球虫病疫苗的制作方法

专利名称：球虫病疫苗的制作方法
球虫病疫苗交叉参考相关申请本申请根据35U. S.C. $119(e)要求在2008年5月四日提交的临时申请美国系列 案61/057，003的优先权，其内容以其全文通过引用合并入本文。发明领域本发明涉及提供免受球虫病侵害的保护作用的疫苗。还提供了制备疫苗以及单独 地或与其他保护剂组合地使用疫苗的方法。背景球虫病是世界范围内攻击家畜的肠道疾病。由于球虫病的原因，依赖于动物产量 的商业经常面临重大的成本问题，包括由于患病家畜引起的金融损失以及旨在减少和/或 预防该疾病的预防性治疗的花费。此类成本尤其与养禽业相关，其中禽类的密集聚居有利 于球虫病的传播。球虫病的生态原因是专性细胞内孢子虫纲(Sporozoa)球虫亚纲(Coccidia)的 成员。对动物产量具有重大影响的该亚纲的一个属是艾美尔球虫属(Eimeria)。就象对 于密切相关的等孢球虫属(Isospora)、囊等孢球虫属(Cystoisospora)和隐孢子虫属 (Cryptosporidium)那样，艾美尔球虫属只需要单个宿主就可完成其生命周期。在自然条件 下，其生命周期始于从环境摄入生成孢子的卵囊。艾美尔球虫是具有复杂的单寄主生命周期的单细胞寄生虫，其展示高度的宿主 物种和组织特异性。艾美尔球虫种包括发现于鸡中的种柔嫩艾美尔球虫(E.tenella)、 堆型艾美尔球虫(E. acervulina)、巨型艾美尔球虫(E. maxima)、毒害艾美尔球虫 (E. necatrix)、和缓艾美尔球虫(E. mitis)、早熟艾美尔球虫(E. praecox)、变位艾美尔球 虫(E.mivati)和布氏艾美尔球虫(E.brimetti)以及发现于火鸡中的艾美尔球虫种珠鸡 和缓艾美尔球虫(E.meleagrimitis)、腺样艾美尔球虫(E. adenoeides)、孔雀艾美尔球虫 (E. gallopavonis)、分散艾美尔球虫(E. dispersa)、珠鸡艾美尔球虫(E. meleagridis)、无 毒艾美尔球虫(E. innocua)和亚圆艾美尔球虫(E. subrotunda)。艾美尔球虫属的生命周期 的阶段对于艾美尔球虫属的所有种基本上都是相同的，虽然每一个种具有在肠中进行发育 的优选部位并且完成生命周期所需要的时间在种间不同。许多艾美尔球虫种可通过经口途径、经鼻途径和/或通过感染性颗粒进入泪道而 感染单个宿主。一旦被摄入，该寄生虫即穿过肠粘膜细胞，然后经历生命周期的无性和有性 阶段。所造成的肠道损伤可最终导致受损的生长(矮化)、减少的饲料利用率、色素沉着的 丧失和增加的死亡率。此外，对肠内层的损伤使动物对其他感染性状况易感，例如受累的鸡 变得对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringen)诱导的坏死性肠炎更易感。感染始于宿主摄入生成孢子的艾美尔球虫卵囊。然后摄入的卵囊在宿主的 肠中释放胞蚴(sporocyst)。胞蚴释放子孢子，其进入肠上皮细胞，然后转化成营养子 (trophozoite) 0营养子依次经历称为卵块发育的过程形成第一代裂殖体(schizont)。由 于它们相对较大，因此正是裂殖体引起感染的主要的致病作用，即对宿主的组织损伤。
早期世代的裂殖体产生大量裂殖子(merozoite)，所述裂殖子被释放，然后生长并 且形成下一代裂殖体。该无性期在开始有性期之前持续进行可变的代数。当裂殖体形成小 配子母细胞(microgametocyte)和大配子(macrogamete)时有性期开始。小配子母细胞随 后发育成小配子，其使大配子受精而产生未孢子化卵囊后代。然后未孢子化卵囊被释放入 肠腔并且随宿主粪便排出。由未孢子化卵囊在宿主粪便中出现预示的生命周期的完成被称 为开放(patency)。当环境是有利的时候，卵囊的孢子形成在宿主外发生。孢子化卵囊被宿主不可避 免的摄入开始下一个感染循环。从孢子化卵囊被宿主摄入至粪便中出现未孢子化卵囊称为 潜隐期(pr印atent time period)。潜隐期在不同艾美尔球虫种间是不同的。反复暴露于艾美尔球虫感染的家禽可从球虫病获得免疫力。事实上，取决于各艾 美尔球虫种的免疫原性，使用少量孢子化卵囊每天感染肉鸡(broiler)可导致禽类在少至 2次重复感染后获得完全免疫。因此，目前利用活艾美尔球虫疫苗的方案基于获得性免疫的 原理，即使用少量感染性卵囊反复感染。通常在孵化期在禽类出生的当天通过直接对禽类施用艾美尔球虫疫苗或通过施 加在它们的饲料和/或饮用水中来进行接种。如上所述，感染性卵囊在禽类的肠道内完成 它们的生命周期，最终在5至11天后(取决于艾美尔球虫的种类)释放新一代未孢子化卵 囊。然后随粪便一起排泄的未孢子化卵囊在外部环境中变得具有感染性，即孢子化，并且通 过宿主摄入再感染禽类。在2或3次这样的循环后，禽类被免疫而抗球虫病。这种免疫力 的特征在于(i)肠中通过显微镜观察到的寄生虫的减少和/或不存在，( )卵囊排出的减 少，(iii)肠损伤的减少，(iv)临床疾病的减少，和/或(ν)体重减轻的减少或预防。获得 性免疫在缺乏后续对感染性卵囊的暴露时在3至4个月时期内减弱。通过从家禽群体的临床疾病的暴发分离野生型艾美尔球虫，可将其繁殖以用作病 原性攻击菌株。