二甲双胍在癌症治疗和预防中的用途的制作方法

专利名称：二甲双胍在癌症治疗和预防中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤治疗领域。
背景技术：
对癌症进行化疗治疗可有效地减小肿瘤块，但是该疾病经常复发(relapse)。为解释这一现象，癌干细胞假说认为，肿瘤内含有少量成瘤的、自我更新的癌干细胞，这些癌干细胞处于非成瘤癌细胞群中(1，2)。不同于肿瘤中的大多数细胞，癌干细胞对公知 (well-defined)的化学疗法具有抗性，并且在治疗后，癌干细胞可通过其干细胞样行为 (stem cell-like behavior)在肿瘤内再生出所有细胞类型。因此，尽管目前一无所知，但是选择性地以癌干细胞作为靶标的药物为癌症治疗提供了很大的希望。

发明内容
本发明一方面涉及在有需要的受试者体内对癌症/肿瘤进行治疗的方法，所述方法包括给予增强量的二甲双胍和减少量的一种或多种化疗剂。在一个实施方式中，二甲双胍的增强量为250mg/天。本发明另一方面涉及一种组合物，所述组合物包含增强量的二甲双胍、减少量的一种或多种化疗剂以及药学上可接受的载体。在一个实施方式中，二甲双胍的增强量为约 25mg、75mg 或 250mgo本发明另一方面涉及在受试者体内预防癌症或延缓癌症复现(recurrence)的方法，所述方法包括向受试者给予有效量的二甲双胍。在一个实施方式中，二甲双胍的量为约 75mg/ 天。本发明另一方面涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含瓶装(vial)的二甲双胍；瓶装的一种或多种化疗剂；以及使用二甲双胍和化疗剂的说明书。


图IA-图IB包括了实验数据的图示，该实验的结果表明，二甲双胍防止了 MCFlOA-ER-Src细胞的转化。图IA 在所示浓度的二甲双胍下，在1 μ M的4-羟基他莫昔芬 (TAM)存在或不存在时，细胞生长Mh后的数目。图IB 在所示浓度二甲双胍存在的情况下， 在未处理或经TAM处理的细胞中的乳腺球(mammospheres)、在软琼脂中的集落以及病灶的相对数目。图2为实验数据的柱状图，该实验的结果表明，二甲双胍抑制了乳腺球的生长。用 0. ImM二甲双胍对来自所示细胞系的6天龄乳腺球处理4 或不进行处理，对乳腺球的数目进行计数。图3A-图3C包括了实验数据的图示，该实验的结果表明，二甲双胍选择性地杀灭癌干细胞并与多柔比星协同地发挥作用。图3A:在转化后(ΤΑΜ处理36h)的MCF-10A群中的癌细胞(⑶44低/⑶M高；灰色)和癌干细胞(⑶44高/⑶M低；黑色)的数目，用多柔比星、0. ImM 二甲双胍或两者的结合(n = 3)对所述的MCF-10A群进行了处理。图将通过分选(sorting)得到的癌干细胞(SC)和非干细胞癌细胞(NSC)用0. ImM 二甲双胍处理 0h、24h和48h。图3C 在注射MCFlOA-ER-Src癌干细胞后，在所示天数时裸鼠体内的肿瘤体积，所述癌干细胞在注射前用0. ImM 二甲双胍处理Ih或不进行处理。图4A-图4B包括了实验数据的图示，该实验的结果表明，二甲双胍和多柔比星组合在裸鼠体内起到减小肿瘤块并延长症状缓解(remission)的作用。图4A:用转化后的 MCFlOA-ER-Src细胞注射(时间0表示注射时间)的小鼠的肿瘤体积(平均值和95%置信区间)，所述小鼠未经处理、或每5天(3个周期；箭头表示天数或注射情况)多柔比星(DoX)、100yg/ml 二甲双胍(Met)或两者同时通过腹膜内注射对小鼠进行处理。图 4B:由3个处理周期后(第25天)的肿瘤得到的细胞中的癌干细胞(CD44高/CDM低)数目，所述肿瘤用Dox或Dox+Met的组合进行处理。
具体实施例方式癌干细胞假说认为，与肿瘤内的大多数癌细胞不同，癌干细胞能抵抗化疗药物并可在肿瘤内再生出各种细胞类型，从而引起疾病的复发。因此，选择性地以癌干细胞作为靶标的药物为癌症治疗提供了很大的希望(特别是与化疗结合时)。我们在本文中证明在四种遗传学上不同的乳腺癌中，低剂量的二甲双胍(糖尿病的标准药物)抑制细胞转化并选择性地杀灭癌干细胞。二甲双胍和公知化疗剂多柔比星的组合同时杀灭培养物中的癌干细胞和非干细胞癌细胞。此外，在异种移植小鼠模型中，这一组合疗法比二者中的任一种单一药物都更有效地减小肿瘤块并防止复发。在用二甲双胍和多柔比星进行组合治疗结束后至少两个月内，小鼠仍然没有肿瘤。这些结果提供了支持癌干细胞假说的进一步证据，并且它们为将二甲双胍和化疗药物的组合用以改进对患有乳腺癌和其他癌症的患者的治疗提供了理论根据和实验基础。本发明的各方面基于如下发现二甲双胍增强了在治疗性疗法(例如癌症治疗) 中所使用的化疗剂的抗肿瘤作用。因而，使产生治疗性抗肿瘤作用所需化疗剂的量减少。化疗剂的量的减少使得化疗剂对受者(recipient)的副作用减弱。因此，本发明一方面针对提高化疗剂的抗肿瘤作用的方法，所述方法包括向有需要的患者给予增强量的二甲双胍和减少量的化疗剂。定义本文所使用的词组“细胞毒素剂”意味着用于对异常和不受控的进行性细胞生长进行治疗的药剂。细胞毒素剂优选包括例如环磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、长春新碱、多柔比星、柔红霉素、苯丁酸氮芥、卡氮芥、长春花碱、氨甲蝶呤和紫杉醇。本文所使用的二甲双胍的“增强量”这一术语是足以对化疗剂(例如细胞毒素剂) 或治疗(例如放疗)的抗肿瘤作用产生统计学上显著、可重现的增强作用的量。可通过本领域已知的各种手段测定抗肿瘤作用的增强。例如，可通过产生抗肿瘤作用所需治疗或药剂的给予量发生统计学上显著的减少来确定抗肿瘤作用的增强。例如，通过与在二甲双胍不存在时接受标准量治疗的适当对照组进行比较来确定这一点。本文所使用的术语“化疗剂”是指用于肿瘤治疗的化学品或药物。这类药剂通常为细胞毒素剂。本文所使用的术语“放疗”是指使用电离辐射来杀灭癌细胞并使肿瘤缩小。本文所使用的化疗剂(例如细胞毒素剂)或治疗的“减少量”这一术语是指比为治疗肿瘤向患有肿瘤的受试者给予的标准量更低、但产生相同或更好的治疗结果的量。 使用减少量的化疗剂或肿瘤治疗的一个益处是减弱了受者所受到的副作用，同时得到了相同或提高的治疗结果。量的减少可以是在一次或多次个体给予(剂量)时给予的量的减少、给予频率的降低或这两种情况的结合。已向本领域技术人员提供了标准剂量和给予计划方案的指南(例如，在Physicians' Desk Reference，第56版(2002)，出版商Edward R-Barnhart，新泽西(“PDR”)中的记载)。减少量比治疗性给予中常用的标准剂量明显更低(例如，减少至标准剂量的约90<%、80%或70<%)。在某些实例中，将可从减少至小于标准剂量的75%的剂量给予(例如，在标准剂量的约75%-25%内进行给予)中获得治疗益处。预期从减少至标准剂量的约60%、50%或40%的剂量给予中获得治疗益处。在某些实例中，将从减少至小于标准剂量40%的剂量给予(例如，在标准剂量的约40% -10%内进行给予)中获得治疗益处。在一个实施方式中，所述剂量为标准剂量的约30%。在一个实施方式中，所述剂量为标准剂量的约20%。在一个实施方式中，所述剂量为标准剂量的约 10%。本文所使用的术语“抗肿瘤作用，，或“抗癌作用，，是指使肿瘤的生长、生长速率、 尺寸、扩散、转移得以减慢；以及预防个体体内肿瘤的发生和/或复现。在“对受试者进行治疗”中的术语“治疗”意味着尤其是出于阻止不期望的生理学或医学病症发展或恶化的目的、或者出于使受试者体内的此类病症得以改善的目的，对该受试者(人或动物)给予医疗救助。除非另有说明，术语“治疗”不局限于任何具体的时长或任何具体的剂量水平。在本文中，术语“组合物”或“药物组合物”可互换使用，并且是指通常包含赋形剂 (例如本领域常规的、适合于向受试者给予的药学上可接受的载体)的组合物或制剂。可将这类组合物进行具体配制，用以通过数种途径(包括但不限于口服给予、眼部给予和鼻部给予等)中的一种或多种途径进行给予。“药学上可接受的载体”意味着与靶向输送组合物混合和/或向受试者递送靶向输送组合物的任何药学上可接受的手段。本文所使用的术语“药学上可接受的载体”意味着参与将受试药剂从生物体的一个器官或部分搬运或转运至生物体的另一器官或部分的药学上可接受的材料、组合物或辅料，如液态或固态的填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。从与制剂的其它成分相容的意义上来说，各载体必须是“可接受的”，并且各载体与向受试者(例如人)进行的给予是相容的。
