专利名称：当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增殖药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种当归和川芎的中药组合物，具体涉及当归和川芎组合物的提取物 在制备促进卵巢颗粒细胞增殖药物中的新用途。
背景技术：
卵巢的生理功能包括排卵和内分泌功能，对女性的生殖功能、身心健康及生活质 量具有重要意义。卵巢功能失调可致排卵功能障碍、黄体功能异常及内分泌紊乱等，从而引 起多种妇科疾病，如子宫发育不良、不孕症、卵巢早衰、围绝经期综合征等，并可影响到全身 其它脏器的生理功能。卵巢颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞，其增殖与分化直接影响着卵 泡的发育、排卵、黄体形成以及留体激素的分泌等卵巢功能；卵巢中颗粒细胞是维持卵巢功 能的重要生殖细胞，其数量及分泌雌激素和孕激素的功能与卵泡发育状况呈正相关。目前， 西医在促卵巢颗粒细胞增殖，调节卵巢功能中主要依靠激素替代、促排卵治疗等手段，收到 一定疗效，但却存在许多副作用，而中药有多系统、多环节、多靶点的整体调节作用，且其副 作用少，在调节卵巢功能方面具有一定的优势。因此很有必要在中医药理论的指导下开发 出一种有效物质明确、疗效确切，副作用小、服用方便的治疗卵巢功能失调和促进卵巢颗粒 细胞增殖的药物。当归配伍川芎，为临床养血活血调经药对，该药对既可独立成方，如佛手 散、神验胎动方、芎归散等，又可以此药对为基础组方或配入其他方剂中使用，如用于调经 止痛的妇科良方四物汤及其类方均含有这两味药。现有技术中当归和川芎药对主要用于治 疗失血过多所致的眩晕、头痛及难产等症，未见有作为治疗卵巢功能失调和促进卵巢颗粒 细胞增殖的研究报道。发明内容
发明目的本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，在祖国传统中医 药理论的基础上，在当归和川芎药对研究基础上，开发其新的用途，提供当归和川芎组合物 的提取物在制备治疗卵巢功能失调和促进卵巢颗粒细胞增殖药物中的应用。本发明进一步 筛选出当归和川芎药对组合物的最佳配比，临床作为治疗卵巢功能失调和卵巢颗粒细胞增 殖促进药物具有有效成分明确、疗效好、副作用小、服用方便的优点。
技术方案为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为
当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增殖药物中的应用。
作为优选方案，本发明所述的当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细 胞增殖药物中的应用，其中当归和川芎组合物中当归和川芎的重量比为1 5 1 5。
作为进一步优选方案，本发明所述的当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵 巢颗粒细胞增殖药物中的应用，其中当归和川芎组合物中当归和川芎的重量比为1 2 1 2。
作为更优选的技术方案，所述的当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增殖药物中的应用，其中当归和川芎组合物中当归和川芎的重量比为2 1,1.5 1、 1 1、1 1. 5 或 1 2。
本发明所述的当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增殖药物中 的应用，所述的当归和川芎组合物的提取物可以通过水提取得到的水提物，提取方法可以 为煎煮法，回流提取法等。作为另一方案，所述的当归和川芎组合物的提取物可以通过醇， 优选浓度为50%的乙醇提取得到的醇提物，提取方法可以为浸泡法，回流提取法等。
本发明所述的当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增殖药物中 的应用，所述的当归和川芎组合物的提取物也可以是通过水提得到水提液，浓缩，再加入浓 度为95%乙醇提取，醇提取液浓缩干燥得到。
本发明所述的当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增殖药物中 的应用，其中当归和川芎组合物的提取物可以先采用水提法得到水提取物，浓缩后加入乙 醇进行沉淀，离心得上清液后上大孔吸附树脂去杂，采用浓度为20%至85%浓度的乙醇梯 度洗脱，收集浓度为30%至60%乙醇的洗脱液，浓缩，干燥得到精制的当归和川芎组合物 的提取物。所述的大孔吸附树脂为D101、D102或AB-8型大孔吸附树脂。本发明通过对不 同极性和不同型号树脂进行吸附和纯化能力的筛选，确定型号为D101、D102或AB-8型的大 孔吸附树脂吸附和纯化效果最好，同时本发明对20% 85%不同浓度乙醇的洗脱能力进 行了优选，以总洗脱物得率和机酸类与内酯类的含量作为指标，确定浓度为30%至60%的 乙醇的洗脱物总含量高，机酸类和内酯类有效成分含量高，且杂质少，因此确定浓度30%至 60%的乙醇为梯度洗脱溶剂。