一般的非减毒疫苗由已通过实验室传代维持的不同艾美尔球虫种的轻微至 中等致病性菌株的感染性卵囊组成。当以高数量被摄入时，此类非减毒艾美尔球虫能够引 起球虫病。疫苗的制造者和使用者必须小心以确保接种只提供在初始宿主(Naiivehost) 中足以诱发免疫但不诱发疾病的感染性卵囊。在初始剂量后，接种过程只依赖于通过窝肥 (litter)从垃圾摄入孢子化卵囊来进行的再感染。减毒疫苗由具有降低的致病性的感染性卵囊组成。由于减弱的致病性与获得更短 的潜隐期之间的强关联性，许多减毒株也是早熟的。与之相符地，具有缩短的潜隐期的减毒 系通常称为“早熟系”。因此，可通过寄生虫在宿主动物中反复传代的过程中选择卵囊的早期出现来实现 艾美尔球虫致病性的一定程度的减弱。这样，已鉴定到了具有大大缩短的潜隐期并且大大 减小的致病性的艾美尔球虫给定种的群体。虽然所观察到的致病性降低的原因还不完全清 楚，但通常据信与裂殖体至少一代的耗尽和/或大小的减小(从而减少了宿主中组织损伤) 相关。非减毒和减毒疫苗都有有利方面和不利方面。由非减毒寄生虫组成的疫苗的一个 有利方面是寄生虫以更大数量复制，从而导致卵囊在环境中更快积累，这是禽类的再感染 和随后的免疫所必需的。在另一方面，非减毒艾美尔球虫在未接种的鸡(naive chicken) 的肠道中的复制过程可产生损伤，导致较差的动物营养、饲料转化效率的丧失和其他有害作用，包括继发感染和炎症。非减毒疫苗的另一个缺点是必须确保每一只禽类接受正确的初始剂量，因为太大 量的接种物将引起严重的肠损伤，而太小量的接种物又将导致相对于群体来说其免疫过程 的开始延迟。在后一种情况下，接受不足初始剂量的禽类可变得不能承受由在初次潜隐期 后它们的群体同伴排泄的扩增数目的感染性卵囊引起的攻击。事实上，在这样的后续艾美 尔球虫攻击之前缺乏足够的免疫是当使用活的非减毒疫苗时发生的大部分失败的原因。减毒疫苗的一个主要有利方面是它们只引起最小损伤。然而，减毒疫苗产生的卵 囊比非减毒株更少，导致感染性卵囊在环境中的积累更慢，从而降低了在初次潜隐期后再 感染的概率。这继而又导致免疫完全建立所需的时间更长，并且甚至可中断整个免疫过程。 因为野生型巨型艾美尔球虫产生相对大量的卵囊，因此当针对艾美尔球虫种巨型艾美尔球 虫免疫时，感染性卵囊在环境中的积累较慢是特别有问题的。因为单个宿主种可被多个艾美尔球虫种感染，因此通常抗球虫病的活疫苗被设计 成包含来自许多艾美尔球虫种的卵囊。迄今为止，只存在3种类型的此类活疫苗只由实验 室培养的卵囊组成的非减毒疫苗、只由减毒卵囊组成的减毒疫苗和混合疫苗(其中来自一 些艾美尔球虫种的卵囊是非减毒的，来自其他艾美尔球虫种的卵囊是减毒的)。不幸地是， 此类疫苗中没有一种克服了上述不利方面。事实上，鉴于目前类型的活艾美尔球虫疫苗中 每一种的显著不利方面以及由于艾美尔球虫感染而导致的球虫病工业的相当昂贵的成本， 仍然长期需要可更好地保护家禽免受这种昂贵的肠疾病侵害的改进的疫苗。本文中任何参考文献的引述不应当理解为承认这样的参考文献是本申请的“现有 技术”。发明概述因此，本发明提供了可用于抗球虫病的疫苗的新型免疫原性组合物。在本发明的 一个方面，提供了疫苗，所述疫苗包含孢子虫病球虫属(coccidia genus)的单个种的至少 两个不同株系，并且所述孢子虫病球虫属的单个种的至少两个不同株系具有彼此不同步的 潜隐期。在一个实施方案中，所述疫苗组合物包含球虫属的种的第一株系和该相同种的第 二株系，其中第一株系和第二株系具有不同步的潜隐期。在一个这样的实施方案中，所述球 虫属是等孢球虫属。在另一个实施方案中，所述球虫属是囊等孢球虫属。在另一个实施方 案中，所述球虫属是隐孢子虫属。在一个特定的实施方案中，所述球虫属是艾美尔球虫属。还提供了包含球虫属的任何和所有组合的多价疫苗。在一些特定的实施方案中， 提供了包含两个或更多个这类球虫属的两个或更多个株系的疫苗。在该类型的一个实施方 案中，疫苗包含多个球虫属的株系对，其中球虫属单个种的多个株系对具有不同步的潜隐 期。在一个特定的实施方案中，疫苗包含囊等孢球虫单个种的株系对(所述株系对具有不 同步的潜隐期)和等孢球虫属单个种的株系对(所述株系对具有不同步的潜隐期)。在另 一个实施方案中，疫苗中球虫属单个种的所有株系对都具有不同步的潜隐期。在一个实施方案中，疫苗中孢子虫球虫属的种的第一株系是非减毒株，第二株系 是早熟株。在该类型的一个特定实施方案中，所述早熟株也是减毒株。本发明的疫苗可包含处于其生命周期任何阶段的孢子虫，包括其生命周期的一个 或多个阶段或甚至所有阶段的混合物。在一个特定的实施方案中，疫苗中的孢子虫是卵囊。在另一个实施方案中，孢子虫是子孢子(sporozoite)。在另一个实施方案中，孢子虫是裂殖 子。在另一个实施方案中，孢子虫是裂殖子和/或子孢子和/或卵囊的混合物。在本发明的另一个方面，提供了包含以确定的比率和/或数量存在的球虫属相同 种的非减毒孢子虫和早熟孢子虫的疫苗。因此，在一个特定的实施方案中，本发明的疫苗包 含球虫属相同种的非减毒孢子虫和早熟孢子虫，其中疫苗中非减毒孢子虫对早熟孢子虫的 比率是大约1份减毒孢子虫对大约4份早熟孢子虫。