在皮肤伤口愈合中使用干细胞的组合物和方法

专利名称：在皮肤伤口愈合中使用干细胞的组合物和方法
在皮肤伤口愈合中使用干细胞的组合物和方法相关申请本申请要求于2008年3月27日提交的美国临时专利申请序列号61/039，941的 优先权的权益，该申请的全部内容通过引用方式并入本文。发明领域本申请与制备和使用干细胞用于伤口愈合应用的组合物和方法相关。背景慢性伤口仍是难以应对的挑战。尽管近期重组生长因子和生物工程化皮肤方面取 得一定突破，但还有高达50%的慢性伤口用一年多的时间仍保持对治疗的抗性。纤维蛋白封闭剂是一种外科手术式“胶水”，由人体的凝血蛋白制成，通常用于 在手术过程中控制出血。纤维蛋白封闭剂已被用于增强止血效果、封合组织、协助靶向给 药，以及伤口治疗。见如，美国专利公开号2008/0181879、2008/0199513、2004/0229333和 2006/0M0555，以上文献以引用方式并入本文。虽然，过去几年，我们在治疗难愈性伤口方 面已取得一定进步，但先进的治疗手段对于相当一部分(高达50慢性伤口，特别是持续 超过一年的伤口，仍不起作用。因此，仍需刺激急性和慢性伤口的愈合，达到标准护理措施 或最近研发创新方法目前不能达到的水平。概要本发明提供了使用纤维蛋白封闭剂及其给药系统的组合物和方法，其中纤维蛋白 封闭剂包括干/祖细胞。根据某些实施方式，本发明提供了在伤口患处局部施用纤维蛋白 封闭剂的方法，其中，纤维蛋白封闭剂由纤维蛋白原复合体成分、凝血酶成分及细胞成分的 混合物制成。根据某些实施方式，细胞成分包含一种或更多种的干/祖细胞(如间充质干 细胞或外周血干细胞)和/或遗传修饰干细胞。根据某些实施方式，细胞成分可能包含干 /祖细胞的混合物。根据优选实施方式，纤维蛋白封闭剂包含至少1.5-2.0 X IO6个干/祖 细胞/每平方厘米。根据某些实施方式，纤维蛋白封闭剂通过将纤维蛋白原复合体(FC)成分、凝血酶 成分和细胞成分混合制成。FC/凝血酶的比率介于每25单位/毫升凝血酶2至10毫克/ 毫升纤维蛋白原之间。FC/凝血酶的比率优选为约每25单位/毫升凝血酶约5毫克/毫升 纤维蛋白原。根据某些实施方式，纤维蛋白封闭剂通过将纤维蛋白原复合体(FC)成分和凝血 酶成分混合制成。在另一实施方式中，可在混合FC成分与凝血酶成分前，向FC成分中添加 细胞成分。根据某些实施方式，可向凝血酶成分中添加细胞成分。根据某些实施方式，可在 允许成分形成纤维蛋白凝胶前，向FC与凝血酶的混合物中添加细胞成分。根据优选实施方式，蛋白酶抑制剂被排除在本发明的纤维蛋白封闭剂组合物之 外。本发明还提供了多种方法，用于浸渍或接种纤维蛋白封闭剂，以形成用于治疗急 慢性伤口的治疗制剂。这些方法包括为患者施用含有细胞成分的纤维蛋白封闭剂。根据某5些实施方式，纤维蛋白封闭剂为聚合凝胶或喷雾剂形态。在伤口愈合过程中，可按需要在伤 口患处施用本发明的纤维蛋白封闭剂一次、两次、三次、四次、五次或以上等等。根据某些实施方式，本发明提供了治疗急慢性伤口的方法。一般而言，患者的伤口 都可受益于本文所述组合物和方法，这对于该领域的普通技术人员是清楚的。根据优选实 施方式，伤口是一种慢性皮肤伤口。在某实施方式中，我们按该领域的公知方法为患者施用纤维蛋白封闭剂，如注射、 喷涂、内窥镜施用或预制凝胶，以及该领域普通技术人员熟知的其它方法。根据优选实施方式，本发明提供了一种纤维蛋白封闭剂，该纤维蛋白封闭剂含有 纤维蛋白原复合体(FC)成分、凝血酶成分和细胞成分，其中，用于形成凝胶的纤维蛋白原 浓度介于约2至约5毫克/毫升之间，细胞成分中含有一种或更多种干/祖细胞，纤维蛋白 封闭剂中含有至少1. 5-2. 0 X IO6个干/祖细胞/每平方厘米。根据优选实施方式，本发明提供了一种使用纤维蛋白封闭剂的方法，包括a)将 干/祖细胞与纤维蛋白封闭剂组合，来形成伤口封闭剂，该纤维蛋白封闭剂含有钙凝血酶 和纤维蛋白原，其中，钙凝血酶的浓度约为25单位/毫升，纤维蛋白原的浓度约为2至5毫 克/毫升，干/祖细胞的最终浓度至少约为1.5至2.0 X IO6个干/祖细胞/平方厘米；b) 将纤维蛋白封闭剂施用到皮肤伤口上，其中，所施用的纤维蛋白封闭剂为聚合凝胶或喷雾 剂的形态。根据优选实施方式，本发明提供了一种改善伤口患处瘢痕形成的方法，包括a) 将干/祖细胞与纤维蛋白封闭剂组合，来形成伤口封闭剂，该纤维蛋白封闭剂含有钙凝血 酶和纤维蛋白原，其中，钙凝血酶的浓度约为25单位/毫升，纤维蛋白原的浓度约为2至5 毫克/毫升，干/祖细胞的最终浓度至少约为1. 5至2. 0 X IO6个干/祖细胞/平方厘米； b)将纤维蛋白封闭剂施用到伤口患处，其中，所施用的纤维蛋白封闭剂为聚合凝胶或喷雾 剂的形态。根据优选实施方式，本发明提供了一种治疗硬皮病的方法，包括a)将干/祖细胞 与纤维蛋白封闭剂组合，来形成伤口封闭剂，该纤维蛋白封闭剂含有钙凝血酶和纤维蛋白 原，其中，钙凝血酶的浓度约为25单位/毫升，纤维蛋白原的浓度约为2至5毫克/毫升，干 /祖细胞的最终浓度至少约为1.5至2.0 X IO6个干/祖细胞/平方厘米；b)将纤维蛋白 封闭剂施用到硬皮病溃疡处，其中，所施用的纤维蛋白封闭剂为聚合凝胶或喷雾剂的形态。根据优选实施方式，本发明提供了一种制备纤维蛋白封闭剂的方法，包括提供纤 维蛋白原复合体(FC)成分、钙凝血酶成分和细胞成分；向FC成分中添加细胞成分，再将FC 成分与钙凝血酶成分混合；向组合的FC/细胞成分的混合物中添加钙凝血酶成分，其中纤 维蛋白原的浓度约为2至5毫克/毫升，干/祖细胞的最终浓度至少约为1.5至2.0 X IO6 个干/祖细胞/平方厘米。根据优选实施方式，干/祖细胞可能选自以下细胞骨髓衍生细胞、造血干细胞、 间充质干细胞、外周血干细胞及其混合物和组合。根据优选实施方式，干/祖细胞是极小 的胚胎样(VSEL)干细胞。根据优选实施方式，VSEL干细胞为0)3471^/0)45-或^^-17 lin7CD45"0根据优选实施方式，钙凝血酶的浓度约为25单位/毫升。根据优选实施方式，在三周的时间内至少在伤口患处施用两次纤维蛋白封闭剂。根据优选实施方式，施用于伤口患处的纤维蛋白封闭剂为CO2Psi小于5psi的喷雾剂形态。 根据优选实施方式，纤维蛋白封闭剂局部施用于伤口患处。根据优选实施方式，皮肤替代物 被施用于伤口患处。本发明还提供了用于制备纤维蛋白封闭剂的试剂盒，其包括a)含有纤维蛋白原 复合体成分的第一个小瓶或存储容器，其中该小瓶任选包含细胞成分；及b)含有凝血酶成 分的第二个小瓶或存储容器，如果第一个小瓶或存储容器未包括细胞成分，则该试剂盒任 选含有具有细胞成分的第三个小瓶或存储容器，所述试剂盒还包含其使用说明。