专利名称：口蹄疫灭活疫苗安全种毒载体及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种ロ蹄疫灭活疫苗安全种毒载体及应用，即在该载体基础上构建不同血清型的ロ蹄疫灭活疫苗安全生产种毒。属于兽用生物制品领域。
背景技术：
ロ蹄疫是由ロ蹄疫病毒引起偶蹄动物的ー种急性、热性、高度传染性病毒性疾病。该病除ー些岛国外，曾广泛流行世界各地，给世界畜牧业造成了巨大的经济损失，为控制和扑灭ロ蹄疫世界各国投入巨资，截止2007年5月，OIE公布59个国家为非免疫的无ロ蹄疫国家，9个国家部分地区为非免疫的无ロ蹄疫地区，7个国家或地区为免疫无ロ蹄疫国家。ロ蹄疫目前仍然在亚洲、非洲、南美部分国家和地区流行。无ロ蹄疫国家为了防止ロ蹄疫的传入和再次爆发，特别是发达国家制定了一系列近乎残酷的国际贸易条例，限制ロ蹄疫流 行国家动物及其产品世界贸易。OIE也将该病列为头号动物疫病，所以ロ蹄疫素有“政治经济病”之称(谢庆阁主编，ロ蹄疫，中国农业出版社，2004 )。ロ蹄疫预防控制策略主要包括两大类其一是以扑杀为主的综合防控措施，是无ロ蹄疫的发达国家主要采取的措施，其ニ是以免疫为主的综合防控措施，是ロ蹄疫流行国家和经济不发达无ロ蹄疫国家所采取的主要措施，也是欧洲大多数国家60年代和南美部分国家80年代成功的控制和扑灭ロ蹄疫的主要措施，疫苗在其中发挥了至关重要的作用。针对我国及其周边国家和地区ロ蹄疫流行状况，我国采取以免疫为主，实施全国大面积普遍免疫结合局部扑杀和其它综合防控措施控制ロ蹄疫。实施免疫为主的综合防控措施的关键环节之ー是疫苗。易感动物在感染ロ蹄疫病毒或免疫ロ蹄疫病毒抗原以后,可以诱导机体产生抗ロ蹄疫病毒抗体，该抗体可以抵抗同型病毒的再次感染，所以人们自1925年开始就研究出ロ蹄疫病毒灭活疫苗用于ロ蹄疫的预防控制。为了提高疫苗的免疫效カ和安全性对ロ蹄疫疫苗进行了不断的探索和改进。对传统灭活疫苗改进了灭活剂，由传统的甲醛灭活改为更安全的BEI，为了提高免疫效カ将氢氧化铝水剂佐剂改为更为有效的免疫持续期更长的矿物油佐剂。探索了弱毒疫苗的可行性，先后研制了非易感动物传代、化学试剂或温度诱变等方法致弱疫苗毒株，60年代在临床上试用，发现很难找到毒力与免疫原性的平衡点，加上ロ蹄疫病毒宿主范围广，致弱毒株在不同宿主之间毒カ差异比较大，逐渐停用或禁用。90年代人们采用基因工程方法，改变结构蛋白及病毒受体结合位点“RGD”或删除致病基因“L蛋白”编码基因，构建新型基因工程致弱毒株，实验研究表明这些毒株可以作为弱毒疫苗毒株免疫动物，而且安全性能比传统致弱毒株高，但考虑到使用弱毒疫苗毒株不利于感染与免疫鉴别诊断而未广泛使用。ロ蹄疫基因工程疫苗，包括原核、真核表达系统，植物表达系统表达抗原，DNA疫苗,各种载体系统(腺病毒、痘苗病毒、伪狂犬病毒等)构建的载体疫苗,合成肽疫苗等一度给ロ蹄疫安全高效疫苗的研究带来了希望，但至今除猪用合成肽疫苗据报道有效果以外，没有一种通过国家或地区审评批准上市的ロ蹄疫新型疫苗。ロ蹄疫预防控制仍然采用传统灭活疫苗，是经过历史考验的最为有效的ロ蹄疫疫苗，但作为传统疫苗不可否认具有自身的缺陷。ロ蹄疫灭活疫苗的生产和检验必须使用强毒株病毒，疫苗生产首先采用强毒株在BHK21细胞中大量繁殖，经过灭活、纯化，配以适当的佐剂乳化而成。成品疫苗还必须使用免疫本动物强毒株攻毒进行检验。世界上严格规定ロ蹄疫疫苗制造、ロ蹄疫病毒研究必须在生物安全3级以上实验室进行，实验室或疫苗生产车间必须有高度安全的防泄漏系统，必须有高效空气过滤系统，疫苗制备抗原必须彻底灭活ロ蹄疫病毒，防止病毒泄漏扩散造成疫病暴发，所以灭活疫苗的安全性一直是人们关注的焦点。甲醛是ロ蹄疫灭活疫苗最初采用的灭活剂，但由于甲醛灭活凝固蛋白，易造成病毒大量聚集灭活不彻底，后来更换为BEI，据文献报道欧洲80年代前后发生几次ロ蹄疫与疫苗灭活不彻底有夫，欧盟于1990年停止使用疫苗。欧美等发达国家建有ロ蹄疫疫苗抗原库，用以配制紧急疫苗，但他们明确规定不能在本国生产灭活抗原，其保存抗原都是在非洲、南美等生产厂家生产灭活以后购进储藏的。位于英国的世界ロ蹄疫參考实验室周边曾在70年代发生过一次南非2型ロ蹄疫，据报道因实验室泄漏造成。据2005年世界ロ蹄疫參考实验室年度报告指出，近年来全世界C 型ロ蹄疫发生很少，2004年肯尼亚发生一次C型ロ蹄疫可能与当地使用疫苗有夫，鉴于此建议世界范围停止使用C型疫苗。2007年英国发生一次0型ロ蹄疫，分离毒株鉴定与1976年分离的实验室毒株OlBFS相近，本次暴发ロ蹄疫可能与发生地附近疫苗厂下水道泄漏有关。鉴于ロ蹄疫灭活疫苗采用强毒株生产，存在严重的安全隐患，本发明根据ロ蹄疫病毒的生物学特性，米用反向遗传操作技术，研发了 ロ蹄疫基因工程缺失弱毒株，该毒株缺失了 ロ蹄疫病毒毒力基因之一的L蛋白基因，L蛋白编码基因是ロ蹄疫病毒的主要毒力基因，该蛋白可以有效的阻断宿主细胞蛋白质的合成，特别是宿主病毒感染之后无法启动非特异性免疫应答一干扰素系统，该基因工程弱毒株对乳鼠、豚鼠等试验动物不致病，对ロ蹄疫毒易感动物毒力显著降低。在此弱毒株的基础上，我们删除了主要表面结构蛋白基因插入了ー个多克隆位点，构建了弱毒株ロ蹄疫感染性克隆为基础的ロ蹄疫病毒基因工程弱毒载体，可以将不同血清型(0、Asia1、A)强毒制苗种毒或田间分离强毒的任何ロ蹄疫病毒结构蛋白基因插入该ロ蹄疫病毒基因工程弱毒载体，转染细胞拯救出活病毒，该病毒維持致弱特性，并呈现所插入外源基因编码蛋白的抗原结构和免疫原性。用该毒株大量培养抗原制备疫苗，制备疫苗維持了疫苗生产毒株抗原性，但提高了疫苗制造过程中的生物安全性。ロ 蹄疫病韋(Foot-and-mouth disease virus)属小 RNA 病韋科(Picornaviridae) ロ疮病毒属(Aphthovirus),是人类发现最早的动物病毒。病毒粒子无囊膜，呈二十面体立体对称，直径约23-30nm，X线晶体衍射三维立体结构为表面相对光滑的球形，由60个分子的结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4包裹着ー个分子的RNA病毒基因组组成。ロ蹄疫病毒基因组RNA长约8. 3kb，为单股正链RNA，具有感染性，含有ー个长的开放读码框(0RF)，两侧为Y UTR和:V UTR0 ロ蹄疫病毒RNA 5' UTR比较长，大约1300nt，5'端无mRNA特有的帽结构，而共价连接ー个病毒编码多肽VPg (3B)。3' UTR由一段约IOOnt的序列和Poly (A)尾巴组成，与病毒RNA的感染性和稳定性、激活5' UTR IRES等有关。
FMDV基因组中最长的部分是翻译约2330氣基酸聚蛋白的编码序列，其蛋白翻译和加工同时进行。ロ蹄疫病毒编码蛋白分为结构蛋白和非结构蛋白，按照基因组编码顺序分别为L蛋白、P1-2A衣壳前体蛋白、P2前体蛋白、P3前体蛋白，分别经病毒蛋白酶和宿主细胞蛋白酶加工成15种成熟蛋白。L蛋白具有自身切割功能，将其从Pl前体蛋白上解1 (Jakuo Kronovetr, I'lm Skern. Foot-and-moutn disease virus leader proteinase: apapain—like enzyme requiring an acidic environment in the active site. FEBSLetters 2002 (528) 58 62);具有裂解翻译起始因子eIF4G，抑制帽结构mRNA翻译功能(Piccone. M. E. ,M. Zellner,T. F. Kumosinski,et al.1dentification of the active-siteresidues of tne L protemaseoi foot-and-mouth disease virus, j.ゾirol. 1995