在该类型的另一个实施方案中，相同 种的非减毒孢子虫对早熟孢子虫的比率是大约1份非减毒孢子虫对大约2份早熟孢子虫。 在另一个实施方案中，相同种的非减毒孢子虫对早熟孢子虫的比率是大约1份非减毒孢子 虫对大约1份早熟孢子虫。在另一个实施方案中，相同种的非减毒孢子虫对早熟孢子虫的 比率是大约2份非减毒孢子虫对大约1份早熟孢子虫。在另一个实施方案中，相同种的非 减毒孢子虫对早熟孢子虫的比率是大约4份非减毒孢子虫对大约1份早熟孢子虫。在该类 型的一些特定实施方案中，非减毒孢子虫是非减毒卵囊。在另一个实施方案中，早熟孢子虫 是早熟卵囊。在另一个疫苗的实施方案中，非减毒孢子虫是非减毒卵囊，并且早熟孢子虫是 早熟卵囊。还提供了包含球虫属相同种的株系的任何和/或所有组合和数量的疫苗，所述株 系具有不同步的潜隐期。在该类型的一个特定实施方案中，疫苗包含大约10至大约1000 个非减毒卵囊。在另一个实施方案，疫苗包含大约25个至大约500个非减毒卵囊。在另一 个实施方案中，疫苗包含大约50至大约250个非减毒卵囊。在另一个实施方案中，疫苗包 含大约100至大约200个非减毒卵囊。在该类型的相关实施方案中，疫苗包含大约50至大约20000个非减毒卵囊。在另 一个实施方案中，疫苗包含大约100至大约10，000个非减毒卵囊。在另一个实施方案中， 疫苗包含大约250至大约5000个非病毒卵囊。在另一个实施方案中，疫苗包含大约500至 大约3000个非病毒卵囊。在另一个实施方案中，疫苗包含大约750至大约2000非病毒卵Λ ο在另一个实施方案中，疫苗包含大约50至大约20000个早熟和/或减毒卵囊。在 另一个实施方案中，疫苗包含大约100至大约10，000个早熟卵囊。在另一个实施方案中， 疫苗包含大约250至大约5000个早熟卵囊。在另一个实施方案中，疫苗包含大约500至大 约3000个早熟卵囊。在另一个实施方案中，疫苗包含大约750至大约2000个早熟卵囊。在 另一个实施方案中，本发明的疫苗包含大约10至大约1000个早熟卵囊。在另一个实施方 案中，疫苗包含大约25至大约500个早熟卵囊。在另一个实施方案中，疫苗包含大约50至 大约250个非减毒早熟卵囊，在另一个实施方案中，疫苗包含大约100至大约200个早熟卵 囊。在一些特定实施方案中，早熟卵囊是减毒卵囊。当本发明的疫苗包括一个特定的孢子虫球虫属例如艾美尔球虫属时，可使用任何 这样的种。在一个这样的实施方案中，疫苗包含可帮助保护鸡免受球虫病侵害的艾美尔球 虫种。在一个这样的实施方案中，所述艾美尔球虫种是柔嫩艾美尔球虫。在另一个实施方 案中，所述艾美尔球虫种是堆型艾美尔球虫。在另一个实施方案中，所述艾美尔球虫种是毒 害艾美尔球虫。在另一个实施方案中，所述艾美尔球虫种是变位艾美尔球虫。在另一个实 施方案中，所述艾美尔球虫种是和缓艾美尔球虫。在另一个实施方案中，所述艾美尔球虫种 是早熟艾美尔球虫。在另一个实施方案中，艾美尔球虫种是布氏艾美尔球虫。在一个特定7的实施方案中，艾美尔球虫种是巨型艾美尔球虫。还提供了包含此类艾美尔球虫种的任何和所有组合的疫苗。此外，还提供了包含 两个或更多个此类单个种的两个或更多个株系的疫苗。在该类型的一个实施方案中，疫苗 包含多个艾美尔球虫种的株系对，其中单个艾美尔球虫种的多个株系对具有不同步的潜隐 期。在该类型的一个特定实施方案中，疫苗中单个艾美尔球虫种的所有株系对具有不同步 的潜隐期。在一个特定的实施方案中，疫苗包含巨型艾美尔球虫的野生型和/或非减毒株以 及巨型艾美尔球虫的减毒和/或早熟株。在一个这样的实施方案中，巨型艾美尔球虫的野 生型和/或非减毒株具有以名称C0CCIVACT销售的疫苗中发现的巨型艾美尔球虫株的 基本上所有的鉴定特征和/或基本上所有的性质。在该类型的另一个特定实施方案中，疫 苗包含巨型艾美尔球虫的减毒和/或早熟株，所述株系具有以名称PARAC0X 销售的疫苗 中发现的巨型艾美尔球虫株的基本上所有的鉴定特征和/或基本上所有的性质。在另一 个实施方案中，疫苗包含巨型艾美尔球虫的野生型和/或非减毒株(所述株系具有以名称 COCCIVAiT销售的疫苗中发现的巨型艾美尔球虫株的基本上所有的鉴定特征和/或基本 上所有的性质)和艾美尔球虫株的减毒、早熟株(所述株系具有以PARAC0X 销售的疫苗 中发现的巨型艾美尔球虫株的基本上所有的鉴定特征和/或基本上所有的性质)。本发明的另一种疫苗包含可帮助保护火鸡免受球虫病的侵害的一个或多个艾美 尔球虫种。在一个这样的实施方案中，艾美尔球虫种是和缓艾美尔球虫。在另一个实施方 案中，艾美尔球虫种是腺样艾美尔球虫。在另一个实施方案中，艾美尔球虫种是孔雀艾美尔 球虫。在另一个实施方案中，艾美尔球虫种是分散艾美尔球虫。在另一个实施方案中，艾美 尔球虫种是珠鸡艾美尔球虫。在另一个实施方案中，艾美尔球虫种是无毒艾美尔球虫。在 另一个实施方案中，艾美尔球虫种是亚圆艾美尔球虫。还提供了包含珠鸡艾美尔球虫种的 任何和所有组合的疫苗。此外，提供了包含两个或更多个此类单个种的两个或更多个株系 的疫苗。在该类型的一个实施方案中，疫苗包含多个珠鸡艾美尔球虫种的株系对，其中单个 珠鸡艾美尔球虫种的多个株系对具有不同步的感染后至排卵囊期。在该类型的一个特定实 施方案中，疫苗中单个珠鸡艾美尔球虫种的所有株系对具有不同步的感染后至排卵囊期。