产酪酸有益菌在制备防治重症疾病肠道屏障损伤及损伤后并发症制剂中的应用的制作方法

专利名称：产酪酸有益菌在制备防治重症疾病肠道屏障损伤及损伤后并发症制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种或一种以上产酪酸有益菌在制备预防和治疗重症疾病中肠道屏 障损伤及损伤后并发症制剂中的应用，具体是指产酪酸有益菌通过在肠道产生酪酸，将酪 酸引入肠道，而提供肠粘膜能量、促进肠粘膜细胞增殖和抑制肠粘膜细胞凋亡，改善肠粘膜 通透性，预防和治疗肠粘膜屏障损伤而发挥对肠屏障的防治作用，属于生物药领域。
背景技术：
大量研究表明重症疾病患者，包括严重创伤、休克、烧伤、手术、重症感染、危重患 者、入住重症监护室患者、应激打击患者、急性胰腺炎、重症急性胰腺炎、肝硬化、肝炎、肠 癌、肠癌术后、肿瘤患者、肿瘤放化疗、重症胆管炎、饥饿、长期全胃肠道外营养、多系统器官 功能衰竭、急性呼吸道窘迫综合征、肾衰、心衰、肝衰、颅脑外伤、呼吸衰竭、循环衰竭、糖尿 病等，在应激状态下最先且最易受累的部位是肠粘膜，肠表现为粘膜糜烂、出血、细胞凋亡 坏死和细胞增殖受到抑制，肠粘膜通透性增加，肠屏障功能遭到破坏。肠道中的致病微生物 和毒素透过损伤的肠屏障进一步导致各种并发症，比如内源性感染、炎症反应综合征、脓毒 症、多器官功能不全综合征、内毒血症、细菌移位、全身感染、多系统器官功能衰竭，从而影 响患者的康复。Venkatraman等研究表明丁酸(酪酸)能够逆转肠粘膜通透性的增加[Scand. J. Gastroenterol. 2000,35 1053-1059]。目前，谷氨酰胺已经作为重症疾病患者预防和治 疗肠粘膜屏障损伤及预防并发症的主要物质，但Chapman等1994年发现，在大肠的不同区 段中，其细胞都优先利用丁酸作为能量来源，其次为谷氨酰胺，再次为葡萄糖[Gut，1994， 35-76]，因此对于重症疾病患者应用丁酸预防和治疗肠粘膜屏障损伤及并发症的疗效要好 于谷氨酰胺。Clausen等利用小鼠结肠细胞，在体外测定14C标记的短链脂肪酸，发现肠粘膜 优先吸收利用丁酸[Gastroenterology，1994，106 (2) :423_432]。丁酸已经被证实是结肠 能量的首选来源，提供肠粘膜70 %的能量，促进肠粘膜细胞增殖生长，改善肠粘膜通透性， 修复受损的肠粘膜，因此，对于重症疾病患者给肠道补充丁酸，能够有效预防和治疗肠粘膜 屏障损伤，并进一步预防内源性感染、炎症反应综合征、脓毒症、多器官功能不全综合征、内 毒血症、细菌移位、全身感染、多系统器官功能衰竭等并发症。但如果丁酸以其自由盐的形 式给予会产生难闻的气味，同时口服给予会在胃和小肠被吸收，不能有效达到大肠发挥作 用。制成缓释或肠溶制剂，制剂又相对较贵，且随着肠道蠕动会很快被排出体外，剂量也不 好控制。制成灌肠剂，应用不方便，又不能有效达到近端肠道。因此，以上各种问题制约了 丁酸制剂在重症疾病患者中的应用。因此，是否能找到一种载体把丁酸带到肠道并持续释放，且剂量容易控制，价钱便 宜，是临床药理专家、临床医生共同关心的问题。

发明内容
本发明的目的是提供一种由产酪酸的有益菌制成的制剂，能在重症患者的肠道内 分泌大量丁酸，预防和治疗肠粘膜损伤及肠粘膜损伤后并发症，克服了直接应用丁酸上述 存在的各种问题。根据背景技术所述重症疾病患者由于肠粘膜屏障损伤，肠腔中的致病微 生物及内毒素和肠毒素可穿越肠粘膜，导致内源性感染、炎症反应综合征、脓毒症、多器官 功能不全综合征、内毒血症、细菌移位、全身感染、多系统器官功能衰竭等并发症，而丁酸能 够提供肠粘膜能量和抑制肠粘膜细胞凋亡，改善肠粘膜通透性，保护肠粘膜和修复受损的 肠粘膜。其中重症疾病指严重创伤、休克、烧伤、手术、重症感染、危重患者、入住重症监护室 患者、应激打击患者、急性胰腺炎、重症急性胰腺炎、肝硬化、肝炎、肠癌、肠癌术后、肿瘤和 肿瘤放化疗、重症胆管炎、饥饿、长期全胃肠道外营养、多系统器官功能衰竭、急性呼吸道窘 迫综合征、肾衰、心衰、肝衰、颅脑外伤、呼吸衰竭、循环衰竭、糖尿病等。根据《伯杰细菌鉴 定手册》(第八版)或相关细菌鉴定资料梭菌属和真杆菌属的主要特征之一就是在代谢过 程中能产生大量的丁酸，因此，本发明的主要技术方案就是通过分离鉴定获得没有毒性的 梭菌和真杆菌制成制剂，通过口服或灌胃等方式补充到重症患者肠道代谢产生丁酸，提供 肠粘膜能量，促进肠粘膜细胞增殖，改善肠粘膜通透性，修复受损的肠粘膜，预防和治疗肠 粘膜损伤及肠粘膜损伤后并发症。由于本发明首次提出通过产酪酸的有益菌在上述中的应 用，因此本发明并不局限于梭菌和真杆菌，所有产酪酸的有益菌在重症疾病中预防和治疗 肠粘膜损伤及肠粘膜损伤后并发症中的应用均在本发明的保护范围之内，包括在动物中的 应用。本发明所述真杆菌和梭菌的技术方案只是对本发明的实施说明，并不是对本发明的 限制。本发明的制剂的制备优选是通过下述步骤实施的，但不局限于此制备工艺，公知 的能实现的制备工艺均可以采取含真杆菌或梭菌的样本，优选人或动物粪便，更优选健 康婴儿粪便，然后将样品置于灭菌厌氧瓶内，吹入氮气同时充分混合，迅速从中取2克样品 加入18mL灭菌的稀释液中，吹入氮气同时充分混勻，在无菌操作台内，进行10入10_2、10_3、 10_4，10_5，10_6，10_7梯度稀释，取10_5，10_6，10_7三个稀释梯度，分别涂布于真杆菌或梭菌选 择性单菌落分离固体培养基上，置于厌氧罐内，厌氧37°C下培养48小时，选择长势良好的 单菌落分别接种于液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37°C下扩增培养48小时。