专利名称：神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物、其主动靶向脂质体载体系统及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物、其主动靶向脂质体载体系统及其制备方法。
背景技术：
前列腺癌是男性生殖系统最常见的恶性肿瘤，发病随年龄而增长，其发病率有明显的地区差异，欧美地区较高。据报道仅次于肺癌，在男性是癌症死亡的第二位。随着人口老龄化程度的增加，近年来中国男性发病率呈明显增加趋势1993年中国前列腺癌发病率为每年每10万人中1. 71个病人，至2000年已上升到了 4. 55人。由于我国对前列腺癌的认识和重视不够，且早起前列腺癌没有任何症状，不易引起人们的注意，所以我国发现的前列腺癌大多是晚期病例，已经发生淋巴转移或者血道转移，形成转移灶。对前列腺癌晚期患者，手术治疗已难以取得较好治疗效果，所以一般采取扩大范围体外放疗或化疗手段，但这两种治疗手段全身毒副作用大，常规化疗对病灶部位无靶向效果，治疗效果不佳。因此，对前列腺癌进行靶向治疗具有重要的临床现实意义。
在所有纳米递药系统中，由于脂质体膜材与细胞膜组成相同，其生物安全性问题较小，而且由于其易制备、易修饰、易控制粒径、载药量高、易工业化生产等优点，脂质体是临床应用最多的纳米载药系统。目前已有阿霉素脂质体、柔红霉素脂质体和两性霉素B脂质体等产品上市，主要用于肿瘤或真菌感染的靶向治疗。现有的脂质体绝大部分是基于被动靶向发挥作用，靶向效率较低。基于多肽介导的肿瘤主动靶向脂质体递药系统因对肿瘤表现出优越的靶向性和生长抑制作用而逐渐成为纳米递药系统和肿瘤治疗领域的研究热点。但目前肿瘤主动靶向递药系统从其静脉给药到与肿瘤细胞发生接合的过程中，仍受到两大屏障的制约——肿瘤血管屏障和肿瘤实质屏障，此问题已受到研究者的普遍关注。有研究者通过多肽筛选技术筛选出一些具有穿透肿瘤血管和肿瘤实质能力的靶向分子，将其用于介导药物分子或者纳米递药系统进入肿瘤组织，取得了很好的效果，但未见用于脂质体递药系统靶向递药的报道。此类多肽及其修饰的脂质体的生物安全性评价也未见文献报道，这也是所有肿瘤主动靶向脂质体递药系统临床应用的共性问题。发明内容
本发明的目的之一在于提供一种神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物。
本发明的目的之二在于提供一种含复合物的主动靶向脂质体载体系统。
本发明的目的之三在于提供该脂质体载体系统的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征在于该复合物由神经毡蛋白-ι配体多肽、聚乙二醇和磷脂三部分通过共价连接而成的线性嵌段共聚物，其中神经毡蛋白-1配体多肽、聚乙二醇和磷脂的摩尔比为1:1:1，所述的神经毡蛋白-1配体多肽的氨基酸序列为RPAKPAR。
上述的聚乙二醇的重均分子量可以为400 8000。
上述的聚乙二醇重均分子量可以为200(Γ5000。
上述的磷脂可以为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。
一种主动靶向脂质体载体系统，含有上述的神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征在于该载体系统的组成为a.磷脂；b.胆固醇；c.甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物；d.神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物；上述各成分之间的摩尔比为a:b=5:l 1:5，a:c=1000:l 1000:100， a:d=1000:0. 1 1000:100。
上述的组分a所述的磷脂为蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、 二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1_棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、I"棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂。
上述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中的磷脂可以为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、 二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。