在本发明的另一个方面，提供了包含等孢球虫属、囊等孢球虫属和/和隐孢子虫 属的一个或多个种和/或种的一个或多个株系的疫苗。在该类型的此类实施方案中，等孢 球虫属、囊等孢球虫属和/和隐孢子虫属的种的至少两个株系也具有不同步的感染至卵囊 排出期。此外，可将本发明的任何艾美尔球虫疫苗与此类等孢球虫属、囊等孢球虫属和/和 隐孢子虫属疫苗组合。在一个特定的实施方案中，疫苗包含隐孢子虫属的种的非减毒株和隐孢子虫属的 相同种的早熟株。在另一个实施方案中，这样的隐孢子虫属疫苗还包含等孢球虫属的种的 非减毒株和等孢球虫属的相同种的早熟株。在另一个实施方案中，隐孢子虫属疫苗还包含 囊等孢球虫属的种的非病毒株和囊等孢球虫属的相同种的早熟株，在另一个实施方案中， 隐孢子虫属疫苗还包含囊等孢球虫属的种的非减毒株、囊等孢球虫属的相同种的早熟株、 等孢球虫属的种的非减毒株和等孢球虫属的相同种的早熟株。在一个相关实施方案中，本发明提供了包含等孢球虫属的种的非减毒株和等孢球 虫属的相同种的早熟株的疫苗。在另一个实施方案中，疫苗包括囊等孢球虫属的种的非减8毒株和囊等孢球虫属的相同种的早熟株。在另一个实施方案中，疫苗包含囊等孢球虫属的 种的非减毒株、囊等孢球虫属的相同种的早熟株、等孢球虫属的种的非减毒株和等孢球虫 属的相同种的早熟株。在本发明的另一个方面，提供了免疫动物受试者以抗球虫病的方法。一个这样的 实施方案包括给所述动物施用免疫有效量的本发明的任何疫苗。在一个实施方案中，经口 施用所述疫苗。在另一个实施方案中，卵内(in ovo)施用所述疫苗。在另一个实施方案中， 局部施用所述疫苗。在另一个实施方案中，通过注射施用所述疫苗。在一个特定的实施方案中，在动物的饮用水中施用所述疫苗。在另一个实施方案 中，在动物食物中施用所述疫苗。在另一个实施方案中，在动物的食物和饮用水中施用所述 疫苗。在另一个实施方案中，通过喷雾施用所述疫苗。在一个这样的实施方案中，对一日 龄小鸡喷雾含有疫苗的溶液。在该类型的一个特定实施方案中，在它们的孵化室中使用喷 雾盒(spray cabinet)接种一日龄鸡。在另一个实施方案中，通过对动物的眼睛施加疫苗 来施用疫苗。在该类型的一个特定实施方案中，使用滴管将疫苗施用于动物的眼睛。在另 一个实施方案中，通过2、3、4或更多种施用方法施用疫苗。在一个特定的实施方案中，给禽类施用本发明的疫苗。在一个实施方案中，所述禽 类是家禽。在一个这样的实施方案中，所述动物是鸡。在另一个实施方案中，所述家禽是火 鸡。在另一个实施方案中，所述家禽是鸭子。在另一个实施方案中，所述家禽是猎鸟(game bird)。在该类型的一个特定实施方案中，所述猎鸟是鹌鹑。在另一个实施方案中，所述猎 鸟是雉鸡。在另一个实施方案中，给哺乳动物施用所述疫苗。在该类型的一个特定实施方 案中，所述哺乳动物是非人哺乳动物。本发明的这些和其他方面通过参考详细描述和实施例将会获得更好地理解。发明详述因此，本发明提供了一种抗球虫病的疫苗，其被配制成分别使非减毒和早熟球虫 疫苗的不同性质的有利方面最大化同时使它们的个别缺点最小化。在本发明的一个方面， 疫苗包含野生型球虫种的一个或多个株系与来自相同种的减毒球虫的一个或多个株系的 组合。这样的疫苗可从宿主产生比两个单个类型的株系单独产生的免疫反应更强的免疫反 应。此外，所得的这两种类型株系的双重和不同的寄生生命周期可促成宿主中牢固免疫的 获得。—般地，与使用非减毒株的疫苗相比，用包含早熟株的疫苗要花费更长的时间才 能获得抗艾美尔球虫的给定种的牢固免疫，虽然对于早熟疫苗而言开放性(patency)来得 更早。该结果表明，相对于对于早熟株观察到的情形而言，非减毒株在潜隐期中经历的额外 复制周期可加速宿主的免疫反应，和/或在用非减毒艾美尔球虫感染/接种后，在开放时释 放的显著更大数量的卵囊可在更少的寄生生命周期中使宿主动物产生完全免疫。虽然绝不受任何特定的作用机制限制，但本发明与通过使用包含球虫属例如艾美 尔球虫属选定种的两个或更多个株系的疫苗(其中至少两个株系具有不同步的潜隐期)接 种宿主动物产生的对宿主免疫系统的协同作用一致。这样的不同步的潜隐期由于这种交替 式开放的加强作用而使得免疫过程比单独地使用任一株系更快地进行。事实上，开放的更 快地继续通过增加新产生的卵囊被宿主摄入的可用性的频率促进再次免疫过程。在本文中称为“回波效应”的这种加强效应从而可引发该宿主动物的更早期免疫。因此，在一个方面，本发明提供了包含具有更短潜隐期的减毒株和相同种的具有 更长潜隐期(但具有强得多的复制卵囊新世代和污染环境的能力)的非减毒株的疫苗。本 发明的一个这样的示例性疫苗包括巨型艾美尔球虫的两个不同株系(或品系)来源于用 于产生以名称PARAC0X 销售的疫苗的相同标准种子(master seed)的减毒早熟株，和来 源于用于产生以名称COCCIVAC 销售的疫苗的标准种子的非减毒株。这两个株系都提供 抗巨型艾美尔球虫野外攻击的功效。使用未减毒株的接种导致肉鸡群在3周结束时显示完 全的免疫，而使用早熟和/或减毒疫苗的接种花费至少4周成才完全建立。由于它们的潜隐期的不同长度，可通过回波效应获得宿主动物的早期免疫。因此 通过产生免疫反应的不同步的刺激，即回波效应，组合的巨型艾美尔球虫株可刺激更长的 抗原对免疫系统的暴露，从而加速发展保护性免疫的过程。