将 所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出各菌种的干燥菌 粉，然后根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)或相关细菌鉴定资料进行菌种鉴定、产丁酸实 验和毒性试验，将能产生丁酸和无毒性的真杆菌或梭菌干燥菌粉单独或组合按需要比例添 加辅料制成片剂、胶囊、散剂、灌肠剂和液体制剂等各种剂型，或制成药品、保健食品、饮品、 肠内营养制剂、食品、兽药和饲料添加剂。真杆菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于纯化水100mL，胰蛋白胨 lg，酵母浸膏0. 5g，磷酸氢二钠0. 4g，葡萄糖0. 15g，可溶性淀粉0. 05g, L-半胱氨酸0. 02g, L-半胱氨酸盐酸盐0. 05g,琼脂1. 5g，调pH值7. 7，115°C，20分钟高压灭菌。灭菌后在冷却 到60°C后加入5mL脱纤维马血，ES溶液4mL。其中ES溶液丙酸钠30%，硫酸链霉素4%， 硫酸巴龙霉素2%，硫酸多粘菌素B0. 02%。真杆菌液体扩增培养基优选但不局限于绞碎的牛肉500g，蒸馏水1L，INNaOH 25. OmL，用精牛肉或马肉，绞碎去除脂肪和连接组织，混合肉、水和氢氧化钠煮沸，同时搅
4拌，冷却至室温，略去表面的脂肪并过滤，保留滤液，补充足够的蒸馏水滤液恢复1升原 体积。向每100mL滤液中添加蛋白胨2. Og、葡萄糖0. 5g、酵母浸膏1. 0g、盐酸半胱氨酸 0. 05g、盐溶液4. OmL,维生素溶液0. lmL、5mg/mL氯化血红素溶液0. 5mL,调pH至7. 2 士 0. 1，在厌氧管内通入97%的氮，3%的氢，盖紧丁基橡胶瓶塞帽，121°C高压灭菌15min。其 中1、盐溶液的配制称取无水氯化钙0. 2g，硫酸镁0. 2g，磷酸氢二钾lg，磷酸二氢钾lg， 碳酸氢钠10g，氯化钠2g，加蒸馏水至1000mL ；2、氯化血红素溶液(5mg/mL)的配制称取氯 化血红素0. 5g溶于lmol/L氢氧化钠lmL中，加蒸馏水至100mL，121°C高压灭菌15min，冰 箱保存；3、维生素&溶液的配制称取维生素& lg加无水乙醇99mL，过滤除菌，放冷暗处 保存。梭菌选择性单菌落分离固体培养基优选但不局限于纯化水1L，蛋白胨40.0g， Na2HP04 5. 0g, K2HP04 1. Og, NaCl 2. Og, MgS04 0. lg，葡萄糖 2. 0g，琼脂 25. 0g，调 pH 7. 6， 116°C灭菌20分钟，待其冷至50°C左右，加入卵黄液50. OmL，加入终浓度为200 u g/mL的硫 酸多粘菌素B，加入终浓度200 u g/mL的新霉素，充分混勻后，分注于平皿中。梭菌液体扩增培养基优选但不局限于纯化水1L，胰蛋白胨10.0g，牛肉浸膏 10. 0g,酵母浸膏3. 0g,葡萄糖5. 0g, NaCl 5. 0g,可溶性淀粉1. 0g,半胱氨酸盐酸盐0. 5g，醋 酸钠 3. 0g,琼脂 0. 5g，调 pH 6. 6-7. 0，121°C，灭菌 15 分钟。为进一步具体说明本发明，发明人利用上述方法通过真杆菌选择性单菌落分离固 体培养基和梭菌选择性单菌落分离固体培养基分离鉴定出了无毒性的真杆菌中的直肠真 杆菌、柱状真杆菌、凸腹真杆菌和两形真杆菌，无毒性的梭菌中的第三梭菌和丁酸梭菌(酪 酸梭菌)，直肠真杆菌、柱状真杆菌、凸腹真杆菌、两形真杆菌、第三梭菌和丁酸梭菌(酪酸 梭菌)只是作为本发明实施说明的优选菌种，本发明所述真杆菌和梭菌并不局限于上述七 种菌，只要能产生丁酸和无毒性的真杆菌菌种或梭菌菌种均是本发明所述，均在本发明的 保护范围内。本发明所述直肠真杆菌优选但不限于直肠真杆菌QQ-66保藏编号CGMCC2124 ；柱 状真杆菌优选但不限于柱状真杆菌QC-01保藏编号CGMCC2302 ；凸腹真杆菌优选但不限于 凸腹真杆菌QD-01保藏编号CGMCC2465 ；两形真杆菌优选但不限于两形真杆菌QE-01保 藏编号CGMCC2466 ；酪酸梭菌优选但不限于酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC0313. 1和 丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC2303 ；第三梭菌优选但不限于第三梭菌QH-07保藏编号 CGMCC2304。本发明实施说明中优选使用的直肠真杆菌的细菌学性质1、菌种分离来源优选人体肠道，直肠真杆菌QQ-66分离自山东省胶南市健康婴儿 粪便中。2、菌落形态显微镜观察长3微米，宽0. 8微米，短细杆菌，革兰氏染色阳性。平板形态菌体呈圆形、凸起、周边整齐、光滑；颜色灰白，半透明。3、生理生化鉴定石蕊牛奶_ ；脂酶_ ；明胶液化+ ；过氧化氢酶_ ；精氨酸产氨_ ；七叶苷水 解-；卩引哚-;硫化氢-;乙酰甲基甲醇试验(V-P试验)_;是否需氧厌氧性。4、糖酵解实验鉴定
