专利名称：基于稳定剂的乳剂及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物医药技术领域的乳剂及其制备方法和用途，具体是一种基于稳定剂的乳剂及其制备方法和用途。
背景技术：
乳剂是一种液相的液滴分散在另一种与其完全不相容的液相中所形成的非均匀混合物。两种液相的互不相容性使得二者在相互接触的地方产生表面张力，当一种液相以液滴的形式分散在另一种液相中时，二者的接触面积明显增大，导致化学势能增加，而液滴之间会自发地碰撞融合来弥补损失的自由能，因此乳剂是一种热力学不稳定体系，稳定乳剂的制备需要在液滴与液滴之间创造一层动力学屏障以阻止它们的聚集。表面活性剂的使用就在于它具有两亲性，可以稳定在互不相容的两相之间，降低表面张力，从而减少乳剂形成过程中损失的自由能。然而它的两亲性也使得它可以吸附在任意固体介质的表面，显著地影响后者的润湿性，这在一定程度上限制了乳剂的应用范围，比如化妆品中使用的表面活性剂就对皮肤有一定的刺激。
近年来，微粒子被认为可以取代表面活性剂来制备稳定乳剂，这种以固体粒子作为稳定剂制备成的乳剂被称为Pickering乳剂，以此来纪念他的发现者Mr.S.U.Pickering。关于Pickering乳剂的研究和报道近年来可谓层出不穷，内容涉及到制备和表征分析等各个方面。Pickering乳剂同时也被应用到生产和生活当中，如被用做粘合剂，密封剂和防水涂层，被用在洗发香波和护发素等化妆品中等等。用来稳定Pickering乳剂的固体粒子也必须满足一定的条件，它们的形状，大小和疏水性等都对乳剂的稳定性有不同程度的影响。比如粒子与液滴的接触角就是疏水性的特征之一，接触角越小，表明粒子越容易被液滴润湿，越不容易阻止液滴之间的聚集，形成的乳剂也越不稳定。只有部分疏水的粒子，也就是说与液滴的接触角接近90度的粒子，才可以被互不相容的两种液相分别润湿，从而更好地结合到液滴的表面，阻止其聚集，也就更好地稳定了乳剂。目前常被用来制备Pickering乳剂的粒子包括硅酸盐，铝酸盐，钛酸盐，硅铝，金属氧化物，碳黑，氮化物，硒化镉等，并且大部分是基于SiO2基础上构建的粒子。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于稳定剂的乳剂及其制备方法和用途，能够制备得到具有较好的亲水亲油性的稳定剂，且具有正电荷和磁性，利用修饰后的稳定剂制备的复乳具有磁性和正电性，可作为磁基因载体或磁共振成像用的造影剂。
本发明是通过以下的技术方案实现的， 第一方面，本发明涉及一种稳定剂，该稳定剂可由如下的方法制备得到取高分子聚合物和卤化铁并采用化学共沉淀法制备得到磁性纳米粒子，即稳定剂； 所述制备方法具体是指将FeCl3和FeCl2溶于脱气水中，制备铁盐溶液；取高分子聚合物溶于脱气水中，得溶液，将该溶液与铁盐溶液混合，得混合溶液；将混合溶液置于冰水浴中，在氮气保护下边搅拌边进行如下操作逐滴滴加NaOH的水溶液，当pH值为10.5～11时停止滴定，继续冰浴；在氮气保护下将溶液油浴，离心，取上清，干燥，得到稳定剂。
第二方面，本发明涉及一种上述稳定剂的修饰方法取1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、所述的稳定剂以及聚乙烯亚胺的MES溶液混合并搅拌后，经透析干燥处理，得带正电稳定剂。
第三方面，本发明涉及一种基于稳定剂的乳剂，其组分为水相、油相和所述稳定剂。
第四方面，本发明涉及一种基于带正电稳定剂的乳剂，该乳剂为水包油包水结构的复乳，其组分为水相、油相和所述带正电稳定剂。
第五方面，本发明涉及上述基于带正电稳定剂的乳剂的制备方法，包括如下步骤 步骤一，采用超声法制备水包油结构的初乳； 步骤二，利用水包油结构的初乳及带正电稳定剂制备水包油包水结构的复乳，即乳剂。
步骤二中所述的制备是指在持续超声的环境下进行反应。