本发明所述的当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增殖药物中 的应用，通过现代HPLC/HPLC-MS分析表明当归和川芎组合物的提取物的主要成分为绿原 酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯和正丁烯基酜内酯。
作为进一步的优选方案，当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增 殖药物中的应用，其中当归和川芎组合物的提取物可以和药学上可接受的载体制成胶囊 剂、颗粒剂、片剂、喷雾剂、注射剂、微囊、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。
本发明提供的当归和川芎组合物的提取物在制成片剂时将当归和川芎组合物的 提取物和载体乳糖或玉米淀粉，需要时加入润滑剂硬脂酸镁，混合均勻，然后压片制成片 剂；本发明提供的当归和川芎组合物的提取物制成胶囊剂时把当归和川芎组合物的提取物 和载体乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，然后装胶囊制成胶囊剂；制成颗粒剂时，把当归和 川芎组合物的提取物和稀释剂乳糖或玉米淀粉混合均勻，整粒，干燥，制成颗粒剂。
有益效果本发明提供的当归和川芎组合物的提取物在作为制备促进卵巢颗粒细 胞增殖药物中的应用具有以下优点
本发明根据中医药理论和卵巢功能失调和卵巢颗粒细胞生长不足的发病机制，充 分利用中药资源，在当归和川芎药对现有研究的基础上，通过大量药理实验，开发出当归和 川芎药对在治疗卵巢功能失调和促进卵巢颗粒细胞增殖中的新的用途，并且通过大量实验 筛选出活性最强的当归和川芎组合物的重量配比；临床作为治疗卵巢功能失调和卵巢颗粒 细胞增殖促进药物具有有效成分明确、疗效好、副作用小、服用方便等优点。
本发明还通过现代仪器分析，确定当归和川芎组合物中主要的活性成分，包括有 机酸类的绿原酸和阿魏酸及其内酯类的洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯和正丁烯基酜内酯。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1当归和川芎组合物的提取物对卵巢颗粒细胞增殖的影响
1、实验材料
1.1主要仪器
SpectrumMAX190 全自动酶标仪(美国 Molecular Devices 公司)，XSZ-D2 光学倒 置显微镜(重庆光学仪器厂)，NU-49500)2培养箱(美国NuAire公司)，D23离心机(德 国Hermile公司)。Waters 2695高效液相色谱仪(美国waters公司)，^96PDA 二极管 阵列检测器(美国waters公司)，自动进样器；Empower色谱工作站(美国waters公司)。 KQ-250E型超声波清洗器(昆山超声波仪器有限公司)，EPED型超纯水系统。
1. 2实验动物
21日龄清洁级健康SD雌性大鼠，体重60 70g，购自南京医科大学实验动物中 心，动物许可证号SCXK(苏)2008-0004。
2、实验方法
2. 1样品制备
当归川芎药对O 1、1.5 1、1 1.5、1 2、1 0、1 1、0 1)7 个配比混合药材各^g，每个配比再均分成4份，每份2kg分别进行热回流水提取(近似模拟水煎)、 热回流50%醇提取(近似模拟酒制)、先水提再用95%醇提(近似模拟散剂应用)和先水 提再用95%醇提后上大孔吸附树脂洗脱，将4种提取液分别浓缩干燥至浸膏，得到不同配 比和提取方法得到的当归川芎药对提取物样品。
2. 2卵巢颗粒细胞的分离与原代培养
取3周龄雌性SD大鼠，颈部皮下注射PMSG 50IU，以促进卵泡发育，4 后颈 椎脱白法处死。浸入酒精缸中消毒5分钟，在无菌条件下迅速剖取卵巢放入预冷的无 菌D-Hank’ s中，去除卵巢周围组织及表面包膜，D-Hank' s逐个清洗3次后置于预冷的 McCoy' 5A培养基中。用25号针头刺破卵泡，使颗粒细胞释放入McCoy’ 5A培养基，离心管 内吹打分散成单个悬浮细胞，200目不锈钢细胞筛过滤。lOOOr/min离心5min，洗涤滤液，弃 上清收集细胞。向沉积在离心管底的细胞团中加入McCoy’ 5A培养基制成单细胞悬液。台 盼蓝染色，计数，细胞活率为70%。将细胞稀释成浓度为1.0X 106/ml的细胞悬液，接种于 96孔培养板中，在37°C、5% CO2培养箱中培养24h后第2天加入待测样品，并设立溶剂对 照组，继续培养4 后用MTT法测定细胞生长情况。实验重复3次。