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纤维二糖+ ；D-果糖+ ；D-半乳糖+ ；葡萄糖+ ；D-甘露糖+ ；D-棉子糖+ ；鼠 李糖_ ；山梨糖+ ；松三糖+ ；蔗糖+ ；海藻糖_ ；木糖+ ；麦芽糖+ ；淀粉+ ；菊糖+ ； 蜜二糖+ ；核糖_ ；甘露醇_ ；甘油_ ；七叶灵_ ；阿拉伯糖+ ；果糖+。本发明实施说明中优选使用的柱状真杆菌的细菌学性质1、菌种分离来源优选人体肠道，柱状真杆菌QC-01分离自山东省胶南市一健康婴 儿粪便中。2、菌落形态显微镜观察长2-5微米，宽1微米，中长杆，革兰氏染色阳性。平板形态菌体呈类圆形、凸起、周边整齐、光滑；颜色灰白，不透明。3、生理生化鉴定石蕊牛奶_ ；脂酶_ ；明胶液化+ ；过氧化氢酶_ ；精氨酸产氨_ ；七叶苷水解 + (-)；吲哚“；硫化氢“；V-P试验-；是否需氧厌氧性。4、糖酵解实验鉴定纤维二糖+ ；D-果糖+ ；D-半乳糖+ ；葡萄糖+ ；D-甘露糖+ ；D-棉子糖_ ；鼠 李糖_ ；山梨糖_ ；松三糖_ ；蔗糖_ ；海藻糖_ ；木糖_ ；葡萄糖酸盐_ ；麦芽糖_ ；淀 粉_ ；蜜二糖_ ；核糖_ ；甘露醇_ ；甘油_。本发明优选使用的凸腹真杆菌的细菌学性质1、菌种分离来源优选人体肠道，凸腹真杆菌QD-01分离自山东省胶南市_健康婴 儿粪便中。2、菌落形态显微镜观察长1. 5-2微米，宽0. 5微米，短杆，革兰氏染色阳性。平板形态菌体呈圆形、凸起、周边整齐、光滑；颜色灰色，不透明。3、生理生化鉴定石蕊牛奶_ ；脂酶_ ；明胶液化_ ；过氧化氢酶_ ；精氨酸产氨_ ；七叶苷水解 + ;吲哚_ ；硫化氢_;乙酰甲基甲醇试验(V-P试验)_;是否需氧厌氧性。4、糖酵解实验鉴定纤维二糖_ ；D-果糖+ ；D-半乳糖+ ；葡萄糖+ ；D-甘露糖+ ；D-棉子糖-；鼠 李糖_ ；山梨糖_ ；松三糖_ ；蔗糖_ ；海藻糖_ ；木糖+ ；麦芽糖+ ；淀粉+ ；蜜二糖+ ； 核糖+ ；甘油“；七叶灵+ ；阿拉伯糖“；果糖+。本发明优选使用的两形真杆菌的细菌学性质1、菌种分离来源优选人体肠道，两形真杆菌QE-01分离自山东省胶南市_健康婴 儿粪便中。2、菌落形态显微镜观察长2. 0-5微米，宽1. 0微米，中长杆，革兰氏染色阳性。平板形态菌体呈圆形、凸起、周边整齐、光滑；颜色灰色，不透明。3、生理生化鉴定石蕊牛奶_ ；脂酶_ ；明胶液化_ ；过氧化氢酶_ ；精氨酸产氨_ ；七叶苷水解 + ；喷哚_ ；硫化氢_ ；V-P试验_ ；是否需氧厌氧性。4、糖酵解实验鉴定
纤维二糖_ ；D-果糖+ ；D-半乳糖+ ；葡萄糖+ ；D-甘露糖+ ；D-棉子糖-；鼠 李糖_ ；山梨糖_ ；松三糖_ ；蔗糖_ ；海藻糖+ ；木糖_ ；麦芽糖_ ；淀粉_ ；蜜二糖_ ； 核糖“；七叶灵I ；甘油“；阿拉伯糖_。本发明实施说明中优选使用的第三梭菌的细菌学性质1、菌种分离来源优选人体肠道，第三梭菌QH-07分离自山东省胶南市一健康婴儿
粪便中。2、菌落形态显微镜观察长3-4微米，宽0. 6-1. 0微米，直杆菌，革兰氏染色阳性，产芽孢，孢子端生。平板形态菌落圆形，边缘稍不规则，不透明，颜色灰白，表面无光泽。3、生理生化鉴定硫化氢_ ；吲哚_ ；明胶液化_ ；氨_ ；硝酸盐还原_ ；卵磷脂酶反应_ ；脲 酶_ ；V-P试验_ ；接触酶_ ；是否需氧厌氧性。4、糖酵解实验鉴定阿拉伯糖+ ；鼠李糖+ ；纤维二糖+ ；D-山梨醇+ ；D-果糖+ ；可溶性淀粉+ ； D-半乳糖+ ；蔗糖+ ；葡萄糖+ ；海藻糖+ ；菊糖+ ；木糖+ ；乳糖+ ；葡萄糖酸盐(钠) + ；DM甘露糖+ ；麦芽糖+ ；D-甘露醇+ ；甘油W㈠；DM棉籽糖+ ；核糖+ ；松三糖 + ；蜜二糖+。本发明实施说明中优选使用的丁酸梭菌(酪酸梭菌)包括酪酸梭菌DF96101和丁 酸梭菌QA-08的细菌学性质1、菌种分离来源优选人体肠道2、菌落形态显微镜观察长3. 0-6. 0微米，宽0. 6-1. 2微米，直杆或梭状菌，革兰氏染色阳性， 产芽孢，孢子次端生。平板形态菌落圆形，边缘不整齐，稍凸，不透明，颜色淡黄，表面无光泽。3、生理生化鉴定硫化氢_ ；吲哚_ ；明胶液化_ ；氨_ ；硝酸盐还原_ ；卵磷脂酶反应_ ；脲 酶_ ；V-P试验_ ；接触酶_ ；是否需氧厌氧性。4、糖酵解实验鉴定阿拉伯糖+ ；鼠李糖+ ；纤维二糖+ ；D-山梨醇_ ；D-果糖+ ；可溶性淀粉+ ； D-半乳糖+ ；蔗糖+ ；葡萄糖+ ；海藻糖+ ；菊糖+ ；木糖+ ；乳糖+ ；葡萄糖酸盐(钠) + ;D(+)甘露糖+；麦芽糖+ ；D-甘露醇+；甘油+ ；DM棉籽糖+；核糖+；松三糖+；