(69):4950 - 4956) ;L蛋白具有显著抑制动物先天性抗ロ蹄疫应答作用，主要通过抑制干扰素表达，降低动物先天性对病毒抵抗能力，造成病毒大量繁殖和迅速扩散。L蛋白不是病毒复制所必需的病毒蛋白，L蛋白缺失病毒对易感动物致病カ明显 下降(Maria ElisaPiccone,Elizabeth Rieder, Peter W. Mason,et al. The Foot-and—Mouth Disease VirusLeader Proteinase GeneIs Not Required for Viral Replication. JOURNAL OF VIROLOGY1995(69):5376-5382)。FMDV基因组PI区，编码四种结构蛋白VP4，VP2，VP3和VPI，但在FMDV基因组翻译蛋白加工工程中，是通过2A (19个氨基酸多肽)自身切割为P12A前体蛋白形式存在，随后由3C进ー步加工成VP0、VP3和VP1。VP0、VP3、VP1可以组装成空衣壳，也可以与病毒RNA组装成前病毒颗粒，随着VPO以ー种目前尚不清楚的机制降解为VP4和VP2而形成完整的具有感染性的病毒颗粒。X-射线晶体衍射技术解析病毒衣壳的精细结构，VP1-VP3位于病毒衣壳表面，不同血清型病毒之间差异比较大，VP4位于内部，不同血清型病毒之间相对保守，变异程度不大。该病毒的表面比较光滑，而无其他小RNA病毒所具有的凹陷结构，但有ー些微小的环状突起，是病毒的主要中和位点和受体结合位点所在(Nuria Verdaguer,Mauricio G. Mateul, David Andreu, et a1. Structure of the major antigenic loopoffoot-and-mouth disease virus complexed with aneutralizing antibody:directinvolvement of theArg-Gly-Asp motif in the interaction.The EMBO Journal,1995(14) :1690-1696)。ロ蹄疫病毒抗原表位多为结构依赖性表位，所以ロ蹄疫病毒的抗原性和免疫原性取决于结构蛋白。反向遗传操作技术是研究RNA病毒基因组特性的新型常规技术已被大多数实验室所掌握，利用ロ蹄疫病毒基因组为正单股RNA，基因组本身具有感染性的特性，将基因组在体外转录为DNA形式克隆至大肠杆菌质粒之中，可以方便的对基因组进行基因操作，再在体外制备出RNA，将RNA转染细胞重新获得病毒的ー项技术。美国梅岛动物疫病研究中心于80年代末期成功的构建了 A型和0型ロ蹄疫病毒的感染性克隆，并通过L蛋白编码基因缺失获得了 L蛋白缺失A型ロ蹄疫病毒。我国中国农业科学院兰州兽医研究所也成功的构建了猪源0型ロ蹄疫病毒感染性克隆。
发明内容
本发明的目的是构建ー种ロ蹄疫灭活疫苗安全种毒载体，可在载体中插入任意A型或Asia I型或0型ロ蹄疫毒株结构蛋白基因而获得相应嵌合病毒，以嵌合病毒为疫苗生产种毒制备ロ蹄疫灭活疫苗。1.该类疫苗毒株安全性高，因缺失L蛋白，病毒对乳鼠、豚鼠、猪的致病力大大降低，不引起临床症状和病理反应，但可以在BHK-21细胞中正常繁殖；2.该类疫苗毒株通过插入口蹄疫任意流行毒株结构蛋白基因快速构建嵌合病毒，可快速生产与流行毒匹配性良好的疫苗；3.该类疫苗毒株通过将嵌合病毒的感染性克隆质粒转染BHK-21细胞拯救，获得大量病毒，从而可作为ロ蹄疫疫苗种毒株，避免了 ロ蹄疫疫苗生产检验中使用强毒，又不影响疫苗的免疫原性，确保疫苗的针对性适时性提高疫苗生产安全性。本发明是通过以下技术方案来实现的1. ロ蹄疫病毒重组载体的构建，其特征在于该载体的构建包括如下步骤
(I) ロ蹄疫病毒缺失L蛋白感染性克隆的构建是以ロ蹄疫病毒0/CHA/90全长感染性克隆(Qizu Zhao, Juan M. Pacheco, and Peter ff. Mason. Evaluation of GeneticallyEngineered Derivatives of a Chinese Strain of Foot-and—Mouth Disease VirusReveals a Novel Ceil_Binding Site Which Functions in Cell Culture and inAnimals.JOURNAL OF VIR0L0GYV,2003 (3) ,3269 - 3280 ；0ffice International desEpizooties. 1990. OIE BuIL 102:724.)为基础，使用序列I和序列2所述的ー对引物及序列4和序列5所述的ー对引物(上海英骏生物技术有限公司合成)通过重叠PCR扩增删除Lb基因，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，测序筛选阳性克隆，提质粒，以Xba I /Not I酶切连接到CHA90全长感染性克隆中构建而成，命名为p43-CHA90-LL ；(2)结构蛋白基因的删除及酶切位点的引入是以CHA90全长感染性克隆质粒为模板，使用序列8和序列9所述的ー对引物及序列10和序列11所述的ー对引物(上海英骏生物技术有限公司合成)通过重叠PCR扩增，删除结构蛋白Pl大部分基因(VP2、VP3、VP1)，同时通过同义突变引入酶切位点Ssp1、SgrA I，将PCR产物克隆至pMD18-T载体，测序筛选阳性克隆，提质粒，以Kpn I酶切连接至(I)项构建的p43-CHA90-LL中，构建获得的阳性克隆命名为p43-CHA90-LL-Vector，该重组载体p43-CHA90-LL_Vector转入到已大肠埃希氏菌中，被命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli )p43-CHA90-LL_Vector株,该菌株于2012年11月29日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCC No. 6898。ロ蹄疫病毒重组载体的应用，包括(I)含ロ蹄疫病毒流行株病毒结构蛋白的感染性克隆构建，其构建是通过PCR扩增ロ蹄疫病毒不同流行株病毒的相应结构蛋白部分，插入到重组载体p43-CHA90-LL-Vector，通过病毒拯救，构建了分别含0型、Asia I型和A型不同流行毒株的ロ蹄疫嵌合病毒。(2) ロ蹄疫嵌合病毒的拯救，是含0型、Asia I型和A型不同流行毒株的嵌合病毒感染性克隆质粒体外转录制备成RNA或直接将质粒DNA与T7聚合酶表达质粒，通过脂质体转染或电转染BHK-21细胞，成功拯救出病毒。(3)将缺失L蛋白或结构蛋白或两者均缺失的ロ蹄疫病毒基础上构建获得的包含0型、Asia I型或A型不同毒株的嵌合病毒通过转瓶培养或悬浮培养大量繁殖病毒，用于ロ蹄疫疫苗生产，制备相应型毒株的灭活疫苗，其灭活疫苗的制备方法为将ロ蹄疫嵌合病毒接种生长良好的BHK-21细胞，待细胞病变达90%以上时收获病毒，经灭活、纯化、浓缩处理后，加入油佐剂(如Mantanide ISA206)乳化而成。
具体实施方案一、ロ蹄疫灭活疫苗安全种毒载体的构建1. ロ蹄疫病毒缺失L蛋白感染性克隆的构建以CHA90株ロ蹄疫病毒全长感染性克隆(本发明人构建，见图1)为基础，用序列I和序列2所述的ー对引物及序列4和序列5所述的ー对引物(上海英骏生物技术有限公司合成)通过重叠PCR扩增删除Lb基因，如图2所示，将PCR产物克隆至pMD18-T载体(Takara公司)，测序筛选阳性克隆，提质粒，以Xba I /Not I酶切连接到CHA90全长感染性克隆中构建而成，命名为P43-CHA90-LL。