上述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中的甲氧基聚乙二醇重均分子量可以为 400 6000。
一种制备上述的主动靶向脂质体载体系统的方法，其特征在于该方法的具体步骤为分别称取上述各组分溶于氯仿中制备得到均勻脂质膜，真空干燥；再加入0. 155M的硫酸铵溶液，在20-70°C水浴中震荡得到脂质体混悬液；再于20-70°C水浴中依次挤压过400、 200,100和50nm核孔膜，得空白脂质体，即为含有神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物的主动靶向脂质体载体系统。
上述的神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物的制备方法的具体步骤为a.将取代度为0. 6mmol/g的叔丁氧羰基-精氨酸(对甲苯磺酰基)_对乙酰氨基苄酯 Boc-Arg (Tos)-PAM树脂用N，N-二甲基甲酰胺DMF溶胀，抽干；再用三氟乙酸TFA脱去Boc保护基，抽去TFA;b.用苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐HBTU的DMF溶液和N，N- 二异丙基乙胺DIEA活化叔丁氧羰基-丙氨酸Boc-Ala，得Boc-Ala活化液；c.将步骤a所得树脂用DMF洗涤后加入步骤b所得的Boc-Ala活化液，25°C振摇反应 25分钟，抽去反应液，并用DMF洗涤树脂；d.重复步骤a_c，按CRPAKPAR序列顺次连接其余氨基酸；反应结束后洗涤树脂、TFA 脱保护基，真空干燥；e.将步骤e所得的树脂放入多肽切割管中，加入适量P-cresol，然后通入HF，冰浴搅拌反应1小时；反应结束后减压抽去管中HF，残液用适量冰乙醚沉淀，过滤得沉淀并用冰乙醚洗涤沉淀；沉淀重新用TFA溶解，过滤得滤液；滤液再于冰乙醚中沉淀，过滤，滤渣以水复溶，冻干得CRPAKPAR纯品；f.将步骤e得到的CRPAKPAR溶于pH7.O的PBS溶液中，取马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂复合物Mal-PEG-DSPE溶于DMF，搅拌反应至Mal-PEG-DSPE反应完全，去除过量的CRPAKPAR 和DMF，冷冻干燥，得到直链的神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物。
RPAKPAR是一种通过噬菌体展示技术筛选得到的直链七肽，是神经毡蛋白-1的配体。研究表明神经毡蛋白-1在前列腺癌肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞表面有高表达，而在正常组织无表达或低表达。RPAKPAR对神经毡蛋白-1高表达的肿瘤细胞和肿瘤血管表现出特异亲和性，且具有介导噬菌体穿透肿瘤血管进入肿瘤组织内部的能力。目前尚未见利用 RPAKPAR多肽介导纳米递药系统用于前列腺癌及其转移灶靶向治疗的报道。
含RPAKPAR序列的多肽通过固相合成法合成，HPLC (高效液相色谱法)和MS (质谱法)表征其结构。
含RPAKPAR序列多肽的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，通过以下方式合成含 RPAKPAR序列的多肽提供一个游离巯基，聚乙二醇-磷脂提供一个马来酰亚胺基，两者发生特异性反应而连接成共价复合物，合成之后通过核磁共振(NMR)表征其结构。
脂质体采用旋转蒸发-薄膜水化-挤压过膜法制备。将一定比例的a、b、C、d溶于氯仿，采用旋转蒸发-薄膜水化法制备RPAKPAR修饰的脂质体(RPAKPAR-脂质体)，用挤压过膜的方法减小脂质体粒径，得到脂质体。激光散射法测定粒径分布。其平均粒径为 30 1000nm。
本发明通过荧光示踪脂质体，考查肿瘤细胞分别对载羧基荧光素(FAM)的 RPAKPAR-脂质体和普通脂质体的摄取，结果证实RPAKPAR在体外能介导脂质体进入肿瘤细胞。
通过以阿霉素为模型药物，考察了 RPAKPAR-脂质体/DOX对PC_3前列腺癌细胞的体外生长抑制作用和体内对前列腺癌的肿瘤生长抑制作用，表明RPAKPAR的修饰能显著增加阿霉素脂质体对前列腺癌细胞和肿瘤组织的生长抑制作用。