蜜二糖+。本发明所述的真杆菌和梭菌及其他产酪酸有益菌指活生物个体。本发明是以有效剂量的上述真杆菌或梭菌及其他产酪酸有益菌单独或组合作为 主要药物活性成份，按照一定的制剂工艺，加入常规的赋形剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润 滑剂、湿润剂、黏合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等药物辅料，制成任何一种适合于临床上使用 的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液体制剂、灌肠剂等剂型。本发明所述以有效剂量的上述真杆菌或梭菌及其他产酪酸有益菌单独或组合作为主要药物活性成份制成活菌制剂，也可以是上述产酪酸有益菌单独或组合与双歧杆菌、 凝结芽孢杆菌、乳杆菌、链球菌、枯草芽孢杆菌等益生菌中的一种或几种或其他活性成份组 合制成活菌制剂，以起到协同治疗作用，提高治疗效果。本发明所述产酪酸有益菌既可以是 肠道常住菌也可以是肠道过路菌。本发明中的制剂在临床上的用量，因患者年龄、体重及症状、用药目的所决定的用 药方式和方法、治疗效果及用药时间等因素而不同，正确的用量应该由医师来决定，且应用 剂量也是临床医生和临床药师根据病情很容易掌握和调整的。本发明所指有效剂量是指以上述真杆菌或梭菌及其他产酪酸有益菌根据上面 所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的固体活菌制剂包含的总活菌数不能低于 1 X 106CFU/g，一般在 1 X 107CFU/g 以上，最高可达到 1 X 1012CFU/g 或 1 X 1012CFU/g 以上。本发明所指有效剂量是指以上述真杆菌或梭菌及其他产酪酸有益菌根据上面 所述单独或组合作为主要药物活性成份制成的液体活菌制剂包含的总活菌数不能低于 1 X 106CFU/mL, 一般在 1 X 107CFU/mL 以上，最高可达到 1 X 1012CFU/mL 或 1 X 1012CFU/mL 以 上。由于本发明首次公开了真杆菌和梭菌及其他产酪酸有益菌在作为主要活性成份 制成制剂在预防和治疗肠粘膜损伤及损伤后并发症中的应用，因此含上述真杆菌或梭菌及 其他产酪酸有益菌的药剂在预防和治疗肠粘膜损伤及损伤后并发症中的应用均属于本发 明的保护范围。由于本发明首次公开了直肠真杆菌、柱状真杆菌、凸腹真杆菌、两形真杆菌、第三 梭菌和丁酸梭菌(酪酸梭菌)在作为主要活性成份制成制剂中的应用，因此含上述直肠真 杆菌、柱状真杆菌、凸腹真杆菌、两形真杆菌、第三梭菌和丁酸梭菌(酪酸梭菌)的药剂在预 防和治疗肠粘膜损伤及损伤后并发症中的应用均属于本发明的保护范围。本发明所述的真杆菌或梭菌中的任何一个菌种，包括直肠真杆菌、柱状真杆菌、凸 腹真杆菌、两形真杆菌、第三梭菌和丁酸梭菌(酪酸梭菌)，在制成任何一种剂型时，均具有 治疗上述疾病的作用。任何药剂，如果其组份中含有上述真杆菌或梭菌中的任何一个菌种 成份制备成药，在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有 治疗上述疾病的作用，则落入本发明的保护范围之内。本发明所述的真杆菌或梭菌及其他产酪酸有益菌中的任何一个菌种，包括直肠真 杆菌、柱状真杆菌、凸腹真杆菌、两形真杆菌、第三梭菌和丁酸梭菌(酪酸梭菌)可以制成保 健食品、饮品、肠内营养制剂或食品。将上述真杆菌或梭菌及其他产酪酸有益菌中的任何一 个菌种制成的保健食品、饮品、肠内营养制剂或食品，如果在其包装或说明书等标识上或者 在其他任何宣传品上只要注明或提示具有治疗上述疾病的作用，则落入本发明的保护范围 之内。本发明所述的真杆菌或梭菌及其他产酪酸有益菌中的任何一个菌种，包括直肠真 杆菌、柱状真杆菌、凸腹真杆菌、两形真杆菌、第三梭菌和丁酸梭菌(酪酸梭菌)可以制成兽 药或饲料添加剂。将上述真杆菌或梭菌及其他产酪酸有益菌中的任何一个菌种制成的兽药 或饲料添加剂在预防和治疗肠粘膜损伤及损伤后并发症中的应用，则落入本发明的保护范 围之内。
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具体实施例方式药物制备例说明上述已经对真杆菌或梭菌的制备进行说明，这里通过直肠真杆菌散 剂、柱状真杆菌散剂、凸腹真杆菌散剂、两形真杆菌散剂、第三梭菌散剂和丁酸梭菌(酪酸梭菌) 散剂为例进行具体说明，其他真杆菌或梭菌及其他产酪酸有益菌菌种制剂的制备方法本领域技 术人员通过本实施例很容易掌握，其他剂型的制备方法本领域技术人员通过本实施很容易掌握， 在此不再一一叙述说明。制备方法并不局限于本发明实施例所述，公知的能够达到制备目的的方 法均可以，实施例的制备说明只是对本发明的说明，并不是对本发明保护范围的限制。药物制备实施例1 口服真杆菌活菌散剂的制备1菌粉的制备和菌种的鉴定采取健康婴儿粪便，然后将粪便置于灭菌厌氧瓶内，吹入氮气同时充分混合，迅速 从中取2克粪便加入18mL灭菌的稀释液中，吹入氮气同时充分混勻，在无菌操作台内，进行 lo-iuo^ioAio—4，10_5，10_6，10_7梯度稀释，取10_5，10_6，10_7三个稀释梯度，涂布于真杆菌 选择性单菌落分离固体培养基上，置于厌氧罐内，厌氧37°C下培养48小时，选择长势良好 的四个单菌落分别接种到真杆菌液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37°C下扩增培养 48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出四个 菌种的干燥菌粉，活菌数均为lX1012CFU/g以上，然后进行菌种鉴定，经鉴定为直肠真杆菌 QQ-66保藏编号CGMCC2124、柱状真杆菌QC-01保藏编号CGMCC2302、凸腹真杆菌QD-01保藏 编号CGMCC2465和两形真杆菌QE-01保藏编号CGMCC2466。