本文所使用的“受试者”是指动物，如哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物或鱼类。 术语“哺乳动物”旨在涵盖单数和复数的“哺乳动物”，并且包括但不限于人类；灵长类动物，如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物，如狗和狼；猫科动物，如猫、狮子和虎；马科动物，如马、牛、驴和斑马；食用动物，如牛、猪和羊；有蹄类动物，如鹿和长颈鹿；啮齿类动物，如小鼠、兔、大鼠、仓鼠和豚鼠。在本文中，术语“个体”、“受试者”和“患者”可互换使用，并且是指动物，例如哺乳动物(如人)。本文所使用的术语“二甲双胍”是指二甲双胍或其药学上可接受的盐，例如盐酸盐；1999年3月4日提交的美国申请号09/262,5 中公开的二甲双胍O 1)琥珀酸盐、 二甲双胍O 1)富马酸盐；氢溴酸盐；对氯苯氧基乙酸盐或双羟萘酸盐(embonate)；以及包括美国专利号3，174，901中所公开的盐在内的其他已知的一元羧酸二甲双胍盐和二元羧酸二甲双胍盐；所有这些盐被统称为二甲双胍。本文中所使用的二甲双胍可以是二甲双胍盐酸盐，即，以Glucophage. RTM. (Bristol-Myers Squibb公司的商标)进行销售。本文所使用的术语“衍生物”是指具有类似化学结构和类似功能的化合物。在本申请文件和所附的权利要求书中，除非上下文另有清楚规定，否则，单数形式 “一(a/an)”和“该/所述(the) ”涵盖复数个的所指物。因此举例来说，提到用于递送“一种药物”的组合物包括提到两种以上药物的情况。在本发明的描述和权利要求中，将根据下文阐明的定义使用接下来的术语。本发明另一方面涉及在受试者肿瘤治疗期间使化疗剂的副作用减弱的方法，所述方法包括向受试者给予增强量的二甲双胍和减少量的化疗剂，其中，与化疗剂的常规量相比，所给予的化疗剂的量引起较弱的副作用。本发明进一步针对肿瘤抑制药物组合物，所述组合物包含增强量的二甲双胍和减少量的一种或多种化疗剂，其中，化疗剂的肿瘤抑制量为使得副作用减弱的量。在本文所述方法的一个实施方式中，化疗剂对癌干细胞没有抑制作用。在本文所述方法的另一实施方式中，化疗剂对癌干细胞具有抑制作用。同时还预想到癌干细胞的抑制性化疗和非抑制性化疗的组合治疗。在一个实施方式中，随标准化疗剂(例如减少量的化疗剂)的混合物一起，向肿瘤 (例如癌症)移除手术后的患者给予增强量的二甲双胍。如本文所讨论，还希望共同给予二甲双胍的效果能增强其他形式的抗肿瘤治疗 (例如激素治疗(如干扰素治疗)或放疗)。因而可选地，可使用增强量的二甲双胍并使用减少量的这些其他形式的肿瘤治疗及其相应的治疗剂(减少给予和/或频率)，来进行本文所述的使用化疗剂的治疗方法。同时还预想到将增强量的二甲双胍与一种或多种治疗组合使用，和/或与一种或多种本文所述的其他疗法组合使用。如本文所讨论，进一步希望共同给予二甲双胍的效果能增强其他杀灭肿瘤/癌症细胞的药剂的作用。这包括传统上并不是化疗组成部分的其他药剂(例如药物)，如影响细胞转化的药物(例如Exendin4、阿斯匹林、美洛昔康、喷哚美辛、塞来考昔、卩比罗昔康、尼美舒利(nimesulfide)、舒林酸、tocilizumab、辛伐他汀、浅蓝菌素、美伐他汀)。通过共同给予二甲双胍，可在协同作用/增强作用的分析(例如本文所述的细胞分析)中对这类药剂进行试验。因而可选地，可使用增强量的二甲双胍并使用减少量的这些其他的肿瘤/癌症杀灭剂(减少给予和/或频率)，进行本文所述的使用化疗剂的治疗方法。这类杀灭肿瘤/ 癌细胞的药剂包括但不限于抗体(例如抗HER2)、他莫昔芬和抑制转化的其他化合物。同时还预想到将增强量的二甲双胍与一种或多种治疗和/或药剂组合使用，和/或与一种或多种其他疗法和/或本文所述的药剂组合使用。二甲双胍对给定的化疗剂或治疗进行增强、从而使向受试者给予的量减少的能力在本领域技术人员的能力之内。例如，当与二甲双胍组合给予时，通过药剂或治疗的效力增高(与一种或多种未给予二甲双胍的适当对照相比)，证明了对化疗剂或肿瘤治疗的增强作用。可通过本领域普通技术人员判断治疗的效力。可在癌症和肿瘤的动物模型中对效力进行评价，例如对患有癌症的啮齿类动物进行治疗；并且使得肿瘤的至少一种症状减缓 (例如肿瘤尺寸减小或者肿瘤生长速率减缓或停止)的任何治疗或者是组合物或制剂的给予都表示有效处理。还可以使用癌症的实验动物模型(例如野生型小鼠或大鼠，或优选植入与下文实施例所述的肿瘤细胞类似的肿瘤细胞)判断任何给定制剂的效力。当使用实验动物模型时，肿瘤症状减轻(例如与未治疗的动物对比，在治疗后的动物中更早出现肿瘤尺寸的减小或者肿瘤生长速率的减缓或停止)证明了治疗的效力。“更早”意味着减轻作用(例如肿瘤尺寸的减小)至少早5%发生，但更优选例如早1天、早2天、早3天以上。在下文实施例部分中详述的实验表明，二甲双胍选择性地杀灭癌干细胞，并且这一杀灭作用在癌干细胞暴露于相对低浓度的二甲双胍时发生。因而，本发明另一方面涉及预防或者延缓受试者体内肿瘤/癌症发展的方法，所述方法包括向受试者给予二甲双胍。例如，这类受试者可能易感于肿瘤发展(例如遗传学原因或者由于暴露于致癌物质)。 这类遗传倾向性的实例包括brcal、brcall、rb或p53基因中的易感突变(predisposing mutations)，但不限于此。在一个实施方式中，受试者此前接受过化疗或放疗，并且处于继发性癌症发展的高风险下。一种此类实例是进行过儿童期白血病或淋巴瘤治疗的受试者。 在一个实施方式中，通过本文所述的方法给予二甲双胍来接触癌前病变(例如皮肤病变)， 由此预防所述病变发展成为癌症。在另一实施方式中，在移除此类病变后给予二甲双胍 (例如与移除部分接触)。本发明另一方面涉及在血癌治疗中的自体移植之前，用二甲双胍处理骨髓或外周血骨髓干细胞样本，由此减少癌干细胞。这类处理将降低干细胞再种植(reseeding)的可能性。在一个实施方式中，在已经进行移植后(例如，在移植后数天、数周、数月或一年)，可向接受移植物的受试者给予二甲双胍。本发明另一方面涉及为了在受试者体内长期预防癌症，给予低剂量的二甲双胍。 在一个实施方式中，以补充有二甲双胍的常规食品或膳食补充剂的形式进行给予(例如 经配制的动物饲料，如狗粮、猫粮；或者常规给予家畜的食物)。本发明还涵盖了这类膳食补充剂和食物的制剂。本发明另一方面涉及对二甲双胍衍生物在癌细胞杀灭方面使化疗剂、肿瘤杀灭剂和其他治疗增强的能力进行试验的分析。本领域技术人员可将下文实施例部分中所述的细胞分析适用于此类分析。剂量和给予在治疗性应用中，所使用的化疗剂或治疗的标准剂量和给予计划可根据许多可变因素而变化，例如所给予的细胞毒素剂或治疗的组合；肿瘤类型；接受患者的年龄、体重和临床病症；给予途径；以及给予治疗的临床医生或执业医师的经验和判断。然而，本发明使得剂量和/或给予计划明显减少，由此使治疗的副作用降低。在一个实施方式中，给予的二甲双胍的量可为用于治疗2型糖尿病的治疗性给予中的常用标准剂量(约1500mg/天至约2550mg/天)。在另一实施方式中，二甲双胍的治疗量(例如，用于增强用化疗进行的肿瘤治疗、或用于预防肿瘤发展)比用于治疗2型糖尿病的治疗性给予中的常用标准剂量明显更低，例如减少至标准剂量的约90% (或约1350mg/ 天)、标准剂量的80% (或约1200mg天)、或者标准剂量的70% (或约1050mg/天)。在某些实例中，将从标准剂量减少至低于75%的剂量给予中获得治疗性益处，例如在标准剂量的约75% -25% (或约1125mg/天至约375mg/天)之中进行给予。预期从减少至标准剂量的约60% (或约900mg/天)、标准剂量的50% (或约750mg/天)、或者标准剂量的40% (或约600mg/天)的剂量给予中获得治疗性益处。在某些实例中，将从标准剂量减少至低于40%的剂量给予中获得治疗性益处，例如在标准剂量的约40% -10% (或约600mg/天至约150mg/天)之中进行给予。在一个实施方式中，所述剂量为标准剂量的约30% (或约 450mg/天)。在一个实施方式中，所述剂量约为标准剂量的20% (或约300mg/天)。在一个实施方式中，所述剂量为标准剂量的约10% (或约150mg/天)。进行给予使得所给予的药剂(例如二甲双胍和化疗剂)与肿瘤或肿瘤部位(例如肿瘤移除后)接触。本领域已知合适的给予途径。