专利名称：用于制备旨在预防球虫病的疫苗组合物的佐剂的制作方法
用于制备旨在预防球虫病的疫苗组合物的佐剂本发明涉及用于制备旨在预防家禽中球虫病的疫苗组合物的新佐剂、包含所述佐剂的疫苗组合物，以及特定矿物油用于生产所述佐剂的用途。球虫病是家禽中常见的寄生虫疾病。家禽是驯养的鸟类，通常属于鹑鸡类或蹼足类鸟类，由于其肉或蛋，在传统农场中或者由工厂饲养场饲养。表述家禽应理解意为鸡、火鸡、鹅、鸭、珍珠鸡、鸽、鹌鹑、雉鸡、鸵鸟。病原(或者疾病的载体)是称为球虫(coccidium)的胞内原生动物寄生虫，其主要属于艾美虫属(Eimeria)。每一鸟类物种都存在几种类型的球虫 鸡球虫堆形艾美虫(E. acervulina)、尼氏艾美虫(E. necatrix)、巨型艾美虫(E. maxima)、波氏艾美虫(E. brunetti)、禽艾美虫(E. tenella)、和缓艾美虫(E. mitis)、塞前艾美虫(E. praecox)。火鸡球虫火鸡艾美虫(E. meleagrimitis)、腺样艾美虫(E. adenoeides)、散布艾美虫(E. dispersa)、孑L雀艾美虫(E. gallopavonis)。鹅球虫树艾美虫(E. truncata)(其还可以影响麝香鸭和天鹅)、鹅艾美虫(E. anseris)。鸭球虫恶性蒂泽虫(Tyzzeria perniciosa)、E. mulardi。该疾病特别影响番鸭。珍珠鸡球虫E. numidia、E. grenieri (最常见但致病性较低)。鴻球虫唇艾美虫(E. labbeana)。基于以下解决方法预防球虫病a)化学预防方法该方法使用抗生素类化学化合物并具有以下缺点-在用这些抗生素处理的动物中产生变态反应的风险，特别地因为“残留物”或者这些抗生素中不期望的副产物的存在；-在经处理的物种中对抗生素产生抗性的风险；-受限制性规则的控制；-损害了市售家禽肉类的外观，具有不再具有品质标签所宣称的在“天然条件”下饲养的益处的风险。b)涉及“活”疫苗的接种方法通过在实验室中繁殖病原体直到其自然地或者通过突变人工地丢失其致病特征，来制备获自减毒的活病原体的疫苗。因此，获得的株系不能完全产生其以前引起的疾病。然而，这些株系保留了其抗原，以及其诱导免疫应答的能力。施用给动物后，接种疫苗的这种模式使得其可以定居在消化道并避免具有致病因子的株系的植入。接种疫苗的这种模式具有以下缺点
-可能回复毒力；-需要实施可能的病原细菌的大规模培养；-通过该方法接种疫苗的动物可能排泄，因此构成了环境中可能的致病源并因此可能播散这些病原体。因此，后一缺点构成了为什么在户外饲养家禽的情况下，其对于针对球虫病的免疫接种并不是优选的原因之一，所述球虫病为寄生虫病并因此容易通过播散传播。抗球虫疫苗是兽药。因此，可以对它们进行应用于兽药的立法，兽药本身取决于对药物的立法。在法国授权了三种抗球虫疫苗它们是由“早期”株系组成的活疫苗，其通过针对在田间发现的物种的免疫原性和保护性进行减毒。 这三种疫苗仅可用于鸡类物种(原鸡(Gallus gallus))，因为它们仅含有能寄生该鸟类物种的物种，与球虫的不同物种不存在交叉免疫。c)用非活体的或“灭活的”抗原免疫接种的常规方法现存疫苗的效力并不令人满意，因为在寄生虫疾病，例如尤其是球虫病的特定情况下，免疫应答的细胞组分的水平并没有高到足以诱导有效的保护。已经描述了许多编码艾美虫属抗原的cDNA，并且其中一些正在进行免疫试验。抗性的产生还取决于遗传背景和施用的模式(以及取决于佐剂)。一些抗原已经显示出部分保护作用。研究涉及为球虫的几种物种所共有的抗原例如与单克隆抗体反应的GX3262抗原，其识别鸡球虫的几种物种所共有的子孢子抗原，诱导部分保护作用。