诱导硬组织再生的材料的制作方法

专利名称：诱导硬组织再生的材料的制作方法
技术领域：
本发明涉及诱导硬组织(例如骨或软骨等)再生的材料，其包含富血小板血浆和明胶β-TCP海绵。
背景技术：
传统上，进行自体骨移植以通过从自身健康部位获取骨和将该骨移植于骨缺损部位来使骨折部位的骨愈合和切除良性骨瘤后等的骨缺损部位的重构。但是，由于对健康部位的侵入，并发症以大约30%的高比率发生，如骨供给位置的感染和残余疼痛、骨供给位置附近的神经损伤等。在骨愈合和骨缺损面积大的情况下，大量的自体骨是必须的，不合格的自体骨供给位置有时会造成临床问题。
为避免自体骨移植和补偿自体骨量不足，已使用利用磷酸钙和β-磷酸三钙(β -TCP)的人工骨。但是，由于人工骨本身没有骨诱导能力，其适用位置仅限于在良好骨再生环境下的较小骨缺损，因为成骨潜力不如自体骨，其花费一些时间以获得动力强度，因此要求在手术后限制负荷和长时间休息成为问题。在这样的背景下，已广泛研究适用于大范围骨愈合和骨缺损的具有骨诱导能力的骨再生技术。近年来，已开发出培养自身骨髓间质干细胞并将这些细胞与人工骨组合而移植到骨缺损部位中的技术，并已报道了临床应用(非专利文献I)。但是，其缺乏广泛应用性，因为积累了各种问题需要专用设施，如可进行细胞培养的洁净室(细胞处理中心)，这使市立医院实际上难以使用该技术，具有多分化潜能的间质细胞具有癌变危险，分化诱导不一定完夫寸。此外，作为使用生长因子的骨再生治疗，通过基因重组生产的骨生成蛋白-2(BMP-2)在1997年被欧洲和美国的食品药品管理局批准用于椎体融合，并在美国临床应用。但是，近年来，其有效性和安全性受到质疑。例如，报道证明，在使用BMP-2的腰椎椎体间融合中，固定椎体和移植骨的再吸收以高频率发生而显著降低骨愈合速率。此外，报道了通过可用于评测软组织的MRI确认的腰椎周缘组织中的炎性反应，和在颈固定的症例中观察到的重度并发症，如咽水肿导致的呼吸困难、吞咽困难和颈部的异常肿大(非专利文献2和3)。其原因被认为是软组织和生命器官中的水肿变化，该变化是由从施用位置扩散到周缘组织的大量人造生长因子的施用诱发的抗原-抗体反应造成。此外，由于BMP-2昂贵，其增加了几十万日元的手术成本，对患者造成经济负担。富血小板血浆(也称作PRP)是通过低速离心分离而从外周血中除去红血球而得的浓缩血小板血楽·。PRP含有大量生长因子，如包含在血小板中的血小板衍生生长因子(roGF)、转化生长因子β (TGF-β )、成纤维细胞生长因子(FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)等，并已知通过它们的协同作用表现出如血管生成、骨生成、促进创伤愈合之类的效应。还已经证实，PRP和适当给药系统材料，如明胶水凝胶等的联合使用在长骨和头盖骨缺损模型中表现出骨生成活性(专利文献1，非专利文献4和5)。但是，PRP单独的作用不足以在大范围骨缺损、解剖学未融合骨和用于将脊椎骨接合到一起的脊椎融合术中提供充分的骨生成，具有促进分化和诱导成骨细胞的三维结构的支架必不可少。现有技术文献 专利文献
专利文献 I: JP-A-2005-211477 专利文献 2: JP-A-2004-123576。非专利文献
非专利文献 I: Morishita T, et. , Artif. Organs, 2006 非专利文献 2: Lohn McClellan 等人，J. Spinal Disord. Tech. , 2006 非专利文献3: Ben B等人，Spine, 2006 非专利文献 4: Hokugo A 等人，Tissue Eng. , 2005
非专利文献5: Hokugo A等人，Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol.Endod. , 2007。

发明内容
本发明要解决的问题
