专利名称：一种复方丹参片的质量控制方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物分析技术中质量控制方法领域，尤其涉及一种复方丹参片的质量 控制方法及应用。
背景技术：
心脑血管疾病是严重危害人类的常见疾病。近年来，由于社会的发展，工作、生活、 及环境的变化，心脑血管疾病呈上升趋势。复方丹参制剂多用来治疗心脑血管疾病，例如复 方丹参片、复方丹参滴丸、冠心丹参滴丸等。这些复方丹参制剂(均含有丹参、三七)因其配 方不同，或者配方比例不同，或者提取精制方法不同，或者剂型不同，治疗效果也有所差异。以“君、臣、佐、使”相互制约和协调的复方制剂，强调从整体上发挥作用，多半不是 针对某个靶点，也不是若干成分的简单加合，仅靠单一成分的检测降低了鉴别的准确和专 属性，不能代表中药制剂的整体功效，不能反映其内在质量，及不能解决伪品掺杂等问题。 中药指纹图谱是一种综合的、可量化的化学鉴定手段，可以鉴别真伪，评价原料药材、半成 品和成品质量的均一性和稳定性，体现了中药作用的整体性和模糊性。近年来，国外对草药 产品的质量评价大力提倡色谱指纹图谱。通过图谱主要特征峰的峰位，面积或比例，反映出 化学成分的种类及数量的特征性，有效地判别真伪，评价优劣。色谱指纹图谱分析成为鉴别 中药真实性及评价质量一致性和产品稳定性的可行的模式。复方丹参片是由丹参、三七为主要原料制成的复方制剂，临床上用于治疗心脑血 管疾病、冠心病、心绞痛、心肌缺血等各类疾病，其治疗效果已经得到临床的验证。但目前复 方丹参片的质量标准仅选取丹参的一、二个活性成分或指标成分进行含量测定，并以其含 量多少来判定质量，具有一定的片面性，不完善，缺乏全面有效的质量控制方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是弥补已有技术的不足，目的在于提供一种有效可靠 的复方丹参片的质量控制方法。本发明的另一目的是提供上述控制方法的应用。为解决以上技术问题，本发明的技术方案是，一种复方丹参片的质量控制方法，包 括如下步骤(1)制备含丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、隐丹 参酮、丹参酮I、丹参酮II A的混合对照品溶液；(2)制备复方丹参片含水醇溶液作为供试品溶液；(3)采用高效液相色谱法分析上述对照品溶液，色谱条件色谱柱为十八烷基硅 烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相A为乙腈酸水溶液，流动相B为乙腈；(4)测定吸取供试品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到复方 丹参片高效液相色谱指纹图谱；(5)比较并根据对照品溶液的色谱图和供试品溶液的指纹图谱监控复方丹参片的质量。
优选地，步骤(3)中所述高效液相色谱法的梯度洗脱程序如下Omin时，流动相A 流动相B ==1000 ；
40min时，流动相A流动相B=7030
60min时，流动相A流动相B=4060
85min时，流动相A流动相B=1585其中，上述比例为体积比。优选地，步骤(3)中所述高效液相色谱法的流速1. OOOml/min。优选地，步骤(3)中所述高效液相色谱法的进样体积10μ 1 20μ 1。优选地，步骤(3)中所述高效液相色谱法的检测波长为274nm 286nm。优选地，步骤(3)中所述流动相A为10%乙腈0. 4%甲酸水溶液。优选地，步骤(3)中所述高效液相色谱法的柱温20°C 30°C。优选地，步骤(2)中所述制备复方丹参片供试品溶液的制备方法如下取复方丹 参片，除去包衣，用含水甲醇或含水乙醇提取，滤过，制成供试品溶液。优选地，步骤(3)和步骤(4)中所述指纹图谱有25个特征峰，各特征峰的保留 时间分另1J 为 6min、12min、21min、24min、25min、27min、29min、30min、31min、33min、35min、 48min、53min、56min、60min、62min、63min、66min、68min、71min、75min、76min、77min、 85min、88min，其中保留时间为 6min、24min、25min、27min、30min、60min、66min、68min、 75min的9个色谱峰依次与对照品溶液的色谱图中丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、 丹酚酸A、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮II A相同。另外，本发明还提供一种复方丹参片的质量控制方法的应用，是应用于鉴别复方 丹参片。