事实上，一起施用两个株系可导致免疫过程功效的增加。非减毒卵囊和早熟卵囊 在宿主中同时开始它们各自的生命周期，但非减毒株比早熟株晚11至31小时完成其潜隐 期。非减毒株还将显著更大量的卵囊泄入粪便中。因此，早熟株首先在宿主中完成其生命周期，从而起始宿主的免疫反应。然后早熟 卵囊被排泄出来，形成孢子，并且在被宿主摄入后，开始它们的第二生命周期。同时，非减毒 株的第一生命周期继续产生一个或多个额外世代的裂殖体，最终导致配子体的形成，加强 和扩展了由早熟株引发的免疫反应。然后排泄的非减毒卵囊在厩肥中形成孢子，并且被已 具有早熟株(正经历其第二生命周期)的宿主摄入。因此，此类同时但不同步的细胞周期 可以减少在宿主中获得牢固免疫所需的时间。但整个过程还可允许疫苗在初始剂量中包含 更少的非减毒卵囊，从而可降低因非减毒株感染在宿主肠中形成的损伤的数量和/或减轻 严重度。为了描述方便使用单数形式绝不是想这样限定。因此，例如，提及包含“某一量”的 组合物即包括提及一个或多个这样的量。此外，除非另外指出，“(一个)卵囊”包括多个这 样的卵囊。如本文中使用的，下列术语将具有下面所示的定义术语“佐剂”和“免疫刺激剂”在本文中可互换使用，并且被定义为引起免疫系统 的刺激的一种或多种物质。佐剂是非特异性增加对特定抗原的免疫反应，从而减少任何给 定疫苗中所必需的抗原的量和/或产生足够的对目的抗原的免疫反应所必需的注射频率 的试剂。在本说明书中，佐剂用于增强对一种或多种疫苗抗原/分离株的免疫反应。可在 疫苗施用之前或与疫苗施用组合或在疫苗施用之后施用佐剂。如本文中所使用的，术语“大致”与术语“大约”互换使用，表示一个值落入所指定 值的50%的范围内，即包含“大约” 100个卵囊的组合物包含50至150个卵囊。如本文中所使用的，球虫属的种的“减毒”株(例如“减毒的艾美尔球虫”)是已就 其在宿主中的减小的致病性选择出来的株系。这样的减毒可通过许多方法来实现，包括连 续传代(例如连续胚胎传代)、化学诱变和通过辐射方法。如本文中所使用，球虫属的种的“早熟”株(例如“早熟艾美尔球虫”)是相对于相 同种的非减毒株而言具有更短的潜隐期的株系。早熟株也可以是减毒株。如本文中所使用的，球虫属的种的“野生型”株(例如“野生型艾美尔球虫”)是已通过减毒传代或任何其他处理(包括通过单卵囊分离、免疫耐受或其他分离处理)进行改 变的野外分离株。如本文中所使用的，球虫属的种的“非减毒”株(例如“非减毒艾美尔球虫”)是相 对于相同种的野生型株系而言既不具有缩短的潜隐期也不具有降低的宿主中致病性的株系。如本文中所使用的，球虫属的种(例如艾美尔球虫的种)的“株系”是可通过以下 一个或多个特征与该种的一般群体区分开的球虫属的种的亚群体致病性、免疫原性、潜隐 期和/或由单个卵囊的扩增产生的群体。术语“不同步的潜隐期”是指球虫属的2个或更多个种和/或球虫属的种的两个 或更多个株系的潜隐期相差10%或更大。在一个特定的实施方案中，球虫属的2个或更多 个种和/或球虫属的单个种的两个或更多个株系具有相差20%或更大的不同步的潜隐期。 在另一个实施方案中，球虫属的2个或更多个种和/或球虫属的单个种的两个或更多个株 系具有相差25%或更大的不同步的潜隐期。在谈及早熟和/或减毒株与非减毒株的不同步的潜隐期相差某一百分比(％ )的 时间时，该百分比是基于非减毒株的潜隐期。因此，当球虫属的非减毒株具有120个小时的 潜隐期，而该球虫属的相同种的早熟株具有108个小时的潜隐期时，这两个株系的不同步 的潜隐期相差10%。除非另外指出，术语“家禽”，如本文中所使用的，包括鸡、火鸡、鸭子、猎鸟(包括 但不限于鹌鹑、野鸡和鹅)和平胸鸟(ratites)(包括但不限于鸸鹋(emu)和鸵鸟)。除非另外指出，术语“艾美尔球虫”，如本文中所使用的，是指感染家禽类的艾美尔 球虫属的一个或多个种。艾美尔球虫种包括在鸡中发现的那些艾美尔球虫种，包括例如柔 嫩艾美尔球虫、堆型艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、和缓艾美尔球虫、早熟 艾美尔球虫、变位艾美尔球虫和布氏艾美尔球虫，还有在火鸡中发现的那些艾美尔球虫种， 包括和缓艾美尔球虫、腺样艾美尔球虫、孔雀艾美尔球虫、分散艾美尔球虫、珠鸡艾美尔球 虫、无毒艾美尔球虫和亚圆艾美尔球虫，还包括感染如上定义的其他家禽的艾美尔球虫种。 术语“艾美尔球虫”还包括艾美尔球虫的上述种的所有株系，包括但不限于早熟株和减毒 株，其还包括已进行了辐射或其他处理以使它们不能完全发育的株系。术语艾美尔球虫还 包括感染如上定义的家禽的艾美尔球虫属任何新发现的株系或种。术语“被囊的(encysted)，，是指该原生动物寄生虫的卵囊阶段。如本文中所使用的，术语“免疫”和“接种”是同义的并且可互换使用。除非另外指 出，术语“有效免疫剂量”，如本文中使用的，是指处于其生命周期任何阶段的孢子虫的足以 在所接种的动物中引发免疫反应，例如引发相应的抗体滴度的升高和/或细胞介导免疫的 激活的数量，包括它们的生命周期的一个或多个阶段或所有阶段的混合物，例如子孢子、卵 囊和/或裂殖子的混合物，或当混合时，是指例如足以实现上述效果的子孢子、卵囊和/或 裂殖子的数目。