本发明的问题是提供用于硬组织如骨或软骨等的再生的新型材料，其提供衍生自富血小板血浆的生长因子的缓释作用和用于组织再生的良好支架功能，并在安全性和实用性方面优异。 解决问题的方式
为解决上述问题，本发明人已制备诱导硬组织再生的材料，其包含通过将作为生长因子给药系统用材料优异的明胶和作为具有生物吸收性和生物降解性的陶瓷的β -TCP颗粒加工成海绵状形式而获得的明胶β -TCP海绵和包含在所述海绵中的从患者自己血中提纯的富血小板血浆(PRP)。他们已证实，该材料在大鼠脊椎融合术模型中显著增强骨生成。本发明基于上述发现而作出，并提供含有富血小板血浆和明胶β-TCP海绵的诱导硬组织再生的材料。待施用本发明的材料的硬组织是需要再生用支架的骨或软骨组织等，还包括牙齿领域中的那些，如牙槽骨等。本发明的诱导硬组织再生的材料促进骨生成和软骨生成。此外，本发明的诱导硬组织再生的材料还促进血管生成。本发明的诱导硬组织再生的材料优选用于需要支架的硬组织如骨或软骨等的再生，因为明胶β-TCP海绵发挥用于组织再生的良好细胞支架的功能。但是，其施用位置不限于硬组织，其可以是与硬组织，如骨或软骨等接触的软组织。具体而言，甚至在与骨或软骨接触的软组织，如腱、韧带等的移植手术的情况下，该材料也通过其血管生成促进作用诱导腱和韧带的再生。因此，本发明中还包括用于诱导与硬组织接触的软组织再生的这种用途。本发明中所用的富血小板血浆优选来自要被施以诱导硬组织再生的材料的对象。 要被施以本发明的诱导硬组织再生的材料的对象不限于人，并包括全部哺乳动物。 本发明中所用的明胶β -TCP海绵优选具有大约10-500 μ m的孔径，明胶β -TCP海绵中的明胶优选是交联的。通过对含有β-TCP和明胶的组合物施以交联和冻干来形成上述交联。交联和冻干的次序可以任意，可以将交联后的组合物冻干，或可以对冻干的组合物施以交联。发明效果
本发明中所用的PRP有利地不具有 与治疗有关的伦理问题和与使用血液制品有关的风险，如病毒感染、免疫不相容性等，因为其容易由被施以诱导硬组织再生的材料的对象的血液获得。此外，本发明中所用的明胶β-TCP海绵以缓释方式释放PRP中所含的组分如生长因子等，以促进骨生成、软骨生成和血管生成，以及发挥用于组织再生的良好细胞支架的功能，由此能实现显著的骨再生。


图I示意性显示在大鼠脊椎后外侧融合模型的横突4和5之间的移植。图2显示左和右横突4、5的矢状切面重建图像。图3是显示横突之间的骨量的图。图4是显示3点弯曲试验的结果的图。图5显示PRP海绵模型的横突4、5之间的组织图像。在横突之间的软骨中观察到骨化样的变化。在[比较]中，无移植组(术后8周)观察到横突之间的韧带成分，但没有观察到骨和软骨成分，其中箭头始终显示为，左横突4，右横突5，右上图显示番红O染色图像。本说明书包括优先权申请No. 2009-241041的说明书中描述的内容。
具体实施例方式本发明涉及诱导硬组织再生的材料，其含有富血小板血浆(PRP)和明胶β -TCP海绵。I.富血小板血浆(PRP)
本发明的“富血小板血浆(PRP) ”是通过低速离心分离从外周血中除去红血球而得的浓缩血小板血衆。PRP含有大量生长因子，如包含在血小板中的血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β (TGF-β )、干细胞衍生因子(SDF)-I、胰岛素样生长因子(IGF)等，并已知通过它们的协同作用表现出如血管生成、骨生成、促进创伤愈合之类的效应。关于用于制备PRP的离心条件，可以适当地根据要使用的离心分离机的种类确定用于有效除去血细胞成分的旋转数和时间。根据需要，可以通过在除去血细胞成分后再离心来浓缩血小板。或者，也可以通过使用膜的血液分离机制备PRP。本发明中所用的PRP优选衍生自需要施用本发明的诱导硬组织再生的材料的对象的自身血。但是，当该对象具有重度贫血或基础疾病以致难以获得血样时，可以使用由他人血液提纯的富血小板血浆。2.明胶 β-TCP 海绵
