一个结合位置，而完整抗体有两个结合位置)时，完整抗体E3和Fab 3E，对三叉神经元的NGF-依赖性存活显示出类似的抑制程度。图13是表示在0.4纳克/毫升人类NGF(饱和条件)的存在下，各种浓度(20、
4、0.8、0.16、0.032、0.0064、0.00128 和 0.0nM)的抗体 E3 (实心三角形；称为"3E ")、抗体911 (实心圆形)和trkA受体免疫粘附素(immunoadhesin)(阴暗的正方形；称为"trkA-Fc ")，抑制E13.5三叉神经元的NGF-依赖性存活的能力的图表。X轴代表抗体浓度(nM)且Y轴代表计算出的神经元。这些结果证实抗体E3阻断了 NGF，明显比老鼠单克隆抗-NGF抗体911或trkA免疫黏附素更好。图14是表示抗-NGF拮抗剂抗体E3(在图中称为"3E")或Fab 911不能抑制由NT3、NT4/5和MSP促进的神经元存活的图表，甚至是高达200nM的抗体浓度。数据代表在培养48小时之后，相对于在每个实验的阳性对照组中观察到存活(在饱和NGF浓度的存在下生长的三叉神经元100%存活)的平均存活百分比(土平均值的标准差，每个数据点η =3)。在不加神经营养素(称为"对照组")、400pM NGF (称为"NGF-400pM" )、10nMNT3 (称为"NT3-10nM)或600pM MSP (称为"MSP_600pM")的存在下，使用各种浓度(20nM、2nM或0.2nM)的E3Fab (在图中称为"3E")和老鼠抗体911Fab。图15是表示抗-NGF拮抗剂抗体E3 (Fab或完整抗体)(在图中称为"3E")或老鼠抗体911 (Fab或完整抗体)不能抑制由NT3、NT4/5和MSP促进的神经元存活的图表，甚至是高达200nM的抗体浓度。在不加神经营养素(称为"无因子")、400pM NGF(称为"NGF-400pM" )、IOnM NT3(称为"NT3_10nM)或 600pM MSP (称为"MSP_600pM")的存在下，使用各种浓度(200nM和80nM)的E3Fab和完整抗体，以及老鼠抗体911完整抗体和 Fab0图16是表示抗-NGF拮抗剂抗体E3或Fab E3不能抑制由BDNF、NT4/5或LIF促进的E17结节神经元存活的图表。也测试老鼠抗-NGF拮抗剂抗体911，并观察到类似的结果。在不加神经营养素(称为"无因子")、400pM BDNF(称为"BDNF_400pM" )、400pMNT4/5(称为"NT4/5-400pM")或 2.5nM LIF(称为"LIF-2.5nM")的存在下，测试各种浓度(200nM或80nM)的完整抗体E3(在图中称为"3E" )、Fab E3、完整抗体911或Fab911。图17是表示抗-NGF拮抗剂抗体E3或Fab E3不能抑制由BDNF、NT4/5或LIF促进的E17结节神经元存活的图表。在不加神经营养素(称为"对照组")、400pMBDNF(称为"BDNF-400pM" )、400pM NT4/5(称为"NT4/5_400pM")或 2.5nM LIF(称为"LIP-2.5nM")的存在下，测试各种浓度(200nM.20nM.2nM)的Fab E3(在图中称为"E3")或 Fab 911。图18是在第14和19天给予抗-NGF抗体(E3和911)之后，证实在关节炎大鼠(风湿性关节炎模式)中的感受伤害反应的图表。将E3(l毫克/千克，静脉内，第14和19天)、911 (10毫克/千克,静脉内， 第14和19天)或n引哚(n引哚美辛(indomethacin) 3毫克/千克，10天内每天口服)给予关节炎老鼠。以平均值土sem,按mV计来表现发声强度值。图19是在第14和19天给予抗-NGF抗体之后，证实抗-NGF抗体在关节炎大鼠(风湿性关节炎模式)中对体重的影响的图表。将E3(l毫克/千克，静脉内，第14和19天)、911(10毫克/千克，静脉内，第14和19天)或吲哚(吲哚美辛3毫克/千克，10天内每天口服)给予关节炎老鼠。以平均值土sem，按公克计来表现体重值。图20是在第14和18天给予不同剂量的抗-NGF抗体E3 (0.003毫克/千克、0.03毫克/千克、0.3毫克/千克和5毫克/千克)之后，证实在关节炎大鼠(风湿性关节炎模式)中的感受伤害反应的图表。以平均值土sem，按mV计来表现发声强度值。图21是在第14和18天给予不同剂量的抗-NGF抗体E3 (0.03毫克/千克、0.3毫克/千克和5毫克/千克)之后，证实在关节炎大鼠(风湿性关节炎模式)中抗-NGF抗体E3对第14天的体重百分比(对第14天标准化)的影响的图表。图22是在第14和18天给予不同剂量的抗-NGF抗体E3 (0.03毫克/千克、0.3毫克/千克和5毫克/千克)之后，证实在关节炎大鼠(风湿性关节炎模式)中抗-NGF抗体E3对体重丧失的影响的图表。将体重值对第O天标准化。图23表示E3重链可变区氨基酸序列(图23A)和轻链可变区氨基酸序列(图23B)，使用连续编号Kabat编号和Chothia编号来编号。图24表示在给予抗-NGF抗体E3之后，与在第O天的基准线相比较，在平均每日疼痛强度上的改变。Y轴代表与在第O天的平均每日疼痛强度相比较，在平均每日疼痛强度(VAS分数)上的降低。X轴代表在给予抗-NGF抗体E3之后的天数。

图25表示在给予抗-NGF抗体E3之后的平均VAS分数。"SE"意指标准差。图26表示在给予抗-NGF抗体E3之后从第2到第14天，和从第2到第28天，在总计疼痛强度差异(SPID)上的最大降低百分比。图27表示在给予不同剂量(3微克/千克、10微克/千克、30微克/千克、100微克/千克和300微克/千克)的抗-NGF抗体E3之后从第I到第28天，对WOMAC的最小二乘方平均值(LSM)反应、疼痛次量表(subscale)、物理功能次量表和僵硬次量表。"SE"意指标准差。X轴代表所给予的抗-NGF抗体E3的剂量。"*"表示在Dunnett' s检定之下，与基准线相比较P < 0.05。
具体实施例方式在本文中公开的本发明，提供抗-NGF拮抗剂抗体，其以高亲和性与NGF (如人类NGF)结合。本发明还提供衍生自与NGF结合的E3的抗体和多肽，以及制造和使用这些抗体的方法。在一些具体实施例中，本发明提供人类化抗体E3，其与神经生长因子("NGF")结合，以及制造和使用该抗体的方法。本发明也还提供与NGF结合的E3多肽(包括抗体)，以及编码E3抗体及/或多肽的多核苷酸。在本文中公开的本发明，也提供了利用给予在治疗上有效的含量的抗-NGF拮抗剂抗体在个体中预防及/或治疗风湿性关节炎疼痛的方法。在本文中公开的本发明，也提供了利用给予在治疗上有效的含量的NGF拮抗剂(如抗-NGF拮抗剂抗体)在个体中预防及/或治疗骨关节炎疼痛的方法。
本发明还提供调整抗体的亲和性的方法，以及表征CDR区的特征的方法。通用技术除非另行指定，本发明的实施将使用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生化和免疫学的传统技术，这些均为本领域技术人员所擅长的。在文献中充分说明了这类技术，如 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版(Sambrook等人，1989) Cold Spring Harbor Press ；01igonucleotide Synthesis (M.J.Gait，编辑，1984) ；Methods in Molecular Biology, Humana Press ；Cell Biology:A LaboratoryNotebook (J.E.Cellis 编辑，1998) Academic Press ；Animal Cell Culture (R.1.Freshney编辑，1987) ；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P.Mather 和 P.E.Roberts，
1998)PlenumPress ；Cell and Tissue Culture !Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,和 D.G.Newell,编辑，1993-1998) J.Wiley 和 Sons ;Methods inEnzymology(Academic Press，Inc.) ；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和 C.C.Blackwell 编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M.Miller和 M.P.Calos 编辑，1987) ；Current Protocols in Molecular Biology (F.M.Ausubel等人，编辑，1987) ；PCR:The Polymerase Chain Reaction，(Mullis 等人，编辑，1994)；Current Protocols in Immunology (J.E.Coligan 等人，编辑，1991) ；Short Protocolsin Molecular Biology (Wiley and Sons，1999) ； Immunobiology(C.A.Janeway andP.Travers,1997) ；Antibodies(P.Finch,1997) ；Antibodies:a practical approach (D.Catty 编辑，IRL Press，1988-1989) ；Monoclonal antibodies:a practical approach (P.Shepherd 和 C.Dean 编辑，Oxford University Press, 2000) ；Using antibodies:a laboratory manual(E.Harlow 和 D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press，