2.结构蛋白基因的删除及酶切位点的引入以ロ蹄疫病毒CHA90株全长感染性克隆质粒为模板，用序列8和序列9所述的一对引物及序列10和序列11所述的ー对引物(上海英骏生物技术有限公司合成)通过重叠PCR扩增，删除结构蛋白Pl大部分基因，同时通过同义突变引入酶切位点Ssp1、SgrA I，将PCR产物克隆至pMD18-T载体(Takara公司)，测序筛选阳性克隆，提质粒(Omega公司)，以Kpn I酶切连接至p43-CHA90_LL中，构建获得的阳性克隆(载体)命名为p43-CHA90-LL-Vector (如图3所示)，该载体已转入到大肠埃希氏菌中，该株带有p43-CHA90-LL-Vector 的大肠埃希氏菌(购自 TransGen Biotech 公司)于 2012 年 11 月 29日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCC No. 6898。ニ、ロ蹄疫灭活疫苗安全种毒载体的应用1. ロ蹄疫嵌合病毒cDNA感染性克隆的构建(I)用序列12和序列13所述的ー对引物(上海英骏生物技术有限公司)通过PCR扩增获得A型A/HuBWH/CHA/2009株的Pl基因(包括VP2、VP3、VPl),同时在两端引入酶切位点Ssp I ,SgrA I，经克隆测序，筛选阳性菌落，细菌培养，质粒提取，以Ssp I /SgrA I双酶切连接至p43-CHA90-LL-Vector中，获得A型毒株的相应嵌合病毒cDNA感染性克隆；(2)用序列14和序列15所述的ー对引物(上海英骏生物技术有限公司)通过PCR扩增获得 Asia I 型 Asial/Jiangsu/China/2005 的 Pl 基因(包括 VP2、VP3、VPl )，同时在两端引入酶切位点Ssp I , SgrA I，经克隆测序，筛选阳性菌落，细菌培养，质粒提取，以Ssp I /SgrA I双酶切连接至p43-CHA90-LL-Vector中，获得Asia I型毒株的相应嵌合病毒cDNA感染性克隆；(3)用序列16和序列17所述的ー对引物(上海英骏生物技术有限公司)通过PCR扩增获得O型不同拓扑型毒株(ME-SA拓扑型Panasia谱系0/HB/07-4株、Cathay拓扑型新猪毒II谱系0/GX/09-7株和SEA拓扑型Mya98谱系0/XJ/10-11株)的Pl基因(包括VP2、VP3、VP1)，同时在两端引入酶切位点Ssp I , SgrA I，经克隆测序，筛选阳性菌落，细菌培养，质粒提取，以Ssp I /SgrA I双酶切连接至p43-CHA90-LL-Vector中，获得O型不同毒株的相应嵌合病毒cDNA感染性克隆。利用本发明构建的载体p43-CHA90-LL-VeCtor，可以根据国外ロ蹄疫流行动态和免疫原性分析結果，采用人工DNA合成技木，合成对我国将造成威胁的ロ蹄疫病毒结构蛋白基因，制成嵌合病毒，制备疫苗，作为技术储备应急使用。免除了将我国尚未流行的境外强毒株引入开展储备性研究造成病毒扩散的风险。2.嵌合病毒cDNA感染性克隆的体外转录将A型或Asia I型或0型嵌合病毒cDNA感染性克隆质粒线性化处理，通过体外转录试剂盒转录成RNA。线性化DNA :用限制性内切酶处理A型或Asia I型或0型嵌合病毒cDNA感染性克隆质粒使其线性化
质粒30pL 10xbuffer5f.1L
IOxBSAS^iL
Swal I3|xL
ddH07^iL
总量50pL25で酶切12 16小时。去RNase :加入蛋白酶K消化酶切产物，以达到去除RNase的效果
0.5moI/L EDTAI^L
10%SDSl\ih
蛋白酶KI^iL
Givcogen from ovster Tvpex2I uL
STE buffer46(_iL
线性化质粒50pL
总体积IOOjiL苯酚氯仿抽提在100 ii L去RNase的线性化质粒中加入100 U L苯酚氯仿异戊醇(25:24:1)，游润混合，4°C, 12000r/min 离心 15min ；酒精沉淀取上清约80 90ii L，加入2. 5倍体积的无水こ醇，1/10倍体积的3mol/L醋酸钠，混匀，放置_20°C沉淀30分钟，4°C，12000r/min离心15min ；DNA溶解弃上清，在37°C干燥15min，加入15 ii L无核酶水。RNA转录按照体外转录试剂盒说明书操作,加入以下成分。DNA模板5pL
IOXbuffer2jLiL
酶混合物2卟
各种 dNTP2\xh
无核酶水3h.L
总体积20gL39 °C作用2 3小时，电泳检测。 3.病毒拯救通过电转染或脂质体转染将A型或Asia I型或0型嵌合病毒RNA转染到BHK-21细胞中，成功拯救出相应病毒。转染后48 72小时可引起BHK-21细胞产生病变(CPE)，经过传代观察CPE，PCR扩增及产物测序，确定病毒拯救成功。4.病毒传代将转染RNA培养48 72小时、BHK-21细胞出现95%CPE后收获病毒液，按照5 10%的接毒量接种生生长良好的BHK-21细胞。5. RT-PCR检测病毒用Trizol法或试剂盒提取病毒液中RNA，反转录获得cDNA，用引物(No. 15，No. 16)扩增A型、0型、Asia I型ロ蹄疫病毒VPl基因，测序，每隔2代进行一次PCR检测。PCR反应体系如下
IOxbufferSjllL
dNTP3 |iiL
上游引物2pL
下游引物2pL
Taq-HS0.3uL
H2O32.7uL
cDNA5ドし
总体积50pL混匀后按照以下程序进行PCR扩增
95lC2min
951 30sI
55 C30s 3OcycIe
72 0CImin
72 TJ IOnvin用0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测A型、0型、Asia I型PCR目的条带大小分别为745bp，745bp，798bp06.病毒遗传稳定性检测将姆次扩增的PCR产物送测序，一直检测至15代，A型、
0型、Asia I嵌合病毒VPl基因中仅出现少量碱基突变，氨基酸未出现突变。
7. FMD抗原检测用酶联免疫吸附试验(双夹心ELISA方法)检测各血清型嵌合病毒，结果均为阳性。三、ロ蹄疫灭活疫苗的制备1.病毒的繁殖(I)通过转瓶培养生产病毒将传代至8 12代的病毒液作为生产种子批，冻存于-80°C冰箱，繁殖病毒时取病毒液解冻，按照5 10%的比例接种生长良好的BHK-21细胞，每瓶1. 5L，培养24 48小时，待细胞病变(CPE)出现95%以上时收获病毒，冻存于_20°C待检。(2)通过悬浮培养生产病毒取8 12代的生产种子批病毒液,接种5L发酵罐，通过逐级放大至1000L，待悬浮BHK-21细胞病变达到95%以上时收获病毒，病毒液冻存于-20°C待检。(3)制苗毒液的检验I)无菌检验按照《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典ニ零一零年版三部中国农业出版社，2010，本发明称《中国兽药典》)附录42页进行，无细菌、霉囷生长；2)支原体检验按照《中国兽药典》附录49页进行，无支原体生长；3)病毒含量測定TCID5。測定将病毒液10倍系列稀释至10_8，分别接种生长良好的96孔BHK-21细胞，每个稀释度重复4孔，每孔接种100 u L，放置37°C，5%C02培养箱中培养72小吋，观察细胞病变并计算TCID5tlt5各株ロ蹄疫嵌合病毒毒价均超过104TCID5(l/mL。146S含量测定取病毒液50ml在4°C，8000r/min条件下离心30min，以除去灭活抗原液中残留的细胞碎片；取上清液，加入等体积三氯こ烯，充分混匀后，4°C 8000r/min离心30min。离心后，取出上清液，装入超速离心管中，4°C 40000r/min离心3. 5h。离心后，弃上清液，往每只离心管内加入0. 5ml TNE缓冲液(pH 7. 6)，用超声波处理充分分散沉淀物。第2天取出浓缩的抗原并加入NP40。