专利名称：一种恒河猴老年痴呆模型的建立方法及药物筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种恒河猴老年痴呆模型的建立方法，属药物领域。
背景技术：
老年痴呆是伴随老化而出现认知功能障碍为主的疾患，认知功能的完善与中枢胆碱能系统功能的健全密切相关；针灸治疗老年痴呆具有一定的疗效，对老年痴呆患者的智能提高(改善学习记忆功能障碍)及临床症状改善均有明显的作用。(刘雨星，等，电针对穹隆一海马伞损伤老年痴呆大鼠学习记忆行为影响的实验研究，《中国康复医学杂志》，2004 年19卷3期)
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种恒河猴老年痴呆模型的建立方法。本发明的另一技术方案是提供了一种筛选治疗老年性痴呆药物的方法。本发明提供了一种恒河猴老年痴呆模型的建立方法，它包括如下步骤a、麻醉实验恒河猴；b、将麻醉后的实验猴固定于脑立体定向仪上，确定海马伞的位置；C、在手术区皮下注射麻醉剂；取冠状缝前、旁中线3cm的额部皮肤切口，钻孔；d、将双极电凝针插入海马，用射频仪，先电刺激观察有无不适、心率改变、肢体抽搐；再用60°C 20秒预毁损，观察心率、血压、肢体肌力有无改变、无并发症出现，然后用 750C 60秒毁损靶区，制造直径4 6mm的毁损灶；e、拔出射频针，缝合创口，创口消毒，给予80万单位青霉素G，即可建立恒河猴老年痴呆模型。本发明提供了所述的方法制备的动物模型在筛选治疗老年痴呆的药物中的用途。本发明提供了一种筛选治疗老年性痴呆药物的方法，它包括如下步骤a、建立恒河猴老年痴呆动物模型；b、将候选药物施用于动物模型；C、观察候选药物对老年痴呆疾病的量化指标的影响情况，并进行评分，评价潜在治疗老年痴呆的药物。其中，所述的恒河猴老年痴呆动物模型的建立方法的步骤是a、麻醉实验恒河猴；b、将麻醉后的实验猴固定于脑立体定向仪上，确定海马伞的位置；C、在手术区皮下注射麻醉剂；取冠状缝前、旁中线3cm的额部皮肤切口，钻孔；d、将双极电凝针插入海马，用射频仪，先电刺激观察有无不适、心率改变、肢体抽搐；再用60°C 20秒预毁损，观察心率、血压、肢体肌力有无改变、无并发症出现，然后用 750C 60秒毁损靶区，制造直径4 6mm的毁损灶；e、拔出射频针，缝合创口，创口消毒，给予80万单位青霉素G，即可建立恒河猴老年痴呆模型。本发明动物模型的建立方法采用热凝探针定点损毁恒河猴海马伞致老年痴呆模型，方法可靠，重复性好，能在一定程度上很好的模拟人类老年痴呆的症状，对于干细胞治疗老年痴呆提供了稳定的动物模型。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明的上述基本技术思想前提下，还可以作出其它多种形式的修改、替换和变更。以下通过实施例形式的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
图1手术前后MRI比较图2手术前后常规观察比较图3手术前后取食成功率比较图4手术前后极限时间比较
具体实施例方式实施例1本发明动物模型建立方法通过热凝探针定点损毁恒河猴海马伞，建立恒河猴老年痴呆动物模型，为研究干细胞治疗老年痴呆提供实验基础。1、试验材料德国西门子1. 5T磁共振成像仪深圳安科脑立体定位仪(ASA-602S内置功能图谱，猴适配器)深圳安科温控热凝射频仪(ASA-601T)2、实验动物普通级成年健康恒河猴2只，雄性，年龄5-7周岁，体重范围为54kg，由四川成都平安动物繁育研究基地(生产许可证号SCXK(川)2004-01 引进。入室前一周进行血常规、肝功能、尿常规检查。结核菌素、寄生虫、沙门氏菌、致贺氏菌检查。