专利名称：一种猪o型口蹄疫合成肽疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种猪0型口蹄疫合成肽疫苗及其制备方法。
背景技术：
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth virus, FMDV)引起猪、牛、羊等偶蹄兽的一种急性热性高度接触性传染病，严重危害家畜的生产力和畜产品质量安全，被OIE列为A类重要传染病。目前对于该病的防制发达国家主要采取屠杀政策，发展中国家采取隔离和免疫接种政策，其中疾病流行前的免疫接种是特异性保护家畜免遭感染的有效手段。我国目前通过接种灭活疫苗及合成肽疫苗等一些新型疫苗来控制该病的流行。但现有的这些疫苗都存在一些缺陷。如灭活疫苗主要缺点是生物安全性问题及稳定性问题，病毒必须在高度要求的设备中生产，以防散毒；现有的合成肽苗虽然具有良好的保护效果，但生产工艺复杂，成本高不利于降低成本。因而一种廉价、安全、 高效的疫苗生产系统的开发具有巨大的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于根据现有合成肽疫苗中存在的生产工艺复杂，成本高的问题， 提供一种廉价、安全、高效的猪0型口蹄疫合成肽疫苗。本发明另一目的在于提供上述疫苗的制备方法。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现
一种猪0型口蹄疫合成肽疫苗，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，基因序列如SEQ ID NO: 2所示；所述氨基酸序列采用的是猪0型口蹄疫VPl蛋白中具有抗原性的141-160位及 200-213位氨基酸肽段，并将其组成多拷贝的串联结构，在肽段连接处加入氨基酸多肽作为接头；抗原多肽采用如下串联结构Y-M-X-N-Y，其中“X”和“Y”分别代表猪0型口蹄疫VPl 蛋白141-160、200-213位氨基酸肽段；“M”和“N”分别代表“Pro-Gly” 二肽接头及i^一肽接头，所述i^一肽接头的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。本发明上述猪0型口蹄疫合成肽疫苗的制备方法包括如下步骤
(I)应用重组DNA技术，合成编码猪0型口蹄疫合成肽的DNA序列，构建pGAPZ a A-SP 表达载体。(2)重组表达载体pGAPZ a A-SP转化宿主细胞毕赤酵母中，构建表达工程菌将感受态 A pas tor is X33 (80 y L)与 Bln 线性化的 pGAPZ a A-SP (10 u g)相混合，I. 5 kV、200 电击5 ms。将转化后的酵母细胞铺于新鲜制备的YPDS平板(含100 u g/ml Zeocin)上，将平板倒置，于30°C温箱中培养至单菌落出现(需要3-5 d)。采用煮一冻一煮法制备PCR模板分析P. Pastoris转化子，以引物能扩增出约200bp的克隆子定为阳性转化子。再经不同浓度Zeocin的YPD平板筛选高拷贝克隆，以用于高效表达目的蛋白。(3)发酵培养重组酵母菌，进行表达，表达产物作SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定；
(4)表达产物纯化，并选用佐剂乳化制成新型的猪0型口蹄疫合成肽疫苗。作为一种优选方案，上述方法中，所述表达载体为毕赤酵母表达载体。作为一种优选方案，上述方法中，所述步骤(3)具体为用灭菌牙签细挑筛选到的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于5 mL的YPD液体培养基中进行一级培养，28°C _30°C，200 r/min振荡过夜，至0D600=2_6，此时细胞处于对数生长期；取I mL—级培养液，重悬于30 mL的YPD中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎。培养72小时，3000 r/ min离心5 min,收集培养液上清，即得纯化蛋白。 作为一种优选方案，上述方法中，所述步骤(4)中所述佐剂为进口油乳佐剂。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