本文所述药剂可以临床医生发现的任何适当方式给予，如在Physicians' Desk Reference，第56版^00 出版商Edward R-Barnhart，新泽西(“PDR”)中所述的方式。例如胃肠外给予、肠内给予、局部给予。可通过本技术领域已知的任何手段给予组合后的药剂或分别给予各药剂。此类模式包括口服给予、直肠给予、鼻部给予、局部给予(包括口腔含化和舌下给予)或者胃肠外给予(包括皮下给予、肌内给予、静脉内给予和皮内给予)。可将二甲双胍和被增强的药剂全身给予，或者局部给予至肿瘤部位或肿瘤部位附近(例如，通过向肿瘤中或向含有肿瘤的人体的器官或部分中进行注射)。在一个实施方式中，二甲双胍和被增强的治疗剂(例如化疗剂)均给予至中枢神经系统。可在术前或者术后给予，或者术前和术后均进行给予。在一个实施方式中，在手术和肿瘤移除前，一天三次(例如25mg/剂)给予二甲双胍，给予1个月。本文所述方法中的二甲双胍给予(当与化疗剂一起应用时)可进行持续的一段时间(例如6-12个月，或者1年、2年、3年，或者无限期)。在一个实施方式中，二甲双胍比化疗剂更频繁地给予。例如，当每天给予二甲双胍(例如250mg/天)时，可以将化疗剂(例如多柔比星)以显著降低的频率(例如3天/月)给予受试者，而非按处方规定。通常，剂量和给予计划应该足以使肿瘤的生长减缓、优选消退、还优选引起肿瘤的完全消退。在某些情况下，可通过肿瘤特异性标记物的血中浓度降低来监测消退作用。药剂的有效量是提供了由临床医生或其他有资格的观察者记录的、客观上可确认的改进的量。 通常参考肿瘤的直径来测定患者体内的肿瘤消退。肿瘤直径的减小表明了消退。还可通过在停止治疗后肿瘤不复现来表明消退作用。二甲双胍和化疗剂的组合或单独的二甲双胍和化疗剂以周期性的间隔进行递送， 该间隔可从一天数次到每月一次进行变动。如上所述，给予药剂直至已经获得期望的治疗结果。另外，为避免副作用，在每次给予时，并非组合中的所有组分都需要递送。治疗剂通过其作用机理可将现有可用的细胞毒素类药物大致地分为四组烷化剂、抗代谢物、抗生素和各种各样的其他活性物质。为治疗患有癌症的个体而对具体细胞毒素剂进行的选择受到许多因素的影响，包括癌症类型、患者年龄和总体健康状况、以及多药耐药性的问题。本发明的组合物可利用多种细胞毒素剂，包括但不限于以下药剂(包括可能的来源)烷化剂，环磷酰胺(Bristol-Meyers Squibb)、异环磷酰胺(Bristol-Meyers Squibb)、苯丁酸氮芥(Glaxo Wellcome)和卡氮芥(Bristol-Meyers Squibb)；抗代谢物， 阿糖胞苷(Pharmacia&Upjohn)、6_ 巯基嘌呤(Glaxo flfellcome)、6_ 硫代鸟嘌呤(Glaxo Wellcome)和氨甲蝶呤(Immunex)；抗生素，多柔比星(Pharmac i a&Up john)、柔红霉素 (NeXstar)和米托蒽醌(Immimex)；以及各种各样的药剂，如长春新碱(Lilly)、长春花碱 (Lilly)和紫杉醇(Bristol-Meyers Squibb)。优选的细胞毒素剂包括环磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、多柔比星、柔红霉素、米托蒽醌和长春新碱。最优选的细胞毒素剂为环磷酰胺和异环磷酰胺。化疗剂是本领域已知的，并且至少包括紫杉烷类、氮芥类、氮丙啶衍生物、烷基磺酸盐/酯、亚硝基脲、三氮烯；叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、长春花生物碱、抗生素、酶、钼配位络合物、取代尿素、甲基胼衍生物、肾上腺皮质抑制剂或拮抗剂。具体而言，化疗剂可以是选自类固醇、孕酮、雌激素、抗雌激素药或雄激素的非限制性组中的一种或多种药剂。更具体而言，化疗剂可以是阿扎立平、博来霉素、苔藓抑素-1、白消安、卡氮芥、苯丁酸氮芥、卡钼、顺钼、CPT-11、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、柔红霉素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、炔雌醇、依托泊苷、氟尿嘧啶、氟羟甲睾酮、吉西他滨、己酸羟孕酮、 羟基脲、L-天冬酰胺酶、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、马法兰、巯嘌呤、氨甲蝶呤、氨甲蝶呤、光辉霉素、丝裂霉素、米托坦、紫杉醇、丁酸苯酯、强的松、 甲基苄胼、司莫司汀、链脲菌素、他莫昔芬、紫杉烷、泰素(taxol)、丙酸睾酮、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、长春花碱或长春新碱。使用化疗剂的任何组合也在考虑之列。其他合适的治疗剂选自于由放射性同位素、硼附加物(boron addend)、免疫调节剂和化疗增敏剂(chemosensitizing agent)所组成的组(参见美国专利号4，925，648 和4932，412)。在如下文献中描述了合适的化疗剂REMINGT0N' S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第 19 版(Mack Publishing Co. 1995)禾口 Goodman and Gilman ' s The Pharmacological Basis of Therapeutics (Goodman等，Macmillan Publishing Co.编辑， 纽约，1980和2001版)。本领域技术人员已知其他合适的化疗剂，如实验药物。本领域周知放射性核素治疗的各种方法均可用于治疗癌症和其他病理状况，例如在Harbert/'Nuclear Medicine Therapy”，纽约，Thieme Medical Publishers，1087，1-340 页中所述。此夕卜，合适的治疗性放射性同位素选自于由α-发射源、β-发射源、Y-发射源、俄歇电子发射源、 发射出α-粒子的中子俘获剂和通过电子俘获发生衰变的放射性同位素所组成的组。优选地，放射性同位素选自于由 225Ac、198Au、32P、1251、131I、90Y、186Re、188Re、67Cu、177Lu、 213Bi、10B和211At所组成的组。在另一实施方式中，将不同的同位素用作第一治疗剂和第二治疗剂，所述不同的同位素由于它们各自的能量发射情况而在不同的距离有效。当在正常的临床环境时，可将这类治疗剂用于实现更有效的肿瘤治疗，并且对患有多个不同尺寸肿瘤的患者是有用的。几乎没有适用于对极小的肿瘤沉积物和单细胞进行治疗的同位素。在这些情况下，药物或毒素可能是更有用的治疗剂。因此，在本发明优选的实施方式中，将同位素与非同位素物质(如药物、毒素和中子俘获剂)组合使用。已知许多对细胞具有细胞毒作用的药物和毒素，并且可将这些药物和毒素与本发明联合使用。所述药物和毒素可在药物和毒素概要(如Merck Index和Goodman and Gilman等)和上述引用的参考文献中找到。还可将干扰胞内蛋白质合成的药物用于本发明的方法中；本领域技术人员已知这类药物，包括嘌呤霉素、放线菌酮和核糖核酸酶。放疗许多种放疗被用于肿瘤治疗中。申请人预想到在肿瘤治疗中使用增强量的二甲双胍使得这类放疗中的任何一种或其组合的量减少。对于某些类型的肿瘤，可能会将放射给予没有肿瘤迹象的区域。这么做是为了防止肿瘤细胞在接受辐射的区域生长。这一技术被称作预防性放疗。还可给予放疗以帮助减轻症状、例如来自于已经扩散到骨或生物体其他部分的癌症的疼痛。这种治疗被称为姑息性放疗。放射可能来自生物体外部的机器(外放射)，可能置于生物体内部(内放射)，或者可能使用作用于生物体全身的未密封放射性物质(全身性放疗)。待给予的放射类型取决于以下条件癌症的类型、癌症的位置、放射将需要进入生物体中到什么程度、患者的总体健康状况和病史、患者是否将进行其他类型的癌症治疗以及其他因素。对接受癌症放疗的大多数人进行外放射。一些患者进行外放疗、内放疗、全身性放疗，上述三者或者相继进行或者同时进行。通常对门诊患者给予外放疗；大多数患者不需要住院。外放疗用于治疗大多数类型的癌症，包括膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、喉癌、肺癌、前列腺癌和阴道癌。另外，当癌症从生物体的原发部位扩散到其他部分时，可使用外放射来减轻疼痛或缓和其它问题。术中放疗(IORT)是在手术期间给予的外放射的形式。IORT用于治疗不能完全移除、或是在邻近组织中具有高复现(重现)风险的局部癌症。