1999)；The Antibodies (M.Zanetti 和 J.D.Capra 编辑，Harwood Academic Publishers,1995);以及 Cancer !Principles and Practice of Oncology (V.T.DeVita 等人，编辑，J.B.Lippincott Company,1993)。定 义"抗体"是能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区的抗原认知位置，与标靶(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等等)特异性结合的免疫球蛋白分子。当在本文中使用时，该名词不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，还包括其片段(如Fab、Fab'、F(ab^ )2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白，以及包括抗原认知位置的免疫球蛋白分子的任何其他修改组态。抗体包括任何种类的抗体，如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，且抗体不一定是任何特殊的种类。依据抗体重链的恒定功能部位的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分成不同的种类。有五大类的免疫球蛋白:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，而这些有可能进一步细分成亚类(同型物)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。分别将与不同种类免疫球蛋白相符合的重链恒定功能部位称为α、δ、ε、Y和μ。已完全明了不同种类的免疫球蛋白的次单元结构和三维组态。" Fv"是含有完整抗原-认知和-结合位置的抗体片段。在双链Fv物种中，该区域是由以紧密、非共价结合的一重链和一轻链可变功能部位的二聚体组成。在单链Fv物种中，可借着有弹性的肽交联剂，共价连接一重链和一轻链可变功能部位，使得该轻链和重链可以类似在双链Fv物种中的二聚体结构来结合。在该组态中，每个可变功能部位的三个⑶Rs交互作用，将抗原-结合特异性限定在VH-VL 二聚体的表面上。然而，甚至单一的可变功能部位(或半个Fv，仅包括对抗原特异的3个CDRs)也具有认出抗原并与其结合的能力，虽然通常是以比完整结合位置更低的亲和性。Fab片段也含有轻链的恒定功能部位和重链的第一个恒定功能部位(CHl)。FaY片段与Fab片段之差异在于在重链CHl功能部位的羧基终端加上数个残基，包括一或多个得自抗体绞链区的半胱氨酸。"单克隆抗体"意指均一的抗体族群，其中该单克隆抗体是由涉及抗原的选择性结合的氨基酸(天然存在或非天然存在的)所组成。单克隆抗体的族群针对单一的抗原性位置是高度特异性的。"单克隆抗体"一词不仅包括完整的单克隆抗体和全长的单克隆抗体，还包括其片段(如Fab、Fabi ,F(ab/ )2、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白，以及包括与抗原结合的特异性和能力所需的抗原认知位置的免疫球蛋白分子的任何其他修改组态。本发明并非企图限制关于抗体的来源或其制造方式(例如借着融合瘤、嗤囷体选择、重组表达、转基因动物等等)。当在本文中使用时，"人类抗体"意指抗体具有与由人类产生，及/或已经使用现有技术中已知或在本文中公开的制造人类抗体的任何技术制造的抗体一致的氨基酸序列。人类抗体的定义，包括由至少一个人类重链多肽或至少一个人类轻链多肽所组成的抗体。这类实例之一，是包括老鼠轻链和人类重链多肽的抗体。可使用现有技术中已知的各种技术产生人类抗体。在一具体实施例中，人类抗体选自表达人类抗体的噬菌体库(Vaughan等人，1996, Nature Biotechnology, 14:309-314 ；Sheets 等人，1998, PNAS, (USA)95:6157-6162 ;Hoogenboom 和 Winter, 1991, J.Mol.Biol.，227:381 ；Marks 等人，1991，J.Mol.Biol.,222:581)。也可利用将人类免疫球蛋白位点导入转基因动物，例如其中已经使内源免疫球蛋白基因部分或全部失活的老鼠中，来制造人类抗体。在美国专利第5，545，807号；5，545，806 号；5，569，825 号；5，625，126 号；5，633，425 号和 5，661，016 号中公开了该方法。或者，可借着永存不死的人类B淋巴细胞来制备人类抗体，其产生针对标靶抗原的抗体(可从个体中回收这类B淋巴细胞，或可以是已经在活体外免疫的)。参见，例如Cole等人，Monoclonal Anti bodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss,第 77 页(1985) ；Boemer等人，1991，J.1mmunol.,147(1):86_95 ;以及美国专利第 5，750，373 号。"嵌合型抗体"意指其中每个重和轻链的氨基酸序列的一部分均是与在衍生自特定物种的抗体中的相对应序列同源的，或属于特定种类，而链的剩余断片是与在其他物种中的相对应序列同源的那些抗体。在这些嵌合型抗体中，轻链和重链两者的可变区通常模仿衍生自一哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定部分则是与抗体中衍生自另一物种的序列同源的。这类嵌合形式的一个显著优点是，例如可使用迅速可用的融合瘤或得自非人类宿主生物的B细胞，从目前已知的来源便利地衍生可变区，并与衍生自例如人类细胞制备物的恒定区混合。虽然可变区具有容易制备的优点，但特异性并不受其来源影响，恒定区则是人类，比得自非人类来源的恒定区，更不可能在注射该抗体时从人类个体中诱发免疫反应。然而，该定义并未受限于该特殊实例。"有功能的Fe区"具有固有序列Fe区的至少一种效应物功能。代表性的"效应物功能"包括Clq结合；补体-依赖性细胞毒性(CDC) ；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞-调解的细胞毒性(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调(down-regulate)等等。这类效应物功能通常需要将与结合功能部位(例如抗体可变功能部位)结合的Fe区，并可使用现有技术中已知用来评估这类抗体效应物功能的各种测定来对其评估。"固有序列Fe区"包括与自然发现的Fe区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。"变种Fe区"包括与固有序列Fe区之差异为至少一个氨基酸修改，但仍保留固有序列Fe区的至少一个效应物功能的氨基酸序列。变种Fe区与固有序列Fe区或与双亲多肽的Fe区相比较，最好具有至少一个氨基酸取代，例如从大约I到大约10个氨基酸取代，且最好是在固有序列Fe区或在双亲多肽的Fe区中，具有从大约I到大约5个氨基酸取代。在本文中，变种Fe区最好与固有序列Fe区及/或双亲多肽的Fe区，将具有至少大约80%序列同一性，且与其最好有至少大约90%序列同一性，更佳的是与其有至少大约95%序列同一性。当在本文中使用时，"抗体-依赖性细胞-调解的细胞毒性"和"ADCC"意指细胞-调解的反应，其中表达Fe受体(FcRs)(例如自然杀手(NK)细胞、嗜中性白血球和巨噬细胞)的非特异性细胞毒性细胞识别在标靶细胞上已结合的抗体，随后引起标靶细胞的溶解。可使用活体外的ADCC测定，如在美国专利第5，500, 362号或5，821，337号中描述的，评估感兴趣分子的ADCC活性。适用于这类测定的效应物细胞包括周围血液单核细胞(PBMC)和NK细胞。或者，或另外也可在活体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模式中，如在 Clynes 等人，1998，PNAS(USA)，95:652_656 中公开的。当在本文中使用时，"Fe受体"和"FcR"描述与抗体的Fe区结合的受体。较佳的FcR是固有序列人类FcR。此外，较佳的FcR是与IgG抗体结合的FcR( Y受体)，并包括FcyR KFcyR II和Fe Y RIII亚类的受体，包括对偶基因变体，以及这些受体的其它接合形式。FcyR II受体包括Fe yR IIA("激活受体")和Fe Y RII B("抑制受体")，其具有类似的氨基酸序列，主要的差异为其细胞质功能部位。在Ravetch和Kinet, 1991, Ann.Rev.1mmunol.，9:457_92 ；Capel 等人，1994, Immunomethods, 4:25_34 ；以及 de Haas 等人，1995，J.Lab.Clin.Med. ，126:330_41 中回顾了 FcRs。" FcR"也包括新生儿受体FcRn，其负责将成熟IgGs运送至胎儿(Guyer等人，1976, J.1mmunol.，117:587 ；以及Kim等人，1994,J.Tmmunol.,24:249)。"补体依赖性细胞毒性"和"CDC"意指在补体存在下的标靶溶解。利用补体系统的第一个补体(Clq)与已与关联抗原复合的分子(例如抗体)结合，发动补体激活路径。欲评估补体激活作用，可进行⑶C测定,例如像是在Gazzano-Santoro等人，J.1mmunol.Methods, 202: 163 (1996)中的描述。