研究结果提示，本发明制备的含有RPAKPAR序列的多肽修饰的主动靶向脂质体载体系统的可用于靶向前列腺癌及其转移灶。该系统可通过皮下组织间隙注射或肌肉注射将脂质体被动引流至淋巴系统内，通过RPAKPAR的介导作用靶向至淋巴转移病灶。该系统也可直接通过静脉注射给药，通过肿瘤EI3R效应和RPAKPAR介导作用将其靶向至原发肿瘤和血道转移病灶。此脂质体载体系统可用作前列腺癌原发肿瘤和转移肿瘤诊断或治疗的药物6靶向递送。
图 1 为 CRPAKPAR 的 HPLC 图谱色谱方法色谱柱Diamonsil C18 5ym 200X4. 6mm 迪马；流动相 A :0. 1%TFA H2O ； 流动相 B:0. 1%TFA 乙腈；洗脱程序0_2min 5%B，2 32min 5%_65%B，32 33min 65% 90%B， 33 36min 90%B ；波长UV214nm ；流速0. 7ml/min ；柱温40°C ； 图2为CRPAKPAR的质谱图； 图 3 为 RPAKPAR-PEG-DSPE 的 -NMR 图谱； 图4为RPAKPAR-脂质体/FAM和脂质体/FAM粒径分布图； 图5为RPAKPAR-脂质体/FAM和脂质体/FAM被PC-3肿瘤细胞摄取照片； 图6为RPAKPAR-脂质体/DOX和脂质体/DOX对PC-3前列腺癌肿瘤细胞体外生长抑制效果。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例1 CRPAKPAR的合成、纯化和表征称取Boc-Arg(Z)-PAM树脂0.4167g (取代度0. 6mmol/g)于接肽瓶中，树脂用DMF (N，N-二甲基甲酰胺)溶胀，二十分钟后，抽干。加入约两倍树脂体积的TFA (三氟乙酸)搅拌反应，抽去TFA，再加入TFA同法操作一次，脱去Boc保护基。用HBTU (苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸盐)的DMF溶液和DIEA (N, N- 二异丙基乙胺)活化 Boc-Ala,树脂用DMF洗涤后加入Boc-Ala活化液，振摇反应。反应结束后抽去反应液，并用 DMF洗涤树脂。随后以上述方法按CRPAKPAR序列顺次连接其余氨基酸。反应结束后按前述方法洗涤树脂、TFA脱保护基。依次用DMF、DCM/MeOH (二氯甲烷/甲醇，1/1，ν/ν)洗涤树脂，真空干燥。
将树脂放入多肽切割管中，加入适量P-cresol，然后通入HF，冰浴搅拌反应1小时。反应结束后减压抽去管中HF，残液用适量冰乙醚沉淀，过滤得沉淀并用冰乙醚洗涤沉淀3次。沉淀重新用TFA溶解，过滤得滤液。滤液再于冰乙醚中沉淀，砂芯漏斗过滤，弃滤液，以水复溶沉淀，冻干得CRPAKPAR纯品，以HPLC及MS对其进行表征，参见图1和图2，由质谱结果计算得其分子量为898. 10与理论分子量相符合。结果表明CRPAKPAR合成成功。
实施例2 :RPAKPAR-PEG335O-DSPE的合成、纯化和表征将上述步骤得到的CRPAKPAR溶于PBS溶液中(ρΗ7. 0)，取Mal-PEG335tl-DSPE (马来酰亚胺-聚乙二醇(分子量3350)-磷脂复合物)溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，TLC (薄层层析法)监测反应，待Mal-PEG335ci-DSPE反应完全后停止反应，过量的CRPAKPAR和DMF通过透析(截留分子量3. 5kDa)除去。冷冻干燥，得到直链的RPAKPAR-PEG335(1-DSPE，NMR表征其结构，参见图3，图中A为Mal-PEG335tl-DSPE的核磁图谱，B为RPAKPAR-PEG335(1-DSPE的核磁图谱，由图可看出，A图显示出马来酰亚胺峰，而B图中该峰消失，而其余峰基本保持不变， 显示Mal-PEG335tl-DSPE中的马来酰亚胺基团已与RPAKPAR反应。结果显示，Mal-PEG335tl-DSPE 图谱在6. 67ppm处显示Mal的特征峰，而RPAKPAR-PEG335(1-DSPE图谱上此峰消失，说明RPAKPAR-PEG3350-DSPE 合成成功。