吸Iml抗原加至蔗糖梯度顶部，然后4°C 35000r/min离心2. 5h，离心结束后，使用蠕动泵从离心管底部开始抽吸液体，每约0. 5ml收集一管，经紫外分光光度測定OD259nm值，计算45% 35%间蔗糖梯度处最高峰值的146S抗原含量。经测定转瓶培养中ロ蹄疫嵌合病毒146S含量较低，所有病毒146S含量为0. 4 1. 5 ii g。而悬浮培养可以大大提供病毒中146S的含量,可达3. 0 7. Oii g。4) ロ蹄疫嵌合病毒对动物致病性检验乳鼠试验每株ロ蹄疫嵌合病毒用体重18 22g乳鼠8只，每只皮下注射病毒液0.5ml，观察7日，所有乳鼠健活。证明A型或Asia I型或0型不同毒株的ロ蹄疫嵌合病毒对乳鼠无致病カ或较弱。本动物试验根据流行毒株主要感染动物的不同，分为猪体实验和牛体试验，如A型ロ蹄疫主要侵害牛，本动物实验选用牛；如0型ロ蹄疫緬甸98谱系毒株对猪和牛均有较强的感染性，本动物实验选用猪和牛。 猪体试验每株ロ蹄疫嵌合病毒用30 40日龄的健康易感仔猪(乳鼠中和抗体滴度彡1:4或细胞中和抗体滴度彡1:8或ELISA抗体效价彡1:8和3ABC抗体检测OD值小于0. 2) 2头，各两侧耳根后肌肉注射2mL病毒液，每头共4mL，连续观察14天，所有猪只健活，表明所有毒株对猪无致病力或较弱。牛体试验用病毒液接种3头牛，每头牛2mL，接种牛舌背面皮内共计20点，每点0. lmL，逐日观察4日。接着每头牛肌肉注射病毒液6mL，继续观察6日，所有牛未出现ロ蹄疫特征性临床症状。2.病毒液灭活及阻断向病毒液中加入0. lmol/L BEI溶液，调节使其终浓度为0. 002mol/L。将病毒液的温度保持在30±1°C，连续灭活28小吋。灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为2%，并加入硫柳汞溶液，使其终浓度为0. 01%，充分混匀，取样后迅速置4°C保存，同时抽样进行无菌检验。3.灭活病毒液的浓缩当使用转瓶培养时需浓缩抗原，悬浮培养时不需浓縮。利用PELLIC0N盒式超滤系统(100K NMWL MILLIP0R膜堆)，对灭活病毒液浓缩3倍。4. 146s含量的測定同病毒含量測定中146S含量測定，经测定转瓶培养中ロ蹄疫 嵌合病毒146S含量较低,所有病毒146S含量可达到0. 3 1. 3 ii g。悬浮培养中病毒146S的含量可达3.0 7. Oii g。5.乳化通过浓缩或稀释将ロ蹄疫灭活抗原中146S含量定量至2. 0 3. Oii g/头份，疫苗乳化用油佐剂为Montanide ISA 206 (法国SEPPIC公司产品)。疫苗配制比例为，灭活抗原佐剂=1:1 (V/V)0成品疫苗放置于2 8°C保存。四、成品疫苗检验1.物理性状检验外观淡粉红色略带粘滞性乳状液。剂型用清洁吸管吸取少许滴于清洁冷水表面,成云雾状扩散,为水包油包水(W/0/W)剂型。粘度用ImL吸管(下口内径为1. 2mm，上口内径为2.7mm)吸取25°C左右的疫苗lmL，令其自然流出，记录流出0. 4ml疫苗所需时间为3秒，检验合格。稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，3000转/分钟离心15分钟，管底析出的水相为0. 03mL,符合规定。2.无菌检验按照《中国兽药典》附录42页进行，无细菌、霉菌生长；3.安全检验( I)豚鼠和小白鼠检验每批疫苗用健康成年豚鼠2只，每只背部皮下注射疫苗2. OmL,同时用18 22g健康小白鼠5只，每只背部皮下注射疫苗0. 5mL,观察7天。接种豚鼠和小白鼠无局部反应和全身不良反应，均健活，判定疫苗对试验动物安全。用本动物检验根据疫苗接种对象的不同，决定选择猪或(和)牛。(2)猪体试验每批疫苗均接种2头仔猪，每头耳根后两侧肌肉分点注射2头份(4mL),连续观察14天，结果均未出现局部或全身不良反应，所有仔猪均健活，证明疫苗对仔猪安全。牛体试验用疫苗接种3头牛，每头牛2mL，接种牛舌背面皮内共计20点，每点0. lmL，逐日观察4日。接着每头牛肌肉注射疫苗6mL，继续观察6日，所有牛未出现ロ蹄疫症状和不良反应。4.效カ检验首先测定疫苗破乳后ロ蹄疫病毒146S含量。同时通过动物试验测定疫苗的ro5Q，根据免疫对象不同，分为猪苗和牛苗。(I)疫苗破乳及146S含量测定在疫苗中加入等量的三氯こ烯或三氯甲烷，震荡混匀，12000r/min离心取上清，然后按照146S含量測定步骤操作，疫苗中146S含量达1.7 2.8iig/ 头份。(2)猪苗效检试验用疫苗免疫40kg左右健康猪15头，分为3个剂量组，每组5头，分别为I头份(2mL)，1/3头份(0. 67mL), 1/9头份(0. 22mL)剂量组。免疫28天后，用检验用毒进行攻毒，每个攻毒组各设对照猪3头。每头猪耳根后肌肉注射1000ID5(l/2mL乳鼠组织毒，连续观察10天，对照组均应在I蹄以上出现临床症状。按Karbeir法计算被检疫苗的 PD5tl。(3)牛苗效检试验每批疫苗用试验牛15头，分为3组，每组5头，将待检疫苗按 使用剂量为2mL/头份，分成I头份、1/3头份、1/9头份3个剂量组，每ー剂量组分别于颈部肌肉注射5头牛。接种21日后，连同对照组2头，进行攻毒，每头牛舌上表面内侧分两点皮内注射牛ロ蹄疫A型病毒强毒，每点0.1mL (共0.2mL，含IO4ID5tlX攻毒后连续观察10日。对照牛均应至少3蹄出现水泡或溃疡。免疫牛仅在接种舌面出现水泡或溃疡，其它部位无病变时判为保护。除舌面以外任一部位出现典型ロ蹄疫水泡或溃疡时判为不保护。根据免疫牛的保护数，按Khrbei 法计算被检疫苗的ro5Q。
图1 ロ蹄疫CHA90全长cDNA感染性克隆示意2缺失L蛋白的ロ蹄疫病毒CHA90感染性克隆示意3 ロ蹄疫灭活疫苗安全种毒载体感染性克隆(p43-CHA90-LL-Vector)示意4 ロ蹄疫嵌合病毒示意图，P1’可为A型或Asia I型或0型任意毒株的Pl置换区本发明涉及的微生物资源本发明构建获得的阳性克隆命名为p43-CHA90-LL-Vector，该重组载体p43-CHA90-LL-Vector已转入到大肠埃希氏菌中，被命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)p43-CHA90-LL-Vector株，该菌株于2012年11月29日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No. 6898。本发明的有益效果 本发明涉及ー种ロ蹄疫灭活疫苗安全种毒载体及应用，即在该载体基础上构建不同血清型的ロ蹄疫灭活疫苗安全生产种毒。本发明中构建的嵌合病毒既保留了经典疫苗毒株细胞适应性良好的优点，又能通过插入流行毒株的结构蛋白克服抗原匹配性不高的缺点，可快速拯救病毒进行ロ蹄疫灭活疫苗的生产；以本载体构建的A型或Asia I型或0型不同毒株嵌合病毒为弱毒，均具有良好的生物安全性，因病毒中缺失了 L蛋白，在自然条件下不发生毒カ返强，并且病毒对乳鼠、猪或牛的致病力大大降低或者无致病性。安全性高，不会引起ロ蹄疫疫情的发生，非常具有实用价值。实施例实施例1