本发明中所用的明胶β-TCP海绵是由明胶和β-TCP颗粒构成的多孔海绵状结构。2. I 明胶
本发明中所用的明胶可通过经各种处理如碱水解、酸水解、酶水解等使可获自各种动物物种，如牛、猪、鱼等的身体的任何部位，如皮、骨、腱等的胶原或用作胶原的物质变性而获得。尽管明胶的性质随所用材料和处理方法而改变，但可以使用任何具有这样的性质的明胶作为本发明中的明胶β-TCP海绵材料。显示明胶性质的尺度的实例包括等电点、分子量、ζ电势等。例如，市售明胶包括Sigma Ltd.制造的A型明胶和Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造的明胶，水溶液中的4电势如下
Sigma Ltd.制造的A型明胶大约O至大约5 mV
Wako Pure Chemical Industries, Ltd.制造的明胶大约-5 至大约-2 mV。ζ电势是显示物质(明胶)的静电荷水平的尺度。本发明中所用的特别优选的明胶具有下列性质 为通过碱水解处理由胶原获得的酸性明胶，
在非还原条件下通过SDS-PAGE测得的大约10-大约200，000道尔顿的分子量，和 大约-15至大约-20 mV的水溶液中ζ电势。优选地，此外，可以使用来源于牛骨的I型胶原通过碱处理制成的酸性明胶，其可获自Nitta Gelatin Inc.，等电点(IEP)为5. O。尽管由酸处理制成的碱性明胶也可获自Nitta Gelatin Inc.(作为样品IEP 9.0), ζ电势如下所示极其不同。酸性明胶(NittaGelatin Inc.样品 IEP 5. O):大约-15 至大约-20 mV 碱性明胶(Nitta Gelatin Inc.样品 IEP 9. O):大约 +12 至大约 +15 mV。2. 2 β -TCP ( β -磷酸三钙)
本发明中所用的β-TCP (磷酸三钙)是可生物降解的陶瓷，其一直以来广泛用作人工骨材料。多孔β-TCP的压缩强度为大约3Μ Pa，其比生物骨(对松质骨而言大约7Μ Pa)弱，但对临床应用而言却足够强。β -TCP在体内逐渐分解并释放钙离子和磷酸离子以实现利于通过成骨细胞合成作为骨构成成分的羟磷灰石的环境。也就是说，β-TCP不仅发挥给药系统的载体或骨化用支架的功能，还积极促进骨生成、软骨生成、血管生成等。因此，β-TCP提供良好的支架材料，其提高通过与明胶混合而得的明胶海绵的动力强度，同时积极促进骨生成、软骨生成、血管生成等。本发明中所用的β-TCP的尺寸、孔隙率、孔径等可以为任意，并可以使用任意种类的β-TCP颗粒。例如，可以使用市售β-TCP-100 (粉碎品)TaiheiChemical Industrial Co. , Ltd.制造，OSferion (注册商标):OLYMPUS CORPORATION 制造
坐寸ο2. 3明胶β -TCP海绵的结构
以干重量计，本发明的明胶β-TCP海绵中的明胶和β-TCP的比率为10:1-1:10，优选5:1-1:5。本发明的明胶β -TCP海绵类似于具有许多平均孔径为10-500 μ m的超细孔的海绵。由于具有包括许多超细孔的结构，该海绵在移植后使周围细胞易于进入其中，并可发挥用于组织再生的支架材料的功能。此外，可以向粘附的细胞提供充足营养和氧，由此能够实现正常细胞生长和分化。本发明的明胶β-TCP海绵中的超细孔的平均孔径的下限为10 μ m，其上限为500 μ m。当其小于10 μ m时，由于细胞无法进入组织工程学载体，细胞粘附性变得极差，且粘附的细胞不能三维地伸展。当其超过500 μ m时，由于细胞密度变低，组织和器官不能再生。优选下限为50 μ m，优选上限为200 μ m。在本发明的明胶β-TCP海绵中，明胶是交联的。评测交联水平(交联度)的指数是水含量。水含量是相对于海绵重量的溶胀的明胶β-TCP海绵中水的重量百分比。当水含量高时，该明胶β-TCP海绵的交联度降低，海绵容易降解。也就是说，该明胶β-TCP海绵在体内的酶降解性随水含量而改变，且水含量影响PRP的缓释(逐渐释放)。本发明的明胶β -TCP海绵优选具有90%-99. 8%的水含量。当水含量低于90%时，有时损害适合移植的挠性，移植到体内后生物降解可能耗费长时间，且生理活性物质可能留在载体中而不以缓释方式释放。当其超过99. 8%时，可能发生的情况是，载体不能在培养基或缓冲液中保持其强度或生理活性物质逐渐释放仅I至3天的短时期。更优选的下限是95%，更优选的上限是98%。 2.4明胶β-TCP海绵的制造方法