实施例3 :RPAKPAR-PEG335O-DPPE的合成、纯化和表征将上述步骤得到的CRPAKPAR溶于PBS溶液中(pH7. 0)，取Mal-PEG335tl-DPPE (马来酰亚胺-聚乙二醇(分子量3350)-磷脂复合物)溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，TLC (薄层层析法)监测反应，待Mal-PEG335ci-DPPE反应完全后停止反应，过量的CRPAKPAR和DMF通过透析(截留分子量3. 5kDa)除去。冷冻干燥，得到直链的RPAKPAR-PEG335(1-DPPE，NMR表征其结构，参见图3，图中A为Mal-PEG335tl-DPPE的核磁图谱，B为RPAKPAR-PEG335(1-DPPE的核磁图谱，由图可看出，A图显示出马来酰亚胺峰，而B图中该峰消失，而其余峰基本保持不变， 显示Mal-PEG335tl-DPPE中的马来酰亚胺基团已与RPAKPAR反应。结果显示，Mal-PEG335tl-DPPE 图谱在6. 67ppm处显示Mal的特征峰，而RPAKPAR-PEG335(1-DPPE图谱上此峰消失，说明 rpakpar-peg335o-dppe 合成成功。
实施例4 :RPAKPAR-PEG4500-DSPE的合成、纯化和表征将上述步骤得到的CRPAKPAR溶于PBS溶液中(pH7. 0)，取Mal-PEG45citl-DSPE (马来酰亚胺-聚乙二醇(分子量4500)-磷脂复合物)溶于DMF，两者混合后磁力搅拌反应，TLC (薄层层析法)监测反应，待Mal-PE(i45(1(1-DSPE反应完全后停止反应，过量的CRPAKPAR和DMF通过透析(截留分子量3. 5kDa)除去。冷冻干燥，得到直链的RPAKPAR-PEG45(1(1-DSPE，NMR表征其结构，参见图3，图中A为Mal-PEG45citl-DSPE的核磁图谱，B为RPAKPAR-PEG45(1(1-DSPE的核磁图谱，由图可看出，A图显示出马来酰亚胺峰，而B图中该峰消失，而其余峰基本保持不变， 显示Mal-PEG45citl-DSPE中的马来酰亚胺基团已与RPAKPAR反应。结果显示，Mal-PEG45citl-DSPE 图谱在6. 67ppm处显示Mal的特征峰，而RPAKPAR-PEG45(1(1-DSPE图谱上此峰消失，说明 rpakpar-peg4500-dspe 合成成功。
实施例5 :RPAKPAR-脂质体/FAM的制备和表征脂质体膜材料处方组成为HSPC (氢化大豆磷脂VChol (胆固醇)/mPEG_-DSPE(甲氧基聚乙二醇(分子量2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物)(55: 45: 2，mo 1/mo 1),RPAKPAR 修饰的 PEG 脂质体膜材料处方为 HSPC/Chol/mPE(i2(l(l(l-DSPE/ RPAKPAR-PEG335(I-DSPE (55: 45: 2: 0.5，mol/mol)。称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均勻脂质膜，真空干燥M小时。加入FAM水溶液水化，60°C水浴震荡2小时，得脂质体混悬液。 在60°C水浴中，使用高压均质机(若脂质体体积少于10 mL则改用微型挤出器)依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的FAM，得脂质体。脂质体用动态光散射法测定粒径， 显示粒径均约为90nm。
实施例6 :RPAKPAR-脂质体/FAM的制备和表征脂质体膜材料处方组成为DPPC (二棕榈酰磷脂酰胆碱)/Chol (胆固醇)/ mPEG3000-DSPE (甲氧基聚乙二醇(分子量3000) - 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺复合物)(55: 45: 2，mol/mol)，RPAKPAR 修饰的 PEG 月旨质体膜材料处方为 DPPC/Chol/mPE(i2_-DSPE/ RPAKPAR-PEG4500-DSPE (55: 45: 2: 0.5，mol/mol)。称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去有机溶媒，得均勻脂质膜，真空干燥M小时。加入FAM水溶液水化，60°C水浴震荡2小时，得脂质体混悬液。在60°C水浴中，使用高压均质机(若脂质体体积少于10 mL 则改用微型挤出器)依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，使其粒径减小。然后以生理盐水为洗脱液过葡聚糖凝胶G-50层析柱分离除去未包封的FAM，得脂质体。脂质体用动态光散射法测定粒径，显示粒径均约为80nm。
