一种egcg的提纯方法及获得的egcg和药物组合物的制作方法
【专利摘要】本发明属于天然产物化学提纯【技术领域】及药物领域中药物组合物的应用，尤其涉及一种EGCG的提纯方法及获得的EGCG和药物组合物。该方法是以低含量EGCG的茶多酚为原料，装柱后原料经溶解、洗脱、收集、浓缩、结晶、干燥而得；获得的EGCG与汉防己甲素组成药物组合物制备治疗老年痴呆症药物的应用。本发明的EGCG提纯方法操作简便，耗能低，溶解剂和洗脱液用量低，起到成本低、环保的效果，得到的EGCG纯度≥99％，收率≥90％，有利于大规模的推广和应用；EGCG药物组合物，不但可以延缓老年痴呆症的发生进程，更体现出显著的治疗效果，增强患者的记忆恢复能力，无副作用，药效明显的组合物，具有广阔的医药前景。
【专利说明】一种EGCG的提纯方法及获得的EGCG和药物组合物
【技术领域】
[0001]本发明属于天然产物化学提纯【技术领域】及其药物领域中药物组合物的应用，尤其涉及一种EGCG的提纯方法及获得的EGCG和药物组合物。
【背景技术】
[0002]EGCG，即表没食子儿茶素没食子酸酯，是从绿茶中提取精制而得。绿茶茶多酚的主要成分是儿茶素。其中又包括表儿茶素(EC)/表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)等，而EGCG约占儿茶素总量的50%。研究表明EGCG具有较强的抗氧化性和预防癌症及心血管疾病的功能，并可以提高癌细胞对化疗的敏感性，同时降低化疗对心脏的毒性。同时EGCG具有抗自由基DNA损害，抗辐射和紫外线，阻止油脂过氧化，减少血清中低密度胆固醇、超低密度胆固醇和甘油三酯的含量，干扰癌细胞生存所需的信号传递，抑制饮食中的致癌物质，与肠、肝、和肺中的其他酶和抗氧化剂作用共同阻止某些致癌物质的活力，清除自由基，抵御污染、日晒和吸烟的影响，防治皮肤老化和起皱等作用。绿茶中的多酚类化合物EGCG与老年痴呆症相关性研究(中国药理通讯2007年第二十四卷第二H月)已证实绿茶中的一种多酚类化合物EGCG能防止Aβ淀粉样斑积聚，通过日常饮食补充，将是防治早老年性痴呆症的有效方法。同时据文献资料显示，EGCG在治疗癌症，修复DNA、抗肿瘤等方面有较强的药理作用，能够增强免疫系统的功能，抑制肝脂和胆固醇的增长，抑制肿瘤的生长，对痢疾伤害、金黄色葡萄球菌也有极强的抑制作用。目前EGCG主要应用于食品添加剂、保健品等产品。
[0003]由于从绿茶中提取出来的多酚类物质其化学结构与性质都极其相似，都具有强极性，一般的分离方法都很难将其分开。目前从茶多酚中直接提取表没食子儿茶素没食子酸酯单体的方法主要有柱层析法、高速逆流分配色谱法、离子反应法，乙酰化法等。中国专利申请CN1136024C公开了一种单体儿茶素的逆流色谱分离制备方法，该分离方法是先配制以乙酸乙酯:乙醇:水构成固定相、流动相的溶剂体系进行表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素没食子酸酯得分离，得到的提纯物的纯度可到98%，但是目前逆流色谱技术一次分离样品的量小，分离周期长，难以应用于工业生产。中国专利CN102311419A公开了一种高含量EGCG的精制提纯方法，该提纯方法主要是利用乙酸乙酯与石油醚按1:1混合液溶解样品，用乙酸乙酯-石油醚-乙酸按比例混合作为洗脱液，原料经上柱、洗脱、浓缩、析晶、干燥而得，得到的产品含量大于98%，收率大于80%，但是该方法配制溶解液和洗脱液操作繁琐，得到的产品的含量和收率效果没有达到最大化。
[0004]汉防己甲素(又名粉防己碱)来源于防己科植物粉防己(Stephania tetrandra
S.Moore)的根，已有研究发现汉防己甲素为一良好的慢通道阻滞剂。临床主要用于治疗早期轻度高血压。金满文等报道汉防己甲素对动物的乳头肌，免心房及主动脉系等心血管方面均呈现不同的药理作用。
[0005]老年痴呆症,又称阿尔茨海默病(Alzhimer’ s Disease, AD),是一种中枢神经系统的退行性疾病，其临床表现为认知和记忆能力的不断恶化，日常生活能力进行性减退以及出现各种精神分裂症状和行为障碍。随着疾病的发展，患者会逐渐丧失生活自理能力，给患者的个人家庭和社会带来沉重的负担。老年痴呆症的发病机制目前仍不明确，关于老年痴呆症发病机制的主流学说是β淀粉样蛋白级联假说。该假说认为β淀粉样蛋白样前体(APP)异常降解生成过量的Αβ蛋白，并在脑内沉积形成老年斑的核心，其可激活小胶质细胞，引起炎症反应，损伤线粒体引起能量代谢障碍，生成过多氧自由，导致机体的氧化应激损害，激活细胞凋亡途径。另一方面，Αβ还能激活蛋白激酶，促使tau蛋白异常磷酸化，损伤胆碱能神经元，引起中枢胆碱能系统的病变。这些病理变化又促进Αβ的生成和异常堆积，产生正反馈的级联放大效应，最终导致神经元的减少和递质释放异常。在研究EGCG对老年痴呆症治疗的实验中， 申请人:意外的发现，EGCG与汉防己甲素组成的药物组合物用于治疗老年痴呆症时效果明显，EGCG和汉防己甲素联合用于老年痴呆症的治疗时，两种药物可以体现显著的协同作用既可以延缓老年痴呆症的发生进程，同时显现出显著的治疗效果，增强患者的记忆恢复能力，减缓老年痴呆症患者的痛苦。