试剂盒还 可能包括用于在体外或体内使用或施用纤维蛋白封闭剂的仪器。试剂盒还包含表征细胞成 分的工具。该工具包括用于识别干/祖细胞标记的存在的试剂。用于识别干/祖细胞标记 的存在的试剂包括但不限于抗体。本发明还提供了用于制备纤维蛋白封闭剂的试剂盒，其包括a)含有纤维蛋白原 复合体成分的第一个小瓶或存储容器；及b)含有凝血酶成分的第二个小瓶或存储容器，其 中该小瓶任选包含细胞成分，如果所述第二个小瓶或存储容器未包括细胞成分，则该试剂 盒任选包含含有细胞成分的第三个小瓶或存储容器，所述试剂盒还包含其使用说明。试剂 盒还可能包括用于在体外或体内使用或施用纤维蛋白封闭剂的仪器。试剂盒还可能包含表 征细胞成分的工具。本发明还提供了用于制备纤维蛋白封闭剂的试剂盒，其包括a)含有纤维蛋白原 复合体成分的第一个小瓶或存储容器，其中，纤维蛋白原的浓度约为2至5毫克/毫升；及 b)含有凝血酶成分的第二个小瓶或存储容器，该试剂盒还含有其使用说明。根据某些实施 方式，本发明的试剂盒提供的凝血酶的浓度约为25单位/毫升。根据某些实施方式，本发 明的试剂盒提供，第一个小瓶或存储容器任选包含细胞成分。根据某些实施方式，如所述第 一个小瓶或存储容器未包含细胞成分，本发明的试剂盒提供含有细胞成分的任选的第三个 小瓶或存储容器。根据某些实施方式，本发明的试剂盒还可能包括用于在体外或体内使用 或施用纤维蛋白封闭剂的仪器。根据某些实施方式，本发明的试剂盒还可能包含表征细胞 成分的试剂。下文的详细叙述中将清楚说明本发明的其它特点和优势。但请注意，虽然下文的 详细叙述和具体例子表明本发明的具体实施方式
，但仅以例示方式给出，因为该领域的技 术人员通过详细叙述即可清楚了解在本发明的精神和范围内的各种变动和修改。本发明的方法和组合物进一步包括用于对干细胞和/或祖细胞(如造血干细胞、 多能间充质干细胞(MSC)或外周血干细胞(PBSC))进行细胞培养和表征的方法和组合物。 应用包括但不限于诱导的多潜能干细胞、胚胎干细胞、极小的胚胎样干细胞和之前等分和/ 或冷冻保存的细胞。附图简介专利或申请文件中含有至少一张彩色图片。根据请求和支付必要费用，专利局将 提供含有彩色图片的专利或专利申请公布的副本。

图1A-E.骨髓衍生培养细胞的外观形态及其从纤维蛋白的迁移。(A)从Ficoll分 离骨髓抽吸物接种2天后，在组织培养塑料中培养的细胞外观。可以观察到从圆形细胞到 梭形细胞的各种形态。(B)从培养的第5天开始，细胞便开始呈现梭形形态，通常是几个细胞沿着长轴相互连接。(C)在培养后期(10-12次传代)，细胞变大，并一般不再呈现梭形形 态，而是较为罕见的多边形形态。(D)在细胞于组织培养塑料中早期传代时(最多10次传 代)，我们通常可以看到极端的梭形细胞形态，伴有三维结构的岛发展。(E)作为含有骨髓 衍生细胞的纤维蛋白喷雾剂，在培养中接种梭形骨髓衍生细胞4小时后的迁移。所有附图 均放大10倍。图2A-D.用选定CD标记对培养细胞进行的免疫染色。骨髓衍生培养细胞在玻片中 生长，并用CD标记进行免疫染色。这些代表性实例证明，培养的细胞对MSC标记((A)CD^、 (B)⑶44、(C)CD90)呈阳性，对造血标记((D)⑶34)呈阴性。放大10倍。图3A-E.培养的MSC分化的功能测定。(A)骨形成的代表性结果；采用钙测定法， 对四名不同患者的培养细胞进行四次连续测试得出的结果。图中还包括阳性(已建立的 MSC细胞株)与阴性(人真皮纤维原细胞)对照。(B)使用油红0测定在培养细胞代表性 例子中脂肪滴的脂肪组织形成；红染的细胞表示脂肪负载细胞。(C)软骨培养细胞颗粒染 色阳性的代表性例子，其中使用番红0。(D)软骨的阴性对照，使用人真皮纤维原细胞。(E) 软骨的阳性对照，采用存档软骨组织。所有图片均放大10倍。图4A-D.将骨髓衍生培养的MSC施用于人体的急性伤口上。(A)用双管注射器进 行纤维蛋白聚合物喷涂，直接将细胞施用于伤口。箭头所指位置为装填凝血酶或含细胞的 纤维蛋白原溶液的各个针筒。附在注射器下喷射共用区的导管连接着C02。(B)在手术后立 即将培养细胞施用于基线伤口，按压图(A)所示双管注射器的共用柱塞，距离创面床约2厘 米。套印小图显示受试者背部的大伤口，该受试者采用坐姿。未发现所喷涂材料有溢流情 况。(C)第6周的伤口外观，图中显示创面床完全长满，并且上皮几乎已完全重新愈合。(D) 第7周伤口完全愈合，并且如图所示，第12周伤口依然保持愈合状态。愈合伤口右侧的粉 色区域是愈合的活检部位。图5A-B.人体伤口愈合率。通过纤维蛋白喷雾剂将自体骨髓衍生培养MSC施用于 人体的急慢性伤口。(A)去除皮肤癌后留下急性伤口的四名受试者的愈合轨迹。数字指四 位单个患者，数字旁边的“ + ”或“_”分别表示用含有MSC的纤维蛋白喷雾剂或单独使用纤 维蛋白喷雾剂治疗的伤口。虚线也表示单独使用纤维蛋白治疗的伤口的愈合情况。4号患 者有一个伤口用细胞治疗，两个伤口单独使用纤维蛋白治疗(_a和_b)。(B)受试者慢性伤 口的愈合轨迹，均以含有MSC的纤维蛋白喷雾剂治疗。图6.施用MSC后第8天，急性伤口的免疫染色。对福尔马林固定活检样本的连续 切片进行CD29、CD45和作为人纤维原细胞的特异性标记(纤维原细胞标记FibM)的脯氨 酰羟化酶的免疫染色。“a”、“b”和“C”分别表示放大4倍、10倍和2倍。蓝染色是由于在 活检样本顶上施用了标记蓝墨水。左边的两列显微图片代表用含有MSC的纤维蛋白治疗代 表性伤口的连续切片，右边的一列图片为单独用纤维蛋白治疗的对照伤口。就用MSC治疗 的伤口而言，对CD^和纤维原细胞标记(FibM)呈阳性的梭形细胞出现在创面床的浅层，即 施用培养细胞的部位。免疫染色细胞看起来不同于对CD45，白细胞共同抗原(LCA)，呈阳性 的。相反，如仅用纤维蛋白的一组所示，在单独用纤维蛋白治疗的创面床浅层，CM9表达细 胞和表达纤维原细胞标记(FibM)的细胞不足。仅伤口深处显现出这些标记的免疫染色，多 数可能代表内源性和更深的细胞成分。图7A-D.施用MSC后第8天，急性人体伤口的弹性纤维。左侧的图片显示两种不同的弹性纤维染色方法。沃-冯二氏染剂将弹性纤维染成黑色，用特定弹性抗体进行免疫 染色的弹性纤维呈红色。箭头所指的位置便是单个具代表性的弹性纤维。左上图(A)和左 下图(C)表示对照普通皮肤，右上图(B)和右下图(D)来自施用MSC的创面床浅层。所使 用的两种染剂，都显示新形成明确的弹性纤维。放大10倍。图8A-D.将骨髓衍生培养细胞施用于人体的慢性伤口上。(A)基线受试者踝关节 处不愈合伤口 ； (B)第三次向现已开始愈合的伤口施用含有MSC的纤维蛋白喷雾剂；(C)第 3个月，伤口几乎已完全愈合。