毕赤酵母菌作为外源基因真核表达系统，具有较高的表达量。用毕赤酵母基因表达系统生产蛋白质具有很大的发展前景，国外已有多种蛋白酶及抗体基因得到了高效表达，一些已经商品化生产。酵母具有比大肠杆菌更完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，且不会产生内毒素，是基因工程中良好的真核基因受体菌。本发明选用野生型毕赤酵母菌X33，生长速度快，而且自身分泌内源性蛋白很少，这就大大减少了我们对培养基中的外源基因表达产物的纯化，有助于提高表达量。pGAPZ a A为一种非诱导分泌型表达载体，不需甲醇诱导，所表达异源蛋白直接分泌到培养基中，便于目的基因表达产物的纯化，且培养基价格低廉，更利于实现工业化生产。优秀基因工程疫苗的出现往往有赖于对该病的病原物的抗原位点的充分研究。所以自上世纪80年代以来，人们更加重视对FMDV各抗原位点的分析。其中结构蛋白VPl的研究最为普遍，并得到其为主要免疫原性抗原这一重要结论，VPl G-H环和C末端含有重要的抗原位点，并进行了大量的研究。现研究的口蹄疫基因工程疫苗都是基于VPl基因及其抗原表位。如化学合成VPl的141-160AA和200-213AA ;在活载体中表达VPl融合蛋白； 用编码VPl的141-160AA和200-213A的DNA研制成核酸疫苗；用植物表达VPl蛋白，研制成植物可饲疫苗等。本研究同样选择141-160AA和200-213AA这两个氨基酸肽段，并将其组成141-160AA 200-213AA 141-160AA的串联结构，在肽段连接处加入适当的氨基酸多肽作为接头。综述所述,本发明中所述疫苗同时具有B细胞抗原表位及T细胞抗原表位,具有较好的免疫原性，另外本发明运用真核表达系统(毕赤酵母表达系统)表达合成肽基因，目的基因表达后得到修饰，增强了肽疫苗的免疫原性。本发明应用基因工程技术在真核细胞中高效表达了猪0型口蹄疫合成肽，经实验表明该表达产物具有较好的免疫原性。且本发明表达效率高，分离纯化简单，生产成本低，易放大，稳定性好，适于大规模工业化生产。因此， 本发明为临床上的猪0型口蹄疫疾病防治和治疗提供新型的疫苗制备方法，具有广阔的应用前景。
图I是重组质粒pGAPZ a A-SP电泳图，M :DNA分子质量标准；1、2:重组质粒 pGAPZa A-SP。图2是重组酵母阳性克隆子PCR电泳图，M =DNA分子质量标准；1、2 :重组酵母菌pGAPZ a A-SP/X33 ；3 :重组酵母菌 pGAPZ a A /Χ33。图3是表达产物SDS-PAGE分析，Μ:非预染蛋白质分子量标准；I :重组酵母菌 pGAPZ α Α/Χ33的表达上清；2、3、4 :重组酵母菌pGAPZ a A-SP/X33菌的表达上清。图4是表达产物Western-blot结果，M :非预染蛋白质分子量标准；1，2 :重组酵母菌pGAPZ a A-SP/X33菌的表达上清；3 :重组酵母菌pGAPZ α Α/Χ33的表达上清。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例I
(I)构建重组表达载体根据毕赤酵母基因的偏嗜性、合成肽SP氨基酸序列及表达载体pGAPZ a A的多克隆位点，设计并全基因合成SP基因，连接于质粒Puc57载体上，双酶切 Puc57重组载体及表达载体pGAPZ αΑ，然后连接转化构建重组表达载体(图I)。另设计两条引物用于检测，引物如下pl: SEQ ID N0:4, p2: SEQ ID NO: 5，酶切位点为EcoR I和 Not I。(2)构建基因工程菌用上述构建好的重组表达载体转化宿主菌，宿主菌为毕赤酵母 X33。(3)重组酵母菌合成肽的表达用灭菌牙签细挑筛选到的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于5 mL的YPD液体培养基中进行一级培养，30°C，200 r/min振荡过夜，至 0D600=2-6，此时细胞处于对数生长期。取I mL—级培养液，重悬于30 mL的YPD中，继续振荡培养，用四层干净的纱布外加两层报纸包扎，培养约72小时，另取一部分菌液采用 “煮-冻-煮”处理后，作PCR检测(图2)。(4)纯化表达上清3 000 r/min离心5 min,纯化蛋白。实施例2