2产丁酸实验将上述直肠真杆菌、柱状真杆菌、凸腹真杆菌和两形真杆菌菌种分别接种到真杆 菌液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37°C下扩增培养96小时，离心(12000rpm)，取上 清液用气相检测代谢产物丁酸含量分别为37mmol/L、37. 5mmol/L,38mmol/L和37mmol/L， 表明均产丁酸。并留取发酵上清液备用。3生理生化鉴定经鉴定均不产生硫化氢、吲哚、氨等有害物质。4毒性试验4. 1动物及分组取50只SPF级别小鼠，6 8周龄，体重15 19g，随机分入直肠 真杆菌组、柱状真杆菌组、凸腹真杆菌、两形真杆菌和未给药组，每组10只。4. 2制备菌液将直肠真杆菌菌粉、柱状真杆菌菌粉、凸腹真杆菌菌粉和两形真杆 菌菌粉用纯化水调制为含菌数均为lX1012CFU/mL的菌液。4. 3方法直肠真杆菌组、柱状真杆菌组、凸腹真杆菌、两形真杆菌和未给药组均 给予相同的基础饲料，且饲养条件均一致，直肠真杆菌组每天灌服直肠真杆菌菌液0. 5mL, 柱状真杆菌组每天灌服柱状真杆菌菌液0. 5mL,凸腹真杆菌组每天灌服凸腹真杆菌菌液 0. 5mL，两形真杆菌组每天灌服两形真杆菌菌液0. 5mL，未给药组每天灌服纯化水0. 5mL，饲 喂6个月，观察体重及毒性反应。4. 4 结果各组小鼠均未出现异常情况，未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常，无眼球突 出，排尿正常，皮肤、呼吸正常，无死亡情况，且直肠真杆菌组、柱状真杆菌组、凸腹真杆菌、 两形真杆菌的体重增加显著高于未给药组(P < 0. 05)，表明直肠真杆菌、柱状真杆菌、凸 腹真杆菌和两形真杆菌等肠道产丁酸真杆菌菌种有促进生长发育作用，说明四菌株效果良好，未见中毒反应，结果见表1和表2。表1小鼠体重增加情况 5制备成散剂等剂型根据上述步骤和方法分离鉴定直肠真杆菌、柱状真杆菌、凸腹真杆菌、两形真杆菌 等真杆菌菌种后，经实验检验产丁酸、不产毒素、无毒性，就可将真杆菌菌种制成菌粉，然后 按照需要添加相关辅料制成各种剂型，优选据真杆菌菌粉的活菌数，按比例添加脱脂奶粉、 葡萄糖制成散剂，使活菌数不低于1 X 106CFU/g,然后装袋。药物制备实施例2口服第三梭菌活菌散剂和口服丁酸梭菌(酪酸梭菌)活菌散剂的制备1菌粉的制 备和菌种的鉴定采取健康婴儿粪便，然后将粪便置于灭菌厌氧瓶内，吹入氮气同时充分混合，迅速 从中取2克粪便加入18mL灭菌的稀释液中，吹入氮气同时充分混勻，在无菌操作台内，进行 10—1、10_2、10_3、10_4，10_5，10_6，10_7 梯度稀释，取 10_5，10_6，10_7 三个稀释梯度，80°C水浴 13 分 钟，涂布于梭菌选择性单菌落分离固体培养基上，置于厌氧罐内，厌氧37°C下培养48小时， 选择长势良好的三个单菌落分别接种到梭菌液体扩增培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37°C 下扩增培养48小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥，调制出三个菌种的干燥菌粉，活菌数均为lX1012CFU/g以上，然后进行菌种鉴定，经鉴定为 酪酸梭菌DF96101保藏编号CGMCC0313. 1、丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC2303和第三梭菌 QH-07 保藏编号 CGMCC2304。2产丁酸实验将上述酪酸梭菌、丁酸梭菌和第三梭菌菌种分别接种到梭菌液体扩增培养基中， 置于厌氧罐内，厌氧37°C下扩增培养96小时，离心(12000rpm)，取上清液用气相检测代谢 产物丁酸含量分别为39mmol/L、39. 5mmol/L和40mmol/L，表明均产丁酸。并留取发酵上清 液备用。3生理生化鉴定经鉴定均不产生硫化氢、吲哚、氨等有害物质。4毒性试验4. 1动物及分组取40只SPF级别小鼠，6 8周龄，体重15 19g，随机分入酪酸 梭菌组、丁酸梭菌组和第三梭菌组和未给药组，每组10只。4. 2制备菌液将酪酸梭菌菌粉、丁酸梭菌菌粉和第三梭菌菌粉用纯化水调制为含 菌数均为1 X 1012CFU/mL的菌液。4. 3方法酪酸梭菌组、丁酸梭菌组、第三梭菌组和未给药组均给予相同的基础饲 料，且饲养条件均一致，酪酸梭菌组每天灌服酪酸梭菌菌液0. 5mL，丁酸梭菌组每天灌服丁 酸梭菌菌液0. 5mL,第三梭菌组每天灌服第三梭菌菌液0. 5mL，未给药组每天灌服纯化水 0. 5mL,饲喂6个月，观察体重及毒性反应。4. 4 结果各组小鼠均未出现异常情况，未发生振颤、痉挛、运动失调、姿态异常，无眼球突 出，排尿正常，皮肤、呼吸正常，无死亡情况，且酪酸梭菌组、丁酸梭菌组和第三梭菌组的体 重增加显著高于未给药组(P < 0. 05)，表明酪酸梭菌、丁酸梭菌和第三梭菌菌种有促进生 长发育作用，说明三菌株效果良好，未见中毒反应，结果见表3和表4。表3小鼠体重增加情况 表4小鼠体重增加情况