在将所有或大多数癌症移除后，在手术期间直接针对肿瘤部位进行一次高能的大剂量放射(用专门的防护罩对邻近的健康组织进行保护)。患者住院至从手术中恢复。可将IORT用于如下癌症的治疗甲状腺癌和结肠直肠癌、妇科癌症、小肠癌和胰腺癌。还在临床试验(探索研究)中研究治疗成年人体内某些类型的脑肿瘤和骨盆肉瘤。预防性头颅照射(PCI)是在原发性癌(例如小细胞肺癌)具有扩散到脑的高风险时给予脑的外辐射。内放疗(也称作近距离治疗)使用放置在非常接近于肿瘤或放置在肿瘤内的放射作用。通常将放射源密封在被称作移植物的小型储器(holder)中。移植物的形式可以是细线、塑料管(称作导管)、条带、胶囊或种子。将移植物直接放入生物体内。内放射疗法可能需要住院。通常以两种使用密封移植物的方式之一递送内放射。将间质内放疗插入到肿瘤部位或其附近的组织中。间质内放疗用于治疗头颈、前列腺、宫颈、卵巢、乳腺以及肛周和骨盆等区域的肿瘤。用外放疗进行乳腺癌治疗的一些妇女接受了“加强剂量(booster dose) ”的放射(可使用间质内放射或外放射)。腔内或管腔内放疗是用施源器(applicator)插入到生物体内。腔内或管腔内放疗通常用于治疗子宫癌。研究人员还研究了用于包括乳腺癌、支气管癌、宫颈癌、胆囊癌、口腔癌、直肠癌、气管癌、子宫癌以及阴道癌在内的其他癌症的内放疗。全身性放疗使用了放射性物质，如碘131和锶89。所述材料可以经口服或注射进入生物体内。有时，将全身性放疗用于治疗甲状腺癌和成人的非霍奇金淋巴瘤。肿瘤通过本发明的方法和组合物治疗的肿瘤可以是恶性肿瘤(例如，致癌肿瘤或“癌症”)或良性肿瘤。所治疗的良性肿瘤的实例包括甲状腺腺瘤、肾上腺皮质腺瘤和垂体腺瘤、良性脑瘤(例如神经胶质瘤、星形细胞瘤、脑膜瘤)。“癌症”通常意味着以出现肿瘤作为症状的一组疾病。这些肿瘤由非典型(atypical)的细胞组成，具有自主生长的能力、 不明确的界限、侵入邻近组织和血管的能力以及通过产生转移瘤进行播散(disseminate) 的倾向。可通过本文所述的方法和组合物治疗的癌症的实例包括膀胱癌、黑色素瘤、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、子宫内膜癌、前列腺癌、肾癌(肾细胞癌)、皮肤癌(非黑色素瘤)、白血病、甲状腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌、睾丸癌，但不限于此。可通过上述方法抑制以下肿瘤的原发性生长和转移性生长女阴上皮性癌(vulvar epidermoid carcinomas)、宫颈癌、子宫内膜腺癌、卵巢腺癌和眼黑素瘤。由于可穿过血脑屏障，根据本文所述方法，给予二甲双胍可用于治疗或预防中枢神经系统肿瘤、或者防止癌症扩散至中枢神经系统。本发明的药物组合物可以是固体剂型、半固体剂型或液体剂型，例如悬浮液或气雾剂等。优选以适合于单次给予精确剂量的单位剂型给予所述组合物。根据所需制剂，所述组合物还可包含药学上可接受的、无毒的载体或稀释剂，所述载体或稀释剂被定义为通常用于配制向动物或人进行给予的药物组合物的辅料。组合物可以缓释或定时释放的制剂提供。载体或稀释剂可包括本领域已知的任何缓释材料，如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯(单独使用或与蜡混合)。通过使用聚合物络合或吸附二甲双胍和/或化疗剂可获得控释制剂。通过选择适当的大分子(例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯、 甲基纤维素、羧甲基纤维素和硫酸鱼精蛋白)并选择大分子的浓度以及并入方法(以控制释放)，可实现受控递送。还可使用微囊化作用(microencapsulation)。定时释放的制剂可全天提供即时释放和脉冲释放的组合。对稀释剂进行选择以免影响组合的生物活性。这类稀释剂的实例为蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液(Ringer' s solution)、右旋糖溶液以及 Hank' s溶液。此外，制剂的药物组合物还可包含其他载体、佐剂、乳化剂(如泊洛沙姆) 或者无毒的、非治疗性的且无致免疫性的稳定剂等。这类稀释剂或载体的有效量为对获得药学上可接受的制剂(就组分溶解度或生物活性等方面而言)有效的量。本发明另一方面涉及用上述药物组合治疗癌症的制剂。在一个实施方式中，所述制剂包括控释装置，在该装置中的一种或数种药物以滞后方式(delayed fashion)释放。这类制剂可为片剂(或丸剂)形式，口服后在不同的时间间隔释放不同剂量的药物。本发明另一方面涉及用于通过本文所公开的方法(例如肿瘤治疗)治疗受试者的试剂盒。所述试剂盒以上文中提供的剂量包含一个或多个瓶装的二甲双胍和一个或多个瓶装的化疗剂(装在一起或者处于单独的小瓶中)。所述试剂盒可进一步组合包含描述其使用的说明书。所述试剂盒可包含二甲双胍以及一种或多种化疗剂的制剂。
对调节化疗剂的药剂或由二甲双胍调节的药剂进行筛选的方法本发明提供了对通过本发明的方法调节化疗剂的药剂(例如二甲双胍衍生物)进行筛选的方法。可将肿瘤、癌症和/或癌干细胞用于分析试验化合物(例如二甲双胍衍生物)杀灭细胞的效力。在该方法中，向细胞给予二甲双胍衍生物和已知的化疗剂，通过测定细胞的指示参数(例如细胞活力)来确定其杀灭细胞的能力。将细胞活力与未接受二甲双胍衍生物的适当对照进行比较，杀灭作用增强(例如协同作用)表明二甲双胍衍生物是调节化疗剂的药剂。本发明还提供了对其肿瘤、癌症和/或癌干细胞杀灭能力被二甲双胍增强的药剂进行筛选的方法。在该方法中，向细胞给予试验化合物和二甲双胍(或已认定的二甲双胍衍生物)；通过测定细胞的指示参数(例如细胞活力)来确定其杀灭细胞的能力。将细胞活力与未接受试验化合物的适当对照进行比较，杀灭作用增强(例如协同作用)表明该试验化合物是被二甲双胍增强的药剂。可方便地向培养中的细胞的培养基中加入溶液形式或易溶形式的试验化合物。在流通系统(flow-through system)中间歇或连续地加入流动的药剂，或者向另外的静态溶液中单次或增量式地加入化合物的团块(bolus)。在流通系统中使用两种流体，其中一种是生理中性溶液，另一种是添加有试验化合物的相同溶液。使第一种流体流过细胞，随后使第二种流体流过细胞。在单一溶液的方法中，向围绕着细胞的培养基的容量中加入试验化合物的团块。培养基组分的总浓度不应该随着团块的加入而明显变化，而且在流通法中的两种溶液之间不应明显变化。在某些实施方式中，药剂制剂不包含可显著影响整个制剂的额外组分(如防腐剂)。因此，在一个实施方式中，制剂本质上由试验药剂和生理上可接受的载体(例如水、乙醇、DMSO等)组成。然而，如果化合物是无溶剂的液体，制剂可本质上由化合物本身组成。用不同的药剂浓度平行进行多次分析，从而获得对各种浓度的差别反应。如本领域所已知，通常使用由1 10(或其他对数尺度)稀释产生的浓度范围来确定药剂的有效浓度。如果必要，可用第二系列的稀释来对浓度进行进一步细化。通常，这些浓度之一起到阴性对照的作用，即，处于零浓度、或处于低于药剂检测水平的浓度、或者是等于或低于在表现型方面未产生可检测的变化的药剂浓度。试验化合物当提到筛选分析时，本文和整个申请文件所使用的术语“试验化合物”或“试验药剂”意味着任何有机分子或无机分子，包括经修饰和未修饰的核酸(如反义核酸)、RNAi (如 siRNA或shRNA)、肽、拟肽、受体、配体和抗体。试验化合物可以是可向试验动物给予的任何分子、化合物或其他物质。在某些情况下，试验药剂本质上不干扰动物活力。合适的试验化合物可为小分子、生物聚合物(如多肽、多糖和多核苷酸等)。一般以lng/kg至10mg/kg、通常10 μ g/kg至lmg/kg)的剂量向动物给予试验化合物。试验化合物可以被认定为治疗上有效的化合物、如抗增殖剂，或者被认定为用于药物开发的先导化合物(lead compound) 0在某些实施方式中，试验化合物可来自于多种库，如随机或组合的、肽或非肽的库。本领域已知许多库，例如化学合成库、重组噬菌体展示库和基于体内翻译的库。