2. 3数据处理与统计
由于不同批次实验可能存在的细胞密度的差异，影响了不同批数据间的比较，因 此我们对所获的数据进行处理，除以空白对照组，得到细胞增殖的促进率。
细胞增殖的促进率=(给药组OD值-溶剂对照组OD值)/溶剂对照组OD 值 X 100%
实验结果以^表示。采用SPSS16. 0统计软件处理数据，组间比较采用t检验。
3、实验结果
具体实验结果见表1，由表1的实验结果表明不同配比及不同制备方法得到的当 归及川芎提取物对卵巢颗粒细胞均有很好的增殖促进作用，比单个的当归和川芎提取物具 有更加明显的促进卵巢颗粒细胞增殖作用，表明本发明提供的当归和川芎组合后起到了协 同增效的作用，并不是简单量的叠加，并且由实验结果表明，当归和川芎的水提物重量比在 1 2时，卵巢颗粒细胞增殖促进作用最强；醇提液中，当归和川芎1 1重量配伍时，促增 殖效果最好；水提后醇提液中，当归或川芎重量配比在1 1.5时，促增殖率较高，水提醇沉 大孔树脂洗脱物中，当归或川芎重量配比在1 1.5时，促增殖率较高。
表1当归和川芎药对不同配比及不同提取方法对大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响
权利要求
1.当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增殖药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增 殖药物中的应用，其特征在于，所述的当归和川芎组合物中当归和川芎的重量比为1 5 1 5。
3.根据权利要求2所述的当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增 殖药物中的应用，其特征在于，所述的当归和川芎组合物中当归和川芎的重量比为1 2 1 2。
4.根据权利要求3所述的当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增 殖药物中的应用，其特征在于，所述的当归和川芎组合物中当归和川芎的重量比为2 1、 1. 5 1、1 1、1 1. 5 或 1 2。
5.根据权利要求1所述的当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增殖 药物中的应用，其特征在于，所述的当归和川芎组合物的提取物为当归和川芎的水提物、醇 提物或者是先水提后再用醇提取得到的提取物。
6.根据权利要求1所述的当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增殖 药物中的应用，其特征在于，所述的当归和川芎组合物的提取物通过以下方法提到取当归 和川芎组合物通过水提得到水提液，浓缩，加入乙醇沉淀，离心得到上清液，浓缩，上大孔吸 附树脂，用浓度为20%至85%的乙醇梯度洗脱，收集浓度为30%至60%乙醇洗脱液，合并， 浓缩，干燥，即得。
7.根据权利要求1至6任一项所述的当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒 细胞增殖药物中的应用，其特征在于，所述的当归和川芎组合物的提取物的主要成分为绿 原酸、阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯和正丁烯基酜内酯。
全文摘要
本发明公开了当归和川芎组合物的提取物在制备促进卵巢颗粒细胞增殖药物中的新应用。本发明对大量古今方剂和中医应用数据进行深入研究，并根据中医药理论和卵巢功能失调和卵巢颗粒细胞生长不足的发病机制，充分利用中药资源，在当归和川芎药对现有研究的基础上，通过大量药理实验，开发出当归和川芎药对在治疗卵巢功能失调和促进卵巢颗粒细胞增殖中的新用途，并且本发明通过大量实验筛选出活性最强的当归和川芎组合物的重量配比，临床作为治疗卵巢功能失调和卵巢颗粒细胞增殖促进药物具有疗效好、有效成分明确、副作用小、服用方便等优点。
文档编号A61K36/236GK102028728SQ20101056540
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者华永庆, 唐于平, 李伟霞, 段金廒, 禹良艳, 钱大玮 申请人:南京中医药大学