肺癌和食管癌相关基因adamts18的制作方法

专利名称：肺癌和食管癌相关基因adamts18的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测和诊断癌症的方法以及用于治疗和预防癌症的方法。
_2] 优先权本申请要求2009年8月24日提交的美国临时申请No. US 61/275，039的权益，通过述及将其完整内容收入本文。
背景技术：
原发性肺癌是大多数国家中癌症死亡的首要原因(NPL I)，而食管鳞状细胞癌 (ESCC)是消化道的一种最常见的致命恶性肿瘤(NPL 2)。尽管手术技术和辅助化疗有改进，晚期肺或食管癌的患者往往因病情进展而致命(NPL 1-2)。因此，了解这两种主要胸部癌症的生物学和开发更加有效的治疗来改善患者的存活是极端重要的(NPL 3)。特异性分子靶向的概念已被应用于创新性癌症治疗策略的开发。现在，临床实践中有两种主要办法可用治疗性单克隆抗体和小分子作用剂(NPL 4)。至今，多种靶向疗法诸如贝伐单抗、西妥昔单抗、埃罗替尼、吉非替尼、索拉非尼(sorafenib)、和舒尼替尼已进行了治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)的II期和III期试验考察(NPL 4-8) 0在常规化疗的基础上添加针对血管发生性蛋白血管内皮生长因子(贝伐单抗)或表皮生长因子受体(西妥昔单抗)的治疗性抗体已经给NSCLC患者提供了显著的存活收益(NPL 4-5)。已显示两种小分子表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂——埃罗替尼和吉非替尼对一部分晚期NSCLC患者有效(NPL 6-7)。用两种口服多重靶向受体酪氨酸激酶抑制剂索拉非尼 (c-RAF、b-RAF、血管内皮生长因子受体2和3、血小板衍生生长因子受体h、和KIT的抑制剂)和舒尼替尼(血小板衍生生长因子受体、KIT、FLT3、和血管内皮生长因子受体的抑制剂)进行的II期研究提示它们在治疗晚期NSCLC中的功效(NPL 8)。然而，毒性问题限制了这些治疗方案用于选定的患者，而且即使应用了所有可用类型的治疗，呈现积极响应的患者的比例仍然非常有限(NPL 4-8)。为了分离用于诊断、治疗、和/或预防肺癌和食管癌的潜在分子靶，先前借助由27，648种基因或表达序列标签组成的cDNA微阵列对来自101名肺癌和19名ESCC患者的癌细胞实施了基因组范围的基因表达谱分析(NPL 3，9-14)。为了验证各基因产物的生物学和临床病理学意义，通过临床肺和食管癌材料的肿瘤组织微阵列分析与RNA干扰技术的组合建立了筛选系统(NPL15-33)。通过此筛选系统鉴定ADAMTS18为小细胞肺癌细胞中上调的因子 (W02007/013665)。ADAM家族中有两个亚群膜锚定ADAM和分泌型ADAMTS。ADAM成员包含多个共同的域，包括原肽域、金属蛋白酶域、解联蛋白域、富半胱氨酸域、EGF样域、跨膜域和胞质域，而ADAMTS成员在原肽域、金属蛋白酶域和解联蛋白域之外还含有血小板反应蛋白基序、富半胱氨酸域和间隔域(NPL 34)。虽然ADAMTS是可溶性蛋白质，但是它们似乎大多藉由其血小板反应蛋白基序或间隔区来结合胞外基质(NPL 35)。除ADAMTS10和-12外， ADAMTS均经由在位于原-域和催化域之间的弗林蛋白酶样识别位点处发生的蛋白水解加工而被调节(NPL 35-36)。已记录肺癌(NPL 16，37-45)和其它癌症(NPL 37)，诸如脑肿瘤、前列腺癌、肝癌、乳腺癌等中数种ADAM和ADAMTS的生成的失调。尽管有这些报告，ADAMTS18 的激活在人癌症进展中的意义及其作为治疗靶的临床潜力尚无完全记载。引用表专利文献[PTL 1JPCT/JP2006/315254非专利文献[NPL 1]Ahmedin J，Rebecca S，Elizabeth W, et al. Cancer statistics，2007. CA Cancer J Clin 2007 ；57 43-66[NPL 2] Shimada H，Nabeya Y，Ochiai T，et al. Surgery 2003;133:486-94[NPL 3]Daigo Y, Nakamura Y. Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008;56:43-53[NPL 4]Thatcher N. Lung Cancer 2007 ；57Suppl 2 S 18-23[NPL 5] Sandler A, Gray R, Perry MC，et al. N Engl J Med 2006 ；355 :2542_50[NPL 6] Shepherd FA, Rodrigues Pereira J，Ciuleanu T，et al. N Engl J Med 2005 ；353 123-32[NPL 7]Thatcher N，Chang A, Parikh P，et al. Lancet 2005;366:1527-37[NPL 8]Cesare G，Paolo M, Filomena G，et al. Oncologist 2007 ；12 :191_200[NPL 9]Kikuchi T，Daigo Y, Katagiri T，et al. Oncogene 2003;22:2192-205[NPL 10]Kakiuchi S，Daigo Y，Tsunoda T，et al.Mol Cancer Res 2003 ；1 485-99[NPL ll]Kakiuchi S，Daigo Y，Ishikawa N，et al. Hum Mol Genet 2004 ；13 3029-43[NPL 12]Kikuchi T, Daigo Y, Ishikawa N，et al. Int J Oncol 2006;28:799-805[NPL 13]Taniwaki M, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006;29:567-75[NPL 14] Yamabuki T，Daigo Y，Kato T，et al. Int J Oncol 2006;28:1375-84[NPL 15] Suzuki C，Daigo Y，Kikuchi T，et al. Cancer Res 2003;63:7038-41[NPL 16] Ishikawa N，Daigo Y，Yasui W, et al. Clin Cancer Res 2004 ；10 8363-70[NPL 17]Kato T，Daigo Y，Hayama S，et al. Cancer Res 2005;65:5638-46[NPL 18]Furukawa C，Daigo Y，Ishikawa N，et al. Cancer Res 2005 ；65 7102-10[NPL 19] Ishikawa N，Daigo Y，Takano A，et al. Cancer Res 2005;65:9176-84[NPL 20] Suzuki C, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Cancer Res 2005;65:11314-25[NPL 21] Ishikawa N，Daigo Y，Takano A，et al. Cancer Sci 2006 ；97 :737_45[NPL 22]Takahashi K，Furukawa C，Takano A，et al. Cancer Res2006 ；66 9408-19[NPL 23]Hayama S，Daigo Y，Kato T，et al. Cancer Res 2006;66:10339-48[NPL 24]Kato T,Hayama S,Yamabuki Y,et al. Clin Cancer Res2007 ;13 :434_42[NPL 25]Suzuki C，Takahashi K，Hayama S，et al. Mol Cancer Ther 2007 ；6 542-51[NPL26]Yamabuki T,Takano A,Hayama S，et al. Cancer Res 2007 ；67 :2517-25Hayama S，Daigo Y，Yamabuki T，et al. Cancer Res 2007 ；67 :4113-22Kato T，Sato N，Hayama S，et al. Cancer Res 2007 ；67 :8544-53Taniwaki M,Takano A,Ishikawa N，et al. Clin Cancer Res 2007 ；13 [NPL 30]Ishikawa N，Takano A，Yasui W, et al. Cancer Res 2007 ；67 :11601-11[NPL 31]Mano Y，Takahashi K，Ishikawa N，et al. Cancer Sci 2007 ；98
