番茄红素在制备防治老年痴呆药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种防治老年痴呆的药物，该药物是番茄红素(Lycopene)。本发明揭示，番茄红素(Lycopene)能减少老年性痴呆大鼠大脑皮质和海马区骨架蛋白tau的异常过度磷酸化并改善动物学习、记忆障碍，能用于老年性痴呆的预防和治疗。
【专利说明】番茄红素在制备防治老年痴呆药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药领域，涉及防治老年痴呆的药物。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病（Alzheimer Disease,AD)是一种典型的神经退行性疾病，是最常见 的痴呆形式，其主要临床症状为近记忆力损害，认知能力下降和思维障碍，且进行性加重， 最后因生活不能自理而死亡，病程一般8?10年。随着社会老龄化进程的加快，AD的患病 人数急剧上升，已成为威胁老龄特别是高龄人群身心健康的头号疾病，并给社会和家庭带 来了严重的负担。
[0003] AD病人大脑的主要病理改变是大量神经纤维缠结（neurofibrillary tangles, NFTs)和老年斑（senile plaque, SP)的形成，其分子标志物分别是异常磷酸化的tau蛋白 和β_淀粉样蛋白（Αβ)。国外学者已采用转基因技术，在小鼠成功地复制出β-淀粉样蛋 白沉积形成的老年斑样病变，从而使得未来AD治疗将减少Α β沉积作为药物干预的靶标成 为可能。NFTs的数量与AD临床痴呆程度正相关。因此，干预NFTs对AD的防治尤为重要。 自从发现NFTs的主要成分是异常高度磷酸化的tau蛋白聚集形成的双螺旋丝以来，国内外 学者普遍认为，骨架蛋白tau的异常高度磷酸化是NFTs形成的关键步骤。高度磷酸化tau 蛋白的聚集不仅以神经缠结的形式存在，它也是神经毡纤丝和老年斑中的营养不良突起的 主要成分。
[0004] 目前尚没有针对老年性痴呆病理特征的特效治疗药物和方法，常用的减缓老年痴 呆发作药物有：（1)改善胆碱神经传递药物：老年痴呆的一个主要原因是胆碱不足导致记 忆衰退。因此乙酰胆碱酯酶（AchE)抑制剂通过增强胆碱能作用在老年痴呆治疗方面发挥 了重要作用；（2)改善脑血液循环和脑细胞代谢的药物：此类药物可以扩张脑血管以改善 老年痴呆患者的糖、蛋白、核酸、脂质等代谢障碍；（3)钙拮抗剂：此类药物易于通过血脑屏 障，选择性扩张脑血管，从而改善记忆和认知功能；(4)激素类药物：主要缓解女性患者的 症状。然而，这些药物仅对中晚期老年性痴呆患者的痴呆症状有所轻度改善或延缓痴呆进 展。因此研发新的针对老年性痴呆病理学特征的药物，成为全球的期待。
[0005] 番茄红素是一种类胡萝卜素烃，属于天然的红色色素，大量存在于红色的水果和 蔬菜中，如西红柿，木瓜，粉红葡萄柚，番石榴和西瓜。番茄红素天然且有益健康，有"植物黄 金"之称，是很好地抗氧化剂。除清除自由基作用外，番茄红素还能够抑制基因的诱变，并可 以通过影响细胞间缝隙连接调节生长代谢。并且先前的一些在体和离体实验均表明，
[0006] 番茄红素对慢性疾病如心血管疾病，动脉粥样硬化，癌症（特别是前列腺癌）和神 经退行性疾病具有保护作用。目前美国、法国、日本、澳大利亚均已相继出品相关的药物或 保健品。
【发明内容】
[0007] 本发明的任务是提供一种用于预防和治疗老年性痴呆药物。
[0008] 实现本发明的具体方案是：
[0009] 本发明提供的用于预防和/或治疗老年性痴呆药物的药物是番茄红素 (Lycopene)。本发明揭示，番爺红素（Lycopene)能减少老年性痴呆大鼠大脑皮质和海马区 骨架蛋白tau的异常过度磷酸化并改善动物学习、记忆障碍。番茄红素（Lycopene)能用于 老年性痴呆的预防和/或治疗。
[0010] 实验资料：
[0011] 本发明通过给大鼠灌服番茄红素（Lycopene)，发现其可以改善AD样动物模型的 tau蛋白过度磷酸化与学习、记忆障碍。
[0012] 具体操作步骤如下：
[0013] 1.实验对象
[0014] 雄性Wistar大鼠（华中科技大学同济医学院实验动物实验中心提供），SPF级，体 重250?300克，45只，常规环境饲养。随机分为三组：①正常组（con);②造模组（hey); ③治疗组（hcy+lyco);
[0015] 2.实验模型制备
[0016] ①正常组：尾静脉注射生理盐水，lml/kg。