实施例7 :RPAKPAR-脂质体/DOX的制备和表征普通脂质体膜材料处方组成为HSPC/Chol/mPE(i2(1(1(1-DSPE(55:45:2, mol/mol)，RPAKPAR 修饰的脂质体膜材料处方为 HSPC/Chol/mPEG2Q(l(l-DSPE/ RPAKPAR-PEG335(I-DSPE (55: 45: 2: 1，mol/mol)。分别称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去氯仿，得均勻脂质膜， 真空干燥Mh。加入一定体积的0. 155M硫酸铵溶液，60°C水浴震荡2h，得脂质体混悬液。 在60°C水浴中，使用高压均质机(若脂质体体积少于IOmL则改用微型挤出器)依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂质体。以生理盐水为洗脱剂，将空白脂质体洗脱通过kphadex G-50凝胶柱更换外水相。按照药脂比1:10 (w/w)加入阿霉素生理盐水溶液，60°C水浴20min。以生理盐水洗脱通过kphadex G-50凝胶柱，除去游离药物， 得阿霉素脂质体。用动态光散射法测定粒径，参见图4，脂质体/FAM和RPAKPAR-脂质体/ FAM粒径分布图，由图可知，两者粒径大小及分布无显著差异。显示粒径均约为90nm。
实施例8 :RPAKPAR-脂质体/DOX的制备和表征普通脂质体膜材料处方组成为HSPCX氧化大豆磷脂)/Chol(胆固醇)/mPE(i2_-D0PE(甲氧基聚乙二醇(分子量2000)- 二油酰基磷脂酰乙醇胺复合物)(55:45:2，mol/mol),RPAKPAR 修饰的脂质体膜材料处方为 HSPC/Chol/mPEG2(IQ(l-D0PE/ RPAKPAR-PEG335(l-D0PE (55: 45: 2: 1，mol/mol)。分别称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去氯仿，得均勻脂质膜， 真空干燥Mh。加入一定体积的0. 155M硫酸铵溶液，60°C水浴震荡2h，得脂质体混悬液。 在60°C水浴中，使用高压均质机(若脂质体体积少于IOmL则改用微型挤出器)依次将脂质体挤压过400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂质体。以生理盐水为洗脱剂，将空白脂质体洗脱通过kphadex G-50凝胶柱更换外水相。按照药脂比1:10 (w/w)加入阿霉素生理盐水溶液，60°C水浴20min。以生理盐水洗脱通过kphadex G-50凝胶柱，除去游离药物， 得阿霉素脂质体。用动态光散射法测定粒径，参见图4，脂质体/FAM和RPAKPAR-脂质体/ FAM粒径分布图，由图可知，两者粒径大小及分布无显著差异。显示粒径均约为70nm。
实施例9 :RPAKPAR-脂质体体外肿瘤细胞靶向性验证取对数生长期的单层培养PC-3细胞，用0. 25%胰蛋白酶和0. 025%乙二胺四乙酸二钠消化单层培养细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔1 X IO5个细胞接种于M孔培养板中，每孔体积1ml，将培养板移入二氧化碳培养箱中，37°C，5% 二氧化碳及饱和湿度条件下培养过夜，使细胞贴壁。次日，用含1%胎牛血清的DMEM培养液配制一系列不同浓度的脂质体/FAM和RPAKPAR-脂质体/FAM溶液。将培养板中的培养液吸出，加入脂质体/FAM和RPAKPAR-脂质体/FAM的系列溶液，37°C孵育lh，吸弃上清液。用PBS溶液洗板两次，在荧光显微境下观察细胞内化情况。参见图5，RPAKPAR-脂质体/FAM (A)和脂质体/FAM (B)于37°C分别与PC-3细胞作用1小时后的荧光显微照片，由图可知，PC-3 细胞对RPAKPAR-脂质体/FAM的摄取量远大于脂质体/FAM。结果显示，脂质体/FAM不能被PC-3细胞摄取，而RPAKPAR-脂质体/FAM则被大量摄取，说明在RPAKPAR的介导作用下， RPAKPAR-脂质体对前列腺癌肿瘤细胞具有良好的体外靶向性。
实施例10 :RPAKPAR-脂质体/DOX对PC_3前列腺癌细胞的体外生长抑制作用采用MTT法测定RPAKPAR-脂质体/DOX和脂质体/DOX对肿瘤细胞的体外生长抑制作用。将处于对数生长期的PC-3细胞用0. 25%胰蛋白酶(含EDTA)消化，细胞计数，96孔板中(corning，USA)每孔加入200μ1细胞悬液(2Χ 103cells)，留出三孔加不含细胞的培养液作为空白孔，贴壁Mh。用细胞培养液将脂质体/DOX和RPAKPAR-脂质体/DOX稀释至DOX 浓度为6. 25ηΜ^102. 4μΜ，吸去96孔板内细胞培液，各孔加入200μ1 —系列浓度的脂质体药液。