化学合成库的实例记载于如下文献中Fodor等(Science 251:767-73(1991))、Houghten 等(Nature 354 :84-86 (1991) )、Lam 等(Nature 354:82-84(1991))、 Medynski(Bio/Technology 12 :709-10 (1994)) , Gallop 等(J. Med. Chem.37 1233-51 (1994))、Ohlmeyer 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :10922—26 (1993))、Erb 等(Proc. Natl. Acad. ki. USA 91 :11422- (1994))、Houghten 等(Biotechniques 13: 412-21(1992))、Jayawickreme 等(Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91 :1614-18(1994))、Salmon 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :11708-12 (1993))、国际专利公开 WO 93/20242 以及 Brenner 禾口 Lerner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :5381-83 (1992))。噬菌体展示库的实例记载于如下文献中Scott和Smith (Science 249 386-90(1990))、Devlin 等(Science 249 :404-06 (1990)) ,Christian 等(J. Mol. Biol. 227 711-18(1992)), Lenstra (J. Immunol. Meth. 152 149-57 (1992)) , Kay 等(Gene 128 59-65(1993))和国际专利公开 WO 94/18318。基于体内翻译的库包括但不限于记载于国际专利公开WO 91/05058和 Mattheakis 等(Proc. Natl. Acad. ki. USA 91 :9022-26(1994))中的库。作为非肽库的实例，可采用苯二氮-‘广库(参见例如，Bunin等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 4708-12(1994))。还可以使用肽库(参见例如，Simon 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367-71(1992))。Ostresh 等(Proc. Natl. Acad. ki. USA 91:11138-42(1994))记载了可使用的库的另一实例，其中，肽中的酰胺官能团已被全甲基化，产生化学转化后的组合库。用于筛选方法的试验药剂可选自于下述组化学品、小分子、化学个体(chemical entity)、核酸序列、作用(action)；核酸类似物或蛋白或多肽或其片段类似物。在某些实施方式中，核酸为DNA或RNA，核酸类似物例如可为PNA、pcPNA和LNA。核酸可为单链或双链，并可选自于包括下述核酸的组对感兴趣的蛋白(proteins of interest)进行编码的核酸、寡聚核苷酸、PNA等。这类核酸序列包括例如但不限于对起到转录阻遏物作用的蛋白进行编码的核酸序列、反义分子、核酶、小的抑制性核酸序列(例如但不限于RNAi、 shRNAi, siRNA、微小RNAi (mRNAi)、反义寡聚核苷酸等)。蛋白和/或肽药剂或其片段可为任何感兴趣的蛋白，例如但不限于突变蛋白、治疗性蛋白、截短蛋白，其中所述蛋白在细胞中通常不存在或以较低水平表达。感兴趣的蛋白可选自于包括如下蛋白的组突变蛋白、 基因工程蛋白、肽、合成肽、重组蛋白、嵌合蛋白、抗体、人源化蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、 经修饰的蛋白以及上述蛋白的片段。可将药剂应用至介质中，使药剂与细胞(如内胚层来源的细胞)接触并诱导其发挥作用。或者，药剂可以处于该细胞(例如内胚层来源细胞) 的胞内，这是将核酸序列引入该细胞、并且所述核酸序列的转录使得在细胞内产生核酸和/ 或蛋白药剂的结果。药剂还涵盖了细胞(例如内胚层来源细胞)所经受的任何作用和/或事件。作为非限制性实例，所述作用可包括在细胞中触发生理变化的任何作用，例如但不限于热休克(heat-shock)、电离辐射、冷休克、电脉冲、光照和/或波长暴露、UV暴露、压力、 拉伸作用、增加和/或减少的氧气暴露、暴露至活性氧(ROS)、缺血性条件、荧光暴露等。环境刺激还包括如下定义的固有的环境刺激。对药剂的暴露可以是连续或间断的。在某些实施方式中，药剂为包含已知和未知化合物的感兴趣的药剂，所述化合物涵盖了可包括有机金属分子、无机分子、遗传序列等在内的许多化学品种类(主要为有机分子)。本发明的重要方面是对候选药物进行评价，包括毒性试验等。候选药剂还包括有机分子，所述有机分子含有为结构相互作用、特别是氢键键合所必需的官能团，并且一般至少
13包含胺、羰基、羟基或羧基，常常包含上述化学官能团中的至少两个。候选药剂经常包含由一个或多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳香族结构或多芳香族结构。还在生物分子中发现了候选药剂，所述生物分子包括肽、多核苷酸、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶或上述生物分子的衍生物、结构类似物或组合。试验药剂还包括药理学活性药物、遗传活性分子等。感兴趣的化合物包括例如 化疗剂、激素或激素拮抗剂、生长因子或重组生长因子以及上述化合物的片段和变体。适用于本发明的示例性药剂为记载于如下文献中的药剂“The Pharmacological Basis of Therapeutics，，，Goodman and Gilman，McGraw-Hill，纽约，N. Y. ， (1996)，第九版，如下章节:ffater, Salts and Ions ；Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism ；Drugs Affecting Gastrointestinal Function ；Chemotherapy of Microbial Diseases ；Chemotherapy of Neoplastic Diseases ；Drugs Acting on Blood-Forming organs ；Hormones and Hormone Antagonists ；Vitamins,Dermatology ；禾口 Toxicology ；以引用的方式将其整体并入本文。还包括毒素、生化战剂(biological and chemical warfare agents),例如参见 Somani, S. Μ. (Ed. ), "Chemical Warfare Agents，，，Academic Press,纽约，(1992)。药剂包括上述所有种类的分子，并可进一步包括未知内容物的样品。感兴趣的是来自于天然来源(如植物)的天然存在化合物的复合混合物。虽然许多样品包含溶液形式的化合物，但也可对能溶于合适溶剂中的固体样品进行分析。感兴趣的样品包括环境样品，例如地下水、海水、采矿废料等；生物样品，例如由作物、组织样品等制备的裂解物 (Iysate)；制造样品，例如药物制备期间的时间进程(time course)；以及为分析制备的化合物库等。感兴趣的样品包括对潜在治疗价值进行评价的化合物，即药物候选物。用于筛选的化合物包括二甲双胍衍生物和候选药剂(本文中也被称为试验药剂或试验化合物)。候选药剂从多种来源获得，包括合成化合物库或天然化合物库。例如，可利用多种手段随机和定向合成包括生物分子在内的多种有机化合物，所述手段包括随机化寡聚核苷酸和寡肽的表达。或者，可得到或容易制得细菌、真菌、植物和动物的提取物形式的天然化合物库。另外，容易通过传统的化学、物理和生化手段对天然的库或合成产生的库以及化合物进行修饰，并可用来产生组合的库。已知可使药理学药剂接受定向或随机的化学修饰(如酰基化、烷基化、酯化、酰胺化等)，从而产生结构类似物。通常在同时使用不含药剂的类似细胞的情况下，在对细胞(通常为多种肿瘤/癌症/癌干细胞)的作用方面对药剂进行筛选。对响应该药剂的参数变化进行测定，并通过与参比培养物(例如存在和不存在该药剂、用其他药剂得到的结果等)相比对结果进行评价。参数为细胞活力、细胞生长和/或肿瘤发生的可定量部分，期望可在高通量系统中对上述参数进行精确测定。虽然大多数参数将提供定量读数，但是在某些实例中，半定量结果或定性结果是可接受的。读数可包括单次测定值、或可包括平均值、中值或方差等。