优选地，当用孢子虫纲(例如艾美尔球虫属或隐孢子虫属)的强毒剂量攻 击时，所引发的免疫反应可提供保护性免疫力，限制或减少被接种动物(例如禽类)的临床 疾病体征、体重减轻、发病率和/或死亡率。除非另外指出，术语“卵囊”、“裂殖子”和“子孢子”，如本文中所使用的，是指有活 力的(即活的)球虫(例如艾美尔球虫或隐孢子虫属)卵囊、裂殖子和子孢子，其可以是减毒或非减毒的。术语“牢固免疫”在本文中可与术语“完全免疫”互换使用，表示对一组被接种动物 (例如一群接种鸟)所提供的一定程度的免疫，该免疫可提供抗同源攻击的保护作用，使得 被接种动物在健康和性能上(如通过例如饲料转化率、体重增长和/或球虫病的损伤(总 体的或微观的)所衡量的)在统计学上与未被攻击的对照相似(和/或统计学上与未接种 的被攻击对照不同)。术语“统计学上相似的”，如本文中所使用的，是指两组或两群动物的统计学比较 将导致在< 0.1显著性水平上接受零假设(或无差异假设)。术语“统计上不同的”，如本文中所使用的，是指两组或两群动物的统计学比较导 致在< 0. 1显著性水平上拒绝零假设(或无差异假设)。术语“胞蚴”是指将子孢子封闭在卵囊中的被膜。动物受试者待这样处理的动物优选是但不限于脊椎动物，更优选哺乳动物、禽类或鱼。可给动 物受试者施用任何本发明疫苗。适当的动物受试者包括野生动物、家畜(例如饲养用于获 得肉、奶、黄油、蛋、毛皮、皮革、羽毛和/或羊毛)、负重的牲畜、研究动物、伴侣动物以及为/ 在动物园、野外栖地和/或马戏团中饲料的动物。可用本发明疫苗治疗或保护的鸟类(禽类)可与商业或非商业鸟类饲养相关。此 类鸟类包括例如鸭科例如天鹅、鹅和鸭，鸠鸽科例如斑鸠和鸽子例如家鸽，雉科例如鹌鹑、 鹧鸪、松鸡、雉鸡和火鸡，Thesienidae例如家鸡(domestic chicken)，鹦鹉科例如鹦鹉、金 刚鹦鹉和鹦鹉等等为宠物或收藏市场饲养的动物。哺乳动物受试者包括牛族动物(例如牛或奶牛)、猪类(例如阉过的公猪或猪)、 羊类(例如山羊或绵羊)、马科动物(例如马)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如家猫)、 骆驼、鹿、羚羊、兔子、豚鼠和啮齿类动物(例如松鼠、大鼠、小鼠、沙鼠和仓鼠)、鲸类(鲸、海 豚、小鲸)、鳍足类(海豹、海象)。鱼也可以是本发明的疫苗的受试者。为了本发明的目的，术语“鱼”应当被理解为 包括但不限于鱼的硬骨类分组，即硬骨鱼。鳗形目(其包括鲑科)和鲈形目(其包括刺鲈 科)都包括在鲷分类中。除其他以外，潜在的鱼接受者的实例包括鲑科(Salmonidae)、鯧 科、鲷科、丽鱼科、刺鲈科、三线眼线解(Parapristipoma trilineatum)和Blue-EyedPleco stomus (Plecostomus spp)。可被治疗的鱼的另外的实例包括但不限于鲶鱼、黑鲈、鲔鱼、大 比目鱼、北极嘉鱼、鲟鱼、比目鱼、鲽(flounder)、鳎(sole)、鲤鱼、罗非鱼、花条鲈(striped kiss)、鳗鱼、海鲷、师鱼(yellowtail)、琥珀鱼、鼻鲈(grouper)和遮目鱼。抗原野生型卵囊可从被感染动物的粪便或组织；污染的饲料或水；土壤；圈垫草或窝； 或多种其他来源获得。用于分离胞蚴和卵囊的方法是已知的。用于分离卵囊的确切方法 将随卵囊所获自的材料而变化，这对于本领域技术人员来说是很显然的。可通过例如US 7，250，286B2中公开的方法培养裂殖子。从原始环境样品中分离生物体的一个可获得的方法如下初始步骤是从外来材料 分离胞蚴和/或卵囊。通常通过与饱和盐溶液形成浆液，然后从浆液分离胞蚴和/卵囊来 处理土壤或排泄物。例如，将待处理的材料与最少2体积(w/v)的饱和NaCl水溶液混合以形成浆液。必要时，可在混合器或搅拌器中处理浆液直至获得均勻的稠度。以大约SOOxg 在4°C下离心浆液10分钟。可通过倾倒通过双层Mx对织粗滤布(weave cheese cloth) 来收集上清液。常用的从样品纯化卵囊的其他方法包括^leather蔗糖浮选法(leather sucrose flotation)和硫酸锌浮选法[例如参见LR Ash和TC Orihel,Parasites :A Guide to Laboratory Procedures and Identification, ASCP Press 1991]。用两体积的饮用水稀释过滤的上清液，然后在4°C下以1600x g离心10分钟。用 水清洗沉淀的卵囊，然后如所描述的通过离心沉淀(再进行3次)。然后使用与用于水清洗 的方法相同的方法在2. 5%重铬酸钾中清洗卵囊3次。在最终的清洗后，可将卵囊在4°C下 贮藏在2. 5 %的重铬酸钾中，或转移至容器中以进行孢子形成。备选地，可将连续过滤用于基于大小分离卵囊。如果使用过滤，则如之前所述用水 和2. 5%重铬酸钾清洗卵囊。通过在很多年中连续传代将源于野生型野外分离株的非减毒品系一直维持在实 验室中，并且其被良好地表征为低至中等的致病性，中至高等的产卵力、确定的潜隐期和已 知的从宿主泄出的模式。除了现有的早熟艾美尔球虫品系(如US 5，055，四2(其内容以其全文通过引用合 并入本文)中例举的)外，早熟品系还可通过在鸡中连续传代后从野生型、强毒力亲本株或 非减毒株获得。