当在本文中使用时，可互换使用的名词"E3"、" 3E"和"抗体E3"，意指包括分别在图1A(SEQ ID N0:1)和1B(SEQ ID NO:2)中示出的重链和轻链可变区的氨基酸序列的抗体。在图1A和IB中，以图解描述抗体E3的⑶R部分(包括Chothia和Kabat⑶Rs)。图2和3分别显示编码重和轻链的多核苷酸，包括分别在图1A和IB中示出的重和轻链可变区。在实例中说明E3的产生及特征。与E3有关的不同生物功能，包括但不限于与NGF结合并抑制NGF生物活性及/或由NGF发送信号来调解之下游路径(们)的能力；以及抑制老鼠E13.5三叉神经元的NGF-依赖性存活的能力。如同在本文中讨论的，本发明的抗体可具有这些特征之一或多项。在一些具体实施例中，"E3" —词意指由(a)编码具有ATCC第PTA-4893号或ATCC第PTA-4894号保藏编号的E3轻链的多核苷酸，以及(b)编码具有ATCC第PTA-4895号保藏编号的E3重链的多核苷酸编码的免疫球蛋白。当在本文中使用时，抗体的"免疫特异性"结合意指抗原特异性的结合交互作用发生在抗体的抗原结合位置与由该抗体认出的特定抗原之间(即该抗体在ELISA或其他免疫测定中与该蛋白质反应，但与无关蛋白质没有可检测到的反应)。一个抗原决定位与抗体或多肽"特异性地结合"或"优先结合"(在本文中可互换使用)，是现有技术中已熟知的字眼，且判定这类特异性或优先结合的方法也是现有技术中已熟知的。若一分子以比它与其它细胞或物质更频繁、更迅速，并以更长的期间及/或更高的亲和性与一特定细胞或物质反应或结合，便说该分子表现出"特异性地结合"或"优先结合"。若一抗体以比它与其他物质更高的亲和性、抗体亲抗原性，更迅速及/或以更长的期间结合，便说该抗体与标靶"特异性地结合"或"优先结合"。例如，与NGF抗原决定位特异性地或优先结合的抗体，是以比它与其他NGF抗原决定位或非NGF抗原决定位更高的亲和性、抗体亲抗原性，更迅速及/或以更长的期间与该抗原决定位结合的抗体。借着阅读该定义也明了，例如与第一个标靶特异性地或优先结合的抗体(或部分或抗原决定位)，可能是或可能不是特异性地或优先与第二个标靶结合。"特异性地结合"或"优先结合"不一定需要(虽然它可能包括)独占的结合。通常，但不一定，在提到结合时意指优先结合。名词"多肽"、"低聚肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，意指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直线或分支的，其可包括经过修改的氨基酸，且其可被非氨基酸中断。该名词也包括已经以天然方式或通过干涉方式修改的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化作用、脂化作用、乙酰化作用、磷酸化作用或任何其他的操作或修改，如与标记组份共轭。在该定义中，也包括例如含有一或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)的多肽，以及在现有技术中已知的其他修改。因为本发明的多肽是以抗体为基础，该多肽当然可以单链或结合链的形式存在。"多核苷酸"或"核酸"在本文中可互换使用，意指任何长度的核苷酸的聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修改的核苷酸或碱基，及/或其类似物，或任何能够由DNA或RNA聚合酶并入聚合物内的物质。多核苷酸可包括经修改的核苷酸，如甲基化的核苷酸及其类似物。若出现修改，可能在聚合物组装之前或之后，给予对该核苷酸结构的修改。可利用非核苷酸组份打断核苷酸的序列。可在聚合作用之后进一步修改多核苷酸，如与标记组份共轭。其他类型的修改包括，例如"加帽"、以类似物取代一或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间的取代，像是例如具有不带电键合(例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰氨酸、氨基甲酸酯等等)和带电荷键合(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等等)的那些，含有垂悬部分的那些，像是例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、Ply-L-离氨酸等等)，具有嵌入剂的那些(例如吖啶、补骨脂素等等)，含有螯合剂的那些(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等等)，含有烷化剂的那些，带有修改键合的那些(例如α异头核酸等等)，以及多核苷酸(们)的未修改形式。此外，任何经常出现在糖中的羟基基团，也可被例如膦酸盐基团、磷酸盐基团置换，以标准保护基保护，或激活，来制备与其他核苷酸的额外键合，或可与固体支撑物共轭。可将5'和3'终端OH磷酸化，或以胺或I至20个碳原子的有机加帽基团部分取代。也可将其他的羟基衍生成标准保护基。多核苷酸也可含有核糖或去氧核糖糖的类似形式，通常是现有技术中已知的，包括例如2' H3-甲基、1 -O-烯丙基、2'-氟-或2' _叠氮-核糖、碳环糖类似物、ct -异头糖类、表异构糖类，如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、批喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、非环化类似物和非碱基核苷类似物，如甲基核糖苷。可利用其它连接基来取代一或多个磷酸二酯键合。这些其它连接基包括，但不限于其中以p(0)s("硫代酯")、P(S)S(" 二硫代酯")、(o)nr2("酰胺化物")> P(O)R, P(O)OR1、⑶或CH2("甲缩醛(formacetal)")置换磷酸盐的具体实施例，其中每个R或!^分别为H或经取代或未经取代的烷基(1-20C)，其可视需要含有(-0-)键合、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。在多核苷酸中并非全部的键合都要是相同的。先前的说明适用于所有在本文中提及的多核苷酸，包括RNA和DNA。抗体的"可变区"意指单独或混合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重和轻链的可变区分别由四个框架区(FR)所组成，由三个也称为高变区的互补性决定区(⑶Rs)连接。在每个链中的⑶Rs都由紧邻的FRs维持在一起，并与来自其他链的⑶Rs形成抗体的抗原结合位置。至少有两种判定CDRs的技术:(I)以交叉-物种序列变异性为基石出的方法(BP Kabat 等人 Sequences of Proteins of Immunological Interest,(第 5版，1991, National Institutes of Health, Bethesda MD));以及(2)以抗原-抗体复合物的结晶学研究为基础的方法(Chothia等人(1989)Nature 342:877 ;Al_lazikani等人(1997) J.Molec.Biol.273:927-948))。当在本文中使用时，CDR可以意指以任一方法或两种方法的组合定义的⑶Rs。抗体的"恒定区"意指单独或混合的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。当在本文中使用时，"神经生长因子"和"NGF"意指神经生长因子及其保留至少一部分NGF的生物活性的变体。当在本文中使用时，NGF包括所有哺乳动物物种的固有序列NGF，包括人类、狗、猫、马或牛。

" NGF受体"意指与NGF结合或被NGF激活的多肽。NGF受体包括任何哺乳动物物种的TrkA受体和p75受体，包括但不限于人类、狗、猫、马、灵长类或牛。当在本文中使用时，"抗-N G F拮抗剂抗体"(也可称为"抗-NGF抗体")意指能够与NGF结合，并抑制NGF的生物活性及/或借由NGF发送信号调解的下游路径(们)的抗体。抗-NGF拮抗剂抗体包括阻断、拮抗、压抑或降低(包括明显地)NGF生物活性的抗体，包括借由NGF发送信号调解的下游路径,如受体结合及/或诱发对NGF的细胞反应。为了本发明的目的，要明确地理解名词"抗-NGF拮抗剂抗体"包括所有先前确认的名词、标题，以及功能状态和特征，其中以任何有意义的程度，使NGF本身、NGF生物活性(包括但不限于其调解任何方面的手术后疼痛的能力)或生物活性的结果无效、减少或中和。在一些具体实施例中，抗-NGF拮抗剂抗体与NGF结合并预防NGF 二聚作用及/或与NGF受体(如p75及/或trkA)结合。在其他的具体实施例中，抗-NGF抗体与NGF结合,并预防trkA受体二聚作用及/或trkA自我磷酸化作用。在本文中提供抗-NGF拮抗剂抗体的实例。NGF的"生物活性"通常意指与NGF受体结合及/或激活NGF受体发送信号路径的能力。生物活性包括，但不限于下列之一或多项:与NGF受体(如p75及/或trkA)结合的能力；提高trkA受体二聚作用及/或自我磷酸化作用的能力；激活NGF受体发送信号路径的能力；在细胞生理学上促进细胞分化、增殖、存活、生长及其他变化的能力，包括(在神经元的案例中，包括周围和中枢神经元)神经元形态学上的变化、突触生成(synaptogenesis)、突触功能、在创伤之后的神经递质及/或神经肽释放和再生；促进老鼠E13.5三叉神经元存活的能力；以及调解疼痛，包括手术后疼痛的能力。当在本文中使用时，"实质上纯的"意指一物质是至少50%纯的(即不含污染物)，更优选的是至少90%纯的，更优选的是至少95%纯的，更优选的是至少98%纯的，更优选的是至少99%纯的。"