由多次相同分析特征性地为每个参数获得参数读数的范围。对可变性进行预期，并使用标准统计方法获得各组试验参数的值的范围，用常用的统计方法提供单一值。在某些实施方式中，该分析是通过计算机界面进行操作的自动(robotic)高通量系统或计算机化的分析。待筛选化合物可以是天然存在的分子或合成的分子。待筛选的化合物还可以从天然来源(如海洋微生物、藻类、植物和真菌)获得。试验化合物也可为矿物质或寡聚药剂(oligo agents) 0或者，试验化合物可从包含有肽或小分子的药剂组合库或从工业(例如，由化学工业、医药工业、环境工业、农业工业、海洋工业、美容工业、药物工业和生物技术工业)合成的化合物的现有库存中获得。试验化合物可包括例如药物、治疗剂、农业试剂或工业试剂、环境污染物、美容化合物、药物化合物、有机化合物和无机化合物、脂类、糖皮质激素、抗生素、肽、蛋白质、糖、碳水化合物、嵌合分子及上述化合物的组合。对于能以分步方式合成的多种类型化合物而言，可产生组合库。这类化合物包括 多肽、蛋白质、核酸、β -转角模拟物(β -turn mimetics)、多糖、磷脂、激素、前列腺素、类固醇、芳香族化合物、杂环化合物、苯并二氮杂T、寡聚N-取代甘氨酸和寡聚氨基甲酸酯。在本发明的方法中，优选的试验化合物为小分子、核酸和经修饰的核酸、肽、拟肽、蛋白质、糖蛋白、碳水化合物、脂或糖脂。核酸优选为DNA或RNA。通过记载在下述文献中的编码合成库(ESL)方法可以构建化合物的大组合库Affymax，WO 95/12608 ；Affymax，WO 93/06121 ；哥伦比亚大学，WO 94/08051 ； Pharmacopeia, WO 95/35503 ；以及 kripps，WO 95/30642 (为所有目的，以引用的方式将上述各文献整体并入本文)。通过噬菌体展示法还可以生成肽库，参见例如Devlin，WO 91/18980。还可以从政府或私人来源获得待筛选的化合物，所述来源包括例如=ChemBridge 公司(圣地亚哥，CA)的DIVERSet E库(16，320种化合物)、美国癌症研究所(NCI)的天然产物库(Bethesda，MD)、NCI 开放合成化合物保藏中心(Bethesda，MD)、NCI 的 Developmental Therapeutics Program 等。另外，通过传统的化学、物理和生化手段可容易地对天然和合成产生的库以及化合物进行修饰。此外，已知的药理学药剂可接受定向或随机的化学修饰，如酰基化、烷基化、
酯化、酰胺化等。为对上述化合物在调节肌肉生长相关因子的转录和/或表达的能力方面进行筛选，应将试验化合物给予试验的对象。在一个实施方式中，试验对象为包含肿瘤、癌症和/ 或癌干细胞的细胞培养物。该细胞可为原代细胞培养物或来自肿瘤的永生化细胞系。可通过例如下述方式给予试验化合物将化合物稀释进入维持细胞的培养基中、 将试验化合物与具有肌肉的动物的食物或饮水混合、向具有肌肉的动物局部给予处于药学上可接受的载体中的化合物、使用浸有试验化合物的三维底物(如慢释颗粒等)并将这类底物包埋入动物体内、肌内给予化合物、胃肠道外给予化合物。也可将多种其他试剂纳入混合物中。这些试剂包括如盐、缓冲液、中性蛋白(例如白蛋白)、去污剂等，这些试剂可用来促进最佳的蛋白质-蛋白质和/或蛋白质-核酸的结合作用，和/或减弱非特异性相互作用或背景相互作用等。同时，可使用改进分析效率的试剂，如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物剂等。还可以存在防腐剂和其他添加剂。例如，可加入抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和非活性气体(通常参见 Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 16 版，Mack, 1980)。 如上所述，通常在体内、例如在所培养的细胞中进行筛选分析。除非本文另有定义，与本申请结合使用的科技术语应具有本领域普通技术人员所共同理解的含义。进一步而言，除非上下文另有要求，单数术语应包含复数且复数术语应包含单数。
应当理解的是，本发明不限于本文所记载的具体的方法学、方案和试剂等，并因而可以进行变化。本文所使用的术语仅仅是为了描述具体的实施方式，而并不打算限定本发明的范围，只通过权利要求书对本发明的范围进行限定。除在操作实施例中或是另有指明以外，本文所使用的全部表达成分的量或反应条件的数值在所有实例中都应被理解为由术语“大约”修饰。当用于描述本发明时，与百分比结合的术语“大约”意味着士 1%。一方面，本发明涉及本文记载的本发明所必需的组合物、方法和其各自的组分，并且仍然开放式地包含未明确指出的成分，无论其是否必需(“包含”)。在某些实施方式中，在组合物、方法或其各自的组分的描述中包含的其他成分限于不会实质上影响本发明具备新颖性的基础特征的成分(“本质上由……组成”)。同样地，这也适用于所记载的方法中的步骤以及组合物和其中的组分。在其他实施方式中，本文所述的发明、组合物、方法和其各自的组分旨在排除被认为未被视为所述组分、组合物或方法所必需成分的任何成分(“由…… 组成”)。为了描述和公开的目的，以引用的方式将所有的专利、专利申请和其它已确定的出版物在此明确地并入本文，例如，所述出版物中描述的方法学的使用可能与本发明相关。 这些出版物仅因为它们的公开早于本发明的申请日而提供。在这方面的任何内容不应视为承认发明者没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请者可得的信息，并且不构成任何关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的承认。本发明可如下述任一编号的段落所定义1.在有需要的受试者体内治疗肿瘤的方法，所述方法包括给予增强量的二甲双胍和减少量的一种或多种化疗剂。2.段落1所述的方法，其中，二甲双胍的增强量为250mg/天。3. 一种组合物，所述组合物包含增强量的二甲双胍、减少量的一种或多种化疗剂以及药学上可接受的载体。4.段落3所述的组合物，其中，二甲双胍的增强量为约25mg。5.段落3所述的组合物，其中，二甲双胍的增强量为约75mg。6.段落3所述的组合物，其中，二甲双胍的增强量为约250mg。7. 一种试剂盒，所述试剂盒包含瓶装的二甲双胍、瓶装的一种或多种化疗剂以及使用二甲双胍和化疗剂的说明书。8.在受试者体内预防癌症或延缓癌症复现的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的二甲双胍。9.段落8所述的方法，其中，二甲双胍的量为约75mg/天。通过下述实施例对本发明进行了进一步的说明，所述实施例不应被视为对本发明的进一步限定。实施例实施例1在此证明，在四种不同遗传类型的乳腺癌中，二甲双胍选择性地杀灭癌干细胞。二甲双胍和多柔比星(公知的化疗药物)的组合对培养中的癌干细胞和非干细胞癌细胞均具
16有杀灭作用，减小肿瘤块，并且在异种移植小鼠模型中比单独使用任一药物都更有效地延长症状缓解。这些观察结果构成了对癌干细胞假说的独立支持，并且提供了为什么二甲双胍和化疗药物的组合可以使患有乳腺癌(和可能的其他癌症)的患者的治疗得以改进的理论基础。为检验二甲双胍的抗癌性质，我们首先使用了由含有ER-Src (v-Src癌蛋白同雌激素受体的配体结合域形成的融合物)的非转化人乳腺上皮细胞(MCF-10A)组成的可诱导转化模型。当用他莫昔芬对这些细胞进行处理时，这些细胞在对_3他内发生转化。转化后的细胞群包含10%的癌干细胞，这由CD44标记物的表达和形成乳腺球(在非附着和非分化条件下生成的多细胞“微瘤”)的能力进行定义(18)。此外，我们分析了用不同药物治疗的其他三种乳腺腺癌细胞系(来自遗传和表型方面不同的肿瘤)ER-阳性MCF7(13)； HER-阳性SKBR3(14)；三阴性MDA-MB-468 (15)。这些细胞系也含有能够形成乳腺球的少量癌干细胞群。在所有的实验中，以不影响非转化细胞生长的浓度使用二甲双胍(0. 1或 0.3mM;图1A)。在先对癌细胞系进行的实验(7-9)使用了远远更高浓度的二甲双胍(通常为10-30mM)，这种条件对非转化细胞也是有毒的。在可诱导的MCF-10A模型中，二甲双胍强有力地抑制了形态学上的转化(见于存在或不存在0. ImM 二甲双胍和/或TAM时细胞生长3 后的相差图像(数据未示出))、创伤愈合分析中的侵袭性生长(见于存在或不存在0. ImM 二甲双胍和/或TAM时细胞生长的创伤愈合/侵入响应分析(数据未示出))、病灶形成、软琼脂中集落的形成和乳腺球的生成(图1B)。