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果以复方丹参片中的主要有效成分丹 参化学组分为指标建立起来的HPLC指纹图谱，代表着复方丹参片大部分药理活性，能有效 地表征复方丹参片的质量。从而实现对复方丹参片最大可能的化学成分进行检测，有利于 对产品质量的全面控制。以复方丹参片中丹参各有效成分指纹图形作为一个整体看待，注 重各个构成指纹特征峰前后顺序和相互关系，避免只测定一、二个化学成分儿判定复方丹 参片整体质量的片面性。本发明的方法建立了复方丹参片的指纹图谱技术标准，通过指纹 图谱中共有峰的有无及特征，有效地全面监控半成品和成品的质量，监控生产工艺的稳定 性，保证其质量的稳定、均一、可控。本发明还具有方法先进、稳定性和重现性好、可操作性 等优点。本发明采用高效液相色谱法构建了复方丹参片的指纹图谱，利用高效液相色谱指 纹特征可全面监控复方丹参片的质量，且通过建立的标准指纹图谱可以监控半成品与成品 生产工艺过程的稳定性。本发明提高了复方丹参片成品、半成品的质量监控标准，有效的避 免了产品伪造，保证该品种的正常生产、流通秩序。
图1是本发明的复方丹参片标准指纹图谱，图中从左到右的箭头所指分别是特征 峰1至25 ；图2是混合对照品与复方丹参片指纹图谱对应的色谱图，图中峰号1、2、3、4、5、6、7、8、9依次指示为丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、隐丹参 酮、丹参酮I、丹参酮II A。
具体实施例方式为了本领域的技术人员能够更好地理解本发明所提供的技术方案，下面结合具体 实施例进行阐述。一种复方丹参片的质量控制方法，包括以下步骤(1)制备含丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、隐丹 参酮、丹参酮I、丹参酮II A的混合对照品溶液，各组分的浓度均为0. 4mg/ml ；(2)制备复方丹参片含水醇溶液作为供试品溶液；(3)采用高效液相色谱法分析上述对照品溶液和供试品溶液，色谱条件色谱柱 为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为10%乙腈0.4%甲酸水溶液； 流动相B为乙腈；梯度洗脱程序如下，其中下述比例为体积比Omin时，流动相A 流动相B =1000 ；
40min时，流动相A流动相B=7030
60min时，流动相A流动相B=4060
85min时，流动相A流动相B=1585流速1. 000ml/min,进样体积10 20 μ 1 ；检测波长280nm ；柱温25°C ；(4)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到复 方丹参片高效液相色谱指纹图谱；(5)比较并根据对照品溶液的色谱图和供试品溶液的指纹图谱监控复方丹参片的质量。上述质量控制方法步骤(2)中所述复方丹参片含水醇溶液的制备方法如下取复 方丹参片，除去包衣，用含水甲醇或含水乙醇提取，滤过，制成供试品溶液。更具体地，该步 骤为取本品，糖衣片除去糖衣，薄膜衣片除去薄膜衣，研细，取约0.5 2g，精密称定，置具 塞锥形瓶中，精密加入含水甲醇或含水乙醇10 40ml，密塞，称定重量，超声处理5 30 分钟，放冷，再称定重量，用含水甲醇或含水乙醇补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤液，用 0. 45 μ m微孔滤膜滤过，作为成品供试品溶液。所述梯度洗脱的步骤也可用表1表示表1梯度洗脱表 按照本发明的方法，通过对多批次复方丹参片构建的高效液相色谱指纹图谱并进 行分析比较，找出其共有特征峰，标出各共有特征峰的保留时间Rt，得到复方丹参片标准 指纹图谱。其共有峰为25个，其保留时间Rt值分别为6min、12min、21min、24min、25min、 27min、29min、30min、31min、33min、35min、48min、53min、56min、60min、62min、63min、 66min、68min、71min、75min、76min、77min、85min、88min,其中 Rt 值为 6min、24min、25min、 27min、30min、60min、66min、68min、75min的9个色谱峰经确证为丹参素钠、迷迭香酸、紫草 酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮II A0以上色谱峰构成了 复方丹参片的指纹特征。1仪器与试药1. 1 仪器DI0NEX SUMMIT P680 高效液相色谱仪(ASI-100TM 自动进样器、PDA-100 二极管阵列检测器、变色龙色谱工作站)；色谱柱=Dikma PLATISIL ODS(250mmX4. 6mm, 5 μ m) ο1.2试药10批成品及对应的半成品，均由广州白云山和记黄埔中药有限公司提 供。