因此，存在改进这些灭活的疫苗组合物的需求。灭活疫苗或含有经纯化的抗原的疫苗的研发越来越重要，因为其可以在接种疫苗之前和之后，尽可能地在接种疫苗的受试者中避免不期望的副作用。然而，以其免疫原性为代价，实现了抗原质量的改进。为此，将它们与佐剂组合，使其可以在接种疫苗的受试者中增加免疫应答。这些佐剂在本质上是不同的。它们可以例如由脂质体、包含至少一种油相和至少一种水相的乳剂组成、由称为弗氏佐剂类型组成、更常见地由水不溶性无机盐组成。在用作为疫苗组合物的佐剂的无机盐中，应当提及的是例如氢氧化铝、硝酸铈、硫酸锌、胶态氢氧化铁或氯化1丐。氢氧化招是最常用的佐剂。特别地，在Rajesh K. Gupta等人“Adjuvants,balance between toxicity and adjuvanticity”，Vaccine,第 11 卷，第 3 期，1993 年，第993-306页的文章中描述了用作为疫苗组合物的佐剂的这些无机盐。上述佐剂具有效力低下的缺点。此外，已知氢氧化铝仅可以有效地诱导体液免疫，并不会诱导细胞免疫。此外，它们可能对受处理的受试者诱导一定毒性。更具体而言，当将这些疫苗组合物注射到待接种疫苗的受试者中时,在注射部位可能观察到病变和其他局部反应例如肉芽肿的形成。由二价或三价金属盐组成的或者由拟交感神经化合物组成的其他佐剂分别描述于在公开号W096/32964、W098/17311和W098/15288下公开的国际专利申请中。乳剂是由两种不混溶流体的系统组成的稳定混合物，其中一种被分成另一种中的小滴。因此，乳剂包含油、水相和表面活性剂，所述表面活性剂具有将两相中的其中一相分散在另一相中，并且获得在宏观上均匀且稳定的混合物的作用。在疫苗制剂中，通常将它们用作为免疫佐剂。将矿物油用作为疫苗佐剂已经已知多年(Freund 1956，Herbert 1967)。用作为疫苗佐剂的矿物油是液态烃，其通过蒸馏石油并通过随后的处理步骤，例如脱硫、脱浙青、提取芳族化合物、提取蜡和其他最终处理步骤获得。油的质量对免疫应答的影响的研究才刚刚开始，并且还不完善。事实上，所使用的原油的地理来源以及用于其制备的方法(化学方法和设备)极大地影响了矿物油的组合物。对多种级分实施的研究旨在评价其对工作人员、使用者的毒性，而并不是评价其在动物或人类健康中的用途。基于宏观特征(粘度、熔点)，用现存的工业级矿物油或者纯的实验室级化学产品实施这些矿物油的组成的优化，所述现存的工业级矿物油或者纯的实验室级化学产品与可接受的原材料的等级的定义或表征并不对应。因此，即使对由参数定义的工业级矿物油实施了大量的研究，但所述参数并不反映其所导致的生物学性质，以及在用于疫苗期间，取决于矿物油的批次的来源，造成行为的改变。尽管这些批次与宏观分析要求和说明一致，并具有相同的商标名，但具有足够不同的组成，以致不给予疫苗相同的特性。此外，获自矿物油的乳剂的粘度，在没有盖伦优化的情况下，会导致结果解释的偏倚。评价了直链和环化链之间分布的影响，以便评估通过注射使用矿物油期间可能的毒性，推测环化形式的致畸作用。然后，将毒性的标准定义为来自不饱和形式的毒性，所述 不饱和形式在当前方法中已经通过大量的氢化作用完全除去。还没有实施研究以旨在评价线性或环化型的构成比率对免疫应答的质量的影响。矿物油作为佐剂已经使用了几十年，并用于旨在增加疫苗的免疫应答效力的佐剂的制备。事实上，在矿物油包水(W/0)型的乳剂中预先乳化抗原，并然后通过胃肠外途径施用，引发更强烈且持久的免疫应答(并因此提供针对病原体的保护)。用于制备佐剂的矿物油的性质对免疫应答的强度，以及与疫苗的注射有关的继发反应(局部和全身反应)具有强烈的影响。