此外，用二甲双胍对来自所有四种乳腺癌细胞系的乳腺球进行处理，引起乳腺球的数目在48h内显著降低(细胞死亡的结果)(图2)。由于乳腺球主要由癌干细胞组成 (18)，后一观察结果表明二甲双胍可以杀灭癌干细胞。惊人的是，在转化后的MCF-10A或MCF-7细胞群内，二甲双胍优先杀灭癌干细胞 (CD44高/CDM低)(图3A)。类似地，当将所有四种癌细胞系进行分选时，癌干细胞对二甲双胍十分敏感，而标准癌细胞群实质上仍然不受影响(图3B)。此外，用二甲双胍对MCF-10A 癌干细胞处理仅Ih就阻滞了这些细胞在裸鼠体内形成肿瘤的能力，即使在注射后的当月药物并不存在(图3C)。二甲双胍选择性杀灭癌干细胞的能力与多柔比星(杀灭癌细胞而非癌干细胞的化疗剂)形成鲜明对比。正如根据它们迥异的性质所预料的那样，共同使用二甲双胍和多柔比星使混合的转化群中非干细胞癌细胞和癌干细胞得以减少(图3A)。与细胞系中的上述结果一致，对肿瘤(向裸鼠注射MCF-IOA-ER-Src细胞10天后出现肿瘤)进行处理后，即观察到了二甲双胍和多柔比星之间的协同作用。在处理15天(3 个处理周期，每个处理周期5天)后，这一药物组合几乎消除了肿瘤，而单用多柔比星仅使得肿瘤体积减小2倍，单用二甲双胍几乎没有作用(图4A)。再过10天(第35天)后，用多柔比星治疗的小鼠显示出了肿瘤体积的进一步降低。单用二甲双胍的微弱效果和独立报告(8)中更显著的效果形成了对比，但是这些研究之间在实验方案方面存在着许多不同。为了确定为什么二甲双胍和多柔比星的组合比单用多柔比星更有效的基本原理， 我们对在3个处理周期(第25天)后从肿瘤中回收的细胞群进行了检查。与我们在细胞系中的结果一致，用该药物组合治疗的小鼠几乎不存在癌干细胞，而在由单用多柔比星治疗的小鼠的肿瘤中容易地检测到癌干细胞(图4B)。因此，在传统化疗的背景下，二甲双胍的治疗优势与其杀灭癌干细胞的能力相联系。
关于人类疾病进程的癌干细胞假说基于癌干细胞和非干细胞癌细胞差别化的成瘤性质和对公知化疗的响应。对这一模型的预测(迄今未经试验)为选择性抑制癌干细胞的药物应当与化疗药物协同发挥作用，从而延缓复发。惊人的是，用二甲双胍和多柔比星的组合治疗的小鼠在治疗结束后至少60天内仍保持症状缓解(图4A)。相比之下，在单用多柔比星对小鼠治疗20天后，肿瘤继续开始生长，并且复发后的肿瘤生长速率与最初发病时(即，未进行治疗)观察到的速率相当。因此，组合治疗对延长症状缓解具有显著的效果， 并且事实上甚至可以治愈这些异种移植生成的肿瘤。除了其潜在的医学意义外，这些观察结果还对癌干细胞假说提供了独立且进一步的支持。据我们所知，二甲双胍选择性地杀灭癌干细胞的能力、以及与多柔比星协同发挥作用以阻滞癌干细胞和非干细胞转化细胞的能力是独特的。对于乳腺癌的情况，赫赛汀和他莫昔芬是用于分别表达HER2和雌激素受体的癌症类型的药物，但是某些形式的乳腺癌不具有这些受体，从而能抵抗这些治疗。对所有这些类型的乳腺癌，二甲双胍选择性地抑制癌干细胞生长，并由此很可能与化疗药物协同地发挥作用。此外，由于二甲双胍抑制了 MCFlOA-ER-Src细胞的转化，表明二甲双胍具有预防癌症发展的能力(相对于对已经出现的癌症进行治疗)。事实上，二甲双胍抑制细胞转化的能力可构成如下的流行病学观察的基础用二甲双胍治疗的糖尿病患者具有较低的癌症发病率(5，6)。作为癌症预防手段，优选以长期的方式给予二甲双胍，并且在这点上，对于此处所观察到的抗癌效果来说，所需要的二甲双胍浓度大大低于用于糖尿病治疗的浓度。最后，二甲双胍和多柔比星在肿瘤中对不同类型细胞的选择性可以解释在裸鼠体内使肿瘤块减小、并延长症状缓解这种惊人的组合效果，并且这种选择性提供了将二甲双胍与化疗结合作为乳腺癌或其他癌症的新治疗措施的基本原理。本发明的方法细胞系MCFlOA细胞是来自纤维囊性乳腺组织的乳腺上皮细胞，所述乳腺组织得自一名无乳腺癌家族史且无发病迹象的36岁妇女的乳房切除术(12)。遗传分析并没有显示出HER2/ neu致癌基因的任何扩增或H-Ras致癌基因的突变，并且这些细胞并不表达雌激素受体。此处的实验中使用了 MCFlOA衍生物，该衍生物含有v-Src癌蛋白同雌激素受体的配体结合域形成的完整融合物(integrated fusion)。MCF7细胞是表达极高水平雌激素受体的乳腺腺癌细胞(对于HER2/neu为阴性)，并且不具有强的锚定独立(anchorage-ind印endent)性质(1 。SKBR3细胞是过表达HER2/neU受体的乳腺腺癌细胞，具有锚定独立性质，并且在异种移植中形成肿瘤(14)。MDA-MB-468细胞来自三阴性乳腺癌，该乳腺癌显示出许多复现性的基底样(basal-like)分子异常，包括ER-PR-HER2阴性状态、p53缺乏、EGFR过表达、 PTEN丧失和MEK/ERK途径的组成性活化(1 。MDA-MB-468细胞非常具有侵略性，在异种移植实验中形成了大肿瘤，该肿瘤对采用他莫昔芬或赫赛汀进行的治疗具有抗性。细胞培养于37 "C>5 % CO2 下，在 DMEM 培养基 Qnvitrogen)、10 % 胎牛血清(Atlanta Biologicals)和青霉素/链霉素(Invitrogen)中，使MCF-7细胞、SKBR3细胞和MDA-MB-486 细胞进行生长。如先前所述(16)对MCFlOA ER-Src细胞进行培养，并用溶于KOH中的IyM 的40Η-他莫昔芬(TAM) (Sigma)诱发转化。在加入TAM对_3他后出现形态变化、表型转化和病灶形成，通过相差显微镜术进行监测。除非另有指明，通常添加溶于水中的二甲双胍 (Sigma)至 0. ImM。创伤愈合活动力(motility)分析将细胞以IX IO5/孔接种于6孔培养皿上。使用PlO微量移液管管尖在汇合的细胞中造成单道刮伤。将细胞用PBS洗涤三次以去除细胞碎片，补充分析培养基并进行监测。 在创伤后oh和1 使用相差显微镜术捕获图像。集落形成分析将来自MCFlOA ER-Src的三份5X IO4细胞的样品以4 1 (ν/ν)与处于MCF-10A 生长培养基中的2. 0%琼脂糖混合，从而使琼脂糖终浓度为0. 4%。将细胞混合物置于处于生长培养基中的0. 5%琼脂糖的固化层上。每6-7天向细胞供给含有0. 4%琼脂糖的生长培养基。在15天后对集落的数目进行计数。乳腺球培养如先前所述(17)，将乳腺球在无血清DMEM/F12培养基中的悬浮液(1000细胞/ml)中进行培养，该培养基补充有 B27(l 50，Invitrogen) ,0. 4 % BSA,20ng/ml EGF(Preprotech)和4μ g/ml胰岛素(Sigma)。在这些条件下，在存在或不存在二甲双胍时， 通过放入转化后的细胞群对乳腺球的形成进行了试验，通过向6天龄的乳腺球中加入二甲双胍、并在处理2天和4天后对乳腺球的数目进行计数来检查乳腺球的生长。癌干细胞的分离和分析在单细胞悬浮液上，对转化后的细胞群进行流式细胞术的细胞分选。将细胞用 CD44 抗体(FITC-缀合)(555478，BD Biosciences)和 CD24 (PE-缀合)(555428，BD Biosciences))抗体进行染色。用0. ImM 二甲双胍处理来自MCFlOA ER-Src细胞(经TAM 处理)和MCF7细胞、SKBR3细胞以及MDA-MD-486细胞的癌干细胞(⑶44高/⑶对低)和非干细胞转化细胞(CD44低/CDM高)，在不同的时间点(12h、Mh、48h)对细胞生长进行评价。进行三次重复实验，数据以平均值士SD表示。异种移植中的肿瘤生长和复发将5X IO6 的 MCFlOA ER-Src 细胞注射入 16 只雌性 nu/nu 小鼠(Charles River 实验室)的右侧腹部，对于所有小鼠均使肿瘤发展10天，大小为 50mm3。将小鼠随机分入4 组中(未治疗的组、每5天(3个处理周期)用％ig/kg多柔比星、100μ g/ml 二甲双胍或其组合通过腹膜内注射进行治疗的组)。在初次注射后的多个时间测定肿瘤体积(平均值和 95%置信区间)。所有的小鼠实验均按照学会动物管理和使用委员会的程序和指南进行。将所引参考文献以引用的方式并入本文。参考文献1. Allies LE, Weissman IL, Cancer stem cells in solid tumors, Curr Opin Biotechnol 2007;18:460-6。