通过对含有明胶和β-TCP的组合物施以交联和冻干来获得本发明中所用的明胶β-TCP海绵。具体而言，将β-TCP添加到明胶中。随后使明胶交联。交联方法不受特别限制，例如，可以提到真空热脱水法、干热法、Y射线辐射法、紫外辐射法、电子束照射法、X-射线辐射法、使用交联剂的方法等。其中，使用交联剂的方法是优选的，因为如下所述，明胶一旦以海绵状成形，则可以以相同交联度交联甚至直至海绵内部。所用交联剂不受特别限制，并且可以使用例如戊二醛、水溶性碳二亚胺如EDC等，和在环氧丙烷、二环氧化合物、羟基、羧基、氨基、硫醇基团、咪唑基等之间产生化学键的缩合剂(乙二醇二缩水甘油醚、聚乙二醇二缩水甘油醚、多甘油多缩水甘油醚、甘油多缩水甘油醚、六亚甲基二异氰酸酯等)。优选的是戊二醛。可以在冻干之前或冻干之后进行交联。具体而言，例如，如下获得海绵状成形产品通过在均质器等中剧烈搅拌含β-TCP的明胶水溶液以使该溶液发泡、进行交联反应、将该反应混合物浇铸在模具中，将其冷冻并进一步冻干，或通过在均质器等中剧烈搅拌含β -TCP的明胶水溶液以使该溶液发泡、将该反应混合物浇铸在模具中、冷冻并进一步冻干以获得海绵状成形产品，将该海绵状成形产品在具有合适浓度的戊二醛溶液中浸泡给定时间以进行交联(参见JP-A-2005-211477)。为了停止通过可与氨基反应的戊二醛的交联反应，例如，只需要使具有氨基的低分子物质，如乙醇胺、甘氨酸等与其接触，或可以添加PH 2. 5或更低的水溶液。为完全除去用于该反应的交联剂和低分子物质，所得明胶β -TCP海绵可以用蒸馏水、乙醇、2-丙醇、丙酮等洗涤并再冻干。可以通过搅拌发泡和冻干步骤形成作为支架材料重要的海绵结构。也就是说，通过冷冻步骤生成的无数冰晶通过冻干变成孔，并可以形成具有所需孔隙率和孔径的多孔海绵结构。此外，为避免海绵状结构在用交联剂如戊二醛等处理的初始阶段中的溶胀，可以在处理前施用热交联处理等。此外，在通过交联剂进行交联时，优选通过处理反应末端来除去毒性。例如，在戊二醛处理后，可以通过用甘氨酸水溶液等洗涤以将反应末端失活来除去毒性。明胶β-TCP海绵可以以任何形状形成并可以以例如圆柱形、棱柱形、片形、盘形、球形、粒形等成形。圆柱形、棱柱形、片形和盘形常用作嵌入片，或也可以在粉化后作为粒子使用。此外，也可以在注射中施用球形和粒形。作为明胶β -TCP海绵，可以使用市售产品(例如增强β -TCP明胶海绵MedGel (注册商标)、Scaffold 或 MedGel (注册商标)、SP (MedgeD)03.本发明的诱导硬组织再生的材料
本发明中的“硬组织”是指具有硬细胞间质的组织，包括骨、软骨和牙齿。本发明的用于诱导硬组织再生的材料用作诱导硬组织再生的材料，因为其含有对骨生成、软骨生成、血管生成等具有再生促进作用的PRP和作为组织再生支架优异的明胶β-TCP海绵。其特别优选用作诱导缺损骨或软骨组织的再生的材料。如上所述，尽管本发明的诱导硬组织再生的材料优选用作诱导需要细胞支架的 缺损骨或软骨组织的再生的材料，但其适用区域不限于硬组织，还可以是与硬组织，如骨或软骨等接触的软组织。具体而言，甚至在与骨或软骨接触的软组织，如腱、韧带等的移植手术的情况下，该材料也通过PRP的血管生成促进作用诱导腱和韧带的再生。因此，在本发明中还包括用于诱导与硬组织接触的软组织再生的这种用途。本发明的诱导硬组织再生的材料可广泛用于医学和兽医学领域，包括整形外科和牙科领域，其施用对象不限于人，包括全部哺乳动物。