存在两种类型的免疫应答-体液免疫应答其是这样的反应，当具有特定受体的B淋巴细胞受抗原刺激时，其分化成开始分泌抗体的浆细胞的克隆。它们对于在血液和淋巴中循环的病原体是有效的。此外，B淋巴细胞的选择性活化给予了机体具有延长寿命的记忆细胞，所述记忆细胞介入二次免疫应答，和-细胞免疫应答体液免疫反应帮助防御网络识别和破坏游离的病原体，但细胞介导的反应与已经进入细胞的病原体战斗。细胞介导的免疫的主要行动者是T淋巴细胞。T淋巴细胞仅与暴露在机体细胞表面的抗原决定簇反应。T淋巴细胞通过其受体(嵌在其质膜中的表面蛋白质中)识别这些决定簇。T淋巴细胞的受体识别与机体的MHC的一个糖蛋白结合的抗原。除了其在体液应答中的作用外，辅助T淋巴细胞还可以活化其他类型的T淋巴细胞，以引发针对抗原的细胞介导的反应。细胞毒性T淋巴细胞是唯一杀死其他细胞(被胞内病原体感染的细胞)的细胞。熟知的是增加免疫应答(一般通过测定I型或IGGl型免疫球蛋白来测量)的体液组分的油性佐剂，而很难获得细胞型应答(通过IGG2间接测量)。已知给予最强的免疫应答的W/0乳剂还诱导细胞型组分，但以例如比一些可溶性分子(皂苷或阳离子表面活性剂型)更低的比例诱导，认为所述可溶性分子使应答朝向细胞机制。使用一般市售矿物油的具有含水连续相的乳剂是细胞应答的非常差的促进剂。事实上，由疫苗产生的应答的类型受抗原的结构影响，另外，还受抗原通过佐剂递呈给免疫系统的方式的影响。佐剂对免疫应答具有不同的作用，因为它们可以在更长或者更短的时间期间诱导免疫应答，主要特征为细胞型或体液型。细胞介导的免疫是重要的，或者甚至在一些时候对于防护胞内细菌、病毒和大多数寄生虫是基本的。其作为体液应答的补充，参与了大多数疫苗保护机制。例如，可以在给相关受试者接种疫苗后的不同时间，通过比较将包含佐剂的疫苗肠胃外施用给所述受试者后测量的IGG1/IGG2比率，针对包含佐剂的疫苗组合物，分类佐剂诱导细胞型免疫应答的能力。该比率越高，佐剂就越将疫苗组合物的免疫应答朝向体液组分。IGG1/IGG2比率的值接近I将被认为疫苗组合物在两种组分之间具有平衡的免疫应答的标志。IGG1/IGG2比率的值低于I将是疫苗组合物的免疫应答主要为细胞型的特征。 本发明的一个目的是为疫苗组合物的制备提供有用的佐剂，其旨在改进免疫应答的细胞组分，同时维持高水平的体液组分。因此，存在获得具有平衡的免疫应答或者甚至主要为细胞免疫应答的疫苗佐剂的需求。此外，用本发明的主题佐剂制备的疫苗应当表现出好的安全性。为此，本发明的主题是疫苗佐剂，其包含100%其质量的-10%至95%，和优选地20%至90%的矿物油，所述矿物油包含-0. 05质量％至10质量％的具有少于16个碳原子的烃链；-0. 05质量％至5质量％的具有多于28个碳原子的烃链；-和2.5至3之间的P/N比率，其对应于按石蜡型碳链的质量计的量与按环烷型碳链的质量计的量之间的比率。用于产生旨在预防球虫病的疫苗组合物。此外，本发明的实施方案包含一个或一个以上的以下特征如上所定义的佐剂，用于产生旨在用于动物，特别是家禽中球虫病的预防的疫苗组合物。如上所定义的佐剂，其特征在于所述P/N比率在2. 5至3之间，优选地在2. 8至2. 9之间。如上所定义的佐剂，其特征在于其另外包含-5%至90%的至少一种表面活性剂。优选地5%至50%。根据另一方面，本发明的主题是旨在预防球虫病的疫苗，其包含如上所定义的佐剂和至少一种抗原。此外，本发明的实施方案包含一种或一种以上的以下特征-如上所定义的疫苗，旨在用于动物，特别是家禽中球虫病的预防，-如上所定义的疫苗,其特征在于球虫选自艾美虫属、等孢子虫属(Isospora)、弓形体属(Toxoplasma)、贝斯虫属(Besnoitia)、新孢子虫属(Neospora),优选地艾美虫属。-如上所定义的疫苗，其特征在于其为油包水(W/0)型乳剂的形式，和-如上所定义的疫苗，其特征在于抗原是包含堆形艾美虫(Eimeraacervulina)序列3-1的重组蛋白质。根据另一方面，本发明的主题是矿物油用于产生如上所定义的疫苗的用途，其特征在于所述油包含100%其质量的-0. 05至10%具有少于16个碳原子的烃链；-0. 05%至5%具有多于28个碳原子的烃链；并具有2. 5至3之间，优选地2. 8至