宿主细胞"包括个别的细胞或细胞培养物，其可以是或已经是并入多核苷酸插入物的载体的接受者。宿主细胞包括单一宿主细胞的子代，且该子代可能因为天然、偶然或故意的突变作用，与原始的双亲细胞不一定是完全相同的(在形态学或在基因组DNA补体上)。宿主细胞包括在活体外以本发明的多核苷酸(们)转移感染的细胞。当在本文中使用时，"治疗"是获得有利或想要的临床结果的方法。为了本发明，有利或想要的临床结果包括，但不限于下列之一或多项:改善或减轻任何方面的疼痛，包括急性、慢性、炎症性、神经病变、手术后的疼痛、风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛。为了本发明，有利或想要的临床结果包括，但不限于下列之一或多项:减轻严重性，缓和一或多个与疼痛有关的症状，包括任何方面的疼痛(如缩短疼痛期间、降低疼痛的严重性或感觉)。药物、化合物或医药组合物的"有效含量"是足以达成有利或想要的结果，包括临床结果，如减轻 或降低疼痛感觉的量。可以一或多次投药，来给予有效含量。为了本发明，有效含量的药物、化合物或医药组合物是足以治疗、改善、降低强度并/或预防疼痛的量，包括手术后疼痛、风湿性关节炎疼痛及/或骨关节炎疼痛。在一些具体实施例中，"有效含量"可降低疼痛至静止(静止疼痛)或以机械方式诱导的疼痛(包括在移动之后的疼痛)，或两者，并可在切入、割伤、撕裂或受伤之前、期间或之后，及/或在疼痛刺激之前、期间或之后给药。就像在临床状况中所了解的，药物、化合物或医药组合物的有效含量，可单独达到，或可并用其他的药物、化合物或医药组合物一起达到。因此，可从给予一或多种治疗剂的情况来考量"有效含量"，若与一或多个其他制剂并用，可能或达到想要的结果，便可认为以有效含量给予该单一制剂。疼痛的"降低发生率"意指任何的降低严重性(其可包括减少对于该状况经常使用的其他药物及/或疗法的需要，及/或减少(例如接触)用量，包括例如鸦片制剂)、期间，及/或频率(包括，例如，在个体中延迟或增加到出现手术后疼痛的时间)。本领域技术人员了解个体可能随着对治疗的反应而有所不同，因此，例如"在个体中降低风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛的发生率的方法"，表示以合理的期待为基础给予抗-NGF拮抗剂抗体，使得这类投药可能得以在特殊个体中引起这类的发生率降低。"改善"疼痛或一或多个疼痛的症状(如风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛)，意指与未给予抗-NGF拮抗剂抗体相比较,减少或改善一或多个疼痛的症状。"改善"也包括缩短或减少症状的期间。"减轻"疼痛或一或多个疼痛的症状(如风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛)，意指在以根据本发明的抗-NGF拮抗剂抗体治疗的个体或个体族群中，减少一或多个手术后疼痛的不受欢迎的临床征候的程度。当在本文中使用时，"延迟"疼痛的发展意指延缓、阻止、减慢、妨碍、使稳定及/或延后疼痛的进行，如手术后疼痛、风湿性关节炎疼痛或骨关节炎疼痛。该延迟可以是不同长度的时间，视待治疗的疾病及/或个体的病史而定。对本领域技术人员而言，显然充分或重大的延迟，事实上可包含预防，在这一点上该个体不发展出疼痛。"延迟"症状发展的方法就是在与不使用该方法相比较时，在特定的时间框架中降低发展出症状的可能性，及/或在特定的时间框架中降低症状之程度的方法。这类比较通常是以临床研究为基础，使用有统计学意义的数目的实验者。当在本文中使用时，"疼痛"意指任何病因学的疼痛，包括急性和慢性疼痛，以及任何有炎症组份的疼痛。疼痛的实例包括手术后疼痛、操作后疼痛(包括牙齿痛)、偏头痛、头痛和三叉神经痛、与烧伤、创伤或肾结石有关的疼痛、与外伤(包括头部外伤)有关的疼痛、神经病变的疼痛、与肌肉-骨胳病症有关的疼痛，如风湿性关节炎、骨关节炎、脊椎僵直性脊椎炎、血清-阴性(非风湿性)关节病、非关节性风湿病和关节周围病症，以及与癌症有关的疼痛(包括"突破疼痛"和与癌症末期有关的疼痛)、周围神经病变和带状疱疹后神经痛。有炎症组份的疼痛的实例(除了上述的那些)，包括风湿性疼痛、与粘膜炎有关的疼痛和经痛。"手术后疼痛"(可互换地称为"切入后"或"受伤后疼痛")意指起因于外伤的疼痛，如个体组织的割伤、穿刺伤、切入、撕裂或受伤(包括起因于所有手术程序的那些，无论是侵入性或非侵入性的)。当在本文中使用时，手术后疼痛不包括没有外在物理创伤而发生(出现或发作)的疼痛。在一些具体实施例中，手术后疼痛是内在或外在(包括周围)的疼痛，并可能偶尔(有外伤)或故意(有手术切开)发生受伤、割伤、外伤、撕裂或切口。当在本文中使用时，"疼痛"包括感受伤害和感觉疼痛，可使用疼痛计分和现有技术中已知的方法，主观和客观地评估疼痛。手术后疼痛，当在本文中使用时，包括异常性疼痛(即增加对正常无害刺激的反应)和痛觉过敏(即增加对正常有害或讨厌刺激的反应)，其实际上可依 次为热或机械(触觉)的。在一些具体实施例中，通过热敏感性、机械敏感性及/或静止疼痛来表征疼痛的特征。在一些具体实施例中，手术后疼痛包括以机械方式引起的疼痛或静止疼痛。在其他的具体实施例中，手术后疼痛包括静止疼痛。该疼痛为主要或次要疼痛，如同现有技术中已熟知的。"生物试样"包括各种获自个体的试样类型，并可用在诊断或监视测定中。该定义包括血液及其他生物来源的液体试样，固体组织试样,如生检样本或从其衍生而来的组织培养物或细胞，及其子代。该定义也包括已经在其采样之后以任何方式处理过的试样，如利用试剂处理、促溶、增强某些组份，如蛋白质或多核苷酸，或为了切片而埋入半固体或固体基质内。"生物试样"一词包括临床试样,也包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞溶胞产物、血清、血浆、生物液体和组织试样。"个体"是脊椎动物，最好是哺乳动物，更佳的是人类。哺乳动物包括，但不限于农场动物(如牛)、竞赛动物、宠物(如猫、狗和马)、灵长类、老鼠和大鼠。当在本文中使用时，"载体"意指构筑体，其能够输送，且最好能在宿主细胞中表达一或多个感兴趣的基因(们)或序列(们)。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸露的DNA或RNA表达载体、质体、粘接质体或噬菌体载体、与阳离子凝聚剂结合的DNA或RNA表达载体、包胶于脂质体中的DNA或RNA表达载体，以及某些真核生物细胞，如生产者细胞。当在本文中使用时，"表达控制序列"意指指挥核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动基因，如组成或可诱导的启动基因，或促进子。表达控制序列以可操作的方式与待转录的核酸序列连接。当在本文中使用时，"在药学上可接受的载剂"包括任何物质，当将其与活性成分混合时，容许该成分保留生物活性，且不与该个体的免疫系统起反应。实例包括，但不限于任何标准药学载剂，如磷酸缓冲盐水溶液、水、乳剂，如油/水乳剂，以及各种形式的湿润剂。适合气溶胶或非经肠投药的较佳稀释剂是磷酸缓冲盐水或生理(0.9%)盐水。利用已熟知的传统方法,来调配包括这类载剂的组合物(参见,例如Remington' sPharmaceutical Sciences,第 18 版，A.Gennaro 编辑，Mack Publishing C0., Easton, PA,1990 ;以及Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing,2000)。当在本文中使用时，"Ktjff"企图意指抗体从抗体/抗原复合物中解离的关闭速率常数。当在本文中使用时，"K/企图意指抗体-抗原交互作用的解离常数。抗体E3、E3-衍生抗体、组合物和使用方法E3组合物、E3衍生的组合物，以及制造组合物的方法本发明包括组合物，含有由E3抗体或多肽组成的医药组合物；以及由编码E3抗体或多肽的序列组成的多核苷酸。当在本文中使用时，组合物包括一或多个与NGF结合的抗体或多肽(可以是或可以不是抗体)，及/或一或多个多核苷酸，包括编码一或多个与NGF结合的抗体或多肽的序列。这些组合物可还包括适当的赋形剂，如在药学上可接受的赋形齐U，包括缓冲溶液，其 为现有技术中已熟知的。本发明也包括经过分离的抗体、多肽和多核苷酸具体实施例。本发明也包括实质上纯的抗体、多肽和多核苷酸具体实施例。本发明的抗体和多肽可具有任何(一或多项)下列的特征:(a)与NGF结合的能力；(b)降低及/或抑制NGF生物活性及/或由NGF发送信号调解的下游路径(们)的能力；(c)降低及/或抑制老鼠E13.5三叉神经元的NGF-依赖性存活的能力；(d)缺少任何对NT3、NT4/5及/或BDNF明显的交叉反应性；(e)治疗及/或预防疼痛(包括手术后疼痛)的能力；(f)增加NGF的清除的能力；(g)降低或抑制trkA受体的激活作用的能力，可使用例如激酶受体激活作用测定(KIRA)来检测(参见美国专利第6，027，927号)。在下文中概述抗体E3的结合特性，与双亲老鼠抗-NGF单克隆抗体911相比较，其以高亲和性和慢解离动力学与人类NGF结合。E3以比双亲老鼠抗体911更高大约50倍的结合亲和性与人类NGF结合。
抗体kDKoffKon
911 (Fab)3.7ηΜθχΤο^Τ12.2xl04M_1s_1