猪O型口蹄疫合成肽疫苗的制备对上诉表达上清进行SDS-PAGE和Western -Blot分析(图Γ4)，然后将青霉素、链霉素与分离纯化的蛋白混合，将混合物PH值调至生理值，即 PH7. 0-7. 5，即制备了猪O型口蹄疫合成肽疫苗，佐剂选用进口油乳佐剂。实施例3
猪O型口蹄疫合成肽表达量测定SP表达上清蛋白浓度测定采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒，由于表达上清中存在少量的菌体蛋白，故测定的浓度为总蛋白浓度，具体步骤如下
I.完全溶解蛋白标准品BSA (5mg/mL)，取10 μ L稀释至100 μ L，使终浓度为O. 5mg/ mL。用PBS稀释标准品。2.将稀释后的标准品按0，I, 2，4，8，12，16，20 μ L加到96孔板的标准品孔中，加PBS稀释液补足到20 μ L03.分别将表达时间为48h、72h、96h合成肽上清10 μ L加到96孔板的样品孔中， 加PBS稀释液至20 μ L04.各孔加入200 μ L G250染色液，室温放置3-5分钟。5.用酶标仪测定波长为595nm的吸光度。
6.根据标准曲线计算出合成肽不同表达时间上清中的蛋白浓度。上述方法测定的浓度为上清中的总蛋白浓度，再根据光密度扫描仪扫描SDS-PAGE 胶中目的条带蛋白占总蛋白的百分比，即可算出合成肽在不同时间的表达量。I.实验方案结果根据标准蛋白BSA在不同浓度下的0D595值，算出在48h、72h、 96h不同时间的总蛋白表达量分别为75mg/L、90mg/L、120mg/L，再经光密度扫描仪扫描合成肽含量占总蛋白不同百分比，可算出48h、72h、96h合成肽表达量分别为40mg/L、57mg/L、 80mg/L,由此确定最佳表达时间为96h,即确定了合成肽大规模发酵的培养时间。完全溶解蛋白标准品，取10 μ I稀释至100 μ I,使终浓度为O. 5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用O. 9%NaCl或PBS稀释标准品。 完全溶解蛋白标准品，取10 μ I稀释至100 μ 1，使终浓度为O. 5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用O. 9%NaCl或PBS稀释标准品。实施例4
动物实验(血清ELISA检测)
1.1小鼠的分组与免疫
小鼠30只，随机分为5组，每组5只。首免、二免及三免各间隔均为14d，每次免疫前小鼠尾静脉采血分离血清置_20°C备用。免疫组别有A: pGAPZ a A-SP进口油乳剂组；B: pGAPZ a A-SP无佐剂组；C: pGAPZ a A组；D:阳性对照组；E: PBS对照组。免疫方案如下
(I)各组均免疫3次，免疫间隔14日。(2)pGAPZ a A-SP进口油乳剂组用进口油乳佐剂与纯化的合成肽制成乳剂，使合成肽蛋白浓度为50 μ g/mL，肌肉注射免疫，200 μ I /只/次。(3)pGAPZ a A-SP无佐剂组用无菌PBS与纯化的合成肽制成乳剂，使合成肽蛋白浓度为50 μ g/mL，肌肉注射免疫，200 μ I /只/次。(4)pGAPZ a A组用无菌PBS与空载体蛋白混合制成乳剂，使终浓度为50 μ g/mL,肌肉注射，200 μ I /只/次。(5)商品用合成肽疫苗作为阳性对照组，按照商品说明动物重量计算注射剂量为 20 μ I / 只/次。(6) PBS对照组使用无菌PBS，肌肉注射，200 μ I /只/次。I. 2疫苗对实验动物安全性试验
连续观察免疫接种的小鼠，考察小鼠注射后局部及全身反应情况。I. 3小鼠抗原特异性抗体检测
每次免疫后的14日，分别断尾采血，用O型口蹄疫ELISA检测试剂盒检测抗原特异抗体水平的变化。酶标二抗用I :2500稀释的HRP标记的山羊抗小鼠抗体。以正常小鼠血清 (PBS免疫组)作阴性对照。对血清I :100倍稀释时的0D450nm值进行统计学分析，比较差异性。
2.结果
2. I实验动物安全性实验
25只小鼠被接种后，连续观察4天，精神、食欲正常，均未出现因注射疫苗引起的死亡、 明显红肿、局部溃疡及全身反应，说明疫苗对小鼠是安全的。
2. 2抗原特异性抗体水平的检测结果
每次免疫后的14d，分别断尾采血，分离血清，用ELISA检测抗原特异抗体水平的变化。 结果见表
表I免疫小鼠血清抗VPl蛋白抗体的ELISA检测结果(0D450nm值)