2.9之间的P/N比率，其对应于按石蜡型碳链的质量计的量与按环烷型碳链的质量计的量之间的比率。根据本发明的组合物还有利地含有一种或一种以上乳化表面活性剂。后者表现出亲脂性或者亲水性特性，其特征在于I至19之间的HLB (亲水性-亲脂性平衡)值。该表面活性剂可以由以下组成-烷基多糖苷或者式Ra-(O)-Zn的烷基多糖苷的混合物，其中Ra表示包含4至24个碳原子的线性的或分支的饱和脂族基，Z是糖残基，优选地葡萄糖残基，并且n在I至5之间，优选地在I. I至2之间，-皂苷，-山梨醇酐酯，例如失水山梨糖醇油酸酯、失水山梨糖醇硬脂酸酯、失水山梨糖醇棕榈酸酯、失水山梨糖醇月桂酸酯；-一缩甘露醇酯，例如一缩甘露醇油酸酯、一缩甘露醇硬脂酸酯、一缩甘露醇软脂酸酯、一缩甘露醇月桂酸酯；-含5mol至20mol之间环氧乙烷的聚氧乙烯化山梨醇酐酯，例如含20mol环氧乙烷的乙氧基化失水山梨糖醇油酸酯；-含5mol至20mol之间环氧乙烷的聚氧乙烯化一缩甘露醇酯，例如含20mol环氧乙烷的乙氧基化一缩甘露醇油酸酯；-卵磷脂；-聚氧乙烯化烷醇，例如那些在名称BRIJ和更具体地BRIJ21和BRIJ 221下，由UNIQEMA公司销售的聚氧乙烯化烷醇；-包含聚氧乙烯化和聚氧丙烯化嵌段的表面活性剂聚合物，例如那些在名称PLUR0NICS下，由BASF公司销售的表面活性剂聚合物；-聚乙二醇或聚乙二醇聚羟基硬脂酸酯，例如由公司UNIQEMA销售的称为HYPERMER B246、ARLACEL P135 的产品。表述抗原应理解为具有免疫原性特性的任一分子，其能诱导特异性免疫应答。这些抗原可以是灭活的病原体，例如灭活的细菌、提取自病原体的分子、通过微生物的基因重组产生的分子。矿物油获自石油来源的产物的蒸馏，然后大量氢化。它们由饱和烷烃家族的化学分子组成。对于这种类型的分子，碳原子的数目一般多于9并少于30，从而在25°C赋予液体外观。也使用表述液体石蜡。固体石蜡由n大于30，直到多达50的烷烃家族的化学分子组成，并从而在25°C赋予固体外观。液体石蜡，或者矿物油是透明无气味的液体，其动态粘度为2毫帕.秒(mPa. s)至I毫帕.秒。矿物油的动态粘度直接与构成所述矿物油的烷烃 的碳链的平均长度相关。具有最长烃链的烷烃是造成最高动态粘度的原因。涉及的分子可以为分枝的线性或烃线性链(在名称“石蜡(P)”或环化的(环烷N)下分类)形式，但仍然是饱和的(没有双键，其在氢化处理期间消除)。粘度、熔点和沸点直接与烃链所含有的碳的数目相关。因此，石蜡油的特征在于其蒸馏范围、其动态粘度、其碳原子的平均数目，以及在于其线性和分支分子之间的P/N比率和环化分子的数量(根据DIN51378方法测定)。应当理解，可以通过混合两种不同的馏分，人为地修饰动态粘度标准。