在一个这样的情况下，只在开放后前面数小时中从粪便收集卵囊。这样，可 逐渐缩短潜隐期。该类型的传代被称为选择传代。备选地，为了增加卵囊的数量以供收获， 可有利地在开放开始与亲本株的大致潜隐期之间的时间上收集卵囊。该类型的传代被称为 中性传代(neutral passage)。最后，在称为松驰传代(relaxed passage)的过程中，实际 上收集所有卵囊，包括比亲本株的潜隐期更晚产生的卵囊。疫苗种子批系统(Seed Lot System)可将各非减毒或减毒艾美尔球虫品系的标准种子例如贮藏在液氮中。可在接种入 宿主例如SPF鸡后从各标准种子的样品制备工作种子(working seed)。可从宿主粪便和/ 或盲肠回收卵囊以产生工作种子。将工作种子在4°C下贮藏和用于起始各疫苗的产生。工 作种子具有6至12个月的贮存期，之后应当替换它们。当制备工作种子时，卵囊的收获只 长达到该物种的野生型亲本株的大约潜隐期，即中性传代。当制备疫苗时，在感染的整个显 露期收获卵囊，即松驰传代。鸡的饲养从获自经过检验的SPF群体的蛋孵育小鸡。在饲养至进行疫苗生产的适当的年龄 (通常1至12周龄)期间使它们保持无球虫。然后将鸡转移至疫苗生产地，按组分配入 分开的室中，或转移至为各艾美尔球虫种所指定的隔离器内。接种用之前确定剂量的工作种子经口接种每一组禽类。可以按照交错排期安排接种以 使在给定的工作日只收获和处理艾美尔球虫的一个种。收获收集粪便，虽然收集的时间点和持续时间在种间不同。在水中制备粪便(和/或盲 肠内容物)的浆液，然后将其勻浆。将勻浆物通过150微米筛子来进行清洗，然后在连续流13式沉降式离心机中离心清洗物。将离心后的沉淀重悬浮于饱和盐溶液中，然后再离心。收 集上清液，用水稀释，然后通过离心进行第三次通过。将沉淀重悬浮于2 %重铬酸钾溶液中。孢子形成在强制通气的情况下将重铬酸钾溶液中的卵囊悬浮液在^rc下 温育48小时以使卵囊形成孢子。在孢子形成后，通过离心除去重铬酸盐溶液，用10% chlorox (次氯酸钠溶液)处理卵囊10分钟。将处理过的卵囊重悬浮于水中，然后加入福尔 马林至0.05%的浓度。将悬浮液贮藏在4°C下。混合对各批卵囊溶液悬浮液的卵囊计数，将计算体积的各悬浮液与悬浮剂混合，得到 多组分疫苗，其中每一个种的卵囊以期望的比例存在。将疫苗装入最终的容器内并且于4°C 下贮藏。佐剂本发明的一些疫苗组合物可包括药学上可接受的佐剂。本发明的佐剂可获自 许多来源(来自天然来源、重组来源)中的任何来源和/或化学合成等。用于动物接 种的合适的疫苗包括但不限于佐剂65(包含花生油、二缩甘露醇一油酸酯和单硬脂酸 铝)；氟式完全或不完全佐剂；矿物凝胶(mineral gel)、铝化合物例如氢氧化铝、磷酸铝 和白矾；表面活性剂例如十六烷基胺、十八烷基胺、溶血卵磷脂、二甲基双十八烷基溴化 铵(dimethyldioctadecylammonium bromide)、N，N-双十八烷基-N'，N' _双0-羟甲 基)丙二胺、甲氧基十六烷基甘油和复合多元醇(pluronic polyol)；聚阴离子例如吡喃 (pyran)、硫酸葡聚糖、poly IC、聚丙烯酸；肽例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和促吞噬肽 (tuftsin)；和油乳剂。关于佐剂的信息公开于例如由P. Tijssen(Practice and Theory of Enzyme immunoassays,第 3 版，Elsevier, Hew York, (1987)提供的系列中。其他潜在的佐剂包括但不限于可代谢的和非可代谢的油、嵌段聚合物、 ISCOM' s (免疫刺激复合物)、维生素和矿物质(包括但不限于维生素E、维生素A、硒和 维生素B12)、Quil A(皂苷)、丙烯酸与聚链烯基醚或二乙烯基二醇交联的聚合物(其以商 标号CARB0P0L 销售例如CARB0P0L 941)，和水乳剂中均勻分散的微米级油滴(例如 以商标Emu 1 s i gen 销售)。有时被特别地提及为免疫刺激剂的佐剂的另外实例包括细菌和真菌细胞壁成分 (例如脂多糖、脂蛋白、糖蛋白、胞壁酰肽、β -1,3/1,6-葡聚糖)，来源于植物的各种复杂碳 水化合物(例如聚糖、醋孟南(acemarman))，来源于动物的各种蛋白质和肽(例如激素、细 胞因子、共刺激因子)和来源于病毒和其他来源的新型核酸(例如双链RNA、CpG)。此外， 上述物质的任何数目的组合可提供佐剂效果，从而可构成本发明的佐剂。本发明的疫苗可容易地通过任何途径施用，包括经口(例如通过滴眼、鼻内、于饲 料中、于水中或通过喷雾)、卵内、局部或通过注射(例如静脉内、皮下、肌内、眶内、眼内、真 皮内和/或腹膜内)接种。本领域技术人员将认识到，优选针对每一种类型的受体动物和 施用途径适当地配制疫苗组合物。虽然本发明的疫苗以艾美尔球虫为例进行说明，但本发明的疫苗也可用密切相关 的属(分别为等孢球虫属、囊等孢球虫属和隐孢子虫属)的未减毒和减毒和/或早熟种和 /或种的株系来构建。实施例1