每个浓度均设三复孔，留出三个仅加入培养液的孔作为对照孔，培养72h。用细胞培液配置MTT，浓度为0. 2mg/ml，吸去96孔板的药液，每孔加入MTT溶液200μ1，37°C培养4h，小心吸去液体，每孔加入150μ1 DMS0，水浴振荡lOmin，酶标仪(Bio-TEK)检测吸光度(检测波长570nm)，以下列公式计算细胞存活率，细胞存活率=(A^-Ase)/ (Aw-Ase)并根据存活率计算得到脂质体/DOX和RPAKPAR-脂质体/DOX体外抗PC-3细胞的IC5tl 值分别为1. 38 X IO4M和1. 66 X IO^5M, RPAKPAR的修饰使阿霉素脂质体的IC5tl值降低了 8. 3 倍，显著增加了阿霉素脂质体体外抗前列腺癌细胞生长作用。
实施例11 :RPAKPAR-脂质体/DOX对前列腺癌肿瘤组织的的体内生长抑制作用将处于对数生长期的PC-3细胞胰酶消化，PBS洗涤，分散于PBS中，以1 X IO7细胞 (ΙΟΟμΙ)浓度皮下注射接种于裸鼠右侧肩胛骨部位，SPF环境下饲养。将M只已形成PC-3 皮下肿瘤的裸鼠随机分为4组(每组6只)，分别设为N. S.，D0X,脂质体/DOX和RPAKPAR-脂质体/DOX组。将ΙΟΟμΙ相应的制剂分别在接种后第15、20、25天经足垫组织间隙注射到裸鼠体内，阿霉素的总剂量为10mg/kg。在接种后30天，将裸鼠处死，取出皮下肿瘤块，称重并测量体积和重量。体积由以下公式计算得到 V (mm3) = (d2 X D) / 2其中d和D分别为淋巴结的短径和长径，单位为mm。参见图6，RPAKPAR的修饰显著增加了阿霉素脂质体对PC-3前列腺癌肿瘤细胞的体外生长抑制效果，结果显示与脂质体/ DOX相比，RPAKPAR-脂质体/DOX对肿瘤生长抑制作用显著增强。
权利要求
1.一种神经毡蛋白-ι配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征在于该复合物由神经毡蛋白-1配体多肽、聚乙二醇和磷脂三部分通过共价连接而成的线性嵌段共聚物，其中神经毡蛋白-1配体多肽、聚乙二醇和磷脂的摩尔比为1:1:1，所述的神经毡蛋白-1配体多肽的氨基酸序列为RPAKPAR。
2.根据权利要求1所述的神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征是所述的聚乙二醇的重均分子量为40(Γ8000。
3.根据权利要求2所述的神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征是所述的聚乙二醇重均分子量为200(Γ5000。
4.根据权利要求1所述的神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征是所述的磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。
5.一种主动靶向脂质体载体系统，含有根据权利要求1、2、3或4所述的神经毡蛋白-1 配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物，其特征在于该载体系统的组成为a.磷脂；b.胆固醇；c.甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物；d.神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物；上述各成分之间的摩尔比为a:b=5:l 1:5，a:c=1000:l 1000:100， a:d=1000:0. 1 1000:100。
6.根据权利要求5所述的主动靶向脂质体载体系统，其特征是组分a所述的磷脂为 蛋磷脂、氢化大豆磷脂酰胆碱、氢化蛋磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、 1-棕榈酰-2-硬脂酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱、1-硬脂酰-2-亚油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、氢化二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二硬脂酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、脑磷脂酰丝氨酸、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰丝氨酸、蛋磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、脑鞘磷脂、二棕榈酰鞘磷脂或二硬脂酰鞘磷脂。