创面床已完全长满，仅有一小块溃烂面。(D)伤口继续愈合， 极少疤痕。照片显示的第6个月创口完全闭合时的最终记录。图9.伤口愈合情况与施用的MSC数目的相互关系。图片表示通过纤维蛋白喷雾 剂施用于伤口的MSC数目与慢性伤口患者的溃疡面积在每次施用喷雾剂2-4周后的百分比 变化(n = 17个数据点)的相互关系。采用施佩尔曼等级相关进行分析；r = -0. 6389 (经 同秩校正)，95%置信区间(-0. 8606至-0. 2135) ；ρ = 0. 0058。施用量大于IxlO6个细胞 /平方厘米伤口与随后周)溃疡面积缩减至少10%高度相关(Fisher精确检验(双 侧);p = 0. 0345)。图10.在施用MSC之前和之后3周慢性伤口的免疫染色。对福尔马林固定的代表 性慢性伤口活检样本的连续切片进行CD^、CD45和作为人纤维原细胞的特异性标记(纤维 原细胞标记FibM)的脯氨酰羟化酶的免疫染色。所有图片均放大10倍。左侧和右侧的图 片分别表示单独用纤维蛋白或含MSC的纤维蛋白喷雾剂治疗伤口的情况。蓝染色是由于在 活检样本顶上施用了标记蓝墨水。图片显示，在创面床浅层(即施用培养细胞的部位)对 CD^和纤维原细胞标记呈阳性的梭形细胞。免疫染色细胞看起来不同于对CD45，白细胞共 同抗原(LCA)，呈阳性的那些。图11A-C.用MSC治疗小鼠伤口愈合的组织学和效果。㈧在施用含有同源MSC的 纤维蛋白喷雾剂后5天，小鼠代表性伤口的组织学。创面床含有大量细胞；4倍。(B)将通 过纤维蛋白喷雾剂将以红色荧光标记的MSC施用于小鼠的伤口。第5天时，细胞已迁移入 创面床的真皮成分中。显微图片显示图(A)所示部位的相邻组织切片；10倍。(C)图片显 示了用同源MSC治疗小鼠尾部伤口时的愈合结果。向db/db小鼠及其对照同窝小鼠都施用 单独的纤维蛋白或含MSC的纤维蛋白喷雾剂。每个点表示四只小鼠的平均值+SEM。图12A-E.小鼠伤口中GFP+MSC的识别。C57BL/6小鼠尾部在受伤18天后的伤口显 微图片。我们用含有GFP+同源骨髓衍生培养MSC的纤维蛋白喷雾剂治疗尾部伤口。用蔡司 Axioplan 2成像系统和Axio CAM分析冰冻切片。以FITC (510-560nm ； (A))识别出的GFP+ 血管(箭头)。以光学显微镜滤光片(C)、德克萨斯红(645/75nm ； (D))和DAPI (435-475nm ； (E))分析邻近切片。我们通过这些滤光片，获得一张合成显微图片，显示绿色荧光的特异性 (B)0放大200倍。图13.从患者自身皮肤长出的角质形成细胞片范例。图14A-D. (A)生物工程皮肤的图解范例活体双层皮肤构造(BSC) ； (B)结网过 程；(C)网状织物；和⑶将网状织物施用于伤口。图15.提供了调节教导成分及将该成分施用于伤口的流程示意图。图16A-D.图例说明用MSC(滴剂而非喷雾剂)治疗硬皮病手指溃疡(局部性缺 血)。(A)显示基线溃疡和凹状疤痕；(B)显示通过纤维蛋白施用MSC ； (C)显示溃疡和凹状疤痕轮廓；和(D)显示施用纤维蛋白/MSC封闭剂。图17.显示用MSC治疗硬皮病手指溃疡(局部性缺血)的结果，8周后愈合情况依 然良好。图18A-D.图例说明用MSC治疗并用生物工程化皮肤覆盖的硬皮病手指溃疡(局 部性缺血)(A)显示基线溃疡和凹状疤痕；(B)显示将生物工程化皮肤覆盖在MSC胶上； (C)显示递送含有MSC的纤维蛋白和生成的凝胶聚合物(治疗后会立即缓解疼痛)；(D)显 示4周后的治愈结果。伤口在8周后仍保持良好治愈状态。图19A-F.比较C57BL/6中的β _半乳糖染色将来自β _半乳糖苷酶阳性小鼠 (A)和(B)的MSC施用于在C57BL/6背景下的同源受伤小鼠(C)和(D)。蓝染色细胞显示 在18天(E)和38天(F)后，纤维蛋白递送细胞的存活率。详细内容纤维蛋白封闭剂通常由两种人类血浆衍生成分组成(a)高浓缩纤维蛋白原复合 体(FC)，其主要由纤维蛋白原、纤连蛋白和催化量的因子XIII和纤溶酶原组成；和(b)高 效力凝血酶。纤维蛋白封闭剂也可含有抑酶肽。通过凝血酶的作用，(溶解的)纤维蛋白 原首先转化为自发凝聚的纤维蛋白单体，并形成所谓纤维蛋白凝块。同时，溶液中的因子 XIII (FXIII)被钙离子存在下的凝血酶激活为因子Xllla。凝聚的纤维蛋白单体与可能存 在的任何剩余纤连蛋白交联，通过形成新的肽键，进而形成高分子量聚合物。通过该交联反 应，所形成的凝块强度得到大幅提升。见如，美国专利公布号2008/0181879，该文献通过引 用方式并入本文。通常，凝块较好的粘附于伤口和组织表面，其产生粘着和止血的效果。因 此，纤维蛋白粘合剂通常用作两成分粘合剂，其包含纤维蛋白原复合体(FC)成分和另外含 有钙离子的凝血酶成分。纤维蛋白封闭剂的市售装为TlSSEEL(Baxter)。TISSEEL由两成分 纤维蛋白生物基质组成，提供高浓缩的人类纤维蛋白原，用于封闭组织和停止弥漫性出血。 纤维蛋白封闭剂的其它市售装包括BERIPLAST (Behringwerke AG, Marburg/Lahn, FRG)和 BIOCOL(CRTS，Lille, France)。本发明的纤维蛋白封闭剂通过将纤维蛋白原复合体(FC)成分、凝血酶成分和另 外的细胞成分组合制成。根据某些实施方式，可在添加凝血酶成分前在FC成分中添加细胞 成分。根据某些实施方式，也可向凝血酶成分中添加细胞成分。根据某些实施方式，可在允 许成分形成纤维蛋白凝胶前，向FC与凝血酶的混合物中添加细胞成分。FC/凝血酶比率可介于每25单位/毫升凝血酶2至10毫克/毫升纤维蛋白原之 间，其包括(例如)约每25单位/毫升凝血酶约2毫克/毫升纤维蛋白原、约每25单位/ 毫升凝血酶约2. 5毫克/毫升纤维蛋白原、约每25单位/毫升凝血酶约3毫克/毫升纤维 蛋白原、约每25单位/毫升凝血酶约3. 5毫克/毫升纤维蛋白原、约每25单位/毫升凝血 酶约4毫克/毫升纤维蛋白原、约每25单位/毫升凝血酶约4. 5毫克/毫升纤维蛋白原、 约每25单位/毫升凝血酶约5毫克/毫升纤维蛋白原、约每25单位/毫升凝血酶约5. 5 毫克/毫升纤维蛋白原、约每25单位/毫升凝血酶约6毫克/毫升纤维蛋白原、约每25单 位/毫升凝血酶约6. 5毫克/毫升纤维蛋白原、约每25单位/毫升凝血酶约7毫克/毫升 纤维蛋白原、约每25单位/毫升凝血酶约7. 5毫克/毫升纤维蛋白原、约每25单位/毫升 凝血酶约8毫克/毫升纤维蛋白原、约每25单位/毫升凝血酶约8. 5毫克/毫升纤维蛋 白原、约每25单位/毫升凝血酶约9毫克/毫升纤维蛋白原、约每25单位/毫升凝血酶约9. 