包含减毒和非减毒巨型艾美尔球虫株的疫苗巨型艾美尔球虫的株系巨型艾美尔球虫MFP 具有大约96小时的潜隐期(与亲株的121小时潜隐期相比 较有长达25小时的缩短)。收获时间可在104至110小时之间，例如108至110小时之间 0.5至4.58天)。配子体在感染后大约72小时或更早时间出现。其中裂殖体的平均大小 和裂殖子的平均数量大体上与亲株的相似。巨型艾美尔球虫球虫疫苗(Coccivac)具有大约121小时的潜隐期，并且可在144 与192小时之间收获产生的卵囊。疫苗制剂如上所述收获卵囊，然后让其生成孢子。选择已知滴度的孢子化卵囊产 品批次以提供每体积期望数量的孢子化卵囊。通过将卵囊的悬浮液转移至无菌容器中，然 后向该容器中定量加入2. 5%重铬酸钾溶液来完成疫苗的制备。将疫苗无菌地分配入容器， 然后将其密封。应理解本发明不限于本文中公开的特定离心、处理步骤和材料，因为此类离心、过 程步骤和材料可在一定程度上变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述一些特定的 实施方案，并且无意进行限定，因为本发明的范围将只由所附权利要求和其等价物来限定。1权利要求
1.包含球虫科(Coccidia)之属的种的第一株系和所述种的第二株系的疫苗组合物； 其中第一株系和第二株系具有不同步的潜隐期。
2.权利要求1的疫苗，其中所述属选自等孢球虫属(Isospora)、囊等孢球虫属 (Cystoisospora)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)禾口艾美尔球虫属(Eimeria)0
3.权利要求2的疫苗，其中所述属是艾美尔球虫属。
4.权利要求3的疫苗，其中所述第一株系是非减毒的艾美尔球虫株，并且所述第二株 系是早熟的艾美尔球虫株。
5.权利要求4的疫苗，其中所述早熟的艾美尔球虫株是减毒的艾美尔球虫株。
6.权利要求4的疫苗，其中包含非减毒的艾美尔球虫卵囊和早熟的艾美尔球虫卵囊。
7.权利要求6的疫苗，其中非减毒的艾美尔球虫卵囊的数量是大约10至大约1000个。
8.权利要求6的疫苗，其中早熟的艾美尔球虫卵囊的数量是大约100至大约10，000个。
9.权利要求8的疫苗，其中非减毒的艾美尔球虫卵囊的数量是大约10至大约1000个。
10.权利要求6的疫苗，其还包含非减毒的艾美尔球虫裂殖子和子孢子，以及早熟的艾 美尔球虫裂殖子和子孢子。
11.权利要求4的疫苗，其中所述艾美尔球虫属的种选自柔嫩艾美尔球虫 (E. tenelta)、堆型艾美尔球虫(E. acervulina)、巨型艾美尔球虫(E. maxima)、毒害艾美尔 球虫(E.necatrix)、和缓艾美尔球虫(E. mitis)、早熟艾美尔球虫(E. praecox)、变位艾美 尔球虫(E. mivati)和布氏艾美尔球虫(E. brunetti)。
12.权利要求11的疫苗，其中所述艾美尔球虫的种是巨型艾美尔球虫。
13.权利要求12的疫苗，其还包含选自柔嫩艾美尔球虫、堆型艾美尔球虫、毒害艾美尔 球虫、和缓艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫、变位艾美尔球虫和布氏艾美尔球虫中的艾美尔球 虫属一个或多个另外的种。
14.权利要求3的疫苗，其还包含选自等孢球虫属、囊等孢球虫属和隐孢子虫属的球虫 属中一个或多个另外的株系。
15.权利要求14的疫苗，其中所述球虫科的属是隐孢子虫属，并且所述隐孢子虫属的 一个或多个另外的株系包括隐孢子虫属之种的非减毒株和该隐孢子虫属之种的早熟株。
16.权利要求4的疫苗，其中所述艾美尔球虫属的种选自珠鸡和缓艾美尔 球虫(E. meleagrimitis)、腺样艾美尔球虫(E. adenoeides)、孔雀艾美尔球虫 (E. gallopavonis)、分散艾美尔球虫(E. dispersa)、珠鸡艾美尔球虫(E. meleagridis)、无 毒艾美尔球虫(E. innocua)和亚圆艾美尔球虫(E. subrotunda)。
17.权利要求2的疫苗，其中所述第一株系是非减毒株，并且所述第二株系是早熟株。
18.权利要求17的疫苗，其中所述属是隐孢子虫属。
19.权利要求18的疫苗，其还包含等孢球虫属之种的非减毒株和该等孢球虫属之种的早熟株。
20.免疫动物受试者以抗球虫病的方法，其包括给该动物施用免疫学有效量的权利要 求1的疫苗。
21.权利要求20的方法，其中经口施用所述疫苗。
22.权利要求21的方法，其中通过选自下述的方法来经口施用所述疫苗将该疫苗加至所述动物的饮用水中、将该疫苗加至所述动物的食物中、将该疫苗用于所述动物的眼睛 以及将该疫苗对所述动物喷雾。
23.权利要求20的方法，其中卵内施用所述疫苗。
24.权利要求20的方法，其中所述动物是家禽。
25.权利要求対的方法，其中所述家禽选自鸡、火鸡、鸭和猎鸟。
26.权利要求25的方法，其中所述家禽是鸡。
全文摘要
本发明公开了提供免受球虫病侵害的保护作用的疫苗以及制造疫苗和单独地或与其他保护剂组合地施用疫苗的方法。
文档编号A61K39/012GK102046197SQ200980119663
公开日2011年5月4日 申请日期2009年5月27日 优先权日2008年5月29日
发明者C·T·布洛萨德, J·S·施拉德, M·朗 申请人:英特威国际有限公司