实验中液相色谱所用试剂乙腈均为色谱纯，其余所用试剂均为分析纯，水为超纯水。2.方法与结果2. 1成品供试品溶液的制备分别取本品10片，研细，取约1. 0g，精密称定，置具塞 锥形瓶中，精密加入70%甲醇(或70%乙醇)20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率360W， 频率35kHz) 30分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇(或70%乙醇)补足减失的重量，摇勻， 滤过，取续滤液，用0. 45 μ m微孔滤膜滤过，作为成品供试品溶液。半成品供试品溶液的制备取本品流膏约0. 5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密 加入70%甲醇(或70%乙醇)50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率360W，频率35kHz) 30 分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇(或70%乙醇)补足减失的重量，摇勻，滤过，取续滤 液，用0. 45 μ m微孔滤膜滤过，作为半成品供试品溶液。混合对照品溶液的制备分别称取丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸 A、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮II A对照品约4mg，精密称定，用甲醇定容于 IOml量瓶中，制成每Iml含丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、 隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮II A各0. 4mg的混合对照品溶液。2. 2高效液相色谱分析精密吸取成品及半成品供试品溶液10 μ 1，进样；色谱条 件色谱柱为Dikma PLATISIL ODS C18，25(kimX4. 6謹，5 μ m ；流动相为流动相A为10%乙 腈0. 4%甲酸水溶液；流动相B为乙腈，采用表2的梯度洗脱方式表2梯度洗脱表 流速1. 000ml/min,进样体积10 μ 1 ；检测波长280nm ；柱温25°C ；得到复方丹参片 高效液相色谱指纹图谱。2. 3共有峰确定将上述得到的多批次复方丹参片的高效液相色谱指纹图谱经 《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行比较，共有模式(参照指纹图谱)共出 现 25 个。其保留时间 Rt 值分别为 6min、12min、21min、24min、25min、27min、29min、30min、 31min、33min、35min、48min、53min、56min、60min、62min、63min、66min、68min、71min、 75min、76min、77min、85min、88min ；25 个共有特征峰中，其中 Rt 值为 6min、24min、25min、 27min、30min、60min、66min、68min、75min的9个色谱峰经确证为丹参素钠、迷迭香酸、紫草 酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、隐丹参酮、丹参酮I、丹参酮II A ；它们构成了复方丹 参片的指纹特征，可作为复方丹参片的标准指纹图谱，具体见图1。对比混合对照品色谱图㈧及复方丹参片指纹图谱(B)，确定了复方丹参片中的9 个成分，具体见图2，图中A为混合对照品，B为复方丹参片。2. 4精密度试验取同一个复方丹参片供试品溶液连续进样6次，检测指纹图谱， 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价，结果表明供试品溶液相似度 均大于0.996，仪器的精密度良好。精密度结果见表3:表3精密度结果 2. 5稳定性考察取同一个复方丹参片供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10、12、24、 48小时进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行评价， 结果表明供试品溶液相似度均等于1，供试品溶液在放置48小时内稳定。稳定性结果见表
4 表4稳定性结果