5毫克/毫升纤维蛋白原，以及约每25单位/毫升凝血酶约10毫克/毫升纤维蛋白原。 FC/凝血酶比率优选为约每25单位/毫升凝血酶约5毫克/毫升纤维蛋白原。FC/凝血酶 比率的优选范围包括约每25单位/毫升凝血酶约4至6毫克/毫升纤维蛋白原、约每25 单位/毫升凝血酶约4. 5至6毫克/毫升纤维蛋白原、约每25单位/毫升凝血酶约5至6 毫克/毫升纤维蛋白原、约每25单位/毫升凝血酶约5. 5至6毫克/毫升纤维蛋白原、约 每25单位/毫升凝血酶约4至5. 5毫克/毫升纤维蛋白原、约每25单位/毫升凝血酶约 4至5毫克/毫升纤维蛋白原，以及约每25单位/毫升凝血酶约4至4. 5毫克/毫升纤维 蛋白原。根据优选实施方式，纤维蛋白原的密度/浓度介于约2至10毫克/毫升之间，其 包括，例如，约2毫克/毫升、约2. 5毫克/毫升、约3毫克/毫升、约3. 5毫克/毫升、约4 毫克/毫升、约4. 5毫克/毫升、约5毫克/毫升、约5. 5毫克/毫升、约6毫克/毫升、约 6. 5毫克/毫升、约7毫克/毫升、约7. 5毫克/毫升、约8毫克/毫升、约8. 5毫克/毫升、 约9毫克/毫升、约9. 5毫克/毫升，以及约10毫克/毫升纤维蛋白原。纤维蛋白原的密 度优选约介于2至5毫克/毫升之间。纤维蛋白原密度/浓度的优选范围包括约4至6毫 克/毫升、约4. 5至6毫克/毫升、约5至6毫克/毫升、约5. 5至6毫克/毫升、约4至 5. 5毫克/毫升、约4至5毫克/毫升、约4至4. 5毫克/毫升、约2至6毫克/毫升、约2 至5毫克/毫升、约2. 5至5毫克/毫升、约3至5毫克/毫升，以及约3. 5至5毫克/毫 升。加入纤维蛋白原中的凝血酶量足以在约3至120秒内形成聚合凝胶。优选约3秒至60 秒间、约3秒至30秒间、约3秒至20秒间、约3秒至10秒间、约10秒至60秒间、约20秒 至60秒间、约30秒至60秒间，以及约30秒至120秒间。根据某些实施方式，本发明伤口封闭剂的基础材料可以为能够形成基质并支持或 包胶细胞或细胞成分的任何蛋白(纤维蛋白原/纤维蛋白除外)或任何非蛋白聚合物(例 如，3M的CAVIL0N )。聚合物的密度/浓度可介于2. 5至10毫克/毫升。聚合物的密度/ 浓度介于约2至约10毫克/毫升之间，其包括，例如，约2毫克/毫升、约2. 5毫克/毫升、 约3毫克/毫升、约3. 5毫克/毫升、约4毫克/毫升、约4. 5毫克/毫升、约5毫克/毫升、 约5. 5毫克/毫升、约6毫克/毫升、约6. 5毫克/毫升、约7毫克/毫升、约7. 5毫克/毫 升、约8毫克/毫升、约8. 5毫克/毫升、约9毫克/毫升、约9. 5毫克/毫升，以及约10毫 克/毫升。聚合物的密度优选约介于2至5毫克/毫升之间。聚合物密度的优选范围包括 约4至6毫克/毫升、约4. 5至6毫克/毫升、约5至6毫克/毫升、约5. 5至6毫克/毫 升、约4至5. 5毫克/毫升、约4至5毫克/毫升、约4至4. 5毫克/毫升、约2至6毫克/ 毫升、约2至5毫克/毫升、约2. 5至5毫克/毫升、约3至5毫克/毫升，以及约3. 5至5 毫克/毫升。根据优选实施方式，纤维蛋白封闭剂为聚合凝胶或凝胶喷雾剂形态。应优化每种 成分的浓度，以防施用后溢流。根据优选实施方式，纤维蛋白封闭剂包含治疗有效量的干/祖细胞。细胞成分中 的细胞优选从自体、同种异体或异种人或动物源采集。优选自体的动物或人源。然后按本 文所述方式制备并分离干/祖细胞组合物。例如，本发明的纤维蛋白封闭剂含有细胞成分， 其包括浓度约IO6至个细胞/平方厘米的干/祖细胞。根据某些实施方式，细胞成分 中的干细胞剂量至少约为每平方厘米1.5-2.0 X IO6个干细胞或更多(例如，大于约IO7个细胞/平方厘米、大于约IO8个细胞/平方厘米、大于约IO9个细胞/平方厘米、大于约101° 个细胞/平方厘米、大于约IO11个细胞/平方厘米、大于约IO12个细胞/平方厘米、大于约 IO13个细胞/平方厘米、大于约IO15个细胞/平方厘米或大于约102°个细胞/平方厘米)。 也可采用富集干细胞制剂。本文所公开发明的组合物和方法有用于治疗有急慢性伤口的患者。慢性伤口包括 但不限于以下各项慢性缺血性皮肤病损；硬皮病溃疡；动脉溃疡；糖尿病足溃疡；压迫性 溃疡；静脉曲张性溃疡；不愈合性下肢伤口 ；炎症状态造成的溃疡；和/或长期伤口。虽然， 本文举例说明特定实施方式，应理解也可利用类似的方法采用适当的自体和/或同种异体 细胞治疗其它类型的伤口。本文所公开发明的组合物和方法有用于改善患者伤口患处的瘢痕形成。根据优选 实施方式，这些方法可以改善、降低或减少烧伤患者的瘢痕形成。根据优选实施方式，这些 方法可以治疗急慢性伤口或损伤患者的肥厚性瘢痕，或降低其发生率或可能性。本发明的组合物和方法可用于治疗慢性缺血性皮肤病损。根据某些实施方式，组 合物包含干/祖细胞悬液，施用于慢性缺血性皮肤病损、慢性皮肤溃疡和/或糖尿病足溃疡 等慢性皮肤病损的表面和周围。其它类型的慢性皮肤病损包括神经性和缺血性慢性皮肤病 损(例如，轻度病损、IV级病损、V级病损等)。可采用该领域熟知的技术向受试者施用本发明的纤维蛋白封闭剂，例如，可在所 需部位注射或喷涂、采用内窥镜技术、海绵状载体、预制封闭剂或该领域已知的其它方法。 在一实施方式中，我们通过注射或喷涂封闭剂，在原位形成凝胶。根据某些实施方式，递送作为细微喷雾剂的本发明的纤维蛋白封闭剂。根据优选 实施方式，我们用带有双管注射器的纤维蛋白聚合物喷涂系统将本发明的纤维蛋白封闭剂 施用于伤口处。就此而言，纤维蛋白原成分可与细胞成分组合，然后用带有双管注射器的纤 维蛋白聚合物喷涂系统将这种组合施用于患处，该喷涂系统可以同时施用组合的FC/细胞 成分和凝血酶成分。纤维蛋白原和凝血酶在与创面床接触时立即聚合为纤维蛋白。根据优选实施方式，纤维蛋白封闭剂(例如，聚合纤维蛋白凝胶)可局部施用于伤 口患处。例如，可以凝胶的形式将纤维蛋白封闭剂局部施用于伤口患处，并散开，均勻的覆 盖在伤口(例如，不愈合性伤口)的表面区域。根据优选实施方式，教导成分指提供小生境、 习生地或结构支撑从而保证干细胞繁殖和分化的一种组织结构(例如，聚合物或支架)。根 据某些实施方式，教导成分为皮肤替代物或细胞外基质(ECM)材料。皮肤替代物包括但不 限于以下各项无细胞敷料(例如，结合于尼龙织物或网的胶原)；自体表皮移植；无细胞， 同种异体真皮移植；牛胶原和软骨素-6-硫酸盐；猪小肠黏膜；可吸收性基质中的人纤维原 细胞；牛胶原海绵中的人纤维原细胞和角质形成细胞；牛胶原基质中的人纤维原细胞和角 质形成细胞。见如，美国专利公开号2007/0274963，该文献通过引用方式并入本文。