[0017] ②造模组：通过尾静脉注射给予同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次， 持续14天，剂量为400 μ g/kg，构建早老性痴呆动物模型。
[0018] ③治疗组：通过尾静脉注射同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，剂量为400 μ g/ kg，每天1次，持续14天；然后大鼠灌胃给予番爺红素（Lycopene)，每天一次，持续14天， 剂量为40mg/kg。
[0019] 3.研究方法
[0020] 大鼠学习记忆的能力：Morris水迷宫训练及测试；离体脑片LTP技术；高尔基染 色海马磷酸化tau阳性细胞的显示：免疫印迹
[0021] 4.实验结果
[0022] *Ρ〈0· 05,与正常组比较
[0023] **Ρ〈0. 01，与正常组比较
[0024] *#Ρ〈0. 001，与正常组比较
[0025] #Ρ〈0· 05，与造模组比较
[0026] ##Ρ〈0. 01，与造模组比较
[0027] ###Ρ〈0· 001，与造模组比较
[0028] (DMorris水迷宫训练及测试结果：造模组与正常组相比出现明显学习记忆障碍 (图1)，统计结果表明水迷宫测试的潜伏期明显延长，学习的时间延长，见图1。造模组在目 标象限停留时间和距离以及穿越平台的次数明显减少，见图2,说明记忆能力的减退。治疗 组与造模组相比潜伏期时间变短，目标象限停留次数和穿越平台次数增加，其学习和记忆 能力都得到了良好的改善。
[0029] (2)脑片LTP结果（见图3):造模组与治疗组的兴奋性突触后电位（fEPSP)的斜 率分别增加了约1. 2倍和1. 6倍，说明Hey破坏了突触的功能，而同时补充番茄红素能够使 EPSP的斜率得到有效的恢复，从而改善学习记忆能力。
[0030] (3)高尔基染色结果（见图4) :Hcy处理组的大鼠脑片中，CA1区神经元树突棘密 度和成熟的蘑菇型树突棘均出现了明显的减少，而同时补充番茄红素能够有效的挽救这种 改变。
[0031] (4) Tau磷酸化免疫印迹结果（见图5)
[0032] 与正常组相比较，造模组大鼠的大脑海马内tau蛋白在丝氨酸198/199/202,苏氨 酸205,丝氨酸212,丝氨酸214,丝氨酸262,丝氨酸396,丝氨酸404位点，磷酸化水平明显 增高，番爺红素（Lycopene)治疗后，tau磷酸化水平明显下降。
[0033] 5.结论及用法建议：
[0034] 以上结果显示给予同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)尾静脉注射的老鼠水迷宫 训练及检测过程中平台的潜伏期增加，穿越平台次数明显减少说明大鼠的学习和记忆能力 损伤，检测早老性痴呆相关指标tau蛋白磷酸化，tau蛋白的磷酸化水平显著上升，说明大 鼠早老性痴呆造模成功。
[0035] 跟造模组相比较，在给与了番茄红素（Lycopene)处理后，检测老鼠水迷宫行为 学，其学习和记忆能力得到了有效的改善；同时，早老性痴呆相关指标tau蛋白磷酸化明显 降低以及记忆相关的突触功能明显改善，说明番茄红素（Lycopene)能缓减老年性痴呆大 鼠大脑皮质和海马区骨架蛋白tau的异常过度磷酸化并改善动物学习、记忆障碍。番茄红 素（Lycopene)能用于老年性痴呆的预防和治疗。番茄红素作为一种天然且含量丰富的物 质，
[0036] 是安全也无不良作用的。
[0037] 参考徐舒云教授主编的《药理实验方法学，》在其附录中有一个表，列出了人和动 物按体表面积折算的等效剂量比值。我们可以算出大鼠剂量与人的比值：
[0038] 大鼠体型系数：0· 09标准体重：200g = 0· 2kg
[0039] 大鼠的折算系数=(体型系数大鼠*W大鼠2/3 V (体型系数人*W人2/3)
[0040] =(0· 09*0. 22/3)/0· 1*702/3)*70Χ/0·4
[0041] =0.018
[0042] 我们理想的认为，对任何药物，大鼠和人的敏感程度是完全一样的，经换算后人的 临床剂量约为〇· 72mg/d。
【专利附图】
【附图说明】