2.Polyak K, Weinberg RA, Transitions between epithelial and mesenchymal states !acquisition of malignant and stem cells traits, Nat Rev Cancer 2009 ；9 265-73。3. Larsson SC, Mantzoros CS, Wolk A,Diabetes mellitus and risk of breast cancer -.a meta-analysis, International journal of cancer 2007 ； 121 :856_62。4. Hsu IR, Kim SP, Kabir Μ, Bergman RN, Metabolic syndrome,hyperinsulinemia，and cancer，Am J Clin Nutr 2007;86:867-71。5. Evans JM, Donnelly LA, Emslie-Smith AM, Alessi DR, Morris AD, Metformin and reduced risk of cancer in diabetic patients,BMJ Clinical research ed 2005 ； 330 :1304-5o6. Jiralerspong S，Palla SL, Giordano SH 等，Metformin and pathologic complete responses to neoadjuvant chemotherapy in diabetic patients with breast cancer, J Clin Oncol 2009 ；27 :3297_302。7. Alimova IN，Liu B，Fan Z，等，Metformin inhibits breast cancer cell growth,colony formation and induces cell cycle arrest in vivo,Cell Cycle 2009 ； 8 :909-15o8. Liu B，Fan Z，Edgerton SM 等，Metformin induces unique biological and molecular responses in triple negative breast cancer cells，Cell Cycle 2009 ；8 2031-40。9.Zakikhani M，Dowling R，Fantus IG，Sonenberg N，Pollak MiMetformin is an AMP kinase-dependent growth inhibitor for breast cancer cells, Cancer research 2006 ；66 :10269-73o10. Cazzaniga M，Bonanni B，Guerrieri-Gonzaga A，Decensi A，Is it time to test metformin in breast cancer clinical trials ？ Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2009 ；18 :701_5。11. Goodwin PJ, Ligibel JA, Stambolic V，Metformin in breast cancer :Time for action, J Clin Oncol 2009 ；27 :3271_3。12. Soule HD, Maloney TM, Wolman SR 等，Isolation and characterization of a spontaneously immortallized human breast epithelial cell line， MCFlO, Cancer research 1990;50:6075-86。13. Brooks SC, Locke ER, Soule HD, Estrogen receptor in a human cell line (MCF-7)from breast carcinoma，J Biol Chem 1973;248:6251-3。14.Bergman I，Barmada MA, Griffin JA, Slamon DJ, Treatment of meningeal breast cancer xenografts in the rat using an anti-p 185/HER2 antibody, Clin Cancer Res 2001；7 :2050_6。15.Oliveras-Ferraros C， Vazquez-Martin A， Lopez-Bonet E 等，Growth and molecular interactions of the anti-EGFR antibody cetuximab and the DNA crosslinking agent cisplatin in gefitinib-resistant MDA_MB_468 cells :new prospects in the treatment of triple-negative/basal-like breast cancer, Int J Oncol 2008 ；33 :1165_76。16.Debnath J, Muthuswamy SK，Brugge JS，Morphogenesis and oncogenesis of MCF-IOA mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures，Methods 2003 ；30 (3) :256_68017. Dontu G, Abdallah WM, Foley JM In vivo propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells， Genes Dev2003 ；17 :1253-70。 18. Grimshaw MJ, Cooper L, Papazisis K 等，Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenie breast cancer cells, Breast Cancer Res 2008 ；10 :R52。
权利要求
1.在有需要的受试者体内治疗肿瘤的方法，所述方法包括给予增强量的二甲双胍和减少量的一种或多种化疗剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中，二甲双胍的增强量为250mg/天。
3.一种组合物，所述组合物包含增强量的二甲双胍、减少量的一种或多种化疗剂以及药学上可接受的载体。
4.如权利要求3所述的组合物，其中，二甲双胍的增强量为约25mg。
5.如权利要求3所述的组合物，其中，二甲双胍的增强量为约75mg。
6.如权利要求3所述的组合物，其中，二甲双胍的增强量为约250mg。
7.一种试剂盒，所述试剂盒同时包含装有二甲双胍的瓶、装有一种或多种化疗剂的瓶以及使用二甲双胍和化疗剂的说明书。
8.在受试者体内预防癌症或延缓癌症复现的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的二甲双胍。
9.如权利要求8所述的方法，其中，二甲双胍的量为约75mg/天。
全文摘要
本文公开了在有需要的受试者体内治疗肿瘤的方法，所述方法包括给予增强量的二甲双胍和减少量的一种或多种化疗剂。二甲双胍的增强量的一个实例为约250mg/天。本文还公开了在受试者体内预防癌症或延缓癌症复现的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的二甲双胍。在该方法的一个实例中，二甲双胍的量为约75mg/天。本文还公开了一种组合物，所述组合物含有增强量的二甲双胍、减少量的一种或多种化疗剂以及药学上可接受的载体。本文还公开了包含有二甲双胍和一种或多种化疗剂的试剂盒。
文档编号A61K31/33GK102596192SQ201080048060
公开日2012年7月18日 申请日期2010年8月25日 优先权日2009年8月25日
发明者凯文·施特尔, 季米特里斯·伊利奥普洛斯, 希瑟·赫希 申请人:哈佛大学校长及研究员协会