根据某些实施方式，为递送纤维蛋白，纤维蛋白聚合物喷涂系统使用极小的CO2气 流(即小于约IOp. s. i.)。CO2气流的优选范围包括约lp. s. i.至IOp. s. i.、约lp. s. i.至 9p. s. i.、约 lp. s. i.至 8p. s. i.、约 lp. s. i.至 7p. s. i.、约 lp. s. i.至 6p. s. i.、约 lp. s. i.至 5p. s. i.、约 lp. s. i.至 4p. s. i.、约 lp. s. i.至 3p. s. i.、约 lp. s. i.至 2p. s. i.、 约 2p. s. i.至 5p. s. i.、约 3p. s. i.至 5p. s. i.、约 4p. s. i.至 5p. s. i.。根据优选实施方 式，为递送纤维蛋白，纤维蛋白聚合物喷涂系统会使用小于约5p. s. i.的CO2气流。根据优选实施方式，为递送纤维蛋白，纤维蛋白聚合物喷涂系统使用小于约4. 5p. s. i.的(X)2气 流。根据优选实施方式，为递送纤维蛋白，纤维蛋白聚合物喷涂系统使用小于约4p. s. i.的 CO2气流。根据优选实施方式，为递送纤维蛋白，纤维蛋白聚合物喷涂系统使用小于约3. 5p. s. i.的CO2气流。根据优选实施方式，为递送纤维蛋白，纤维蛋白聚合物喷涂系统使用小于 约3p.s.i.的CO2气流。根据优选实施方式，为递送纤维蛋白，纤维蛋白聚合物喷涂系统使 用小于约2.5p.s.i.的CO2气流。根据优选实施方式，为递送纤维蛋白，纤维蛋白聚合物喷 涂系统使用小于约2p. s. i.的CO2气流。可对纤维蛋白原(含有干/祖细胞)和凝血酶进行稀释，以最佳的递送聚合凝胶， 其立即附着于伤口上，而不会出现溢流情况，同时还使干/祖细胞保持存活，并从凝胶中迁 移出来。在伤口愈合过程中，可按需要在伤口患处施用本发明的纤维蛋白封闭剂一次、两 次、三次、四次、五次、十次、二十次或以上等。根据优选实施方式，至少间隔1周为患者施用 至少两次纤维蛋白封闭剂。根据优选实施方式，至少间隔2周为患者施用至少两次纤维蛋 白封闭剂。根据优选实施方式，至少间隔1周为患者施用至少三次纤维蛋白封闭剂。根据 优选实施方式，至少间隔2周为患者施用至少三次纤维蛋白封闭剂。根据优选实施方式，至 少间隔1周为患者施用至少四次纤维蛋白封闭剂。根据优选实施方式，至少间隔2周为患 者施用至少四次纤维蛋白封闭剂。根据优选实施方式，至少间隔1周为患者施用至少五次 纤维蛋白封闭剂。根据优选实施方式，至少间隔2周为患者施用至少五次纤维蛋白封闭剂。根据某些实施方式，本发明提供含有浸渍或接种于纤维蛋白基质中的干/祖细胞 的局部制剂的用途。本发明的组合物和方法所用的干/祖细胞可以为同种异体或自体干/ 祖细胞。干细胞的潜在来源包括人类胚胎干(hEQ细胞、从脐带中采集的干细胞、从外周血 采集的干/祖细胞、骨髓衍生细胞、成体干细胞、多潜能干细胞、胚胎干细胞、极小的胚胎样 干细胞和之前等分和/或冷冻保存的细胞。根据优选实施方式，本发明的纤维蛋白封闭剂中的细胞成分可包括成体自体骨髓 衍生干细胞、成体自体PBSC或成体自体MSC。根据优选实施方式，本发明的纤维蛋白封闭剂 中的细胞成分可包括由成体自体骨髓衍生干细胞、成体自体PBSC或成体自体MSC中的两种 或以上的混合物。成体干细胞或体干细胞是组织或器官的分化细胞中的一种未分化细胞。成体干细 胞可以自我更新，并可以分化，产生组织或器官的主要特异细胞类型。成体干细胞在活体中 的主要作用是维护和修复其所在组织。骨髓的非造血成分包括多能间充质干细胞(MSC)，该细胞可以分化为脂肪、骨骼、 肌肉、软骨和内皮。根据优选实施方式，本发明的方法和组合物中使用了 MSC。骨髓衍生干 细胞主要发现在长骨内部(腿骨、髋骨、胸骨等)，并且组成“骨髓”。这些干细胞可以离开 骨髓，并在血流中循环。可按该领域内已知的物理步骤采集干细胞。干细胞使伤口内的某些结构重建成为可能。骨髓是造血干细胞的重要来源，造血 干细胞经常可以再生血液中的成分和包括间充质干细胞(MSC)在内的非造血干细胞。自体 干细胞可通过几种潜在机制有力的促进伤口愈合。在适当条件下，干细胞可复原或重建组 织室。Falanga, Lancet 366(9498) :1736_43，2005。不愈合性伤口中原有的真皮纤维原细 胞已形成异常表型，无益于适当的组织的修复。Falanga et al.，Tissue Eng. 2007 Jun ；13(6) 1299-3120具体而言，从不愈合性伤口培养的纤维原细胞对某些生长因子(如血小 板源生长因子-BB(PDGF-BB)和转化生长因子-β 1 (TGF-β 1))的作用没有反应。对TGF-β 1 没有反应可能是由于II型TGF-β受体的衰减调节和关键信号分子(包括Smad3和MAPK) 的磷酸化下降。干细胞的采集本发明的干/祖细胞(例如，MSC、PBSC、VSEL等)可从骨髓、外周血(优选动员外 周血)、脾、脐带血及其组合中采集。可采用该领域已知的任何方式从各个来源采集干/祖 细胞。一般而言，从受试者身上采集干/祖细胞的方法包括采集总有核细胞群，然后进一步 富集细胞群的干/祖细胞。根据某些实施方式，本发明的干/祖细胞(例如，造血干细胞和/或MSC)从骨髓 中采集而来。可采用该领域已知的任何方法采集骨髓衍生细胞。根据某些实施方式，可从 患者身上获得骨髓抽取液。根据某些实施方式，可从患者身上获得单独的骨髓抽取液。根据优选实施方式，干细胞/祖细胞为极小的胚胎样(VSEL)干细胞。见如， W0/2007/067280,国际申请编号PCT/US2006/042780，该文献通过引用方式全文并入本文。 在某些实施方式中，VSEL干细胞或其衍生物包括CD34+/1 in7CD45_或ka-Γ/Ι in7CD45_极 小胚胎样(VSEL)干细胞。在某些实施方式中，VSEL干细胞的直径约3-4微米，表达SSEA-1、 Oct-4、Rev-I和Nanog中的至少一种，细胞核很大，周围环绕着一层很窄的细胞质，染色质 (常染色质)呈开放状态。在某些实施方式中，包括VSEL干细胞或其衍生物组成的⑶45_细胞群分离自由人 源或小鼠源骨髓、外周血、脾、脐带血及其组合构成的组群。在某些实施方式中，诱导VSEL 干细胞或其衍生物形成类胚体样球体的一种或更多种生长因子包括表皮生长因子(EGF)、 纤维原生长因子-2及其组合。在某些实施方式中，我们通过将VSEL干细胞或其衍生物与 C2C12细胞共同培养，为VSEL干细胞或其衍生物提供一种或更多种因子。在某些实施方式 中，VSEL干细胞为CXCR4+和/或AC133+。