【发明内容】
[0006]为了解决现有技术中EGCG提纯含量低，收率低存在的缺陷和为了克服目前老年痴呆症治疗药物药效不明确、药物毒副作用大的缺陷。本发明的第一个目的在于提供一种EGCG的提纯方法，该方法以低含量EGCG的茶多酚为原料(低含量EGCG是指EGCG的含量为40-50%)，其步骤如下:
(1)装柱:采用干法将硅胶装于直径为5cm，高为80cm的玻璃层析柱中；
(2)溶解:用70%的乙醇浸泡低含量EGCG的茶多酚后倒入硅胶柱中进行层析； (3)洗脱:接着加入洗脱剂进行洗脱；
(4)收集:使用薄层层析收集各洗脱段液的EGCG洗脱段液；
(5)浓缩:将EGCG收集液合并后浓缩，得到EGCG浸膏；
(6)结晶^fEGCG浸膏置于锥形瓶中，加入75%乙醇，然后在65°C水浴加热，边加热边搅拌，溶解I h，放置过夜结晶，过滤，收集晶体；
(7)干燥:将晶体置于70°C条件下减压干燥，干燥后即可得到EGCG粉末。
[0007]经发明人不断的研究，发现茶多酚和EGCG的最佳浸提溶剂为70%的乙醇，乙醇的添加量与低含量EGCG的茶多酚的添加量的重量比为3~4:1时，其浸提量达到最大化。其中层析硅胶是采用70~90目层析硅胶，发明人经过大量的实验发现，硅胶的添加量与低含量EGCG的茶多酚的添加量的重量比为1:5~1:7时，其分离效果最好；所述的洗脱剂是乙酸乙酯与石油醚的体积比为3:5飞:7混合溶剂；骤(6)中的乙醇的添加量与低含量EGCG的茶多酚的添加量的重量比为1:7、时，其结晶效果最佳。
[0008]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明的EGCG的提纯方法操作简单、减压干燥温度低，达到节能的效果、溶解剂和洗脱液用量低，起到成本低、环保的效果；而且本发明得到的EGCG粉末收率高、纯度高，收率> 90%，纯度> 99%。
[0009]本发明的第二个目的在于提供一种治疗老年痴呆症的药物组合物，根据上述的纯方法获得的EGCG用来制备预防或治疗老年痴呆症药物药物组合物，该药物组合物包含EGCG和汉防己甲素，EGCG和汉方己甲素的重量份数比为1_5:1_5，其中EGCG和汉方己甲素的重量份数比优选为3:2。本发明所述的药物组合物对老年痴呆症的治疗作用主要是由于其对Αβ的聚集的抑制作用，其与其他采用不同治疗机制的老年痴呆症药物联用可以取得意想不到的治疗或预防效果。实验证明，药物联用不仅可以增强药物的治疗效果，而且可以降低药物不良反应以及机体对药物的耐药性。基于此，本发明提供一种治疗老年痴呆症的含有EGCG和汉防己甲素的药物组合物。 申请人:发现，该药物组合物用于老年痴呆症的治疗时，两种药物可以体现显著的协同作用(参见本发明实施例7和实施例8)，不但可以延缓老年痴呆症的发生进程，更体现出显著的治疗效果，增强患者的记忆恢复能力，可以减轻老年痴呆症患者的痛苦。
【具体实施方式】
[0010]下面采用具体实施例进一步说明本发明的内容
以下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
[0011]实施例1、本发明的EGCG提纯工艺如下:
(1)装柱:采用干法将100g的70目硅胶装于直径为5cm，高为80cm的玻璃层析柱中；
(2)溶解:加入60ml的70%的乙醇浸泡20g茶多酚后倒入硅胶柱中进行层析；
(3)洗脱:接着加入体积比为3:5的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂进行洗脱；
(4)收集:使用薄层层析收集各洗脱段液的EGCG洗脱段液；
(5)浓缩:将EGCG收集液合并后浓缩，得到EGCG浸膏；
(6)结晶:将EGCG浸膏置于的锥形瓶中，加入75%乙醇140ml，然后在65°C水浴加热，边加热边搅拌，溶解I h，放置过夜结晶，过滤，收集晶体；
(7)干燥:将晶体置于70°C条件下减压干燥，干燥后即可得到18.4g EGCG粉末，收率达92%，经HPLC检测其纯度达99.3%。