2. 6重复性试验取同一批复方丹参片供试品6份，按“成品及半成品供试品溶液 的制备”项下方法制备，分别进样，检测指纹图谱，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A版》进行评价，结果表明供试品溶液相似度均大于0. 999，方法重复性好。结果见表 5 表5重复性结果 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对 本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改 进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
一种复方丹参片的质量控制方法，其特征在于，包括如下步骤(1)制备含丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮Ⅰ、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ、丹参酮ⅡA的混合对照品溶液；(2)制备复方丹参片含水醇溶液作为供试品溶液；(3)采用高效液相色谱法分析上述对照品溶液，色谱条件色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相A为乙腈酸水溶液，流动相B为乙腈；(4)测定吸取供试品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到复方丹参片高效液相色谱指纹图谱；(5)比较并根据对照品溶液的色谱图和供试品溶液的指纹图谱监控复方丹参片的质量。
2.根据权利要求1所述的复方丹参片的质量控制方法，其特征在于，步骤(3)中所述高效液相色谱法的梯度洗脱程序如下Omin时，流动相A 流动相B ==100 0 ；40min时，流动相A流动相B=70 3060min时，流动相A流动相B=40 6085min时，流动相A流动相B=15 85其中，上述比例为体积比。
3.根据权利要求1所述的复方丹参片的质量控制方法，其特征在于，步骤(3)中所述高 效液相色谱法的流速1. OOOml/min。
4.根据权利要求1所述的复方丹参片的质量控制方法，其特征在于，步骤(3)中所述高 效液相色谱法的进样体积10 μ 1-20 μ 1。
5.根据权利要求1所述的复方丹参片的质量控制方法，其特征在于，步骤(3)中所述高 效液相色谱法的检测波长为274nm 286nm。
6.根据权利要求1所述的复方丹参片的质量控制方法，其特征在于，步骤(3)中所述流 动相A为10%乙腈0.4%甲酸水溶液。
7.根据权利要求1所述的复方丹参片的质量控制方法，其特征在于，步骤(3)中所述高 效液相色谱法的柱温20°C 30°C。
8.根据权利要求1所述的复方丹参片的质量控制方法，其特征在于，步骤(2)中所述复 方丹参片含水醇溶液的制备方法如下取复方丹参片，除去包衣，用含水甲醇或含水乙醇提 取，滤过，制成供试品溶液。
9.根据权利要求1所述的复方丹参片的质量控制方法，其特征在于，步骤(3)和步 骤(4)中所述指纹图谱有25个特征峰，各特征峰的保留时间分别为6min、12min、21min、 24min、25min、27min、29min、30min、31min、33min、35min、48min、53min、56min、60min、 62min、63min、66min、68min、71min、75min、76min、77min、85min、88min,其中保留时间为 6min、24min、25min、27min、30min、60min、66min、68min、75min 的 9 个色谱峰依次与对照品 溶液的色谱图中丹参素钠、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸A、二氢丹参酮I、隐丹参 酮、丹参酮I、丹参酮II A相同。
10.权利要求1所述的复方丹参片的质量控制方法的应用，是应用于鉴别复方丹参片。
全文摘要
本发明公开一种复方丹参片的质量控制方法，包括如下步骤(1)制备混合对照品溶液；(2)制备复方丹参片含水醇溶液作为供试品溶液；(3)采用高效液相色谱法分析上述对照品溶液，色谱条件色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料，采用梯度洗脱，流动相A为乙腈酸水溶液，流动相B为乙腈；(4)测定吸取供试品溶液注入液相色谱仪，按照高效液相色谱法测定，得到复方丹参片高效液相色谱指纹图谱；(5)比较并根据对照品溶液的色谱图和供试品溶液的指纹图谱监控复方丹参片的质量。本发明还公开了一种质量控制方法的应用，是应用于鉴别复方丹参片。本发明的目的提供一种更为有效可靠的复方丹参片的质量控制方法。
文档编号A61P9/10GK101912440SQ20101025149
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者姚小华, 李楚源, 林青, 肖晓丽, 黄琳 申请人:广州白云山和记黄埔中药有限公司