实施例I)第一部分以下实施例可以说明根据本发明的佐剂组合物的特性。在该工作中，对多种较好表征的油的佐剂性质的研究使得可以鉴定新的原始组合物，所述新的原始组合物的特征在于通过层析建立的组成的限制。在第一个实例中，用以油包水(W/0)乳剂形式提供的制剂在实验性疫苗组合物上实施的研究使得可能对于在小鼠中良好耐受的制剂，为获得其两种组分之间的平衡免疫应 答以及具有主要为细胞组分的免疫应答建立最佳条件。实验性试验的第二阶段在其他类型的制剂和不同的动物上实施，其可以说明，为本发明主题的佐剂组合物可以定量和定性的提供最佳免疫应答。在以下实例中，通过以下特征选择矿物油 以百分比表述的短懼分(short fraction)(SF),相当于具有碳原子C数〈16的实体的比例。 以百分比表述的重懼分(heavy fraction) (HF),相当于具有碳原子C数>28的实体的比例。 分子分布(MD)(表述为碳原子C的数目)，计算为通过将同化到18个碳原子的馏分C16到C20、同化到22个碳原子的20个碳原子到24个碳原子的馏分和同化到26个碳原子的24个碳原子到C28馏分的表面系数进行分配所得到的C16到C28之间曲线的重心。
P/N比率(根据标准方法DIN 51378获得)。测试的多种油列表于表I中。
油编号 ~SF (〈C16)MD~ HF OC28)~P/N
~I5X720 6 373I. 78
2Ti2h5 l~l1.86
3I~2205 L51.86
~ Tl2L6 Tl1.86
547 718 4 051.86
6032fL2 9 62.03 ~ 30 1873 06 2. 19
权利要求
1.疫苗佐剂，其包含100%其质量的 -10%至95%的矿物油，所述矿物油包含 -0. 05质量％至10质量％的具有少于16个碳原子的烃链； -0. 05质量％至5质量％的具有多于28个碳原子的烃链； -和2. 5至3之间的P/N比率，其对应于按石蜡型烃链的质量计的量与按环烷型烃链的质量计的量之间的比率， 所述佐剂用于生产旨在预防球虫病的疫苗组合物。
2.权利要求I的佐剂，用于生产旨在预防动物，特别是家禽中球虫病的疫苗组合物。
3.权利要求I和2之一的佐剂，其特征在于所述P/N比率在2.8至2. 9之间。
4.权利要求I至3之一的佐剂，其特征在于其另外包含 -5%至90%的至少一种表面活性剂。
5.旨在预防球虫病的疫苗，其包含权利要求I至4之一所定义的佐剂，以及至少一种抗原。
6.权利要求5的疫苗，其旨在用于动物，特别是家禽中球虫病的预防。
7.权利要求5和6之一的疫苗，其特征在于所述球虫选自艾美虫属(Eimeria)、等孢子虫属(Isospora)、弓形体属(Toxoplasma)、贝斯虫属(Besnoitia)、新孢子虫属(Neospora),优选地艾美虫属。
8.权利要求7的疫苗，其特征在于其为油包水(W/0)型乳剂的形式。
9.权利要求5至8之一的疫苗，其特征在于所述抗原是含有堆形艾美虫(EimeraAcervulina)序列3_1的重组蛋白质。
10.矿物油用于生产权利要求5至9之一所定义的疫苗的用途，其特征在于所述油包含.100%其质量的 -0. 05至10%的具有少于16个碳原子的烃链； -0. 05%至5%的具有多于28个碳原子的烃链； 并具有2. 5至3之间的P/N比率，其对应于按石蜡型碳链的质量计的量与按环烷型碳链的质量计的量之间的比率。
全文摘要
本发明涉及疫苗佐剂，其基于100%其质量包含10%至95%的矿物油，所述矿物油包含0.05质量%至10质量%的具有少于16个碳原子的烃链；0.05质量%至5质量%的具有多于28个碳原子的烃链。此外，所述佐剂具有2.5至3之间的P/N比率，其对应于按石蜡型碳链的质量计的量与按环烷型碳链的质量计的量之间的比率，所述佐剂旨在用于生产预防球虫病的疫苗组合物。
文档编号A61K39/39GK102740883SQ201180007950
公开日2012年10月17日 申请日期2011年1月14日 优先权日2010年2月1日
发明者F·贝特朗, L·迪皮伊, S·德维尔 申请人:化工产品开发公司Seppic