18. 12±0. 63 39. 65±1.56 45. 78 ±2. 42 47. 18±3.96 49. 52±4. 47 51. 96±5. 51 53. 79±4. 75
18. 96 土 0. 47 39. 42±1.51 45. 89±2.03 47. 21 ±4. 07 49. 25±4. 18 51.87±4. 75 53. 69±5. 27
服用1个月 服用2个月 服用3个月 服用4个月 服用5个月 服用6个月5制备成散剂等剂型根据上述步骤和方法分离鉴定酪酸梭菌、丁酸梭菌和第三梭菌等梭菌菌种后，经 实验检验产丁酸、不产毒素、无毒性，就可将梭菌菌种制成菌粉，然后按照需要添加相关辅 料制成各种剂型，优选据梭菌菌粉的活菌数，按比例添加脱脂奶粉、葡萄糖制成散剂，使活 菌数不低于lX106CFU/g，然后装袋。药物制备实施例3双歧杆菌和乳酸杆菌菌粉和发酵上清液的制备为进一步说明本发明的新颖性和创造性，在应用效果实施例中用双歧杆菌和乳酸 杆菌做对照研究。其中选用的双歧杆菌为婴儿双歧杆菌DF96102保藏编号CGMCC0313. 2，乳 酸杆菌为嗜酸乳杆菌DF96106保藏编号CGMCC0313. 4。1双歧杆菌菌粉和发酵上清液的制备培养基为(培养基不限于本发明所述的，公知的培养基均可以)蛋白胨15.0g， 酵母粉2. 0g,葡萄糖20. 0g,可溶性淀粉0. 5g，氯化钠5. 0g, 5 %半胱氨酸10. OmL,西红柿 浸出液400. OmL,吐温80 1. OmL,肝提取液80. OmL,琼脂20. 0g,蒸馏水520. OmL,调PH7. 0， 115°C 20min灭菌。将婴儿双歧杆菌DF96102接种到上述培养基中，置于厌氧罐内，厌氧37°C 下扩增培养96小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷冻真空干燥， 调制出干燥菌粉，活菌数为lX1012CFU/g以上。并将离心后的发酵上清液留取备用。上清 液经气相色谱分析不含丁酸，含乙酸和乳酸分别为25mmol/L和14mmol/L。2乳酸杆菌菌粉和发酵上清液的制备培养基为(培养基不限于本发明所述的，公知的培养基均可以)大豆蛋白胨(国 产)5g，胰胨(Tryptone) 5g，酵母提取物5g，肉膏10g, K2HP04 10g,柠檬酸二铵2g，乙酸钠 5g,葡萄糖 20g，吐温 80 1. OmL, MgS04 7H20 4. 8g，MnS04. 4H200. 05g,蒸馏水 1000M1，调 PH6. 2-6.4，121°C灭菌15分钟。将嗜酸乳杆菌DF96106接种到上述培养基中，置于厌氧罐 内，厌氧37°C下扩增培养96小时。将所得培养液离心(12000rpm)分离出菌体后，将菌体冷 冻真空干燥，调制出干燥菌粉，活菌数为lX1012CFU/g以上。并将离心后的发酵上清液留取 备用。上清液经气相色谱分析不含丁酸和乙酸，含乳酸为38. 5mmol/L。应用效果实施例说明虽然真杆菌或梭菌及其他产酪酸有益菌有许多菌种， 但按上述方法分离的不同菌种具有相同的生物学特性，且主要作用机理基本相同，代 谢过程中均能分泌大量丁酸，因此本发明选用按上述方法分离的直肠真杆菌QQ-66保
12藏编号CGMCC2124、柱状真杆菌QC-01保藏编号CGMCC2302、凸腹真杆菌QD-01保藏编 号CGMCC2465、两形真杆菌QE-01保藏编号CGMCC2466、酪酸梭菌DF96101保藏编号 CGMCC0313. 1、丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC2303和第三梭菌QH-07保藏编号CGMCC2304 为研究对象，介绍真杆菌和梭菌及其他产酪酸有益菌的应用效果。本技术领域人员按照本 发明所述很容易得出按照上述步骤和方法分离的其他真杆菌或梭菌及其他产酪酸有益菌 菌种单独或组合具有相同的应用效果，因此本发明只选择通过直肠真杆菌、柱状真杆菌、凸 腹真杆菌、两形真杆菌、第三梭菌和丁酸梭菌(酪酸梭菌)来揭示和证实真杆菌或梭菌及其 他产酪酸有益菌的应用效果为代表，其他菌种的应用效果不再一一叙述说明。应用效果实施例真杆菌和梭菌对肠粘膜屏障保护作用的研究1材料与方法1.1 材料1. 1. 1 药物1.1. 1.1菌液的制备将上述各菌种菌粉分别用蒸馏水溶解成107CFU/mL菌液(随用随溶解)。1.1. 1.2发酵上清液将上述直肠真杆菌、柱状真杆菌、凸腹真杆菌、两形真杆菌、第三梭菌和丁酸梭菌 (酪酸梭菌)的发酵上清液分别调节成含丁酸为35mmol/L和用氢氧化钠调节PH值为7. 00 的发酵上清液。将上述双歧杆菌的发酵上清液调节成含乙酸和乳酸的总浓度为35mmol/L 和用氢氧化钠调节PH值为7. 00的发酵上清液。将上述乳酸杆菌发酵上清液调节成含乳酸 为35mmol/L和用氢氧化钠调节PH值为7. 00的发酵上清液。35mmol/L的丁酸纳溶液、乳酸 纳溶液和乙酸纳溶液作对照。1. 2方法[参考文献彭曦，等.肠道营养支持对烧伤大鼠肠粘膜屏障功能的保护 作用及其机理.基础医学与临床，2001，21 (4) 352-356]1.2. 