7.根据权利要求5所述的主动靶向脂质体载体系统，其特征是所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中的磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、氢化大豆磷脂酰乙醇胺、氢化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或蛋磷脂酰乙醇胺。
8.根据权利要求5所述的主动靶向脂质体载体系统，其特征是所述的甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物中的甲氧基聚乙二醇重均分子量为400飞000。
9.一种制备根据权利要求5、6、7或8所述的主动靶向脂质体载体系统的方法，其特征在于该方法的具体步骤为分别称取上述各组分溶于氯仿中制备得到均勻脂质膜，真空干燥；再加入0. 155M的硫酸铵溶液，在20-70°C水浴中震荡得到脂质体混悬液；再于20_70°C 水浴中依次挤压过400、200、100和50nm核孔膜，得空白脂质体，即为含有神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物的主动靶向脂质体载体系统。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述的神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物的制备方法的具体步骤为a.将取代度为0.6mmol/g的叔丁氧羰基-精氨酸(对甲苯磺酰基)_对乙酰氨基苄酯 Boc-Arg (Tos)-PAM树脂用N，N-二甲基甲酰胺DMF溶胀，抽干；再用三氟乙酸TFA脱去Boc 保护基，抽去TFA;b.用苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸盐HBTU的DMF溶液和N，N- 二异丙基乙胺DIEA活化叔丁氧羰基-丙氨酸Boc-Ala，得Boc-Ala活化液；c.将步骤a所得树脂用DMF洗涤后加入步骤b所得的Boc-Ala活化液，25°C振摇反应 25分钟，抽去反应液，并用DMF洗涤树脂；d.重复步骤a_c，按CRPAKPAR序列顺次连接其余氨基酸；反应结束后洗涤树脂、TFA 脱保护基，真空干燥；e.将步骤d所得的树脂放入多肽切割管中，加入适量P-cresol，然后通入HF，冰浴搅拌反应1小时；反应结束后减压抽去管中HF，残液用适量冰乙醚沉淀，过滤得沉淀并用冰乙醚洗涤沉淀；沉淀重新用TFA溶解，过滤得滤液；滤液再于冰乙醚中沉淀，过滤，滤渣以水复溶，冻干得CRPAKPAR纯品；f.将步骤e得到的CRPAKPAR溶于pH7.O的PBS溶液中，取马来酰亚胺-聚乙二醇-磷脂复合物Mal-PEG-DSPE溶于DMF，搅拌反应至Mal-PEG-DSPE反应完全，去除过量的CRPAKPAR 和DMF，冷冻干燥，得到直链的神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物。
全文摘要
本发明涉及一种神经毡蛋白-1配体多肽-聚乙二醇-磷脂复合物、其主动靶向脂质体载体系统及其制备方法。脂质体载体系统的成分为a磷脂，和b胆固醇，和c甲氧基聚乙二醇-磷脂复合物(甲氧基聚乙二醇的分子量为400~6000)，和d含RPAKPAR序列的多肽-聚乙二醇-磷脂复合物(聚乙二醇的分子量为400~8000)。各成分之间的摩尔比为a:b=5:1~1:5，a:c=1000:1~1000:100，a:d=1000:0.1~1000:100。该系统可通过皮下组织间隙注射或肌肉注射将脂质体被动引流至淋巴系统内，通过RPAKPAR的介导作用靶向至淋巴转移病灶。该系统也可直接通过静脉注射给药，通过肿瘤EPR效应和RPAKPAR介导作用将其靶向至原发肿瘤和血道转移病灶。此脂质体载体系统可用作前列腺癌原发肿瘤和转移肿瘤诊断或治疗的药物靶向递送。
文档编号A61P35/00GK102516391SQ20111043759
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者何丹农, 杨一祎, 金彩虹, 钟建, 闫志强, 陈玉云, 魏岱旭 申请人:上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司