E3 (Fab)0.07nM< 4x ΙΟ 6xl05M_1s_1E3抗体和相关抗体也显示出强有力的拮抗人类NGF的能力，可经由在活体外的测定来评估(参见实例2和3)。例如，抗体E3在15pM人类NGF的存在下以大约21pM的IC5(I，并在1.5pM人类NGF的存在下以大约1.2pM的IC5tl拮抗老鼠E13三叉神经元的NGF-依赖性存活。因此，另一方面，更进一步确认本发明的抗体和多肽具有下列特征:(h)以高亲和性和低解离动力学与人类NGF结合(在一些具体实施例中，具有低于大约2nM的KD，及/或比大约δχΙ ΤΥ1更慢的kj，及/或⑴在大约15pM NGF (在一些具体实施例中，人类NGF)下，以大约IOOpM或更低的IC5tl,并/或在大约1.5pM NGF下以大约20pM或更低的IC5tl，抑制(阻断)老鼠E13.5三叉神经元的NGF依赖性存活的能力。在一些具体实施例中，该抗体与人类NGF结合，但不与得自其他脊椎动物物种(在一些具体实施例中为哺乳动物)的NGF明显地结合。在一些具体实施例中，该抗体与人类NGF,以及一或多个得自其他哺乳动物物种(在一些具体实施例中为哺乳动物)的NGF结合。在另外的具体实施例中，该抗体与NGF结合，但不与其他神经营养素(如相关的神经营养素，NT3、NT4/5及/或BDNF)产生明显的交叉反应。在一些具体实施例中，该抗体结合NGF,以及至少一个其他的神经营养素。在一些具体实施例中，该抗体与哺乳动物物种的NGF结合，如马或狗，但不与得自其他哺乳动物物种的NGF明显地结合。在一些具体实施例中，本发明是包括由多核苷酸编码的轻链的抗体，该多核苷酸是由具有ATCC第PTA-4893号或ATCC第PTA-4894号保藏编号的宿主细胞产生的。另一方面，本发明是包括由多核苷酸编码的重链的抗体，该多核苷酸是由具有ATCC第PTA-4895号保藏编号的宿主细胞产生的。本发明也包括E3的各种调配物及等同的抗体片段(例如Fab> Fab;、F(ab' ) 2、Fv、Fe等等)、单链(ScFv)、其突变体、包括抗体部分的融合蛋白，以及E3的任何其他经过修改的组态，其包括所需的特异性的抗原(NGF)认知位置。E3的等同抗体，包括E3的抗体和多肽片段(其可以是或可以不是抗体)，以及借着上述的任何(一或多项)基准确认并表征的包括E3的多肽片段的多肽。因此，本发明提供任何下列的，或包括任何下列的组合物(包含医药组合物):(a)抗体E3 ； (b)抗体E3的片段或区域；(c)如图1B所示的抗体E3的轻链；(c)如图1A所示的抗体E3的重链；(d)得自抗体E3的轻链及/或重链的一或多个可变区(们)；(e)在图1A和IB中示出的抗体E3的一或多个CDR(S) (—、二、三、四、五或六个CDRs) ； (f)得自在图1A中示出的抗体E3的重链的⑶R H3 ; (g)得自在图1B中示出的抗体E3的轻链的⑶R L3 ；(h)得自在图1B中示出的抗体E3的轻链的三个CDRs ;(i)得自在图1A中示出的抗体E3的重链的三个⑶Rs ； (j)得自在图1A和IB中示出的抗体E3的轻链的三个⑶Rs和重链的三个CDRs ;以及(k)包括(b)到(j)中任一个的抗体。从本文的说明可以明了，显然明确地排除由与老鼠单克隆抗体911的氨基酸序列相同的氨基酸序列所组成的多肽具体实施例。在图1A和IB中，并在SEQ ID NO:9_14中示出了 Mab 911的衍生⑶R序列。在图1A和IB中以图解说明抗体E3的⑶R部分(包括Chothia和Kabat⑶Rs)，并由下列的氨基酸序列组成:(a)重链CDR 1(" CDRHl " )GFSLIGYDLN(SEQ ID NO:3) ； (b)重链 CDR 2(" CDRH2" ) IIffGDGTTDYNSAVKS (SEQ ID NO:4) ； (c)重链 CDR 3(" CDR H3")GGYffYATSYYFDY (SEQ ID NO:5) ; (d)轻链 CDR 1(" CDR LI" ) RASQSISNNLN (SEQ ID NO:6) ； (e)轻链 CDR 2(" CDRL2" ) YTSRFHS(SEQ ID NO:7);和(f)轻链 CDR 3(" CDRL3")QQEHTLPYT(SEQ ID NO:8)。CDR区域的判定为本领域技术人员已熟知的。在一些具体实施例中，⑶Rs当然可以是Kabat和Chothia⑶R的组合(也称为"组合的⑶Rs"或"衍生的⑶Rs")。在一些具体实施例中，⑶Rs包括Kabat⑶R。在另外的具体实施例中，⑶Rs为ChothiaCDRs。 在一些具体实施例中，本发明提供包括至少一个⑶R的抗体，该⑶R实质上是与E3的至少一个⑶R、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个⑶Rs是同源的(或在一些具体实施例中，与E3的所有6个⑶Rs是同源的，或衍生自E3)。其他的具体实施例包括具有至少2、3、4、5或6个CDR(s)的抗体，该CDRs实质上是与E3的至少2、3、4、5或6个CDRs是同源的，或衍生自E3。当然为了本发明，通常保留了结合特异性及/或全部的活性(可从治疗及/或预防疼痛或抑制E13.5老鼠三叉神经元的NGF-依赖性存活的方面来看)，虽然与E3比较活性的程度可能有变化(可能更大或更小)。本发明也提供包括E3的氨基酸序列(在图1A和IB中所示)的多肽(可以是或可以不是抗体)，其具有下列任一项:E3序列的至少5个连续的氨基酸、至少8个连续的氨基酸、至少大约10个连续的氨基酸、至少大约15个连续的氨基酸、至少大约20个连续的氨基酸、至少大约25个连续的氨基酸、至少大约30个连续的氨基酸，其中至少3个氨基酸是得自E3的可变区，并了解明确地排除由与老鼠单克隆抗体911的氨基酸序列相同的氨基酸序列所组成的具体实施例。在图1A和IB中，并在SEQ ID NO:9_14中示出了 Mab 911的衍生CDR序列。在一具体实施例中，该可变区得自E3的轻链。在另一具体实施例中，该可变区得自E3的重链。在其他的具体实施例中，5个(或更多个)连续的氨基酸是得自在图1A和IB中示出的E3的互补性决定区(CDR)。在另一具体实施例中，本发明提供包括E3的氨基酸序列的多肽，其具有下列任一项:E3序列的至少5个连续的氨基酸、至少8个连续的氨基酸、至少大约10个连续的氨基酸、至少大约15个连续的氨基酸、至少大约20个连续的氨基酸、至少大约25个连续的氨基酸、至少大约30个连续的氨基酸，其中该E3序列包括下列任一或多项=CDRHl的氨基酸残基L29、CDRH2的I50、CDRH3的W101，及/或CDRH3的A103 ;及/或CDRLl的氨基酸残基S28、CDRLl的N32、CDRL2的T51、CDRL3的91E，及/或CDRL3的H92，并了解明确地排除由与老鼠单克隆抗体911的氨基酸序列相同的氨基酸序列所组成的具体实施例。显然在本公开内容中，使用连续的氨基酸编号体系来称呼可变区中的氨基酸残基(即在每个可变区中的氨基酸残基均按顺序编号)。如同现有技术中已熟知的，当比较两个抗体或多肽时，如E3抗体和E3变体(或怀疑其为E3变体的多肽)，可使用Kabat及/或Chothia编号系统。在现 有技术中，例如，若需要在E3和其他多肽之间进行比较时，当然知道如何将连续编号转变为Chothia及/或Kabat编号。图23表示使用连续的Chothia和Kabat编号，将E3可变区编号。此外，为了便于比较，框架残基通常，但并非总是，具有约略相同的残基数目。然而，CDRs的大小可能有变化(即可能插入及/或删除一或多个氨基酸残基)。当比较E3抗体和候选的E3变体(例如，在得自候选序列的CDR区比在与其比对的抗体E3中的序列更长的案例中)，可能遵循下列的步骤(虽然在现有技术中已知其他的方法)。将候选抗体序列与E3抗体重链和轻链可变区对齐。可用手或借着电脑，使用普遍接受的电脑程序来进行排列。可借着使用对大多数Fab序列而言常见的一些氨基酸残基，使得排列更为容易。例如，轻链和重链通常都有两个半胱氨酸，通常是在保留位置发现它们。当然候选变体抗体的氨基酸序列可能是更长(即有插入的氨基酸残基)或更短的(有删除的氨基酸残基)。可将残基编号加上字尾，代表插入额外的残基，例如残基34abc。至于候选序列，例如将其与E3序列排成一直线，例如残基33和35，但在它们之间没有残基与残基35排在一起，简单地不指派该残基35为一残基。在其他的方法中，在比较不同长度的CDRs时，通常已知可在结构相等的(例如在抗原-抗体复合物中的相同位置)氨基酸之间进行比较。例如Chothia编号(Al-Lazikani等人,在前)，通常(但并非在所有情况下)在结构正确的位置安排插入和删除。也可使用X-射线结晶学或双突变环分析(参见Pons等人(1999)Prot.Sc1.8:958_968)来推论或证实结构同等。抗-NGF抗体对NGFQnhNGF)的结合亲和性，可能是大约0.10至大约0.80nM、大约0.15至大约0.75nM，以及大约0.18至大约0.72nM。在一些具体实施例中，结合亲和性是大约2pM、大约5pM、大约ΙΟρΜ、大约15pM、大约20pM、大约40pM或比大约40pM更高。在一具体实施例中，结合亲和性是在大约2pM到22pM之间。在其他的具体实施例中，结合亲和性是低于大约ΙΟηΜ、大约5nM、大约4nM、大约3.5nM、大约3nM、大约2.5nM、大约2nM、大约1.5nM、大约InM、大约900pM、大约800pM、大约700pM、大约600pM、大约500pM、大约400pM、大约300pM、大约200pM、大约150pM、大约ΙΟΟρΜ、大约90pM、大约80pM、大约70pM、大约60pM、大约50pM、大约40pM、大约30pM、大约ΙΟρΜ。在一些具体实施例中，结合亲和性是大约ΙΟηΜ。在其他的具体实施例中，结合亲和性是低于大约ΙΟηΜ。在其他的具体实施例中，结合亲和性是大约0.1nM或大约0.07ηΜ。在其他的具体实施例中，结合亲和性是低于大约0.1nM或低于大约0.07ηΜ。在其他的具体实施例中，结合亲和性是大约ΙΟηΜ、大约5ηΜ、大约4ηΜ、大约3.5ηΜ、大约3ηΜ、大约2.5ηΜ、大约2ηΜ、大约1.5ηΜ、大约InM、大约900pM、大约800pM、大约700pM、大约600pM、大约500pM、大约400pM、大约300pM、大约200pM、大约150pM、大约ΙΟΟρΜ、大约90pM、大约80pM、大约70pM、大约60pM、大约50pM、大约40pM、大约30pM、大约IOpM之中任一者至大约2pM、大约5pM、大约ΙΟρΜ、大约15pM、大约20pM或大约40pM之中任一者。