第六方面，本发明涉及上述乳剂的用途，将该乳剂用于制备基因载体或磁共振成像造影剂。
第七方面，本发明涉及另一种基于带正电稳定剂的乳剂的制备方法，包括如下步骤 步骤一，采用超声法制备水包油结构的初乳； 步骤二，利用水包油结构的初乳及带正电稳定剂，在持续通入六氟化硫的条件下制备水包油包水结构的复乳，即乳剂。
步骤二中所述的制备是指在持续超声的环境下进行反应； 第八方面，本发明涉及上述乳剂的用途，将该乳剂用于制备超声诊断用造影剂的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果本发明制备的稳定剂为一种固体粒子，经与PEI复合修饰后，具有较好的亲水亲油性，且具有正电荷和磁性；利用本发明的修饰过的稳定剂制备的乳剂具有磁性和正电性，可作为磁基因载体或磁共振成像用的造影剂；同时，在制备乳剂的过程中边超声边通六氟化硫气体，则可得到含六氟化硫的乳剂，这种乳剂可作为超声影像诊断的新型造影剂。
图1为W/O初乳和W/O/W复乳的表观图； 图2为40倍光学显微镜下观察到的W/O初乳和W/O/W复乳结果图； 图3为W/O/W复乳与DNA结合后的琼脂糖凝胶电泳图； 图4为W/O/W复乳携带pGL3-control质粒转染COS-7细胞的效果比较结果； 图5为W/O/W复乳及稳定剂的体外磁共振成像(T2加权相)照片； 图6为W/O/W复乳在TEM下的形态图； 图7为W/O/W复乳在超声诊断仪下的体外成像结果。
具体实施例方式 下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1 本实施例涉及的实验材料如下 氯化亚铁，氯化铁，氢氧化钠均为分析纯，购自中国医药集团上海化学试剂公司； 聚乳酸(PLA)，购自上海拜博生物科技有限公司； 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)购自Sigma公司； 聚乙烯亚胺(PEI)25000购自Sigma公司； 大豆油，市售； 六氟化硫(SF6)气体购自中核红华特种气体股份有限公司； 非洲绿猴肾细胞系COS-7细胞购自ATCC； RPMI-1640培养基及血清均购自GIBICO公司； 荧光素酶报道质粒pGL3-control购自美国Promega公司； PCS质粒在中国发明专利申请CN101095951公开说明书中公开； 荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司； BCA蛋白定量试剂盒购自上海业力生物技术公司； 本实施例的稳定剂制备方法如下 称取730mg FeCl3和360mg FeCl2溶解在5ml脱气水中，得铁盐溶液；之后取2.8g的PLA，溶解在2ml脱气水中，得溶液，将该溶液与铁盐溶液混合，得混合溶液；将混合溶液置于冰水浴(2～4℃)中，在氮气保护下边搅拌边进行如下操作逐滴滴加NaOH(5M)的水溶液，pH计在线监测pH值，当pH值为10.5～11时停止滴定，继续冰浴30分钟；在氮气保护下将溶液85℃油浴加热2小时，使颗粒熟化；反应完毕后，9000rpm，4℃离心10分钟，去掉大颗粒沉淀，保留上清，同样条件再次离心10分钟，进一步去掉大颗粒沉淀，保留上清，得到约10ml的磁性粒子溶液；进一步地，通过透析干燥可得到磁性纳米粒子固体(即MP-PLA磁性粒子)，即稳定剂。
本实施例的乳剂制备方法如下 利用上述稳定剂超声制备W/O乳剂取透析得到的溶液(即PLA磁性粒子的原液)，稀释5倍后，取100ul来与900ul大豆油混合，25℃，30％超声强度，超声7次，每次5S on，6S off，得W/O的乳剂。
实施例2 本实施例采用与实施例1相同的材料及步骤制备稳定剂，并基于所述稳定剂制备乳剂的方法，具体包括如下步骤 利用上述稳定剂超声制备O/W乳剂取透析得到的溶液(即PLA磁性粒子的原液)，稀释5倍后，取900ul来与100ul大豆油混合，25℃，30％超声强度，超声7次，每次5S on，6S off，得O/W的乳剂。