通过将PRP添加到上述明胶β -TCP海绵中，制备本发明的诱导硬组织再生的材料。可以通过例如将PRP逐滴添加到上述冻干的明胶β -TCP海绵中、或将明胶β -TCP海绵浸溃在PRP中以使海绵浸渗有PRP来获得含PRP的明胶β -TCP海绵。这种浸溃操作通常在4-37°C下在15分钟-I小时内，优选在4-25°C下在15-30分钟内结束，在此期间PRP使该海绵溶胀，PRP中所含的生长因子等与海绵中的明胶分子相互作用，由此生长因子等与明胶分子形成复合体，由此通过物理相互作用将PRP固定在明胶β-TCP海绵中。它们之间的静态相互作用以及其它相互作用，如疏水键、氢键等被认为极大有助于形成PRP和明胶分子之间的复合体。PRP相对于明胶β -TCP海绵的重量比(干重量)优选在大约I倍至大约10000倍的范围内。更优选地，PRP相对于明胶β -TCP海绵表现出大约2倍至大约5000倍，更优选大约10倍至大约1000倍的重量比。本发明的诱导硬组织再生的材料直接包埋于(施加到)患部中并可设计成具有适合各用途的适当剂型。也就是说，可以根据其施用位置将明胶β-TCP海绵成形为具有所需形式，如圆柱形、棱柱形、片形、盘形、球形、粒形等。可以根据疾病严重程度和对象的年龄、体重等适当调节本发明的诱导硬组织再生的材料中的PRP剂量。对人而言，成年患者的剂量通常选自大约O. I-大约500mL，优选大约I-大约50mL的范围，这可施用于患部或其附近。在通过单次给药获得的效果不足时，可以多次进行给药。根据需要，本发明的诱导硬组织再生的材料可含有其它适当药剂和可药用载体。这种药剂和载体的实例包括促进血管生成和骨再生的药剂、成骨细胞活化剂或破骨细胞抑制剂、促进细胞生长和分化的支架载体、它们的组合等。4.本发明的诱导硬组织再生的材料的作用 4. I PRP缓释作用由于本发明的诱导硬组织再生的材料表现出PRR缓释作用和稳定化作用，其少量即可长时间发挥PRP中所含的各种生长因子等的功能。因此，可以在局部施用位置有效发挥生长因子等的血管生成促进功能和骨生成、软骨生成能力。缓释的机制是基于PRP中所含的各种生长因子等物理固定在海绵中的明胶β-TCP上的事实。本发明人此前已通过使用生物吸收性高分子水凝胶而尝试了生长因子、细胞因子、单核因子、淋巴因子、其它生理活性物质等的缓释，并成功实现通过其它材料无法实现的具有生理活性的生长因子等的缓释和该缓释持续期的控制。在本发明中，PRP中所含的生长因子等被认为由于类似机制以缓释方式从明胶β-TCP中释放。固定在明胶β-TCP上的生长因子等却不从该海绵释放。随着明胶β-TCP海绵在体内的降解，明胶β-TCP分子变得可溶于水，这造成固定在明胶β-TCP分子上的生长因子等的释放。也就是说，明胶β-TCP海绵的降解能够控制生长因子等的缓释。可以通过在明胶β-TCP海绵制造过程中控制交联度来改变明胶β-TCP海绵的可降解性。此外，由于PRP中所含的各种生长因子等与明胶β-TCP相互作用，它们的体内稳定性，例如抗酶降解性等得到改进。此 夕卜，由于明胶β -TCP海绵随生长因子等的缓释一起消失，因而不会在身体上抑制归因于细胞生长和分化的骨再生过程。 4. 2血管生成促进作用以及骨生成和软骨生成促进作用
本发明的诱导硬组织再生的材料中所含的PRP含有各种生长因子等，并提供各种作用，如血管生成促进作用、骨生成促进作用、软骨生成促进作用、创伤愈合促进作用、皮肤溃疡治疗作用等(如上所述)。如下述实施例中所示，本发明人已经证实，本发明的诱导硬组织再生的材料具有显著的骨再生作用。骨化据报道涉及血管生成，并且与骨生成和软骨生成促进作用、以及PRP的各种作用如血管生成促进作用等的贡献结合地，促进缺损区域中的组织再生并实现良好的骨再生。4. 3作为支架材料的作用