在部分实施例中，本文所公开的方法和组合物进 一步包括筛选为HLA-DR-、MHC class Γ、⑶9(Γ、⑶四-、⑶105—或其组合的细胞。本发明公 开的主题还提供了包括多个极小胚胎样(VSEL)干细胞的类胚体样球体。根据优选实施方式，干细胞/祖细胞采集自个体的外周血。根据一优选实施方式， 可在血浆分离置换程序中采集干细胞，该程序通常利用血浆分离置换仪器。血浆分离置换 仪器的外观与透析机相似，只是该仪器为离心机，而透析机则采用过滤技术。可以在供体的 家中或采集中心采集干细胞。血液采集自一只手臂，然后输入血浆分离置换仪器，进行干细 胞分离和采集。全血的其余部分会重新输入供体的体内。注册护士(RN)或其他核准人员 会以正常采血方式在受试者的两只手臂上插入针头。然后，注册护士会运行血浆分离置换 仪器，来分离血液成分(红细胞、白细胞、血浆)，采集干细胞，并将全血的其余部分重新输 入供体体内。采集干细胞需要大约2-4小时，受试者在此期间要保持静止状态。接受血浆 分离置换采血后，骨髓会很快向血流中释放更多干细胞，替换所采集的干细胞。干细胞采集 量仅占人体干细胞中的极小一部分。健康的个体可以迅速繁殖干细胞，替换损失的干细胞。 因此，本发明的程序不会减少体内的干细胞。每年，会为采集血小板、红细胞、血浆和干细胞 进行数十万次血浆分离置换采血。经实践证明，这是一种安全有效的技术。根据某些实施方式，我们通过血浆分离置换程序从成人或儿童外周血中采集干细14胞和/或祖细胞，并进行加工，优化所采集干细胞的数量和质量，任选将干细胞冷冻保存， 在有需要时解冻，用于自体治疗目的。根据一优选实施方式，本发明提供了从人类受试者采 集自体成体干细胞的方法。该过程可能涉及通过血浆分离置换程序，从人类受试者的外周 血中采集成体干细胞；采集时，在所采集细胞上加耳标，以便用于人类受试者；保存所采集 的细胞，以维持细胞的细胞完整性。人类受试者可以为成年人或非新生儿儿童。因此，上述 程序可进一步包括采集成人或非新生儿儿童外周血干细胞，这些细胞在冷冻保存前按指定 剂量部分进行等分，以便在从库存中取出细胞时，不必解冻全部所采集细胞。可对包括成人或非新生儿儿童在内的任何人进行采集。此外，采集可涉及一个或 更多个采集步骤或采集期。例如，一个人可以至少进行2次、3次或5次采集(例如，通过 血浆分离置换程序)。在每个采集步骤中，人体每千克体重所采集的总有核细胞数量可为 一百万(1 χ IO6)个或更多(例如、1 χ IO7U χ IO8U χ IO9U χ IO10U χ IO11U χ ΙΟ12、 1 χ IO13U χ IO14U χ ΙΟ15)。在优选实施方式中，在单次采集中采集的细胞数量可等于或 大于 1 χ IO15 个总有核细胞，或至少在 ΙΟ14、1013、IOi2UOiiUO10, IO9、ΙΟ8、107、IO6 或 IO5 的数 量级上的总有核细胞，视供体的体重和年龄而定。依据将从供体身上采集的干/祖细胞的情况、数量和质量，任选在供体已“成年” 或达到“成熟”年龄(除非特定文意另有所指，否则本文中的“成年”指并包括成年人和非 新生儿)和/或达到特定最低体重要求时采集干/祖细胞。例如，根据本发明一实施方 式，在受试者介于10至200公斤时采集干/祖细胞，或该体重范围内的任何范围，如20至 40公斤。此外或替代地，根据本发明一实施方式，可要求受试者达到2-80岁间某年龄段内 (例如，2-10、10-15、12-18、16-20、20-26、26-30、30-35、30-40、40-45、40-50、55-60、60-65、 60-70和70-80岁)的特定年龄。收集的干细胞和/或祖细胞也可以用离体过程扩展。例如，可能需要扩展和增殖 干细胞群、部分分化干细胞，以达到一个组织特定祖细胞群或将干细胞或祖细胞分化为完 全功能细胞。已为富集该等细胞群制定众多方案。见如，美国专利第5，486，359号、美国专 利第5，753，506号和美国专利第5，736，396号，通过引用方式全文并入本文。可能采用扩 增或分化干细胞或祖细胞的任何已知方案。例如，使用的策略可能包括培养干细胞或祖细 胞带有或不带早期和晚期生长因子的不同混合物，带有或不带组织特定生长或分化因子； 带有或不带血清；固定培养、快速培养基交换培养或持续灌注(生物反应器)；和带有或不 带已建立的细胞饲养层。为实现干细胞最大的离体扩增，应满足下列一般条件(i)分化应 可逆地抑制或延迟(ii)自我再生应得到最大的延长。同样，细胞扩增后，必须采用方法，诱 导分化扩增的细胞群，以将扩增的细胞群转化为成熟功能细胞或组织。干细胞增效剂在外周血细胞循环的干细胞/祖细胞的数量，可能会随着在收集前输注细胞生长 因子而增加，例如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。常规地将生长因子输注至骨髓和外周血供 体，且不会产生任何长期的不良反应。不良副作用并不常见，但包括可能在长骨、胸骨与骨 盆出现的疼痛、轻微头痛、轻度恶心和体温瞬时升高。给予成长因子1-6天后，收集外周血 干细胞/祖细胞。输注G-SCF后1-6天，用血浆分离置换仪器无菌收集外周血干细胞/祖 细胞。在优选实施方式中，提供了包括给予干细胞增效剂的动员大量外周血干细胞/祖细胞的方法。干细胞增效剂功能在于增加从人身上收集的干细胞/祖细胞数量或质 量。这些试剂包括但不限于G-CSF、GM-CSF, dexamethazone、CXCR4受体抑制剂、白细胞介 素-1 (IL-I)、白细胞介素-3 (IL-3)、白细胞介素-8 (IL-8)、PIXY-321 (GM-CSF/IL-3 融合蛋 白)、巨噬细胞炎症蛋白、干细胞因子、促血小板生成素和生长相关致癌基因，可作为单一试 剂或组合。在优选实施方式中，提供了包括向疾病早期受试者给予G-CSF的动员大量外周 血干细胞/祖细胞的方法。根据优选实施方式，G-CSF在1至6天的期间内给予疾病早期受试者，在受试者外 周血血浆分离置换时结束。优选的是，在2天至6天的期间内G-CSF给予疾病早期受试者 至少两次。例如，可在第1天和第3天给予G-CSF，或可在第1天、第3天和第5天或可选 的第1天、第2天和第5天给予。最优选的情况是，在3天的期间连续的天内将G-CSF给予 疾病早期受试者两次。因此，根据优选实施方式，在第1天和第2天向疾病早期受试者给予 G-CSF，然后在第3天进行血浆分离置换。此外，根据优选实施方式，向受试者给予低剂量的G-CSF。因此，受试者可能接受约 1微克/千克/天至8微克/千克/天剂量的G-CSF。优选的是，给予受试者剂量约2至7 微克/千克/天或等效剂量的G-CSF。