—A型ロ蹄疫嵌合病毒的构建及疫苗生产一、A型ロ蹄疫嵌合病毒的构建1. A型ロ蹄疫嵌合病毒感染性克隆的构建通过PCR扩增获得A型(引物No. 12，No. 13)(上海英骏生物技术有限公司)A/HuBWH/CHA/2009株的Pl基因(包括VP2、VP3、VP1 )，同时在两端引入酶切位点Ssp I , SgrA I (序列18)，经克隆测序，筛选阳性菌落，细菌培养，质粒提取，以Ssp I /SgrA I双酶切连接至p43-CHA90-LL-Vector中，获得A型嵌合病毒cDNA感染性克隆。2.嵌合病毒cDNA感染性克隆的体外转录将A型嵌合病毒cDNA感染性克隆质粒线性化处理，通过体外转录试剂盒转录成RNA。3.病毒拯救通过电转染或脂质体转染将A型嵌合病毒RNA转染到BHK-21细胞中，成功拯救出相应病毒。转染后48 72小时可引起BHK-21细胞产生病变(CPE)，经过传 代观察CPE，PCR扩增及产物测序，确定病毒(A-WH-LL)拯救成功。4.病毒传代将转染RNA培养48 72小时、BHK-21细胞出现95%CPE后收获病毒液，按照5 10%的接毒量接种生生长良好的BHK-21细胞。5.病毒检测通过PCR和双夹心ELISA方法检测均为A型ロ蹄疫阳性。PCR产物测序为A型ロ蹄疫嵌合病毒。ニ、A型ロ蹄疫嵌合病毒灭活疫苗的生产1.病毒的繁殖取8 12代的生产种子批病毒液，接种5L发酵罐，通过逐级放大至1000L，待悬浮BHK-21细胞病变达到95%以上时收获病毒，病毒液冻存于_20°C待检。2 制苗毒液的检验(I)无菌检验按照《中国兽药典》附录42页进行，无细菌、霉菌生长；(2)支原体检验按照《中国兽药典》附录49页进行，无支原体生长；(3)病毒含量測定(測定TCID5tl):将病毒液10倍系列稀释至10_8，分别接种生长良好的96孔BHK-21细胞，每个稀释度重复4孔，每孔接种IOOii L，放置37°C，5% CO2培养箱中培养72小吋，观察细胞病变并计算TCID5tlt5 A型ロ蹄疫嵌合病毒毒价达到105 8TCID5(l/mL。3.病毒液灭活及阻断向病毒液中加入0. lmol/L BEI溶液，调节使其终浓度为0. 002mol/L。将病毒液的温度保持在30±1°C，连续灭活28小吋。灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为2%，并加入硫柳汞溶液，使其终浓度为0. 01%，充分混匀，取样后迅速置4°C保存，同时抽样进行无菌检验。4. 146s含量的測定取灭活抗原50ml在4°C，8000r/min条件下离心30min，以除去灭活抗原液中残留的细胞碎片；取上清液，加入等体积三氯こ烯，充分混勻后，4°C 8000r/min离心30min。离心后，取出上清液，装入超速离心管中，4°C 40000r/min离心3. 5h。离心后，弃上清液，往每只离心管内加入0.5ml TNE缓冲液(pH 7. 6)，用超声波处理充分分散沉淀物。第2天取出浓缩的抗原并加入NP40。吸Iml抗原加至蔗糖梯度顶部，然后4°C 35000r/min离心2. 5h，离心结束后，使用蠕动泵从离心管底部开始抽吸液体，每约0. 5ml收集一管，经紫外分光光度測定OD 259 值，计算45%-35%间蔗糖梯度处最高峰值的146S抗原含量。经测定转瓶培养中ロ蹄疫嵌合病毒146S含量较低,所有病毒146S含量为0. 3 1. 3 ii g。而悬浮培养可以大大提高病毒中146S的含量，可达3. O 7. Oiig。5.乳化疫苗乳化用油佐剂为Montanide ISA 206 (法国SEPPIC公司产品)。疫苗配制比例为，灭活抗原佐剂=1:1 (V/V)0成品疫苗放置于2 8°C保存。三、成品疫苗的检验L物理性状检验外观淡粉红色略带粘滞性乳状液。剂型用清洁吸管吸取少许滴于清洁冷水表面，成云雾状扩散，为水包油包水(W/0/W)剂型。粘度用ImL吸管(下口内径为1. 2mm，上口内径为2.7mm)吸取25°C左右的疫苗 lmL，令其自然流出，记录流出0. 4ml疫苗所需时间为3秒，检验合格。稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，3000转/分钟离心15分钟，管底析出的水相为0. 03mL,符合规定。2.无菌检验按照《中国兽药典》附录42页进行，无细菌、霉菌生长；3.安全检验豚鼠和小白鼠检验每批疫苗用健康成年豚鼠2只，每只背部皮下注射疫苗
2.OmL,同时用18 22g健康小白鼠5只，每只背部皮下注射疫苗0. 5mL,观察7天。接种豚鼠和小白鼠无局部反应和全身不良反应，均健活，判定疫苗对试验动物安全。牛体试验用疫苗接种3头牛，每头牛2mL，接种牛舌背面皮内共计20点，每点0. lmL，逐日观察4日。接着每头牛肌肉注射疫苗6mL，继续观察6日，所有牛未出现ロ蹄疫症状和不良反应。4 效カ检验每批疫苗用试验牛15头，分为3组，每组5头，将待检疫苗按使用剂量为2mL/头份，分成I头份、1/3头份、1/9头份3个剂量组，每ー剂量组分别于颈部肌肉注射5头牛。接种21日后，连同对照组2头，进行攻毒，每头牛舌上表面内侧分两点皮内注射牛ロ蹄疫A型病毒强毒，每点0.1mL (共0. 2mL，含IO4ID5tlX攻毒后连续观察10日。对照牛均应至少3蹄出现水泡或溃疡。免疫牛仅在舌面出现水泡或溃疡，其它部位无病变时判为保护。除舌面以外任一部位出现典型ロ蹄疫水泡或溃疡时判为不保护。经KArber 法计算被检疫苗的PD50 为 10. 05PD50/ 头份。实施例2——0型ロ蹄疫Cathay拓扑型嵌合病毒的构建及疫苗生产—、0型ロ蹄疫Cathay拓扑型嵌合病毒的构建1.0型ロ蹄疫Cathay拓扑型嵌合病毒感染性克隆的构建通过PCR扩增(No. 16，No. 17)(上海英骏生物技术有限公司)获得Cathay拓扑型新猪毒II谱系0/GX/09-7株的Pl基因(包括VP2、VP3、VP1)，同时在两端引入酶切位点Ssp1、SgrA I (序列21)，经克隆测序，筛选阳性菌落，细菌培养，质粒提取，以Ssp I /SgrA I双酶切连接至p43-CHA90-LL-Vector中，获得0型ロ蹄疫Cathay拓扑型嵌合病毒cDNA感染性克隆。2.嵌合病毒cDNA感染性克隆的体外转录将0型ロ蹄疫Cathay拓扑型嵌合病毒cDNA感染性克隆质粒线性化处理,通过体外转录试剂盒转录成RNA。3.病毒拯救通过电转染或脂质体转染将0型Cathay拓扑型嵌合病毒RNA转染到BHK-21细胞中，成功拯救出相应病毒。转染后48 72小时可引起BHK-21细胞产生病变(CPE)，经过传代观察CPE，PCR扩增及产物测序，确定病毒(O-GX-LL)拯救成功。4.病毒传代将转染RNA培养48 72小时、BHK-21细胞出现95%CPE后收获病毒液，按照5 10%的接毒量接种生生长良好的BHK-21细胞。5.病毒检测通过PCR和双夹心ELISA方法检测均为0型ロ蹄疫阳性。PCR产物测序为0型ロ蹄疫Cathay拓扑型0_GX_LL嵌合病毒。ニ、0型ロ蹄疫Cathay拓扑型嵌合病毒灭活疫苗生产1.病毒繁殖取8 12代的生产种子批病毒液，接种5L发酵罐，通过逐级放大至 1000L，待悬浮BHK-21细胞病变达到95%以上时收获病毒，病毒液冻存于_20°C待检。2.制苗毒液的检验(I)无菌检验按照《中国兽药典》附录42页进行，无细菌、霉菌生长；(2)支原体检验按照《中国兽药典》附录49页进行，无支原体生长；(3)病毒含量測定(測定TCID5tl):将病毒液10倍系列稀释至10_8，分别接种生长良好的96孔BHK-21细胞，每个稀释度重复4孔，每孔接种100 u L，放置37°C，5%C02培养箱中培养72小吋，观察细胞病变并计算TCID5tlt5 0型ロ蹄疫Cathay拓扑型嵌合病毒毒价达到106 0TCID50/mLo(4)病毒液灭活及阻断向病毒液中加入0. lmol/L BEI溶液，调节使其终浓度为0. 002mol/L。将病毒液的温度保持在30±1°C，连续灭活28小吋。灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为2%，并加入硫柳汞溶液，使其终浓度为0. 01%，充分混匀，取样后迅速置4°C保存，同时抽样进行无菌检验。(5) 146s含量的测定取灭活抗原50ml在4°C,8000r/min条件下离心30min,以除去灭活抗原液中残留的细胞碎片；取上清液，加入等体积三氯こ烯，充分混匀后，4°C8000r/min离心30min。离心后，取出上清液，装入超速离心管中，4°C 40000r/min离心