在一些具体实施例中，结合亲和性是大约ΙΟηΜ、大约5ηΜ、大约4ηΜ、大约3.5ηΜ、大约3ηΜ、大约2.5ηΜ、大约2ηΜ、大约1.5ηΜ、大约InM、大约900pM、大约800pM、大约700pM、大约600pM、大约 500pM、大约 400pM、大约 300pM、大约 200pM、大约 150pM、大约 ΙΟΟρΜ、大约 90pM、大约80pM、大约70pM、大约60pM、大约50pM、大约40pM、大约30pM、大约IOpM之中任一者。在另外的具体实施例中，结合亲和性是大约2pM、大约5pM、大约ΙΟρΜ、大约15pM、大约20pM、大约40pM或比大约40pM更高。可使用现有技术中已熟知的方法,判定抗体对NGF的结合亲和性。一种判定抗体对NGF的结合亲和性的 方法是借着测量抗体的单功能Fab片段的亲和性，如同在实例中的描述。欲获得单功能Fab片段，可利用木瓜酵素切开抗体(例如IgG)，或以重组方式表达。可借着表面等离子体激光共振(BIACore3000TM表面等离子体激光共振(SPR)系统，BIAcore，INC, Piscataway NJ)，按照在实例中的描述，判定抗体的抗-NGF Fab片段的亲和性。该草案适用于判定抗体对任何物种的NGF的结合亲和性，包括人类NGF、其他脊椎动物的NGF (在一些具体实施例中为哺乳动物)(如老鼠NGF、大鼠NGF、灵长类NGF)，并适用于其他的神经营养素，如相关的神经营养素NT3、NT4/5，及/或BDNF。在一些具体实施例中，本发明的抗体或肽可(在大约15pM的NGF的存在下)以大约 200pM、150pM、100pM、80pM、60pM、40pM、20pM、10pM 或更低的 IC5tl，抑制(降低及 / 或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活。在一些具体实施例中，本发明的抗体或肽可(在大约 1.5pM 的 NGF 的存在下)以大约 50pM、40pM、30pM、10pM、20pM、10pM、5pM、2pM、lpM或更低的IC5tl，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活。在一些具体实施例中，本发明的抗体或肽可(在大约15pM的NGF的存在下)以大约 150pM、125pM、100pM、80pM、60pM、40pM、30pM、20pM、10pM、5pM或更低的 IC5tl，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的大鼠NGF-依赖性存活。在一些具体实施例中，本发明的抗体或肽可(在大约1.5pM的NGF的存在下)以大约30pM、25pM、20pM、15pM、10pM、5pM、4pM、3pM、2pM、lpM或更低的IC50，抑制(降低及/或阻断)老鼠E13.5三叉神经元的大鼠NGF-依赖性存活。测量老鼠三叉神经元的NGF-依赖性存活的方法是现有技术中已知的，并在实例2中说明。本发明也提供制造任何这些抗体或多肽的方法。可借着现有技术中已知的程序，在实例中解释其中一些，来制造本发明的抗体。可借着蛋白水解或抗体的其他作用，借着上述的重组方法(即单一或融合多肽)，或借着化学合成来产生多肽。借着化学合成便利地制造抗体的多肽，尤其是较短的，最多大约50个氨基酸的多肽。化学合成的方法是现有技术中已知的，并为市售的。例如，可借着使用固相法的自动多肽合成器，产生E3抗体。也参见美国专利第5，807，715号、4，816，567号和6，331，415号。也可在活体外使用合成蛋白质化学的已知方法，包括涉及交联剂的那些，来制备嵌合型或杂种抗体。例如，可使用二硫交换反应，或借着形成硫酯键结，来建构免疫毒素。适合该目的的试剂的实例包括亚胺硫醇盐和甲基-4-巯基丁酰亚酰胺盐。在另一种选择中，可以重组方式制造抗体，使用现有技术中已熟知的程序。在一具体实施例中，将包括编码抗体E3(在图1A和IB中示出)的可变和轻链区的序列的多核苷酸选殖到载体内，以便在宿主细胞(例如CHO细胞)中表达或繁殖。在另一具体实施例中，将在图2和3中示出的多核苷酸序列选殖到一或多个载体内，以便表达或繁殖。可将编码感兴趣的抗体的序列保存在在宿主细胞中的载体内，然后可为了未来使用将宿主细胞扩大并冷冻。在本文中进一步描述了载体(包括表达载体)和宿主细胞。已经公开了在植物或乳汁中以重组方式表达抗体的方法。参见，例如Peeters等人(2001) Vaccine 19:2756 ；Lonberg, N.和 D.Huszar (1995) Int.Rev.Tmmunol 13:65 ；以及 Pollock 等人(1999)J Immunol Methods 231:147。制造抗体衍生物的方法,例如人类化、单链等等,为现有技术中已知的。本发明也包括本发明的抗体，如E3的单链可变区片段("scFv")。借着使用短交联肽连接轻及/或重链可变区，制造单链可变区片段。Bird等人(1988) Science 242:423-426。交联肽的实例为(GGGGS)3(SEQ ID NO:15)，其在一可变区的羧基终端和另一可变区的氨基终端之间架起约 3.5纳米的桥。已经设计并使用其他序列的交联剂(Bird等人(1988))。为了额外的功能，如附接药物或附接固体支撑物，可转而修改交联剂。可以重组或合成方式产生单链变体。关于scFv的合成产生,可使用自动合成器。至于scFv的重组产生，可将含有编码scFv的多核苷酸的适当质体导入适当的宿主细胞内，宿主细胞可以是真核生物的，如酵母菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或原核生物的，如大肠杆菌。可借着例行的操作，如多核苷酸的连接，制造编码感兴趣的scFv的多核苷酸。可使用现有技术中已知的标准蛋白质纯化技术，分离所得的scFv。也包括其他形式的单链抗体,如微型双功能抗体(diabodies)。微型双功能抗体是二价的，双重特异性的抗体，其中在单一的多肽链上表达VH和VL功能部位，但所使用的交联剂太短，以致于不容许在同一链上两个功能部位之间配对，借此迫使功能部位与在另一链上的互补功能部位配对，并创造两个抗原结合位置(参见，例如Holliger，P.等人(1993)Proc.Natl.Acad Sc1.USA 90 =6444-6448 ；Poljak, R.J.等人(1994) Structure 2:1121-1123)。抗体可以是双重特异性的抗体，对至少两个不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。可使用在本文中公开的抗体制备双重特异性的抗体。制造双重特异性抗体的方法，为现有技术中已知的(参见，例如Suresh等人，1986,Meyhods in Enzymology 121:210)。在传统上，双重特异性抗体的重组产生，是以两个免疫球蛋白重链-轻链对的共同表达为基础，而这两个重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello，1983，Nature 305，537-539)。根据一制造双重特异性抗体的方法，将具有想要结合特异性(抗体-抗原结合位置)的抗体可变功能部位与免疫球蛋白恒定功能部位序列融合。该融合最好是利用免疫球蛋白重链恒定功能部位，包括至少一部分绞链、CH2和CH3区。最好是有第一个重链恒定区(CHl)，含有轻链结合所需的位置，出现在至少一个融合中。将编码免疫球蛋白重链融合，若需要还有免疫球蛋白轻链的DNAs，插入分开的表达载体中，并共同转移感染到适当的宿主生物内。这在使用不等比例的三个多肽链来建构，以便提供最佳产量的具体实施例中，在调整三个多肽片段的突变比例上提供了相当大的弹性。然而，也有可能在一表达载体中插入二或全部三个多肽链的密码序列，此时以等比例表达至少两个多肽链，结果产生高产量，或此时该比例并不是特别重要的。在一方法中，双重特异性抗体由杂种的免疫球蛋白重链组成，在一臂上有第一个结合特异性，而在另一臂上有杂种免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二个结合特异性)。该不对称的结构，仅在双重特异性分子的一半具有免疫球蛋白轻链，使想要的双重特异性化合物更容易与不想要的免疫球蛋白链组合分·开。在1994年3月3日发表的PCT公开第WO94/04690号中描述了该方法。
·
包括两个共价连接的抗体的异源共轭抗体，也在本发明的范围内。已经使用这类抗体使免疫系统细胞瞄准不想要的细胞(美国专利第4，676，980号)，并用来治疗HIV感染(PCT申请公开第WO 91/00360号和W092/200373号；欧洲专利第03089号)。可使用任何便利的交联法，制造异源共轭抗体。适当的交联剂和技术是现有技术中已熟知的，并描述在美国专利第4，676，980号中。该抗体可以是人类化抗体，例如如同在现有技术中已知的，并在本文中描述。可按照在1999年11月18日发表的PCT公开第WO 99/58572中描述的，来修改(修饰)抗体。除了针对标靶分子的结合功能部位之外，这些抗体包括具有实质上与人类免疫球蛋白重链的全部或部分恒定功能部位同源的氨基酸序列的效应物功能部位。这些抗体能够与标靶分子结合，不诱发明显的补体依赖性溶解，或细胞-调解的标靶破坏。效应物功能部位最好能够特异性地结合FcRn及/或Fe Y RII b。这些通常是以衍生自二或多个人类免疫球蛋白重链CH2功能部位的嵌合型功能部位为基础。最好是在慢性抗体疗法中使用以此方式修改的抗体，以避免炎症和其他对传统抗体疗法不利的反应。本发明包括对抗体E3的修改，包括不显著影响其特性的功能相等的抗体，以及具有提高或降低活性的变体。在现有技术中，例行地实行多肽的修改，并在实例中进一步举例说明。修改多肽的实例包括具有氨基酸残基的取代(包括保守取代)，一或多个不会明显有害地改变功能活性的氨基酸删除或添加的多肽，或使用化学类似物。当在本文中使用时，多肽"变体"是与固有蛋白质之差异在于一或多个取代、删除、添加及/或插入的多肽，使得实质上并未减少该多肽的免疫反应性。换句话说，相对于固有蛋白质，可提高或不改变变体特异性地与抗原结合的能力，或相对于固有蛋白质，可减少至低于50%，较佳的是低于20%。多肽变体最好对已经确认的多肽，显示出至少大约80%，更佳的是至少大约90%，且最佳的是至少大约95 %的同一性(根据在本文中的描述来判定)。可借着将适当的核苷酸改变导入抗体DNA内，或借着肽合成，来制备抗体的氨基酸序列变体。这类变体包括，例如从在本文中描述的SEQID NO:1或2的氨基酸序列中删除及/或插入及/或取代残基。可进行删除、插入和取代的任何组合以获得最终的构筑体，其限制条件为最终的构筑体具有想要的特征。氨基酸变化也可改变抗体的转译后加工，如改变糖基化作用的数目和位置。