实施例3 本实施例采用与实施例1相同的材料制备带正电的稳定剂，该制备方法具体包括如下步骤 步骤一，取聚乳酸，FeCl3和FeCl2，采用化学共沉淀法制备磁性纳米粒子； 称取730mg FeCl3和360mg FeCl2溶解在5ml脱气水中，得铁盐溶液；之后取2.8g的PLA，溶解在2ml脱气水中，得溶液，将该溶液与铁盐溶液混合，得混合溶液；将混合溶液置于冰水浴(2～4℃)中，在氮气保护下边搅拌边进行如下操作逐滴滴加NaOH(5M)的水溶液，pH计在线监测pH值，当pH值为10.5～11时停止滴定，继续冰浴30分钟；在氮气保护下将溶液85℃油浴加热2小时，使颗粒熟化；反应完毕后，9000rpm，4℃离心10分钟，去掉大颗粒沉淀，保留上清，同样条件再次离心10分钟，进一步去掉大颗粒沉淀，保留上清，得到约10ml的磁性粒子溶液；进一步地，通过干燥可得到磁性纳米粒子固体； 步骤二，取1-(3二甲氨基丙基)3乙基碳二亚胺，磁性纳米粒子，聚乙烯亚胺的MES溶液，混合，搅拌使之反应，透析，干燥，得稳定剂； 将PEI25000溶在pH6.0的MES溶液(0.05M MES，0.5M NaCl)中，使得PEI25000的终浓度为0.1667g/ml，得PEI的MES溶液；取400ul步骤一所得的磁性粒子溶液，240ul PEI的MES溶液，80ulEDC，混合，室温下搅拌反应2小时，之后将溶液置于分子量10,0000的透析袋中透析4小时以除去游离的PEI和EDC，得到MP-PLA-EDC-PEI磁性粒子的原液，干燥，得稳定剂。
本实施例的乳剂制备方法包括如下步骤 步骤一，利用上述带正电稳定剂和超声法制备W/O初乳取透析得到的溶液(即MP PLA EDC PEI磁性粒子的原液)，稀释5倍后，取100ul来与900ul大豆油混合，25℃，30％超声强度，超声7次，每次5S on，6S off，得W/O的初乳； 步骤二，利用上述带正电稳定剂和W/O初乳来超声制备W/O/W复乳，即乳剂取透析得到的溶液(即MP-PLA-EDC-PEI磁性粒子的原液)，经6倍稀释后的溶液900ul，W/O的初乳100ul混合，然后25℃，30％超声强度，超声6次，即得到比较均一的复乳，即乳剂。该乳剂的组分如下按体积比，水相与油相的比例为91∶9，水相中稳定剂的浓度为0.032g/ml。
实施效果 (1)与PEI连接前后的磁性粒子的表征分析 取磁性粒子(MP-PLA)与稳定剂(MP-PLA-EDC-PEI)，分别取等体积去离子水ddH2O稀释后进行Zeta电位和粒径检测，结果见表1，从中可以看出，相对于MP-PLA，MP-PLA-EDC-PEI的粒径变大，表面电位也由负变正，说明PEI已经连接在MP-PLA的表面，因为其与PLA上的部分羧基反应，故使得磁性粒子表面的负电荷减少，导致粒子聚集，粒径变大；同时又因为PEI连接到MP-PLA表面，使MP-PLA-EDC-PEI表面带有众多氨基，故表面电位为正。
表1 (2)乳剂的表观形貌和稳定性考察 用普通照相机及光学显微镜对初乳和复乳的表观形貌进行观察。普通照相机结果见图1，A为初乳形成前的油相和水相，B为W/O初乳，C为W/O/W复乳；然后分别用PBS将初乳稀释5倍，复乳稀释40倍后在40倍光学显微镜下观察，结果见图2，A为稀释后的初乳，B为稀释后的复乳，可以看出，所形成的初乳和复乳表观均比较均一，光镜下观察乳滴形态比较稳定，复乳的乳滴粒径分布更加均一，且可以看见很多大乳滴中套小乳滴的情况，说明的确形成了W/O/W的复乳，也进一步证明在不加任何表面活性剂的情况下，仅以MP-PLA-EDC-PEI磁性粒子作为稳定剂就可以形成相对比较稳定的复乳。复乳在室温下静置，可稳定48小时，然后逐渐分为两层，但是上下两层界限仍然十分模糊，仍是复乳，只是上层油相比例大，下层水相比例大；将其稀释100倍后静置36小时，光学显微镜下观察仍然可以看见分散均匀的乳滴。以上证据表明利用本实施例的稳定剂制备的复乳稳定性较好。