3.5h。离心后，弃上清液，往每只离心管内加入0.5ml TNE缓冲液(pH 7. 6)，用超声波处理充分分散沉淀物。第2天取出浓缩的抗原并加入NP40。吸Iml抗原加至蔗糖梯度顶部，然后4°C 35000r/min离心2. 5h，离心结束后，使用蠕动泵从离心管底部开始抽吸液体，每约0. 5ml收集一管，经紫外分光光度測定OD259nm值，计算45%-35%间蔗糖梯度处最高峰值的146S抗原含量。经测定转瓶培养中ロ蹄疫嵌合病毒146S含量较低,所有病毒146S含量为0. 3 1. 3 ii g。而悬浮培养可以大大提高病毒中146S的含量,可达3. 0 5. 0 ii g。(6)乳化疫苗乳化用油佐剂为Montanide ISA 206 (法国SEPPIC公司产品)。疫苗配制比例为，灭活抗原佐剂=1:1 (V/V)0成品疫苗放置于2 8°C保存。三、成品疫苗的检验I 物理性状检验外观淡粉红色略带粘滞性乳状液。剂型用清洁吸管吸取少许滴于清洁冷水表面，成云雾状扩散，为水包油包水(W/0/W)剂型。粘度用ImL吸管(下口内径为1. 2mm，上口内径为2.7mm)吸取25°C左右的疫苗lmL，令其自然流出，记录流出0. 4ml疫苗所需时间为3秒，检验合格。稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，3000转/分钟离心15分钟，管底析出的水相为o. 03mL,符合规定。2.无菌检验按照《中国兽药典》附录42页进行，无细菌、霉菌生长；3.安全检验豚鼠和小白鼠检验每批疫苗用健康成年豚鼠2只，每只背部皮下注射疫苗
2.OmL,同时用18 22g健康小白鼠5只，每只背部皮下注射疫苗0. 5mL,观察7天。接种豚鼠和小白鼠无局部反应和全身不良反应，均健活，判定疫苗对试验动物安全。猪体试验每批疫苗均接种2头仔猪，每 头耳根后两侧肌肉分点注射2头份(4mL)，连续观察14天，结果均未出现局部或全身不良反应，所有仔猪均健活，表明疫苗对仔猪安全。4 效カ检验用疫苗免疫40kg左右健康猪15头，分为3个剂量组，每组5头，分别为I头份(2mL), 1/3头份(0. 67mL), 1/9头份(0. 22mL)剂量组。免疫28天后，用检验用毒进行攻毒，每个攻毒组各设对照猪3头。每头猪耳根后肌肉注射1000ID5(l/2mL乳鼠组织毒，连续观察10天，对照组出现ロ蹄疫临床症状。按FOhter法计算被检疫苗的I3D5tl为8. 06PD50/头份。实施例3——0型ロ蹄疫ME-SA拓扑型嵌合病毒的构建及疫苗生产一、0型ロ蹄疫ME-SA拓扑型泛亚毒株嵌合病毒的构建1.0型ロ蹄疫ME-SA拓扑型嵌合病毒感染性克隆的构建通过PCR扩增(No. 16，No. 17)(上海英骏生物技术有限公司)获得ME-SA拓扑型泛亚谱系0/HB/07-4株的Pl基因(包括VP2、VP3、VP1)，同时在两端引入酶切位点Ssp I ,SgrA I (序列20)，经克隆测序，筛选阳性菌落，细菌培养，质粒提取，以Ssp I /SgrA I双酶切连接至p43-CHA90-LL-Vector中，获得0型ロ蹄疫ME-SA拓扑型泛亚谱系嵌合病毒cDNA感染性克隆。2.嵌合病毒cDNA感染性克隆的体外转录将0型ロ蹄疫ME-SA拓扑型嵌合病毒cDNA感染性克隆质粒线性化处理,通过体外转录试剂盒转录成RNA。3.病毒拯救通过电转染或脂质体转染将0型ME-SA拓扑型嵌合病毒RNA转染到BHK-21细胞中，成功拯救出相应病毒。转染后48 72小时可引起BHK-21细胞产生病变(CPE)，经过传代观察CPE，PCR扩增及产物测序，确定病毒(O-HB-LL)拯救成功。4.病毒传代将转染RNA培养48 72小时、BHK-21细胞出现95%CPE后收获病毒液，按照5 10%的接毒量接种生生长良好的BHK-21细胞。5.病毒检测通过PCR和双夹心ELISA方法检测均为0型ロ蹄疫阳性。PCR产物测序为0型ロ蹄疫ME-SA拓扑型O-HB-LL嵌合病毒。ニ、0型ロ蹄疫ME-SA拓扑型嵌合病毒灭活疫苗生产1.病毒繁殖取8 12代的生产种子批病毒液，接种5L发酵罐，通过逐级放大至1000L，待悬浮BHK-21细胞病变达到95%以上时收获病毒，病毒液冻存于_20°C待检。2.制苗毒液的检验(I)无菌检验按照《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典ニ零一零年版三部中国农业出版社，2010，本发明称《中国兽药典》)附录42页进行，无细菌、霉囷生长；(2)支原体检验按照《中国兽药典》附录49页进行，无支原体生长；
(3)病毒含量測定(測定TCID5tl):将病毒液10倍系列稀释至10_8，分别接种生长良好的96孔BHK-21细胞，每个稀释度重复4孔，每孔接种100 u L，放置37°C，5%C02培养箱中培养72小吋，观察细胞病变并计算TCID5tlt5 0型ロ蹄疫ME-SA拓扑型嵌合病毒毒价达到106 0TCID50/mLo(4)病毒液灭活及阻断向病毒液中加入0. lmol/L BEI溶液，调节使其终浓度为0. 002mol/L。将病毒液的温度保持在30±1°C，连续灭活28小吋。灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为2%，并加入硫柳汞溶液，使其终浓度为0. 01%，充分混匀，取样后迅速置4°C保存，同时抽样进行无菌检验。(5) 146s含量的测定取灭活抗原50ml在4°C,8000r/min条件下离心30min,以除去灭活抗原液中残留的细胞碎片；取上清液，加入等体积三氯こ烯，充分混匀后，4°C 8000r/min离心30min。离心后，取出上清液，装入超速离心管中，4°C 40000r/min离心
3.5h。离心后，弃上清液，往每只离心管内加入0.5ml TNE缓冲液(pH 7. 6)，用超声波处理充分分散沉淀物。第2天取出浓缩的抗原并加入NP40。吸Iml抗原加至蔗糖梯度顶部，然后4°C 35000r/min离心2. 5h，离心结束后，使用蠕动泵从离心管底部开始抽吸液体，每约0. 5ml收集一管，经紫外分光光度測定OD259nm值，计算45% 35%间蔗糖梯度处最高峰值的146S抗原含量。经测定转瓶培养中ロ蹄疫嵌合病毒146S含量较低,所有病毒146S含量为0. 3 1. g。而悬浮培养可以大大提高病毒中146S的含量,可达3. 0 7. Oii g。(6)乳化疫苗乳化用油佐剂为Montanide ISA 206 (法国SEPPIC公司产品)。疫苗配制比例为，灭活抗原佐剂=1:1 (V/V)0成品疫苗放置于2 8°C保存。三、成品疫苗的检验I 物理性状检验外观淡粉红色略带粘滞性乳状液。剂型用清洁吸管吸取少许滴于清洁冷水表面，成云雾状扩散，为水包油包水(W/0/W)剂型。粘度用ImL吸管(下口内径为1. 2mm，上口内径为2.7mm)吸取25°C左右的疫苗ImL,令其自然流出，记录流出0.4ml疫苗所需时间为3秒，检验合格。稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，3000转/分钟离心15分钟，管底析出的水相为0. 03mL,符合规定。2.无菌检验按照《中国兽药典》附录42页进行，无细菌、霉菌生长；3.安全检验豚鼠和小白鼠检验每批疫苗用健康成年豚鼠2只，每只背部皮下注射疫苗