1模型制作与分组健康成年雄性Wistar大鼠240只，体重200g左右，随机分成24组正常对照组、 模型对照I组、模型对照II组、直肠真杆菌组、直肠真杆菌发酵上清液组、柱状真杆菌组、柱 状真杆菌发酵上清液组、凸腹真杆菌组、凸腹真杆菌发酵上清液组、两形真杆菌组、两形真 杆菌发酵上清液组、酪酸梭菌组、酪酸梭菌发酵上清液组、丁酸梭菌组、丁酸梭菌发酵上清 液组、第三梭菌组、第三梭菌发酵上清液组、丁酸钠组、乙酸钠组、乳酸钠组、双歧杆菌组、双 歧杆菌发酵上清液组、乳酸杆菌组和乳酸杆菌发酵上清液组。正常对照组不予烧伤，其他各 组烧伤前禁食12小时，戊巴比妥钠(40mg/Kg)腹腔麻醉，背部电推剃毛，称重后置剃毛 区于92°C水浴中18秒，造成30%体表面积III度烧伤(病理切片证实)。伤后按50mL/Kg腹 腔注入乳酸林格氏液抗休克。1.2. 2各组处理正常对照组、模型对照I组处死，观察测定肠粘膜通透性、肠粘膜上皮细胞增殖指 数和肠粘膜细胞凋亡数。各活菌组造模后灌服上述菌液10ml/kg 体质量/次，1次/天， 连续7天，7天后断头处死，观察测定肠粘膜通透性、肠粘膜上皮细胞增殖指数和肠粘膜细 胞凋亡指数，并于灌服前和灌服7天后用气相色谱测定新鲜粪便中丁酸的含量。各发酵上 清液组、丁酸钠组、乙酸钠组、乳酸钠组造模后，灌肠，lmL/次，每天1次，连续7天，7天后断
13头处死，观察测定肠粘膜通透性、肠粘膜上皮细胞增殖指数和肠粘膜细胞凋亡指数。模型对 照II组造模后生理盐水灌肠，lmL/次，1次/天，连续7天，7天后断头处死，观察测定肠粘膜 通透性、肠粘膜上皮细胞增殖指数和肠粘膜细胞凋亡指数，并于灌服前和灌服7天后用气 相色谱测定新鲜粪便中丁酸的含量。1. 2. 3肠粘膜通透性测定经股静脉注入[99mTc]DTPA-HAS，剂量为1480kBq/Kg，30min后断头处死大鼠，测定 肠腔灌洗液的cpm值，以对照大鼠肠粘膜通量为1，用各处理组与之的比值来反映肠粘膜通 透性的改变。1. 2. 4流式细胞术测定肠粘膜上皮细胞增殖指数分离肠粘膜细胞，调节细胞数为1X105，75%乙醇固定，弃固定剂，PBS洗2次，加 5g/L的RNA酶0. 5mL,混勻，37°C水浴30min,加50mg/L的PI染色液0. 5mL,摇勻，避光冷藏 30min,上机检测，每份标本分析1万个细胞。据&、S、G2及M各期细胞所占百分比，计算增 殖指数(s+g2+m)。1. 2. 5肠粘膜细胞凋亡指数测定细胞凋亡TUNEL原位检测，石蜡切片脱蜡入水，10%福尔马林溶液固定，新鲜配制 蛋白酶K工作液消化30min，10%福尔马林液固定5min，滴加Equilibration Buffer，室温 平衡lOmin，滴加50iiLTdT酶反应液，盖上盖玻片于湿盒内37°C反应120min，去除盖玻片， 加2 X SSC溶液终止反应，用H202/甲醇浸洗5min，滴加Str印tavidin_HRP溶液，室温5min， 滴加100 yL DAB工作液，苏木素复染，脱水，封片，光镜观察。光镜下正常细胞核呈蓝色，凋 亡细胞核为深浅不一的棕褐色。在低倍镜下(X100)选取细胞分布均勻的视野，再在高倍 镜下(X400)计数1000个肿瘤细胞中阳性染色细胞数，重复计数10个视野，分别计算各组 的细胞凋亡指数。细胞凋亡指数=细胞凋亡数/细胞总数X 100%。2 结果2. 1肠粘膜通透性、肠粘膜细胞增殖指数和肠粘膜细胞凋亡指数直肠真杆菌组、直肠真杆菌发酵上清液组、柱状真杆菌组、柱状真杆菌发酵上清液 组、凸腹真杆菌组、凸腹真杆菌发酵上清液组、两形真杆菌组、两形真杆菌发酵上清液组、酪 酸梭菌组、酪酸梭菌发酵上清液组、丁酸梭菌组、丁酸梭菌发酵上清液组、第三梭菌组、第三 梭菌发酵上清液组、丁酸钠组的肠粘膜通透性和肠粘膜凋亡指数显著低于模型对照I组、 模型对照II组、乙酸钠组、乳酸钠组、双歧杆菌组、双歧杆菌发酵上清液组、乳酸杆菌组和乳 酸杆菌发酵上清液组，而肠粘膜细胞增殖指数显著高于模型对照I组、模型对照II组、乙酸 钠组、乳酸钠组、双歧杆菌组、双歧杆菌发酵上清液组、乳酸杆菌组和乳酸杆菌发酵上清液 组，差异具有统计学意义(P< 0.05)，但直肠真杆菌组、直肠真杆菌发酵上清液组、柱状真 杆菌组、柱状真杆菌发酵上清液组、凸腹真杆菌组、凸腹真杆菌发酵上清液组、两形真杆菌 组、两形真杆菌发酵上清液组、酪酸梭菌组、酪酸梭菌发酵上清液组、丁酸梭菌组、丁酸梭菌 发酵上清液组、第三梭菌组、第三梭菌发酵上清液组、丁酸钠组之间比较差异没有统计学意 义(P > 0.05)，模型对照II组、乙酸钠组、乳酸钠组、双歧杆菌组、双歧杆菌发酵上清液组、 乳酸杆菌组和乳酸杆菌发酵上清液组之间比较差异没有统计学意义(P > 0. 05)，见表1。表1肠粘膜通透性、肠粘膜细胞增殖指数和肠粘膜细胞凋亡指数比较(X 士S) 2. 2肠道丁酸测定直肠真杆菌组、柱状真杆菌组、凸腹真杆菌组、两形真杆菌组、酪酸梭菌组、丁酸梭 菌组和第三梭菌组7天后的肠道丁酸含量分别是灌服活菌前、模型对照II组、双歧杆菌组 和乳酸杆菌组的5 6倍，差异具有统计学意义(P<0. 05)。模型对照II组、双歧杆菌组和 乳酸杆菌组肠道丁酸含量差异没有统计学意义(P > 0. 05)。3 结论以上研究结果表明，能够分泌丁酸的有益菌可以通过提供肠粘膜细胞能量，促进 肠粘膜细胞增殖和抑制细胞凋亡，而改变肠粘膜的通透性。而不能分泌丁酸的有益菌没有 以上作用。