[0012]实施例2、本发明的EGCG提纯工艺如下:
(1)装柱:采用干法将120g的70目硅胶装于直径为5cm，高为80cm的玻璃层析柱中；
(2)溶解:加入70ml的70%的乙醇浸泡20g茶多酚后倒入硅胶柱中进行层析；
(3)洗脱:接着加入体积比为4:6的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂进行洗脱；
(4)收集:使用薄层层析收集各洗脱段液的EGCG洗脱段液；
(5)浓缩:将EGCG收集液合并后浓缩，得到EGCG浸膏；
(6)结晶:将EGCG浸膏置于的锥形瓶中，加入75%乙醇160ml，然后在65°C水浴加热，边加热边搅拌，溶解lh，放置过夜结晶，过滤，收集晶体；
(7)干燥:将晶体置于70°C条件下减压干燥，干燥后即可得到19g EGCG粉末，收率达95%，经HPLC检测其纯度达99.6%。
[0013]实施例3、本发明的EGCG提纯工艺如下:
(1)装柱:采用干法将14 0g的70目硅胶装于直径为5cm，高为80cm的玻璃层析柱中；
(2)溶解:加入80ml的70%的乙醇浸泡20g茶多酚后倒入硅胶柱中进行层析；
(3)洗脱:接着加入体积比为5:7的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂进行洗脱；
(4)收集:使用薄层层析收集各洗脱段液的EGCG洗脱段液；(5)浓缩:将EGCG收集液合并后浓缩，得到EGCG浸膏；
(6)结晶:将EGCG浸膏置于的锥形瓶中，加入75%乙醇180ml，然后在65°C水浴加热，边加热边搅拌，溶解I h，放置过夜结晶，过滤，收集晶体；
(7)干燥:将晶体置于70°C条件下减压干燥，干燥后即可得到18.6g EGCG粉末，收率达93%，经HPLC检测其纯度达99.4%。
[0014]对比实验例一、一种高含量EGCG精制提纯工艺:
对比实验例一同中国专利CN102311419A的实施例一至实施例五。
[0015]由本发明的实施例1-3与中国专利CN102311419A的实施例一至五可以得出，本发明的EGCG提纯方法得出的EGCG粉末，收率和纯度都比中国专利CN102311419A的收率和纯度高，而且本发明的EGCG的提纯方法操作简单、减压干燥温度低，达到节能的效果、溶解剂和洗脱液用量低，成本低，环保；收率大于90 %，纯度大于99 %，有利于工业化的生产。
[0016]实施例4、一种治疗老年痴呆症的药物组合物:
【权利要求】
1.一种EGCG的提纯方法，该方法以低含量EGCG的茶多酚为原料，其特征在于，包括以下步骤: (1)装柱:采用干法将硅胶装于直径为5cm，高为80cm的玻璃层析柱中； (2)溶解:用70%的乙醇浸泡低含量EGCG的茶多酚后倒入硅胶柱中进行层析； (3)洗脱:接着加入洗脱剂进行洗脱； (4)收集:使用薄层层析收集各洗脱段液的EGCG洗脱段液； (5)浓缩:将EGCG收集液合并后浓缩，得到EGCG浸膏； (6)结晶:将EGCG浸膏置于锥形瓶中，加入75%乙醇,然后置于65°C水浴加热,边加热边搅拌，溶解I h，放置过夜结晶，过滤，收集晶体； (7)干燥:将晶体置于70°C条件下减压干燥，干燥后即可得到EGCG粉末。
2.根据权利要求1所述的EGCG的提纯方法，其特征在于，步骤(1)中乙醇的添加量与低含量EGCG的茶多酚的添加量的重量比为3~4:1。
3.根据权利要求1所述的EGCG的提纯方法，其特征在于，层析硅胶是采用70~90目层析硅胶，硅胶的添加量与低含量EGCG的茶多酚的添加量的重量比为1:5~1:7。
4.根据权利要求1所 述的EGCG的提纯方法，其特征在于，步骤(3)中洗脱剂是乙酸乙酯与石油醚的体积比为3:5飞:7的混合溶剂。
5.根据权利要求1所述的EGCG的提纯方法，其特征在于，步骤(6)中的乙醇的添加量与低含量EGCG的茶多酚的添加量的重量比为1:7~9。
6.根据权利要求1-5任一所述的提纯方法获得的EGCG。
7.一种治疗老年痴呆症的药物组合物，其特征在于，它含有如权利要求6所述的EGCG和汉方己甲素。
8.根据权利要求7的治疗老年痴呆症的药物组合物，其特征在于，EGCG和汉方己甲素的重量份数比为1-5:1-5，其中EGCG和汉方己甲素的重量份数比优选为3:2。
【文档编号】A61K31/353GK104130232SQ201410393252
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】李威, 李选民, 张雄修 申请人:四川天予植物药业有限公司