2.OmL，同时用18 22g健康小白鼠5只，每只背部皮下注射疫苗0. 5mL，观察7天。接种豚鼠和小白鼠无局部反应和全身不良反应，均健活，判定疫苗对试验动物安全。猪体试验每批疫苗均接种2头仔猪，每头耳根后两侧肌肉分点注射2头份(4mL)，连续观察14天，结果均未出现局部或全身不良反应，所有仔猪均健活，表明疫苗对仔猪安全。4 效カ检验用疫苗免疫40kg左右健康猪15头，分为3个剂量组，每组5头，分别为I头份(2mL), 1/3头份(0. 67mL), 1/9头份(0. 22mL)剂量组。免疫28天后，用检验用毒进行攻毒，每个攻毒组各设对照猪3头。每头猪耳根后肌肉注射1000ID5(l/2mL乳鼠组织毒，连续观察10天，对照组出现ロ蹄疫临床症状。按Karbei 法计算被检疫苗的I3D5tl为12. 5IPD5tl/头份。实施例4——0型ロ蹄疫SEA拓扑型嵌合病毒的构建及疫苗生产一、0型ロ蹄疫SEA拓扑型嵌合病毒的构建1.0型ロ蹄疫SEA拓扑型嵌合病毒感染性克隆的构建通过PCR扩增(No. 16，No. 17)(上海英骏生物技术有限公司)获得SEA拓扑型緬甸98谱系0/XJ/10-11株的Pl基因(包括VP2、VP3、VP1)，同时在两端引入酶切位点Ssp I ,SgrA I (序列22)，经克隆测序，筛选阳性菌落，细菌培养，质粒提取，以Ssp I /SgrA I双酶切连接至p43-CHA90-LL-Vector中，获得0型ロ蹄疫SEA拓扑型嵌合病毒cDNA感染性克隆。 2.嵌合病毒cDNA感染性克隆的体外转录将0型ロ蹄疫SEA拓扑型嵌合病毒cDNA感染性克隆质粒线性化处理，通过体外转录试剂盒转录成RNA。3.病毒拯救通过电转染或脂质体转染将0型SEA拓扑型嵌合病毒RNA转染到BHK-21细胞中，成功拯救出相应病毒。转染后48 72小时可引起BHK-21细胞产生病变(CPE)，经过传代观察CPE，PCR扩增及产物测序，确定病毒(O-XJ-LL)拯救成功。4.病毒传代将转染RNA培养48 72小时、BHK-21细胞出现95%CPE后收获病毒液，按照5 10%的接毒量接种生生长良好的BHK-21细胞。5.病毒检测通过PCR和双夹心ELISA方法检测均为0型ロ蹄疫阳性。PCR产物测序为0型ロ蹄疫SEA拓扑型O-XJ-LL嵌合病毒。ニ、0型ロ蹄疫SEA拓扑型嵌合病毒灭活疫苗生产1.病毒繁殖取8 12代的生产种子批病毒液，接种5L发酵罐，通过逐级放大至1000L，待悬浮BHK-21细胞病变达到95%以上时收获病毒，病毒液冻存于_20°C待检。2.制苗毒液的检验(I)无菌检验按照《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典ニ零一零年版三部中国农业出版社，2010，本发明称《中国兽药典》)附录42页进行，无细菌、霉囷生长；(2)支原体检验按照《中国兽药典》附录49页进行，无支原体生长；(3)病毒含量測定(測定TCID5tl):将病毒液10倍系列稀释至10_8，分别接种生长良好的96孔BHK-21细胞，每个稀释度重复4孔，每孔接种100 u L，放置37°C，5%C02培养箱中培养72小吋，观察细胞病变并计算TCID5tlt5 0型ロ蹄疫SEA拓扑型嵌合病毒毒价达到106 0TCID50/mLo(4)病毒液灭活及阻断向病毒液中加入0. lmol/L BEI溶液，调节使其终浓度为0. 002mol/L。将病毒液的温度保持在30±1°C，连续灭活28小吋。灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为2%，并加入硫柳汞溶液，使其终浓度为0. 01%，充分混匀，取样后迅速置4°C保存，同时抽样进行无菌检验。(5) 146s含量的测定取灭活抗原50ml在4°C,8000r/min条件下离心30min,以除去灭活抗原液中残留的细胞碎片；取上清液，加入等体积三氯こ烯，充分混匀后，4°C8000r/min离心30min。离心后，取出上清液，装入超速离心管中，4°C 40000r/min离心
3.5h。离心后，弃上清液，往每只离心管内加入0.5ml TNE缓冲液(pH 7. 6)，用超声波处理充分分散沉淀物。第2天取出浓缩的抗原并加入NP40。吸Iml抗原加至蔗糖梯度顶部，然后4°C 35000r/min离心2. 5h，离心结束后，使用蠕动泵从离心管底部开始抽吸液体，每约0. 5ml收集一管，经紫外分光光度測定OD259nm值，计算45%-35%间蔗糖梯度处最高峰值的146S抗原含量。经测定转瓶培养中ロ蹄疫嵌合病毒146S含量较低,所有病毒146S含量为0. 3 1. 3 ii g。而悬浮培养可以大大提高病毒中146S的含量,可达3. 0 5. 0 ii g。(6)乳化疫苗乳化用油佐剂为Montanide ISA 206 (法国SEPPIC公司产品)。疫苗配制比例为，灭活抗原佐剂=1:1 (V/V)0成品疫苗放置于2 8°C保存。三、成品疫苗的检验1.物理性状检验外观淡粉红色略带粘滞性乳状液。剂型用清洁吸管吸取少许滴于清洁冷水表面，成云雾状扩散，为水包油包水(W/0/W)剂型。粘度用ImL吸管(下口内径为1. 2mm，上口内径为2.7mm)吸取25°C左右的疫苗lmL，令其自然流出，记录流出0. 4ml疫苗所需时间为3秒，检验合格。稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，3000转/分钟离心15分钟，管底析出的水相为0. 03mL,符合规定。2.无菌检验按照《中国兽药典》附录42页进行，无细菌、霉菌生长；3.安全检验豚鼠和小白鼠检验每批疫苗用健康成年豚鼠2只，每只背部皮下注射疫苗
2.OmL,同时用18 22g健康小白鼠5只，每只背部皮下注射疫苗0. 5mL,观察7天。接种豚鼠和小白鼠无局部反应和全身不良反应，均健活，判定疫苗对试验动物安全。猪体试验每批疫苗均接种2头仔猪，每头耳根后两侧肌肉分点注射2头份(4mL)，连续观察14天，结果均未出现局部或全身不良反应，所有仔猪均健活，表明疫苗对仔猪安全。4 效カ检验用疫苗免疫40kg左右健康猪15头，分为3个剂量组，每组5头，分别为I头份(2mL), 1/3头份(0. 67mL), 1/9头份(0. 22mL)剂量组。免疫28天后，用检验用毒进行攻毒，每个攻毒组各设对照猪3头。每头猪耳根后肌肉注射1000ID5(l/2mL乳鼠组织毒，连续观察10天，对照组出现ロ蹄疫临床症状。按KSrber法计算被检疫苗的I3D5tl为8. 06PD50/头份。实施例5——Asia I ロ蹄疫嵌合病毒的构建及疫苗生产一、Asia I型ロ蹄疫嵌合病毒的构建 l.Asia I型ロ蹄疫嵌合病毒感染性克隆的构建通过PCR扩增(No. 14，No. 15)(上海英骏生物技术有限公司)获得AsiaI型江苏株(JSL)的Pl基因(包括VP2、VP3、VPl),同时在两端引入酶切位点Ssp I , SgrA I (序列19)，经克隆测序，筛选阳性菌落，细菌培养，质粒提取，以Ssp I /SgrA I双酶切连接至p43-CHA90-LL-Vector中，获得Asia I型ロ蹄疫嵌合病毒cDNA感染性克隆。2.嵌合病毒cDNA感染性克隆的体外转录将Asia I型ロ蹄疫嵌合病毒cDNA感染性克隆质粒线性化处理，通过体外转录试剂盒转录成RNA。
3.病毒拯救通过电转染或脂质体转染将Asia I型嵌合病毒RNA转染到BHK-21细胞中，成功拯救出相应病毒。转染后48 72小时可引起BHK-21细胞产生病变(CPE)，经过传代观察CPE，PCR扩增及产物测序，确定病毒(Asia1-JSL-LL)拯救成功。4.病毒传代将转染RNA培养48 72小时、BHK-21细胞出现95%CPE后收获病毒液，按照5 10%的接毒量接种生生长良好的BHK-21细胞。5.病毒检测通过PCR和双夹心ELISA方法检测均为Asia I型ロ蹄疫阳性。PCR产物测序为Asia I型ロ蹄疫嵌合病毒。ニ、Asia I型ロ蹄疫嵌合病毒灭活疫苗生产1.病毒繁殖取8 12代的生产种子批病毒液，接种5L发酵罐，通过逐级放大至 1000L，待悬浮BHK-21细胞病变达到95%以上时收获病毒，病毒液冻存于_20°C待检。2.制苗毒液的检验(I)无菌检验按照《中国兽药典》(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典ニ零一零年版三部中国农业出版社，2010，本发明称《中国兽药典》)附录42页进行，无细菌、霉囷生长；(2)支原体检验按照《中国兽药典》附录49页进行，无支原体生长；(3)病毒含量測定(測定TCID5tl):将病毒液10倍系列稀释至10_8，分别接种生长良好的96孔BHK-21细胞，每个稀释度重复4孔，每孔接种100 u L，放置37°C，5%C02培养箱中培养72小吋，观察细胞病变并计算TCID5tlt5 Asia I型ロ蹄疫嵌合病毒毒价达到IO6 tlTCID5ci/