免疫组别首免后第14d二免后第14d三免后第14dpGAPZ a A-SP进口油乳剂组O. 433±0. 1150. 760±0. 076I. 610±0. 115pGAPZ a A-SP无佐剂组O. 510±0. 0830. 633±0. 2300. 649±0. 083pGAPZa A 组O. 323±0. 0500. 327±0. 0670. 334±0. 050阳性对照组0. 635±0. 054I. 671±0. 0422. 764±0. 054PBS对照组0. 297±0. 0400. 305±0. 0430. 313±0. 040
由表I可见，三免后第14d，阳性对照组与其它各组抗体水平有显著差异(P < O. 05)； pGAPZ a A-SP进口油乳剂组从二免后抗体水平上升较快，三免后与pGAPZ a A-SP无佐剂组、 空载体组及PBS对照组均有显著差异；pGAPZ a A-SP无佐剂组产生了一定水平的抗体，但是三次免疫数值变化不大；pGAPZ a A组及PBS对照组无猪O型口蹄疫特异性抗体产生。以上结果说明，本发明中所提供的猪O型口蹄疫合成肽疫苗生产过程无需接触任何口蹄疫活毒，安全可靠。同时，所采用的佐剂副作用小，能大幅度提高机体对合成肽的特异性免疫应答。总之，该疫苗免疫原性良好，安全性高，生产成本低廉，具有很好的应用价值和推广前景。
权利要求
1.一种猪O型口蹄疫合成肽疫苗，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，基因序列如SEQ ID NO:2所示；所述氨基酸序列采用的是猪O型口蹄疫VPl蛋白中具有抗原性的141-160位及200-213位氨基酸肽段，并将其组成多拷贝的串联结构，在肽段连接处加入氨基酸多肽作为接头；抗原多肽采用如下串联结构Y-M-X-N-Y，其中“X”和“Y”分别代表猪 O型口蹄疫VPl蛋白141-160、200-213位氨基酸肽段；“M”和“N”分别代表“Pro-Gly”二肽接头及十一肽接头，所述十一肽接头的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
2.权利要求I所述猪O型口蹄疫合成肽疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)应用重组DNA技术，合成编码猪O型口蹄疫合成肽的DNA序列，构建pGAPZa A-SP 表达载体；(2)重组表达载体pGAPZa A-SP转化宿主细胞毕赤酵母中，构建表达工程菌；(3)发酵培养重组酵母菌，进行表达，表达产物作SDS-PAGE及Western-blot分析鉴(4)表达产物纯化，并选用佐剂乳化制成新型的猪O型口蹄疫合成肽疫苗。
3.根据权利要求2所述猪O型口蹄疫合成肽疫苗的制备方法，其特征在于所述表达载体为毕赤酵母表达载体。
4.根据权利要求2所述猪O型口蹄疫合成肽疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤(3)具体为用灭菌牙签细挑筛选到的具有Zeocin抗性的单菌落，挑于5mL的YPD液体培养基中进行一级培养，28°C-30°C，200 r/min振荡过夜，至0D600=2_6，此时细胞处于对数生长期；取I mL—级培养液,重悬于30 mL的YPD中，继续振荡培养,用四层干净的纱布外加两层报纸包扎。
5.培养72小时，3000r/min离心5 min，收集培养液上清，即得纯化蛋白。
6.根据权利要求2所述猪O型口蹄疫合成肽疫苗的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中所述佐剂为进口油乳佐剂。
全文摘要
本发明公开了一种猪O型口蹄疫合成肽疫苗及其制备方法。本发明是通过选择真核表达系统表达合成肽基因，然后将表达产物乳化成疫苗，应用了基因工程技术高效稳定表达了猪O型口蹄疫合成肽，生产成本低，易放大，且没有毒副作用和生物安全方面的担忧，适于大规模工业化生产，为临床上口蹄疫防控及治疗提供一种价格便宜的新型猪O型口蹄疫疫苗。
文档编号A61K39/135GK102580076SQ20111043730
公开日2012年7月18日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者何俊, 刘德辉 申请人:广州自远生物科技有限公司