(3)W/O/W复乳体外结合DNA能力 将复乳稀释10倍后放在10,0000的透析袋中，在PBS中透析4小时，然后取2ul透析之后的复乳经5倍稀释后分别与0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4ul的1.25ug/ul的PCS质粒混合，室温下静置10分钟后上样电泳，并取1ulPCS质粒作为对照。0.8％的琼脂糖凝胶，80V，电泳20分钟，然后在凝胶成像系统下观察拍照，找到复乳与DNA结合的最佳比例。琼脂糖凝胶电泳结果见图3，条带1～9分别代表2ul复乳与0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4ul的1.25ug/ul的PCS质粒复合后的电泳泳道，可以看出，前4个泳道几乎没有条带的出现，而其余泳道则出现了DNA条带，这说明2ul复乳可复合2ul的PCS质粒。
(4)W/O/W复乳的体外基因转染 按照2*104个细胞/孔的密度将COS-7细胞均匀接种于24孔板，培养16小时后，换成无血清的1640培养基继续培养4小时，然后同样在无血清的1640培养基里，每孔加入不同体积(0.1、0.2、0.3、0.4ul)的乳剂与3ul 0.4ug/ul的pGL3-control质粒复合后的产物进行转染，0.024ul0.1667g/ml的PEI同样与3ul 0.4ug/ul的pGL3-control质粒复合作为阳性对照；每个浓度4个平行孔，转染3.5小时。去掉上清后，换成含10％血清的培养基继续培养24小时，然后去掉培养液，用PBS洗细胞两次，再用裂解液裂解细胞，130ul裂解液/孔，37℃，裂解0.5小时，然后取10ul裂解液与10ulLuciferace底物混合物混合，照度计下检测。结果见图4，从转染结果来看，以MP-PLA-EDC-PEI磁性粒子作为稳定剂制备的W/O/W的复乳可以携带外源基因对cos-7细胞进行体外转染，并且具有一定的转染效率。在四个不同乳剂浓度中，0.2ul的转染效果最好，说明该乳剂也存在一定的毒性，只有找到合适的N/P，才能达到最佳的转染效果。
(5)W/O/W复乳的体外磁共振(MRI)成像 分别取稳定剂原液及W/O/W复乳原液，用去离子水进行适当地倍比稀释，得到一系列含有不同铁元素浓度的稳定剂稀释液及W/O/W复乳稀释液.然后用西门子公司的3T MRI扫描仪(TrioTim)来检测上述样品的MRI信号强度(T2加权相)。所用的参数为20℃，3T，spin-ethosequence，TR为8000ms，TE为19ms.具体结果见图5。A为稳定剂MP-PLA-EDC-PEI，B为W/O/W复乳。从中可以看出，在一定范围内，对于一个给定的铁元素浓度，W/O/W复乳与稳定剂MP-PLA-EDC-PEI相比，显示出相对更暗的影像，也就是说W/O/W复乳可以相对更强地增加影像的对比度，具有成为磁共振(MRI)成像的造影剂的潜力。
(6)制备含有SF6的W/O/W复乳 按照乳剂制备方法步骤一中的方法制备W/O初乳，之后将MP-PLA-EDC-PEI磁性粒子的原液稀释6倍后，取450ul作为外水相，50ul W/O初乳作为内水相，二者混在一起后即边通SF6边持续超声(100W)，分别通气2min和5min，即得到两种含气的复乳。稀释50倍后TEM(透射电镜)下观察，比较不同通气时间对形成的复乳的乳滴的形貌的影响，并用医院的超声检测仪来检测复乳乳滴中是否含气以及含气量的多少。