本发明的诱导硬组织再生的材料包含交联明胶(以β -TCP海绵为主要成分)并具有许多有给定孔径的超细孔的基材。因此，该材料使细胞易进入，而发挥再生支架材料的功能。此外，由于PRP成分静电结合到基材表面上并随基材分解以缓释方式释放，其可长时间作用于细胞，由此显著提高成骨作用。可以通过调节明胶交联度来控制缓释速率。也就是说，本发明的诱导硬组织再生的材料可同时起到再生用支架材料和再生促进剂这两种作用。
实施例下面参照实施例更详细说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。
实施例I.富血小板血浆(PRP)的制备
通过腹腔内注射戊巴比妥(250μυ，将SD大鼠(雄性，8周龄，240-290 g，SHIMIZULaboratory Supplies Co. , Ltd. , Kyoto)全身麻醉,打开胸腔,使用21G针从心脏取血(5CC)。将血液转移到预先装有A⑶-A溶液(W/V%’ 柠檬酸O. 85，柠檬酸三钠2. 32，葡萄糖2. 59) (2 CC)的15 cc离心管中。该离心管在离心机(KN-70，KUBOTA CORPORATION制造)中以1500 rpm离心10分钟。在离心后，用14G SurfIo针吸取上层中的透明血清部分，并转移到另一离心管中并以3000 rpm离心10分钟。用14G SurfIo针吸取上层中的血清部分，留下200yL，搅拌剩余溶液以得到富血小板血浆(PRP) (200yL)o将切割成2mm立方体的明胶β -TCP海绵(β -TCP-增强明胶海绵MedGel (注册商标)Scaffold (MedGEL CO.，LTD.)，总共20mg)浸在所得PRP (200 μ L)中并在4°C下静置整夜。作为对照，将相同量和形状的明胶β-TCP海绵浸在磷酸盐缓冲盐水(下称PBS，200 μ L)中并在4°C下静置整夜。2.大鼠脊椎后外侧融合模型
通过腹腔内注射戊巴比妥(250yL)，将SD大鼠(雄性，8周龄，240-290 g，SHIMIZULaboratory Supplies Co. , Ltd. , Kyoto)全身麻醉。纵切背中部的皮肤40mm。在中线左右5厘米处，纵切脊椎旁肌肉25mm，并使第四和第五腰椎的横突(下称横突4、5)在两侧都露出。使用具有 0. 5mm 直径尖端的钢条(0SADASUCCESS-40M, 0S-40MV, 0SADA, INC.制造)，、将该横突的背侧皮质骨钻孔直至证实来自骨髓的出血。在横突4、5之间移植下示材料，并用3-0尼龙线(公司制造)缝合切开的脊椎旁肌肉与皮肤。要移植的材料是I :PRP浸溃的明胶β -TCP海绵(下称PRP海绵)，2 =PBS (磷酸盐缓冲盐水)浸溃的明胶β -TCP海绵(MedGel(注册商标)Scaffold (MedGEL CO. , LTD.):下称PBS海绵)，3 :单独的PRP，4 :自体髂骨，和无移植组，总共5组。在单独PRP模型3中，在横突之间仅喷施200 μ L的PRP。作为4的自体髂骨，以5X2X2 _的尺寸获取与预定移植位置同侧的髂骨顶端。图I示意性显示在大鼠脊椎后外侧融合模型中的横突4、5之间的移植。3.骨生成的评测和机械强度的评测
在术后8周，通过戊巴比妥的高剂量给药，使大鼠安乐死，并分离腰椎。使用μ CT (微焦 2D/3D X-射线 CT 装置，ScanXmate-E090S40, Comscantiecno Co. , Ltd.制造)，形成横突4、5的矢状面重建图像，并评测横突之间的愈合的有无。此外，基于所得图像并使用图像分析软件(Comscantecno Co. , Ltd.制造的FanCT verl. 3),仅提取横突之间的部分并测量骨量。此后，通过3点弯曲试验机(TOKYO TESTING MACHINE, LSC-200/30-2)进行腰椎的3点弯曲试验。腰椎在正面朝上的情况下固定在跨距40mm的夹具上，并使用圆柱形夹具(直径5mm)以10mm/min的速度向第4/5腰椎椎间盘前方加压。分组比较在移位距离为IOmm时的时间点的载荷。然后，用4%低聚甲醛在4°C下固定组织I周。组织用0. 5M EDTA (乙二胺四乙酸)溶液脱钙2周并在20%蔗糖中浸泡2天。制备横突4、5之间的冷冻组织切片(厚度12 μ m)并用苏木精曙红和番红O染色(软骨基质被染红)。4.结果