[0043] 图1为水迷宫测试大鼠鼠游泳学习轨迹图和潜伏期统计结果。图中：*P〈0. 01， 与正常组比较；***P〈〇. 01，与造模组比较。正常组：尾静脉注射生理盐水，lml/kg。造 模组：通过尾静脉注射给予同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次，持续14天， 剂量为400 μ g/kg，构建早老性痴呆动物模型。治疗组：通过尾静脉注射同型半胱氨酸 (Homocysteine, Hey)，剂量为400 μ g/kg，每天1次，持续14天；然后大鼠灌胃给予番爺红 素（Lycopene),每天一次，持续14天，剂量为40mg/kg。
[0044] 雄性Wistar大鼠随机分为三组①正常组：尾静脉注射生理盐水，lml/kg。②造 模组：通过尾静脉注射给予同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次，持续14天， 剂量为400 μ g/kg，构建早老性痴呆动物模型。③治疗组：通过尾静脉注射同型半胱氨酸 (Homocysteine, Hcy)，剂量为400μ g/kg，每天1次，持续14天；然后大鼠灌胃给予番爺红 素（Lycopene),每天一次，持续14天，剂量为40mg/kg。
[0045] 实验所采用Morris水迷宫测试系统包括圆形水池直径120cm，高60cm ;圆柱形有 机玻璃平台直径l〇cm，高40cm。水池中水面高约45cm，室温及水温均保持在26± 2°C，平台 放置于某一象限的中心位置，并没于水面下约2cm。训练时将大鼠从任一象限1/2弧度处头 面向池壁轻放于水中，检测其潜伏期（即大鼠从入水点起到找到平台所用的时间）、游泳路 径作为衡量大鼠学习记忆和测试成绩的指标。每只大鼠每天在3个象限训练1次，每次游 泳时限为60s，即在60s内未找到平台者系统自动停止记录，潜伏期记60s，由测试者引导 其上台，适应30s后进行下一次训练。首先进行为期6天的训练，然后让大鼠休息1天，第 8天，撤去平台进行测试，记录大鼠找到平台的潜伏期，目标象限停留时间及目 [0046] 标平台穿越次数。
[0047] 结果显示跟正常组相比造模组大鼠游泳轨迹混乱，找到平台所需潜伏期时间最 长，说明大鼠学习能力受到损伤，在给予番茄红素（Lycopene)后，治疗组大鼠跟造模组相 比轨迹重新恢复简单，潜伏期变短，学习能力得到明显改善。
[0048] 图2为水迷宫测试老鼠穿越平台次数及时间和距离统计结果。图中：*p〈0. 05， **p〈0. 01，与正常组比较；#p〈0. 05与造模组比较。正常组：尾静脉注射生理盐水，lml/ kg。造模组：通过尾静脉注射给予同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次，持续14 天，剂量为400 μ g/kg，构建早老性痴呆动物模型。治疗组：通过尾静脉注射同型半胱氨酸 (Homocysteine, Hey)，剂量为400 μ g/kg，每天1次，持续14天；然后大鼠灌胃给予番爺红 素（Lycopene)，每天一次，持续14天，剂量为40mg/kg。
[0049] Morris水迷宫测试系统经过6天训练，大鼠学会如何寻找平台后。休息一天，去平 台，计算3分钟内大鼠在目标象限的停留时间并分析其在平台所在位置的穿越次数，以评 价其记忆能力。
[0050] 结果表明造模组大鼠穿越平台的时间和距离最短，次数最少，说明造模组老鼠的 记忆能力受到损害，不记得平台的位置；治疗组大鼠跟造模组相比穿越平台的时间和距离 恢复到正常一致，穿越平台次数也相应增加，其记忆能力在给予番茄红素（Lycopene)后得 到明显恢复。
[0051] 图3为脑片LTP结果。图中：#P〈0. 01，与造模组比较。造模组：通过尾静脉注射 给予同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次，持续14天，剂量为400 μ g/kg，建立早 老性痴呆动物模型。治疗组：通过尾静脉注射同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，剂量为 400 μ g/kg，每天1次，持续14天；然后大鼠灌胃给予番爺红素（Lycopene)，每天一次，持续 14天,剂量为40mg/kg。
[0052] 大鼠断头后，立即将脑组织取出，并浸入连续通入95% 02和5% C02的冰冷的人 工脑脊液（ACSF ;125mM NaCl, 2. OmM KC1, 1. 2mM MgS04, 2. 5mM CaC12, 1. 2mM KH2P04, llmM glucose and26mM NaHC03)。用振动切片机进行旁矢状面切片。切好的脑片应在通 氧的ACSF(34±1°C )中进行预培养至少1小时。随后，将脑片转移至不断循环灌注 ACSF(1. 0-1. 3ml/min)的浸没式记录腔（温度保持在34土 1°C )。用平面多电极记录设置 (MED64系统，Alpha Med Sciences)记录局部的兴奋性突触后电位（fEPSP)。