图6为W/O/W复乳在TEM下的形态图；可以看到短通气时间(2min)形成的复乳在TEM下乳滴普遍很小，粒径约为100～200nm，且乳滴缺乏立体感，见图6A，图6B；而长通气时间(5min)形成的复乳在TEM下观察则大部分乳滴普遍较大，粒径为500nm～1um，且乳滴普遍呈球形，立体感很强，见图6C，图6D。通过两种复乳的对比，证明了有SF6气体被包在乳滴当中，使得乳滴变大，且乳滴中间较亮周围较暗，同时也说明MP-PLA-EDC-PEI磁性粒子包在乳滴的外表面起到了稳定剂的作用。超声检测仪检测，采用CPS MSK的模式，14.0MHz的频率。通气2min形成的复乳在体外超声模式下观察，刚开始气泡就比较少，持续超声条件下显影效果逐渐减弱，大概可维持6min左右，见图7A，图7B；而通气5min形成的复乳在体外超声模式下，则一开始气泡就比较密集，且在持续超声条件下显影效果大概可维持10min左右，见图7C，图7D，这说明SF6气体被包在了复乳的乳滴当中，且形成的复乳具有成为超声诊断用造影剂的潜力。
权利要求
1.一种稳定剂的制备方法，其特征在于，取高分子聚合物和卤化铁并采用化学共沉淀法制备得到磁性纳米粒子，即稳定剂。
2.根据权利要求1所述的稳定剂的制备方法，其特征是，所述的制备方法具体是指将FeCl3和FeCl2溶于脱气水中，制备铁盐溶液；取高分子聚合物溶于脱气水中，得溶液，将该溶液与铁盐溶液混合，得混合溶液；将混合溶液置于冰水浴中，在氮气保护下边搅拌边进行如下操作逐滴滴加NaOH的水溶液，当pH值为10.5～11时停止滴定，继续冰浴；在氮气保护下将溶液油浴，离心，取上清，干燥，得稳定剂。
3.一种根据权利要求1所述的稳定剂的修饰方法，其特征在于，取1-(3-二甲氨基丙基)-3乙基碳二亚胺、所述的稳定剂以及聚乙烯亚胺的MES溶液混合并搅拌后，经透析干燥处理，得带正电稳定剂。
4.一种根据权利要求1所述的制备方法得到的稳定剂所合成的乳剂，其特征在于，该乳剂为油包水乳剂或水包油乳剂，其组分为水相、油相和所述稳定剂。
5.一种根据权利要求4所述的乳剂的用途，其特征在于，将该乳剂用于制备磁共振成像造影剂。
6.一种根据权利要求3所述的修饰方法得到的带正电稳定剂所合成的乳剂，其特征在于，该乳剂为水包油包水结构的复乳，其组分为水相、油相和所述带正电稳定剂。
7.根据权利要求6所述的乳剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤
步骤一，采用超声法制备水包油结构的初乳；
步骤二，利用水包油结构的初乳及带正电稳定剂制备水包油包水结构的复乳，即乳剂。
8.根据权利要求7所述的乳剂的制备方法，其特征是，步骤二中所述的制备是指在持续超声的环境下进行反应。
9.一种根据权利要求6所述的乳剂的用途，其特征在于，将该乳剂用于制备基因载体。
10.一种根据权利要求3所述的修饰方法得到的带正电稳定剂所合成的乳剂，其特征在于，该乳剂为水包油包水结构的复乳，其组分为水相、油相、所述带正电稳定剂和六氟化硫。
11.一种根据权利要求10所述的乳剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤
步骤一，采用超声法制备水包油结构的初乳；
步骤二，利用水包油结构的初乳及带正电稳定剂，在持续通入六氟化硫的条件下制备水包油包水结构的复乳，即乳剂。
12.一种根据权利要求10所述的乳剂的用途，其特征在于，将该乳剂用于制备超声诊断用造影剂。
全文摘要
一种生物医药技术领域的基于稳定剂的乳剂及其制备方法和用途，通过聚乳酸和卤化铁采用化学共沉淀法制备得到稳定剂；或进一步采用1-(3二甲氨基丙基)3乙基碳二亚胺及聚乙烯亚胺进行修饰得到稳定剂；通过将稳定剂与水相和油相混合来制备乳剂，以及将乳剂应用于基因载体、磁共振成像造影剂或超声诊断用造影剂。本发明制备所得的稳定剂具有较好的亲水亲油性和磁性，经过修饰后还具有一定的正电性；制备所得的乳剂具有磁性和正电性，具有成为磁基因载体和磁共振成像用的造影剂的潜力。通六氟化硫后所制备的乳剂还具有成为超声诊断用造影剂的潜力。
文档编号A61K49/22GK101757643SQ20101013350
公开日2010年6月30日 申请日期2010年3月26日 优先权日2010年3月26日
发明者徐宇虹, 郭微 申请人:上海交通大学