更优选的是，给予受试者剂量约4至6微克/千克/ 天或等效剂量的G-CSF。对于皮下注射而言，G-CSF剂量可从约50微克至约800微克，优选 的是从约100微克至约600微克，更优的是从约250微克至500微克，最优的是从约300微 克至约500微克。根据另一个优选实施方式，CXCR4受体拮抗剂或抑制剂可用作干细胞增效剂。 已发现能增加外周血干细胞/祖细胞数量的CXCR4抑制剂实例包括但不限于AMD3100、 ALX40-4C、T22、T134、T140和TAK-779。也见于美国专利第7，169，750号，通过引用方式全 文并入本文。该等干细胞增效剂可在收集步骤开始前给予人。例如，增效剂可在收集步骤 开始前至少一天、至少三天或至少一周给予。优选的是，在2天至6天的期间内CXCR4抑制 剂给予疾病早期受试者至少两次。例如，可在第1天和第3天给予CXCR4抑制剂，或可在第 1天、第3天和第5天或可选的第1天、第2天和第5天给予。最优选的情况是，在3天的期 间连续的天内将CXCR4抑制剂给予疾病早期受试者两次。因此，根据优选实施方式，在第1 天和第2天向疾病早期受试者给予CXCR4抑制剂，然后在第3天进行血浆分离置换。选择的给药的配方和途径将根据个别受试者、受试者要治疗的病症的性质和通常 主治医生的判断量身定制。CXCR4抑制剂恰当的剂量范围取决于这些考虑因素，但通常，化 合物的给药范围为约0. 1微克/公斤至5毫克/公斤体重；优选范围是约1微克/公斤至 300微克/公斤体重；更优的是约10微克/公斤至100微克/公斤体重。因此，对于典型 的70公斤的人类受试者而言，剂量范围为从约0. 7微克至350毫克；优选的是约700微克 至21毫克；最优的是约700微克至7毫克。相比如i.v.给药等方式，化合物通过口服或经 皮给药方式剂量可能更高。干细胞加工在本发明一些实施方式中，收集干细胞/祖细胞后，会按照本领域所熟知的方法 力口工(见于如 Lasky, L. C. and Warkentin, P. I. ；Marrow and Stem Cell Processing for Transplantation ；AmericanAssociation of Blood Banks (2002))。在本发明的实施方式 中，加工可能包括下列步骤准备容器(如试管)和标签、采样和/或试验收集的物质、离心、将物质从收集容器转移到储存容器、添加冷冻保护剂等。在一些实施方式中，加工后，一 些加工过的干细胞/祖细胞可用于进一步试验。细胞也可以加工，优选是在开展保存步骤之前。例如，加工可能涉及用某些细胞表 面标志富集或消耗细胞。任何细胞表面标志，包括本说明书任何地方所述细胞表面标志，可 用作富集或消耗的标准。此外，加工可能涉及在一个干细胞/祖细胞群或至少一个非干细 胞/祖细胞群中分析一个细胞的至少一个特征。特征可能是DNA或RNA序列。例如，基因 组DNA或RNA可能已部分或完全测序(确定)。或者，细胞的DNA或RNA特定区域可被测 序。例如，可能会提取细胞或细胞群的核酸。可能用扩增流程中的扩增探针扩增这些核酸 的特定区域。例如，扩增流程可能是PCR或LCR。扩增后，扩增引物(扩增的产物)可能会 被测序。此外，可用基因芯片、杂交或其它技术分析DNA和RNA。特定种类的组织分型可用于样本鉴定或用于该等干细胞/祖细胞可能的同种异 体用途。这类信息可能包含基因型或表型信息。表型信息可能包含任何观察或测量得出的 特征，不论是宏观的或是系统级别或微观层面、细胞或分子层面。基因型信息可能指特定个 别有机体的特定基因组成，包括个别基因组的基因组成中一个或更多个变异或突变和该基 因组成与疾病的可能关系。该表型信息实例是基因“指纹”和供体的人类白细胞抗原(HLA) 类型。在本发明一些实施方式中，干细胞/祖细胞将按确定剂量被鉴定和等分至恰当容器 的方式加工。在优选实施方式中，干细胞/祖细胞富集群的细胞数量可能等于或大于h IO8的 总有核细胞总数，或至少在107，或IO6或105，或IO4的数量级上，视乎供体的重量和年龄。 可能会等分该等细胞，以便满足一个剂量的细胞数量储存在一个冷冻细胞袋或试管中。该 流程包括“成套储存”的独特流程，让个人能够收回大量细胞，用于自体用途，而无需融化全 部数量的储存细胞(更多详情于下文讨论)。干细胞富集或分类富集过程优选包含按大小和/或细胞标志分类细胞。例如，干细胞包含替代CD34+ 细胞测量的约0. 1-1.0%的有核细胞总数。因此，干细胞可按照其⑶34表达分类。就本发明的一个方面而言，通过本发明的方法收集的细胞可分类为至少两个亚 群，其可单独或一起(如在同一小瓶中)冷藏。所述细胞的至少两个亚群可能是干细胞/ 祖细胞的两个亚群。但是，所述细胞的至少两个亚群可能是(1)干细胞群或干细胞/祖细 胞富集群( 非干细胞群或干细胞/祖细胞消耗群。此外，也可预见到，两个亚群(即上文 (1)和O))可能会放在一起冷藏。可根据与干细胞相关的细胞表面标志对干细胞进行分类。由于此为本发明富集干 细胞的一个实施方式，因此，细胞分类的实用标志无需专门在干细胞中表达。未在干细胞中 专门表达的细胞标志仍在富集干细胞中有效。还应注意，分化细胞的标志也对本发明的方 法有效，因为例如，这些标志可用于选择性去除分化细胞，从而在余下的细胞群中富集干细 胞。可在本发明任何流程中使用的标志、细胞表面或其它，至少包括下列
权利要求
1.纤维蛋白封闭剂，其含有纤维蛋白原复合体(FC)成分、凝血酶成分和细胞成分， 其中，用于形成凝胶的纤维蛋白原浓度介于约2至5毫克/毫升之间，细胞成分含有一种或更多种干/祖细胞，并且纤维蛋白封闭剂含有至少1.5-2.0 X IO6个干/祖细胞/平 方厘米。
2.权利要求1所述组合物，干/祖细胞选自以下细胞骨髓衍生细胞、造血干细胞、间 充质干细胞、外周血干细胞及其混合物和组合。
3.权利要求1所述组合物，其中干/祖细胞为骨髓衍生细胞。
4.权利要求1所述组合物，其中干/祖细胞为间充质干细胞。
5.权利要求1所述组合物，其中干/祖细胞为外周血干细胞。
6.使用纤维蛋白封闭剂的方法，其包括a)将干/祖细胞与纤维蛋白封闭剂组合，来形 成伤口封闭剂，该纤维蛋白封闭剂含有钙凝血酶和纤维蛋白原，其中，钙凝血酶的浓度约为 25单位/毫升，纤维蛋白原的浓度约为2至5毫克/毫升，并且干/祖细胞的最终浓度至 少约为1.5至2.0 X IO6个干/祖细胞/平方厘米；b)将纤维蛋白封闭剂施用到皮肤伤口 上，其中，所施用的纤维蛋白封闭剂为聚合凝胶或喷雾剂的形态。
7.根据权利要求6所述方法，在三周的时间内至少在伤口患处施用两次纤维蛋白封闭剂。