[0053] 结果显示fEPSP的斜率分别增加了约1. 2倍和1. 6倍，说明Hey破坏了突触的功 能，并且同时补充番茄红素后，EPSP的斜率得到了有效的恢复。这些数据表明，番茄红素能 有
[0054] 效地逆转Hey诱导的突触传递缺陷。
[0055] 图4为高尔基染色结果。图中：*P〈0. 05，#P〈0. 01，与正常组比较；#P〈0. 05,与治 疗组比较。正常组：尾静脉注射生理盐水，lml/kg。造模组：通过尾静脉注射给予同型半胱 氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次，持续14天，剂量为400 μ g/kg，构建早老性痴呆动物 模型。治疗组：通过尾静脉注射同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，剂量为400 μ g/kg，每 天1次，持续14天；然后大鼠灌胃给予番茄红素（Lycopene)，每天一次，持续14天，剂量为 40mg/kg〇
[0056] 为了进一步验证番茄红素对突触功能的改善作用，我们还进行了重要的突触后成 分-树突棘的形态观察与分析。动物行为学检测完毕后，用6%水合氯醛（0.6ml/kg)将大 鼠麻醉，先经心脏快速灌注500ml含0. 5%的亚硝酸钠的生理盐水进行循环冲洗，然后用 500ml4%的甲醛生理盐水溶液灌注，待大鼠肢体抽搐后改为慢滴，经充分固定后，等待两个 小时，然后在避光条件下用500ml Golgi媒染液（5%水合氯醛，5%的重铬酸钾，4%甲醛） 行灌注染色，灌注完成后，静置2个小时。将脑组织取出，切成厚5-10_的脑片，室温避光条 件下置于媒染液中继续染色3天，注意每天更换新染液，保证染色完全。染色完成后，先用 1 %的硝酸银溶液漂洗，然后再将脑片置于1 %的硝酸银溶液中进行镀银还原3天，注意全 程避光，且每天更换新溶液，使镀银充分。上述各项完成后，振荡切片机切片，厚度约35um， 将切好的脑片置于2%重铬酸钾溶液中漂洗，约0. 5h后，将脑片置于双蒸水中贴片，然后常 规脱水，透明，封片后观察。
[0057] 运用高尔基染色方法，我们发现，Hey处理组的大鼠脑片中，CA1区神经元树突棘 密度和成熟的蘑菇型树突棘均出现了减少，而补充番茄红素能够恢复这种改变。以上数据 均表明，番茄红素可能降低了 Hey引起的突触损伤，从而减轻甚至挽救了记忆损害。
[0058] 图5为大鼠海马内tau蛋白磷酸化位点磷酸化水平免疫印迹结果。图中： *卩〈0.05，*扑〈0.01，#扑〈0.001，与正常组比较 ；#?〈0.05，###?〈0.001，与治疗组比较。正 常组：尾静脉注射生理盐水，lml/kg。造模组：通过尾静脉注射同型胱氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次，持续14天，剂量为400 μ g/kg，构建早老性痴呆动物模型。治疗组：通过尾 静脉注射同型半胱氨酸（Homocysteine，Hey)，剂量为400 μ g/kg，每天1次，持续14天；然 后大鼠灌胃给予番爺红素（Lycopene),每天一次，持续14天，剂量为40mg/kg。
[0059] 6%水合氯醒麻醉（0.61111/1^)处死大鼠,迅速取出大脑脑组织置于0-4°(：0.05皿 Tris缓冲盐溶液（TB，pH7.0)内，快速分离双侧海马，制成10 %的蛋白匀浆，12000g离心15 分钟，取上清，测定蛋白含量后备用。
[0060] 分别检测tau蛋白不同位点的磷酸化水平，包括Ser214的（PS214)， Thr231(PT231),
[0061] Ser262(PS262)和Ser396(PS396)检测非磷酸化位点taul的水平以及总tau5的 水平变化。β-actin为内参条带，证明蛋白上样量的一致性。通过与总tau5比较，造模组 非磷酸化位点taul磷酸化水平明显减少，磷酸化位点PS396, PS404, PS212, PS205磷酸化 水平明显增加，tau发生过度磷酸化；治疗组给予番茄红素（Lycopene)后，tau的过度磷酸 化得到降低，恢复到和正常组相近水平。
【具体实施方式】
[0062] 实施例1