一种确认抗体的某些残基或区域是进行诱变或修改的较佳场所的有用方法，叫做"丙氛酸扫描诱变"，并由 Cunningham 和 Wells, 1989，Science, 244:1081-1085 描述了。确认一残基或一群标祀残基(例如带电荷的残基，如arg、asp、his、Iys和glu),并以中性或带负电的氨基酸(最好是丙氨酸或聚丙氨酸)取代，影响氨基酸与抗原的交互作用。然后借着在取代位置导入更多或其他变体，改进那些证实对取代有功能敏感性的氨基酸位置。因此，虽然预先判定导入氨基酸序列变化的位置，仍不必预先判定突变本身的性质。例如，欲分析突变在特定位置的效能，在标靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机突变生成作用，并就想要的活性筛选所表达的抗体变体。也可使用在本文中描述的库扫描突变生成作用，确认在抗体中适合突变或修改的位置。氨基酸序列插入包括范围从一个残基到含有一百或更多残基的多肽的氨基-及/或羧基-终端融合，以及单一或多个氨基酸残基的序列内插入。终端插入的实例包括带有N-终端甲硫胺酰基残基的抗体，或与抗原决定位标签融合的抗体。抗体分子的其他插入变体包括酵素或增加抗体的血清半衰期的多肽与抗体的N-或C-终端融合。取代变体在抗体分子中移除至少一个氨基酸残基，并在其位置插入另一个残基。取代突变生成作用最感兴趣的位置包括高变区，但也期待FR改变。在表I中，在"保守性取代"项目之下示出保守取代。若这类取代结果改变了生物活性，然后可导入更多实质上的改变，在表I中称为"典型的取代"，或按照下文在提及氨基酸种类时更多的描述，并筛选产物。表1:氨基酸取代
原始残基保守性取代典型的取代
Ala(A)ValVal ；Leu ；Ile
Arg(R)LysLys ；Gln ；Asn
Asn (N)GlnGln ；His ；Asp ；Lys ；Arg
Asp (D)GluGlu ；Asn
Cys(C)SerSer ；Ala
权利要求
1.一种用于在个体中治疗骨关节炎疼痛的方法，包括给予该个体有效量的NGF拮抗剂。
2.如权利要求1的方法，其中所述个体是人。
3.如权利要求1的方法，其中该NGF拮抗剂是抗-NGF拮抗剂抗体。
4.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率介于每星期一次到每12个星期一次。
5.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率为每个月I次、每两个月I次、每三个月I次、每四个月I次、每五个月I次或每六个月I次。
6.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以每三个月I次给予个体。
7.如权利要求3的方法，其中在给予单一剂量的抗-NGF拮抗剂抗体后，该疼痛的减轻持续至少大约7天的期间。
8.如权利要求3的方法，其中在给予单一剂量的抗-NGF拮抗剂抗体后，该疼痛的减轻持续至少大约14天的期间。
9.如权利要求3的方法，其中在给予单一剂量的抗-NGF拮抗剂抗体后，该疼痛的减轻持续至少大约4周的期间。
10.如权利要求3的方法，其中在给予单一剂量的抗-NGF拮抗剂抗体后，该疼痛的减轻持续至少大约12周的期间。
11.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以从大约3微克/千克至大约I毫克/千克范围内的剂量使用。
12.如权利要求11的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以大约100微克/千克的剂量使用。
13.如权利要求11的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以大约300微克/千克的剂量使用。
14.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以静脉内给药。
15.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以皮下给药。
16.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是单克隆抗体。
17.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是人类化抗体。
18.如权利要求3 的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体与人类NGF结合。
19.如权利要求18的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体还与啮齿类NGF结合。
20.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体: (a)以低于大约2nM的Kd与NGF结合； (b)以大约IOOpM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中该IC50是在大约15pM人类NGF的存在下测量到的；以及 (c)以大约IOpM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中该IC50是在大约1.5pM的NGF的存在下测量到的。
21.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体包括重链可变区，其包括: (a)显示在SEQID NO:3中的CDRl区； (b)显示在SEQID NO:4中的CDR2区；以及 (c)显示在SEQID NO:5中的CDR3区。
22.如权利要求3的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体包括轻链可变区，其包括: (a)显示在SEQID NO:6中的CDRl区； (b)显示在SEQID NO:7中的CDR2区；以及 (c)显示在SEQID NO:8中的CDR3区。
23.如权利要求22的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体还包括重链可变区，其包括: (a)显示在SEQID NO:3中的CDRl区； (b)显示在SEQID NO:4中的CDR2区；以及 (c)显示在SEQID NO:5中的CDR3区。
24.如权利要求23的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是包括显示在SEQID NO:1和2中的氨基酸序列的抗体。
25.如权利要求24的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是包括显示在SEQID NO:16和17中的氨基酸序列的抗体。
26.一种用于改善患有骨关节炎的个体的物理功能的方法，包括给予该个体有效量的NGF拮抗剂。
27.如权利要求26的方法，其中所述个体是人。
28.如权利要求26的方法，其中该NGF拮抗剂是抗-NGF拮抗剂抗体。
29.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率介于每星期一次到每12个星期一次。
30.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率为每个月I次、每两个月I次、每三个月I次、每四个月I次、每五个月I次或每六个月I次。
31.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以每三个月I次给予个体。
32.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以从大约3微克/千克至大约I毫克/千克范围内的剂量使用。
33.如权利要求32的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以大约100微克/千克的剂量使用。
34.如权利要求32的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以大约300微克/千克的剂量使用。
35.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以静脉内给药。
36.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以皮下给药。
37.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是单克隆抗体。