mLo(4)病毒液灭活及阻断向病毒液中加入0. lmol/L BEI溶液,调节使其终浓度为0. 002mol/L。将病毒液的温度保持在30±1°C，连续灭活28小吋。灭活结束后，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的50%硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为2%，并加入硫柳汞溶液，使其终浓度为0. 01%，充分混匀，取样后迅速置4°C保存，同时抽样进行无菌检验。(5) 146s含量的测定取灭活抗原50ml在4°C,8000r/min条件下离心30min,以除去灭活抗原液中残留的细胞碎片；取上清液，加入等体积三氯こ烯，充分混匀后，4°C8000r/min离心30min。离心后，取出上清液，装入超速离心管中，4°C 40000r/min离心
3.5h。离心后，弃上清液，往每只离心管内加入0.5ml TNE缓冲液(pH 7. 6)，用超声波处理充分分散沉淀物。第2天取出浓缩的抗原并加入NP40。吸Iml抗原加至蔗糖梯度顶部，然后4°C 35000r/min离心2. 5h，离心结束后，使用蠕动泵从离心管底部开始抽吸液体，每约0. 5ml收集一管，经紫外分光光度測定OD259nm值，计算45%-35%间蔗糖梯度处最高峰值的146S抗原含量。经测定转瓶培养中ロ蹄疫嵌合病毒146S含量较低,所有病毒146S含量为0. 3 1-3 ii go而悬浮培养可以大大提高病毒中146S的含量,可达3. 0 7. Oii g。(6)乳化疫苗乳化用油佐剂为Montanide ISA 206 (法国SEPPIC公司产品)。疫苗配制比例为，灭活抗原佐剂=1:1 (V/V)0成品疫苗放置于2 8°C保存。三、成品疫苗的检验1.物理性状检验外观淡粉红色略带粘滞性乳状液。剂型用清洁吸管吸取少许滴于清洁冷水表面，成云雾状扩散，为水包油包水(W/0/W)剂型。
粘度用ImL吸管(下口内径为1. 2mm，上口内径为2.7mm)吸取25°C左右的疫苗lmL，令其自然流出，记录流出0. 4ml疫苗所需时间为3秒，检验合格。稳定性吸取疫苗IOml加入离心管中，3000r/min离心15min，管底析出的水相为0. 03mL,符合规定。2.无菌检验按照《中国兽药典》附录42页进行，无细菌、霉菌生长；3.安全检验豚鼠和小白鼠检验每批疫苗用健康成年豚鼠2只，每只背部皮下注射疫苗2. OmL,同时用18 22g健康小白鼠5只，每只背部皮下注射疫苗0. 5mL,观察7天。接种豚鼠和小白鼠无局部反应和全身不良反应，均健活，判定疫苗对试验动物安全。猪体试验每批疫苗均接种2头仔猪，每头耳根后两侧肌肉分点注射2头份(4mL),连续观察14天，结果均未出现局部或全身不良反应，所有仔猪均健活，表明疫苗对 仔猪安全。4.效カ检验用疫苗免疫40kg左右健康猪15头，分为3个剂量组，每组5头，分别为I头份(2mL), 1/3头份(0. 67mL), 1/9头份(0. 22mL)剂量组。免疫28天后，用检验用毒进行攻毒，每个攻毒组各设对照猪3头。每头猪耳根后肌肉注射1000ID5(l/2mL乳鼠组织毒，连续观察10天，对照组出现ロ蹄疫临床症状。按Kjjrber法计算被检疫苗的I3D5tl为15. 59PD50/头份。
权利要求
1.口蹄疫病毒重组载体的构建，其特征在于该载体的构建包括如下步骤 (1)口蹄疫病毒缺失L蛋白感染性克隆的构建是以口蹄疫病毒CHA90全长感染性克隆为基础，使用序列I和序列2所述一对引物及序列4和序列5所述一对引物通过重叠PCR扩增删除Lb基因，将PCR产物(序列7)克隆至pMDlS-T载体(Takara产品)，测序筛选阳性克隆，提质粒，以Xba I /Not I酶切连接到CHA90全长感染性克隆中构建而成，命名为P43-CHA90-LL ； (2)结构蛋白基因的删除及酶切位点的引入是以CHA90全长感染性克隆质粒为模板，使用序列8和序列9所述一对引物及序列10和序列11通过重叠PCR扩增，删除结构蛋白Pl大部分基因(VP2、VP3、VPl )，同时通过同义突变引入酶切位点Ssp1、SgrA I，将PCR产物克隆至PMD18-T载体(Takara产品)，测序筛选阳性克隆，提质粒，以Kpn I酶切连接至(I)项构建的P43-CHA90-LL中，构建获得的阳性克隆命名为p43-CHA90-LL-Vector，该重组载体p43-CHA90-LL_Vector已转入到大肠埃希氏菌中，该株带有p43-CHA90-LL_Vector的大肠埃希氏菌于2012年11月29日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为=CGMCCNo.6898。
2.如权利要求1中所述口蹄疫病毒重组载体的应用，其特征在于；(I)含口蹄疫病毒流行株病毒结构蛋白基因的感染性克隆构建；(2)含口蹄疫流行毒株结构蛋白的嵌合病毒拯救，及病毒繁殖；(3)疫苗制备。
3.如权利要求2中所述口蹄疫病毒重组载体的应用，其特征在于含口蹄疫病毒流行株病毒结构蛋白基因的感染性克隆构建，其构建是通过PCR扩增口蹄疫病毒不同流行株病毒的相应结构蛋白部分的DNA序列，插入到重组载体p43-CHA90-LL-Vector，通过病毒拯救，构建了分别含O型、Asia I型和A型不同流行毒株的口蹄疫嵌合病毒。
4.如权利要求2中所述口蹄疫病毒重组载体的应用，其特征在于口蹄疫嵌合病毒的拯救，是含O型、Asia I型和A型不同流行毒株的嵌合病毒感染性克隆质粒体外转录制备成RNA或直接将质粒DNA与T7聚合酶表达质粒，通过脂质体转染或电转染BHK-21细胞，成功拯救出病毒。
5.如权利要求4中所述口蹄疫病毒重组载体的应用，其特征在于将缺失L蛋白或结构蛋白或两者均缺失的口蹄疫病毒基础上构建获得的包含O型、Asia I型或A型不同毒株的嵌合病毒通过转瓶培养或悬浮培养大量繁殖病毒，用于口蹄疫疫苗生产，制备相应型毒株的灭活疫苗，其灭活疫苗的制备方法为将口蹄疫嵌合病毒接种生长良好的BHK-21细胞，待细胞病变达90%以上时收获病毒，经灭活、纯化、浓缩处理后，加入油佐剂(如MantanideISA206)乳化而成。
全文摘要
本发明涉及一种口蹄疫灭活疫苗安全种毒载体及应用，即在该载体基础上构建不同血清型的口蹄疫灭活疫苗安全生产种毒。本发明中构建的嵌合病毒既保留了经典疫苗毒株细胞适应性良好的优点，又能通过插入流行毒株的结构蛋白克服抗原匹配性不高的缺点，可快速拯救病毒进行口蹄疫灭活疫苗的生产；以本载体构建的A型或Asia Ⅰ型或O型不同毒株嵌合病毒为弱毒，均具有良好的生物安全性，因病毒中缺失了L蛋白，在自然条件下不发生毒力返强，并且病毒对乳鼠、猪或牛的致病力大大降低或者无致病性。安全性高，不会引起口蹄疫疫情的发生，非常具有实用价值。
文档编号A61K39/135GK103014043SQ201210508638
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者赵启祖, 邹兴启, 朱元源, 徐璐, 范学政, 王琴, 沈青春, 王芳, 宁宜宝 申请人:中国兽医药品监察所