[0063] 通过给大鼠灌服番爺红素（Lycopene)，发现其可以改善AD样动物模型的tau蛋白 过度磷酸化与学习、记忆障碍。
[0064] 1.实验对象：雄性Wistar大鼠（华中科技大学同济医学院实验动物实验中心提 供），SPF级，体重250?300克，45只，常规环境饲养。随机分为三组：①正常组（con);② 造模组（hey);③治疗组（hcy+lyco);
[0065] 2.实验模型制备及实验给药：
[0066] ①正常组：尾静脉注射生理盐水，lml/kg。②造模组：通过尾静脉注射给予同型半 胱氨酸（Homocysteine, Hey)，每天一次，持续14天，剂量为400 μ g/kg，构建早老性痴呆动 物模型。③治疗组：通过尾静脉注射同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)，剂量为400 μ g/ kg，每天1次，持续14天；然后大鼠灌胃给予番爺红素（Lycopene)，每天一次，持续14天， 剂量为40mg/kg。
[0067] 3.研究方法：
[0068] 大鼠学习记忆的能力：Morris水迷宫训练及测试；离体脑片LTP技术；高尔基染 色海马磷酸化tau阳性细胞的显示：免疫印迹。
[0069] 4.实验结果：参见附图，附图中符号标识表示：*P〈0. 05,与正常组比较； **P〈0. 01，与正常组比较；*#P〈0. 001，与正常组比较；#P〈0. 05,与造模组比较；##P〈0. 01， 与造模组比较；###P〈〇. 001，与造模组比较。
[0070] (DMorris水迷宫训练及测试结果：造模组与正常组相比出现明显学习记忆障碍 (图1)，统计结果表明水迷宫测试的潜伏期明显延长，学习的时间延长，见图1。造模组在目 标象限停留时间和距离以及穿越平台的次数明显减少，见图2,说明记忆能力的减退。治疗 组与造模组相比潜伏期时间变短，目标象限停留次数和穿越平台次数增加，其学习和记忆 能力都得到了良好的改善。
[0071] (2)脑片LTP结果（见图3):造模组与治疗组的兴奋性突触后电位（fEPSP)的斜 率
[0072] 分别增加了约1. 2倍和1. 6倍，说明Hey破坏了突触的功能，而同时补充番茄红素 能够使EPSP的斜率得到有效的恢复，从而改善学习记忆能力。
[0073] (3)高尔基染色结果（见图4) :Hcy处理组的大鼠脑片中，CA1区神经元树突棘密 度和成熟的蘑菇型树突棘均出现了明显的减少，而同时补充番茄红素能够有效的挽救这种 改变。
[0074] (4)Tau磷酸化免疫印迹结果（见图5):与正常组相比较，造模组大鼠的大脑海马 内tau蛋白在丝氨酸198/199/202,苏氨酸205,丝氨酸212,丝氨酸214,丝氨酸262,丝氨 酸396,丝氨酸404位点，磷酸化水平明显增高，番爺红素（Lycopene)治疗后，tau磷酸化 水平明显下降。
[0075] 5.结论：以上结果显示给予同型半胱氨酸（Homocysteine, Hey)尾静脉注射的老 鼠水迷宫训练及检测过程中平台的潜伏期增加，穿越平台次数明显减少说明大鼠的学习和 记忆能力损伤，检测早老性痴呆相关指标tau蛋白磷酸化，tau蛋白的磷酸化水平显著上 升，说明大鼠早老性痴呆造模成功。
[0076] 跟造模组相比较，在给与了番茄红素（Lycopene)处理后，检测老鼠水迷宫行为 学，其学习和记忆能力得到了有效的改善；同时，早老性痴呆相关指标tau蛋白磷酸化明显 降低以及记忆相关的突触功能明显改善，说明番茄红素（Lycopene)能缓减老年性痴呆大 鼠大脑皮质和海马区骨架蛋白tau的异常过度磷酸化并改善动物学习、记忆障碍。番茄红 素（Lycopene)能用于老年性痴呆的预防和治疗。
【权利要求】
1. 番爺红素（Lycopene)在制备用于预防和/或治疗老年性痴呆药物中的应用。
2. -种用于预防和/或治疗老年性痴呆药物，其特征在于含有活性成分番茄红素 (Lycopene)〇
3. -种用于预防和/或治疗老年性痴呆的药物制剂，其特征在于，它由作为活性成分 的番茄红素（Lycopene)和药学上可接受的载体和/或添加剂组成。
【文档编号】A61P25/28GK104083345SQ201410263970
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月13日 优先权日:2014年6月13日
【发明者】朱铃强, 高鑫雅, 刘丹, 王志昊, 马禹佳, 毛璐 申请人:华中科技大学