38.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是人类化抗体。
39.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体与人类NGF结合。
40.如权利要求39的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体还与啮齿类NGF结合。
41.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体: (a)以低于大约2nM的Kd与NGF结合； (b)以大约IOOpM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中该IC50是在大约15pM人类NGF的存在下测量到的；以及 (c)以大约IOpM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中该IC50是在大约1.5pM的NGF的存在下测量到的。
42.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体包括重链可变区，其包括: (a)显示在SEQID NO:3中的CDRl区； (b)显示在SEQID NO:4中的CDR2区；以及 (c)显示在SEQID NO:5中的CDR3区。
43.如权利要求28的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体包括轻链可变区，其包括: (a)显示在SEQID NO:6中的CDRl区； (b)显示在SEQID NO:7中的CDR2区；以及 (c)显示在SEQID NO:8中的CDR3区。
44.如权利要求43的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体还包括重链可变区，其包括: (a)显示在SEQID NO:3中的CDRl区； (b)显示在SEQID NO:4中的CDR2区；以及 (c)显示在SEQID NO:5中的CDR3区。
45.如权利要求44的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是包括显示在SEQID NO:1和2中的氨基酸序列的抗体。
46.如权利要求45的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是包括显示在SEQID NO: 16和17中的氨基酸序列的抗体。
47.一种用于在患有骨关节炎的个体中改善僵硬的方法，包括给予该个体有效量的NGF拮抗剂。
48.如权利要求47的方法，其中所述个体是人。
49.如权利要求47的方法，其中该NGF拮抗剂是抗-NGF拮抗剂抗体。
50.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率介于每星期一次到每12个星期一次。
51.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率为每个月I次、每两个月I次、每三个月I次、每四个月I次、每五个月I次或每六个月I次。
52.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以每三个月I次给予个体。
53.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以从大约3微克/千克至大约I毫克/千克范围内的剂量使用。
54.如权利 要求53的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以大约100微克/千克的剂量使用。
55.如权利要求53的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以大约300微克/千克的剂量使用。
56.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以静脉内给药。
57.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以皮下给药。
58.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是单克隆抗体。
59.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是人类化抗体。
60.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体与人类NGF结合。
61.如权利要求60的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体还与啮齿类NGF结合。
62.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体: (a)以低于大约2nM的Kd与NGF结合；(b)以大约IOOpM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中该IC50是在大约15pM人类NGF的存在下测量到的；以及 (c)以大约IOpM或更低的IC50抑制老鼠E13.5三叉神经元的人类NGF-依赖性存活，其中该IC50是在大约1.5pM的NGF的存在下测量到的。
63.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体包括重链可变区，其包括: (a)显示在SEQID NO:3中的CDRl区； (b)显示在SEQID NO:4中的CDR2区；以及 (c)显示在SEQID NO:5中的CDR3区。
64.如权利要求49的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体包括轻链可变区，其包括: (a)显示在SEQID NO:6中的CDRl区； (b)显示在SEQID NO:7中的CDR2区；以及 (c)显示在SEQID NO:8中的CDR3区。
65.如权利要求64的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体还包括重链可变区，其包括: (a)显示在SEQID NO:3中的CDRl区； (b)显示在SEQID NO:4中的CDR2区；以及(c)显示在SEQID NO:5中的CDR3区。
66.如权利要求65的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是包括显示在SEQID NO:1和2中的氨基酸序列的抗体。
67.如权利要求66的方法，其中该抗-NGF拮抗剂抗体是包括显示在SEQID NO:16和17中的氨基酸序列的抗体。
68.一种试剂盒，其包括有效量的NGF拮抗剂以及为了治疗个体中的骨关节炎而将有效量的NGF拮抗剂给予个体的说明书。
69.如权利要求68的试剂盒，其中所述个体是人。
70.如权利要求68的试剂盒，其中该NGF拮抗剂是抗-NGF拮抗剂抗体。
71.如权利要求70的试剂盒，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率介于每星期一次到每12个星期一次。
72.如权利要求70的试剂盒，其中在给予单一剂量的抗-NGF拮抗剂抗体后，疼痛的减轻持续至少大约7天的期间。
73.—种试剂盒，其包括有效量的NGF拮抗剂以及为了改善患骨关节炎个体的物理功能而将有效量的NGF拮抗剂给予个体的说明书。
74.如权利要求73的试剂盒，其中所述个体是人。
75.如权利要求73的试剂盒，其中该NGF拮抗剂是抗-NGF拮抗剂抗体。
76.如权利要求75的试剂盒，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率介于每星期一次到每12个星期一次。
77.如权利要求75的试剂盒，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以从大约3微克/千克至大约I毫克/千克范围内的剂量使用。
78.—种试剂盒，其包括有效量的NGF拮抗剂以及为了在患骨关节炎的个体中改善僵硬而将有效量的NGF拮抗剂给予个体的说明书。
79.如权利要求78的试剂盒，其中所述个体是人。
80.如权利要求78的试剂盒，其中该NGF拮抗剂是抗-NGF拮抗剂抗体。
81.如权利要求80的试剂盒，其中该抗-NGF拮抗剂抗体的给药频率介于每星期一次到每12个星期一次。
82.如权利要求80的试剂盒，其中该抗-NGF拮抗剂抗体以从大约3微克/千克至大约I毫克/千克范围内的剂量使用。
83.一种用于在个体中治疗骨关节炎疼痛的医药组合物，其包括NGF拮抗剂和在药学上可接受的载剂。
84.一种用于在患有骨关节炎的个体中改善物理功能的医药组合物，其包括NGF拮抗剂和在药学上可接受的载剂。
85.一种用于在患有骨关节炎的个体中改善僵硬的医药组合物，其包括NGF拮抗剂和在药学上可接受的 载剂。
全文摘要
本发明涉及通过给予神经生长因子拮抗剂及其组合物来治疗骨关节炎疼痛的方法。本发明涉及抗-NGF抗体(如抗-NGF拮抗剂抗体)及编码该抗体的多核苷酸。本发明进一步涉及这类抗体及/或多核苷酸于治疗及/或预防疼痛，包括手术后疼痛、风湿性关节炎疼痛和骨关节炎疼痛的用途。
文档编号A61P19/02GK103143016SQ20111043788
公开日2013年6月12日 申请日期2006年4月11日 优先权日2005年4月11日
发明者安侬·露森达尔, 大卫·L·谢尔顿, 帕特里夏·安·沃尔卡 申请人:礼纳特神经系统科学公司