检疫合格后，纳入实验。恒河猴饲养于国家成都中药安全性评价中心普通动物房(实验动物房使用许可证号SYXK(川)2003-030)，不锈钢猴笼分笼饲养，饲养条件符合国标GB14925-2001，室温 21 士5°C (日温差彡40C )，相对湿度55士 15%，12小时明暗交替，换气次数8 10次/小时。猴配合饲料(北京科澳协力饲料有限公司提供，生产许可证SCXK(京)2005-0007)喂养，反渗透水自由饮用，每日添加水果。动物挂颈牌和笼上贴标签作为动物识别标记。3、实验方法以0. 2ml/kg的剂量对实验猴肌肉注射氯胺酮(5% )进行预麻醉，然后再以Iml/ kg的剂量静脉注射戊巴比妥钠(3% )。将麻醉后的实验猴固定于脑立体定向仪上，在MRI图上确定海马伞的位置，用计
4算机计划系统确定三维坐标值。(1)在手术区皮下注射利多卡因。(2)取冠状缝前、旁中线3cm的额部皮肤切口，钻孔。(3)将双极电凝针插入海马，用射频仪，先电刺激观察有无不适、心率改变、肢体抽搐；再用60°C 20秒预毁损，观察心率、血压、肢体肌力有无改变。无并发症出现，然后用 750C 60秒毁损靶区，大约制造直径4 6mm的毁损灶。(4)拔出射频针，缝合创口，创口消毒，给予80万单位青霉素G，完成手术。4、观察与检查4. 1术后观测与检测4. 1. 1术后常规饲养，并监测创口愈合情况。4. 1. 2记录手术记录，纳入实验记录档案。4. 2模型成功评判标准4. 2. 1延迟取食训练所有实验动物在手术前预先进行行为学训练。(1)实验每周进行5天，每天1次。(2)在猴笼外放训练装置，板上有四个食槽，可于内放置食物颗粒，食槽上方置一可移动木板盖，可移动盖子遮蔽或暴露食槽。训练猴通过触摸放有食物的食槽，拨开盖子以获得食物。(3)在实验猴可见范围内，将食物随机放进任一食槽。遮蔽所有食槽，然后将训练装置置于实验猴可及范围，使之自由选择，记录一次性成功率，只有选择正确方给予食物奖励。此为Os延迟，每次训练10次，当成功率达到100%后，进行下一时间段训练。(4)仍在实验猴可见范围内，随机放置食物至任一食槽，遮蔽所有食槽并将装置置于实验猴不可见区域As后再行上述训练，一周平均成功率需达90%-100%。此为IOs延迟，每次训练10次。(5)按照k延迟的步骤，继续进行延迟时间为20S、30S、60S、90S、120S的训练，成功率分别需达 85% -95%,75% -85%,65% -75%,55% -65%,40% -55%—周平均。(6)完成上述训练后，进行极限时间的训练，以实验猴能达到20%成功率的最长时间为极限时间，训练满3个月后，连续记录实验猴一周的极限时间并计算平均值。(7)手术后，再次进行训练，记录猴在整个实验中的成功率与极限时间，与术前进行比较。(8)手术后，从术后第1日至第1月末，每天进行一次上述实验，纪录时间，并与术前进行比较。1个月后，每周对实验猴活动进行一次上述实验，一直记录至实验终止(实验终止包括动物死亡、实验动物症状完全消失或手术后6个月)。(9)模型成功的评判每只动物比较术前和术后最大延迟间隔时间的差异，可用自身对照分析，如果有统计学意义，说明模型成功。4. 2. 2常规行为学观察(1)在笼养后第7天、第14天对实验猴活动情况进行观察。术前2天再次对实验猴活动情况进行观察，确定无异常，方可进行造模。(2)在术后第1日至第1月末，对实验猴活动情况每日进行观察。1个月后，每周对实验猴活动情况进行观察，直至实验终止(实验终止包括动物死亡、实验动物症状完全消失或手术后6个月)，并与术前比较。如实验猴在观察期内出现异常表现，应进行录像记录。5、实验结果，见图1。术后可见海马穹窿伞处出现明显的瘢痕形成，提示热凝损毁成功，见图2。