8.根据权利要求6所述方法，干/祖细胞为骨髓衍生细胞、造血干细胞、间充质干细胞、 外周血干细胞及其混合物和组合。
9.根据权利要求6所述方法，其中施用于伤口患处的纤维蛋白封闭剂为CO2Psi小于 5psi的喷雾剂形态。
10.根据权利要求6所述方法，纤维蛋白封闭剂局部施用于伤口患处。
11.根据权利要求10所述方法，皮肤替代物施用于伤口患处。
12.改善伤口患处瘢痕形成的方法，包括a)将干/祖细胞与纤维蛋白封闭剂组合，来 形成伤口封闭剂，该纤维蛋白封闭剂含有钙凝血酶和纤维蛋白原，其中，钙凝血酶的浓度约 为25单位/毫升，纤维蛋白原的浓度约为2至5毫克/毫升，干/祖细胞的最终浓度至少 约为1.5至2.0 X IO6个干/祖细胞/平方厘米；b)将纤维蛋白封闭剂施用到伤口患处上， 其中，所施用的纤维蛋白封闭剂为聚合凝胶或喷雾剂的形态。
13.根据权利要求12所述方法，在三周的时间内至少在伤口患处施用两次纤维蛋白封 闭剂。
14.根据权利要求12所述方法，干/祖细胞为骨髓衍生细胞、造血干细胞、间充质干细 胞、外周血干细胞及其混合物和组合。
15.根据权利要求12所述方法，施用于伤口患处的纤维蛋白封闭剂为CO2Psi小于5psi 的喷雾剂形态。
16.根据权利要求12所述方法，纤维蛋白封闭剂局部施用于伤口患处。
17.根据权利要求16所述方法，向伤口患处施用皮肤替代物。
18.根据权利要求12所述方法，伤口为烧伤的结果。
19.根据权利要求12所述方法，该瘢痕为肥厚性瘢痕。
20.制备纤维蛋白封闭剂的方法，包括提供纤维蛋白原复合体(FC)成分、钙凝血酶 成分和细胞成分；向FC成分中添加细胞成分，再将FC成分与钙凝血酶成分混合；向组合的FC/细胞成分的混合物中添加钙凝血酶成分，其中纤维蛋白原的浓度约为2至5毫克/毫 升，干/祖细胞的最终浓度至少约为1.5至2.0 X IO6干/祖细胞/平方厘米。
21.根据权利要求20所述方法，钙凝血酶的浓度约为25单位/毫升。
22.根据权利要求20所述方法，干/祖细胞选自以下细胞骨髓衍生细胞、造血干细 胞、间充质干细胞、外周血干细胞及其混合物和组合。
23.用于制备纤维蛋白封闭剂的试剂盒，其包括a)含有纤维蛋白原复合体成分的第 一个小瓶或存储容器，其中，纤维蛋白原的浓度约为2至5毫克/毫升；及b)含有凝血酶成 分的第二个小瓶或存储容器，该试剂盒还包含其使用说明。
24.根据权利要求23所述试剂盒，凝血酶的浓度约为25单位/毫升。
25.根据权利要求23所述试剂盒，所述第一个小瓶或存储容器任选包含细胞成分。
26.根据权利要求23所述试剂盒，如果所述第一个小瓶或存储容器不含有细胞成分， 该试剂盒任选包含装有细胞成分的第三个小瓶或存储容器。
27.根据权利要求23所述试剂盒，该试剂盒进一步包括在体外或体内使用或施用纤维 蛋白封闭剂的仪器。
28.根据权利要求23所述试剂盒，该试剂盒还包含表征细胞成分的试剂。
29.纤维蛋白封闭剂，其包含纤维蛋白原复合体(FC)成分、凝血酶成分和细胞成分，其 中，用于形成凝胶的纤维蛋白原浓度介于约2至5毫克/毫升之间，细胞成分含有一种或更 多种干/祖细胞，纤维蛋白封闭剂含有至少1.5-2.0 X IO6个干/祖细胞/每平方厘米，其 中干/祖细胞为极小胚胎样(VSEL)干细胞。
30.根据权利要求四所述方法，其中的VSEL干细胞为⑶34+/lin_/⑶45_或&￡1-17 lin7CD45"0
31.使用纤维蛋白封闭剂的方法，包括a)将干/祖细胞与纤维蛋白封闭剂组合，来形 成伤口封闭剂，该纤维蛋白封闭剂含有钙凝血酶和纤维蛋白原，其中，钙凝血酶的浓度约为 25单位/毫升，纤维蛋白原的浓度约为2至5毫克/毫升，干/祖细胞的最终浓度至少约为 1. 5至2. 0 X IO6个干/祖细胞/平方厘米，其中的干/祖细胞为极小胚胎样(VSEL)干细 胞；b)将纤维蛋白封闭剂施用到皮肤伤口上，其中，所施用的纤维蛋白封闭剂为聚合凝胶 或喷雾剂的形态。
32.根据权利要求31所述方法，其中VSEL干细胞为0)347111170)45_或&￡1-171化7 CD45-。
33.改善伤口患处瘢痕形成的方法，包括a)将干/祖细胞与纤维蛋白封闭剂组合，来 形成伤口封闭剂，该纤维蛋白封闭剂含有钙凝血酶和纤维蛋白原，其中，钙凝血酶的浓度约 为25单位/毫升，纤维蛋白原的浓度约为2至5毫克/毫升，干/祖细胞的最终浓度至少 约为1. 5至2. 0 X IO6个干/祖细胞/平方厘米，其中的干/祖细胞为极小胚胎样(VSEL) 干细胞；b)将纤维蛋白封闭剂施用到伤口患处，其中，所施用的纤维蛋白封闭剂为聚合凝 胶或喷雾剂的形态。
34.根据权利要求33所述方法，其中VSEL干细胞为CD34+/lin7CD45_或ka-l+/lin7 CD45- 。
35.制备纤维蛋白封闭剂的方法，包括提供纤维蛋白原复合体(FC)成分、钙凝血酶 成分和细胞成分；向FC成分中添加细胞成分，再将FC成分与钙凝血酶成分混合；向组合的FC/细胞成分的混合物中添加钙凝血酶成分，其中纤维蛋白原的浓度约为2至5毫克/毫 升，干/祖细胞的最终浓度至少约为1.5至2.0 X IO6个干/祖细胞/平方厘米，其中的干 /祖细胞为极小胚胎样(VSEL)干细胞。
36.根据权利要求35所述方法，其中的VSEL干细胞为⑶34+/lin_/⑶45_或ka-1+/ lin7CD45"0
37.治疗硬皮病的方法，包括a)将干/祖细胞与纤维蛋白封闭剂组合，来形成伤口封 闭剂，该纤维蛋白封闭剂含有钙凝血酶和纤维蛋白原，其中，钙凝血酶的浓度约为25单位/ 毫升，纤维蛋白原的浓度约为2至5毫克/毫升，干/祖细胞的最终浓度至少约为1. 5至 2.0 X IO6个干/祖细胞/平方厘米；b)将纤维蛋白封闭剂施用到硬皮病溃疡处，其中，所 施用的纤维蛋白封闭剂为聚合凝胶或喷雾剂的形态。
38.根据权利要求37所述方法，在三周的时间内至少在伤口患处施用两次纤维蛋白封 闭剂。
39.根据权利要求37所述方法，干/祖细胞为骨髓衍生细胞、造血干细胞、间充质干细 胞、外周血干细胞及其混合物和组合。
40.根据权利要求37所述方法，施用于伤口患处的纤维蛋白封闭剂为CO2Psi小于5psi 的喷雾剂形态。
41.根据权利要求37所述方法，纤维蛋白封闭剂局部施用于伤口患处。
42.根据权利要求41所述方法，皮肤替代物施用于伤口患处。
全文摘要
本文提供了使用干/祖细胞用于治疗急和慢性伤口或促进急和慢性伤口愈合的治疗方法的组合物和方法。
文档编号A61K38/36GK102046188SQ200980119753
公开日2011年5月4日 申请日期2009年3月27日 优先权日2008年3月27日
发明者V·法兰加 申请人:尼奥斯泰姆公司