在危重疾病发展过程中，肠道是机体应激的中心器官之一，而肠粘膜屏障首当其冲受到损害，肠粘膜损伤、萎缩、凋亡增加和通透性增高等可导致整个肠屏障功能障碍，肠 内致病微生物和毒素透过肠屏障引发各种并发症。而产丁酸的益生菌进入肠道，分泌大量 丁酸，从而预防和治疗肠粘膜损伤，保护肠屏障功能和预防并发症的发生。本发明在实施过程中所使用的微生物菌种已分别于1997年7月28日、2007年8 月2日、2007年12月26日和2008年04年25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所邮编100101)保藏，共9个下述 微生物菌种，但本发明所述的真杆菌属、梭菌属、双歧杆菌属和乳酸杆菌属等并不局限于这 9微生物菌种。(1)分类命名直肠真杆菌Eubacterium rectale，保存编号2124。(2)分类命名柱状真杆菌Eubacterium cylindroides，保存编号2302。(3)分类命名凸腹真杆菌Eubacterium ventriosum，保存编号2465。(4)分类命名两形真杆菌Eubacterium biforme，保存编号2466。(5)分类命名酪酸梭菌 Clostridium butyricum，保存编号 0313. 1。(6)分类命名丁酸梭菌 Clostridium butyricum，保存编号 2303。(7)分类命名第三梭菌Clostridium tertium，保存编号2304。(8)分类命名婴儿双歧杆菌Bifidobacterium infantis，保存编号0313. 2。(9)分类命名嗜酸乳杆菌 Lactobacillus acidophilus，保存编号 0313. 4。上述9个微生物菌种经该微生物中心检测，检测结果均为存活。
1权利要求
一种或一种以上产酪酸(丁酸)有益菌在制备预防和治疗重症疾病中肠道屏障损伤及损伤后并发症的制剂中的应用，其中所述预防和治疗重症疾病中肠道屏障损伤及损伤后并发症是指通过在肠道产生酪酸，将酪酸引入肠道，而提供肠粘膜能量、促进肠粘膜细胞增殖和抑制肠粘膜细胞凋亡，改善肠粘膜通透性，预防和治疗肠粘膜屏障损伤而发挥对肠屏障的防治作用。
2.按权利要求1所述应用，其特征在于产酪酸有益菌优选但不限于梭菌、真杆菌。
3.按权利要求1所述应用，其特征在于产酪酸有益菌是肠道常住菌或肠道过路菌。
4.按权利要求1所述应用，其特征在于重症疾病优选但不限于严重创伤、休克、烧伤、 手术、重症感染、危重患者、入住重症监护室患者、应激打击患者、急性胰腺炎、重症急性胰 腺炎、肝硬化、肝炎、肠癌、肠癌术后、肿瘤患者、肿瘤放化疗、重症胆管炎、饥饿、长期全胃肠 道外营养、多系统器官功能衰竭、急性呼吸道窘迫综合征、肾衰、心衰、肝衰、颅脑外伤、呼吸 衰竭、循环衰竭、糖尿病。
5.按权利要求1所述应用，其特征在于并发症包含内源性感染、炎症反应综合征、脓毒 症、多器官功能不全综合征、内毒血症、细菌移位、全身感染、多系统器官功能衰竭。
6.按权利要求1所述应用中的制剂，其特征在于有效剂量的一种或一种以上产酪酸的 有益菌制成药品、保健食品、饮品、肠内营养制剂、食品、兽药和饲料添加剂。
7.按权利要求1所述应用，其特征在产酪酸有益菌指活的生物个体。
8.按权利要求1所述应用中的制剂，其特征在于固体制剂包含的总活菌数不能低于 1 X 106CFU/g, 一般在 1 X 107CFU/g 以上，最高可达到 1 X 1012CFU/g 或 1 X 1012CFU/g 以上；或 液体制剂包含的总活菌数不能低于1 X 106CFU/mL，一般在lX107CFU/mL以上，最高可达到 1 X 1012CFU/mL 或 1 X 1012CFU/mL 以上。
9.按权利要求2所述产酪酸有益菌，其特征在于梭菌优选但不限于酪酸梭菌(丁酸梭 菌)、第三梭菌；真杆菌优选但不限于直肠真杆菌、柱状真杆菌、凸腹真杆菌和两形真杆菌。
10.按权利要求9所述产酪酸有益菌，其特征在于酪酸梭菌优选但不限于酪酸梭菌 DF96101保藏编号CGMCC0313. 1和丁酸梭菌QA-08保藏编号CGMCC2303 ；第三梭菌优选但不 限于第三梭菌QH-07保藏编号CGMCC2304 ；凸腹真杆菌优选但不限于凸腹真杆菌QD-Ol保 藏编号CGMCC2465 ；两形真杆菌优选但不限于两形真杆菌QE-Ol保藏编号CGMCC2466 ；直肠 真杆菌优选但不限于直肠真杆菌QQ-66保藏编号CGMCC2124 ；柱状真杆菌优选但不限于柱 状真杆菌QC-Ol保藏编号CGMCC2302。
全文摘要
本发明涉及产酪酸有益菌的新用途，具体涉及一种或一种以上产酪酸(丁酸)有益菌在制备预防和治疗重症疾病中肠道屏障损伤及损伤后并发症的制剂中的应用，其中所述预防和治疗重症疾病中肠道屏障损伤及损伤后并发症是指通过在肠道产生酪酸，将酪酸引入肠道，而提供肠粘膜能量、促进肠粘膜细胞增殖和抑制肠粘膜细胞凋亡，改善肠粘膜通透性，预防和治疗肠粘膜屏障损伤而发挥对肠屏障的防治作用。
文档编号A61P1/00GK101849969SQ200910134078
公开日2010年10月6日 申请日期2009年3月31日 优先权日2009年3月31日
发明者崔云龙, 李洪福 申请人:青岛东海药业有限公司;北京普尔康医药高科技有限公司