手术创伤恢复后，可见实验猴注意力集中能力明显下降，性格发生明显变化，表现为丧失警惕性、 无论是饲养及训练人员或者是陌生人员均能主动亲近、取食速度明显减慢且常无视干扰下仍自主进食。常有无意义的行为出现，如反手握足并抽搐、频繁将肢体伸出笼外不知收回以致出现擦伤等。见图3，从图中可见，术后，两猴在无延迟时间的情况下，成功率无大的下降， 但是在进行延迟后，均出现极为明显的降低，差异有统计学意义(P<0.01)。30s之后的延迟，两猴均无法完成。从图4中可见，术后两猴能完成训练的极限时间明显降低，差异有统计学意义(P < 0.01)，该结果证明造模成功。实验结果可知，本发明动物模型是采用热凝探针定点损毁恒河猴海马伞致老年痴呆模型，能在一定程度上很好的模拟人类老年痴呆的症状，对于干细胞治疗老年痴呆提供了稳定的动物模型，该建模方法可靠，重复性好。实施例2利用治疗老年痴呆的经典药物验证本发明老年痴呆模型并初步建立相关药物筛选体系a、按实施例1所述的方法建立恒河猴老年痴呆动物模型；b、将经典治疗老年痴呆的药物、候选药物分别施用于本发明动物模型；c、与治疗老年痴呆的经典药物相比，观察候选药物对老年痴呆疾病的量化指标的影响情况，并进行评分，评价潜在治疗老年痴呆的药物；同时也验证了本发明老年痴呆动物模型用于药物筛选的可行性。经过步骤c的评价，经典药物能明显改善模型猴的症状，证明本发明猴老年痴呆模型建模成功，同时也证明了该药物筛选体系是有效的。经过步骤c的评价，如果候选药物对上述猴老年痴呆病的症状有改善的，并达到类似经典治疗药物的评分标准，即证明该候选药物具有治疗老年痴呆的作用。
权利要求
1.一种恒河猴老年痴呆模型的建立方法，它包括如下步骤a、麻醉实验恒河猴；b、将麻醉后的实验猴固定于脑立体定向仪上，确定海马伞的位置；C、在手术区皮下注射麻醉剂；取冠状缝前、旁中线3cm的额部皮肤切口，钻孔；d、将双极电凝针插入海马，用射频仪，先电刺激；再用60°C20秒预毁损，然后用 750C 60秒毁损靶区，制造直径4 6mm的毁损灶；e、拔出射频针，缝合创口，创口消毒，给予80万单位青霉素G，即可建立恒河猴老年痴呆模型。
2.权利要求1所述的方法制备的动物模型在筛选治疗老年痴呆的药物中的用途。
3.一种筛选治疗老年性痴呆药物的方法，它包括如下步骤a、建立恒河猴老年痴呆动物模型；b、将候选药物施用于动物模型；c、观察候选药物对老年痴呆疾病的量化指标的影响情况，并进行评分，评价潜在治疗老年痴呆的药物。
4.根据权利要求3所述的筛选药物的方法，其特征在于所述的恒河猴老年痴呆动物模型的建立方法的步骤是①、麻醉实验恒河猴；②、将麻醉后的实验猴固定于脑立体定向仪上，确定海马伞的位置；③、在手术区皮下注射麻醉剂；取冠状缝前、旁中线3cm的额部皮肤切口，钻孔；④、将双极电凝针插入海马，用射频仪，先电刺激；再用60°C20秒预毁损，然后用 750C 60秒毁损靶区，制造直径4 6mm的毁损灶；⑤、拔出射频针，缝合创口，创口消毒，给予80万单位青霉素G，即可建立恒河猴老年痴呆模型。
全文摘要
本发明提供了一种恒河猴老年痴呆模型的建立方法。本发明还提供了一种筛选治疗老年性痴呆药物的方法。本发明动物模型的建立方法采用热凝探针定点损毁恒河猴海马伞致老年痴呆模型，方法可靠，重复性好，能在一定程度上很好的模拟人类老年痴呆的症状，对于干细胞治疗老年痴呆提供了稳定的动物模型。
文档编号A61P25/28GK102551910SQ201010608698
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者周彦来, 徐策, 李宏霞, 王莉, 程峰 申请人:四川大学华西医院, 国家成都中药安全性评价中心, 成都华西海圻医药科技有限公司