图2显示左和右横突4、5的矢状切面重建图像的结果。发现PRP海绵模型和自体髂骨模型表现出左和右横突之间的愈合趋势。此外，PRP海绵模型与自体髂骨模型相比表现出横突前后径的显著增大。PBS海绵、单独PRP和无移植模型没有表现出横突之间的增大并且没有发现骨愈合趋势。图3显示横突4、5之间的骨量。PRP海绵模型与其它模型相比表现出骨量的显著增大。图4显示3点弯曲试验的结果。PRP海绵模型与其它组相比表现出平均59. 6倍的强度。图5显示PRP海绵模型的横突4、5之间的组织图像。在图像中，在横突之间，骨基质和透明软骨成分混合在一起，观察到类似于软骨内骨化的现象。通过番红O染色，透明软骨周围的一部分表现出红色染色图像，证实其是软骨基质。为了比较，显示无移植组的横突4、5之间的组织图像(术后8周)。如图5中所示，观察到横突之间的韧带成分，但没有观察到骨和软骨成分。5.结论
由上述结果证实，PRP和明胶β -TCP海绵的组合实现超过自体骨移植的极高的骨或软骨生成能力，显著加强骨愈合部位的机械强度。参考例.明胶β-TCP海绵的制造 作为明胶，使用Nitta Gelatin Inc.制造的酸处理产品(酸处理明胶)。作为β-TCP，使用 β-TCP-100(粉碎品，Taihei Chemical Industrial Co. , Ltd.)。也可以使用 OSferion。将该酸处理的明胶溶解在蒸馏水中以产生3重量％明胶水溶液。向所得明胶水溶液(60mL)中加入β -TCP (I. 8克)并加入O. 16重量％戊二醛水溶液(O. 4mL),该混合物在均质器中在5000 rpm下搅拌3分钟以便发泡。将该发泡的明胶β -TCP水溶液浇铸在12cmX12 cm模具中，在4°C下静置12小时以进行交联反应，此后将该溶液在_40°C下冷冻并冻干而获得海绵。所得海绵用O. IN甘氨酸水溶液进行3次I小时洗涤，进一步用水洗涤，再冻干而得到明胶β-TCP海绵。本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请全文经此引用并入本文。产业适用性
本发明中所用的富血小板血浆不需要特殊设施和设备，因为其可通过被施以诱导硬组织再生的材料的对象的自身血的离心而提纯。因此，可以在许多设施中实施本发明。此外，由于使用来源于自身血的富血小板血浆，与基因重组生长因子相比，副作用的可能性极低。此外，由于明胶β -TCP海绵仅包含临床用材料并对人体具有高安全性，因而本发明的诱导硬组织再生的材料预计极快投入临床使用。本发明的普及显著降低以往通常进行的收集自体骨的需要，并且成骨促进作用可实现早期负载和早期康复。因此，其益处无法估量。
权利要求
1.诱导硬组织再生的材料，包含富血小板血浆和明胶β-TCP海绵。
2.根据权利要求I的材料，其中硬组织是骨或软骨组织。
3.根据权利要求I或2的材料，其促进骨生成或软骨生成。
4.根据权利要求I或2的材料，其促进血管生成。
5.根据权利要求I至4任一项的材料，其中富血小板血浆来自要被施以诱导硬组织再生的材料的对象。
6.根据权利要求I至5任一项的材料，其中明胶β-TCP海绵具有10-500 μ m的孔径。
7.根据权利要求I至6任一项的材料，其中明胶β-TCP海绵中的明胶是交联的。
8.根据权利要求I至7任一项的材料，其中明胶β-TCP海绵是通过交联和冻干包含β -TCP和明胶的组合物来制备的。
全文摘要
本发明涉及包含富血小板血浆和明胶β-TCP海绵的诱导硬组织再生的材料，其促进血管生成、骨生成、软骨生成等。
文档编号A61L27/00GK102665775SQ20108004715
公开日2012年9月12日 申请日期2010年10月19日 优先权日2009年10月20日
发明者冈本慎一, 田畑泰彦 申请人:日东电工株式会社