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7症，或抑制癌细胞生长中使用而配制的。本发明的药物组合物包括针对ADAMTS18基因的反义核苷酸或双链分子(例如siRNA)，其抑制ADAMTS18基因的表达。本发明的还有另一个目的是提供针对ADAMTS18基因的反义核苷酸或双链分子 (例如siRNA)的用途，特别是在癌症治疗和预防的背景中，更特别的是肺癌和食管癌的治疗和/或预防。更具体地，本发明提供下述[I]至[26][I] 一种用于在受试者中检测或诊断癌症或发生癌症的倾向性的方法，包括测定源自受试者的生物样品中ADAMTS18基因的表达水平的步骤，其中所述表达水平与所述基因的正常对照水平相比的升高指示所述受试者罹患或有风险发生癌症，其中所述表达水平是通过选自下组的任何方法测定的(a)检测 ADAMTS18 基因的 mRNA ；(b)检测由ADAMTS18基因编码的蛋白质；和(c)检测由ADAMTS18基因编码的蛋白质的生物学活性，[2] [I]的方法，其中所述表达水平比所述正常对照水平高至少10%，[3] [I]或[2]的方法，其中该生物学活性为细胞增殖活性、N-糖基化活性、侵袭活性或基质金属蛋白酶(MMP)活性，[4] 一种筛选用于治疗或预防癌症的候选物质的方法，其中所述方法包括下述步骤(a)使测试物质与ADAMTS18多肽或其片段接触；(b)检测该多肽或片段和该测试物质之间的结合；并(c)选择结合该多肽或片段的测试物质作为用于治疗或预防癌症的候选物质，[5] 一种筛选用于治疗或预防癌症的候选物质的方法，其中所述方法包括下述步骤(a)使测试物质与ADAMTS18多肽或其片段接触；(b)检测该多肽或片段的生物学活性；(C)将该多肽或片段的生物学活性与在该物质不存在时检测到的生物学活性比较；并(d)选择阻抑该多肽的生物学活性的测试物质作为用于治疗或预防癌症的候选物质，[6] [5]的方法，其中该生物学活性为细胞增殖活性、N-糖基化活性、侵袭活性或基质金属蛋白酶(MMP)活性，[7] 一种筛选用于治疗或预防癌症的候选物质的方法，其包括下述步骤(a)使测试物质与表达ADAMTS18基因的细胞接触；(b)检测ADAMTS18基因的表达水平；(c)将该表达水平与在该测试物质不存在时检测到的表达水平比较；并(d)选择降低该表达水平的测试物质作为用于治疗或预防癌症的候选物质，[8] 一种筛选用于治疗或预防癌症的候选物质的方法，其中所述方法包括下述步骤(a)使测试物质与其中导入有载体的细胞接触，该载体包含ADAMTS18基因的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报告基因；(b)测量所述报告基因的表达水平或活性；(C)将该表达水平或活性与在该测试物质不存在时检测到的表达水平或活性比较；和(d)选择降低该表达水平或活性的测试物质作为用于治疗或预防癌症的候选物质，[9] 一种双链分子，其在导入表达ADAMTS18基因的细胞中时抑制该基因的表达， 其中该双链分子包含有义链和反义链，其中该有义链包含与选自SEQ ID NO : 11和12的靶序列对应的核苷酸序列，且该反义链包含与该有义链的靶序列互补的核苷酸序列，使得该有义和反义链彼此杂交以形成该双链分子，[10] [9]的双链分子，其中该有义链与反义链在该靶序列处杂交以形成该双链分子，该双链分子长度为19-25个核苷酸对，[11] [9]或[10]的双链分子，其中所述双链分子为单一多核苷酸构建体，其包含经单链连接的所述有义链和所述反义链，[12] [11]的双链分子，其具有通式5’ -[A]-[B]-[A，]_3，，其中[A]为有义链，其包含与选自SEQ ID NO 11和12的靶序列对应的核苷酸序列，[B]为单链且由3至23个核苷酸组成，且[A’ ]为反义链，其包含与选自SEQ ID NO 11和12的靶序列互补的核苷酸序列，[13] 一种载体，其编码[9]至[12]中任一的双链分子，[14]载体，它们包含包括有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸组合中之任一种， 其中所述有义链核酸包含与SEQ ID NO :11或12对应的核苷酸序列，且所述反义链核酸由与该有义链互补的序列组成，其中所述有义链和所述反义链的转录物彼此杂交以形成双链分子，且其中所述载体在导入表达ADAMTS18基因的细胞中时抑制细胞增殖，[15] 一种在受试者中治疗或预防癌症的方法，包括对所述受试者施用药学有效量的针对ADAMTS18基因的双链分子或编码所述双链分子的载体，其中该双链分子抑制 ADAMTS18基因的表达，[16] [15]的方法，其中该双链分子为[9]至[12]中任一的双链分子，[17] [15]的方法，其中该载体为[13]或[14]的载体，[18] [I]至[8]和[15]至[17]任一的方法，其中该癌症选自肺癌和食管癌，[19] 一种用于治疗或预防癌症的组合物，该组合物包含药学有效量的针对 ADAMTS 18基因的双链分子或包含所述双链分子的载体，其中该双链分子抑制ADAMTS18基因的表达，和可药用的担载体，[20] [19]的组合物，其中该双链分子为[9]至[12]中任一的双链分子，[21] [19]的组合物，其中该载体为[13]或[14]的载体，[22] [19]至[21]中任一的组合物，其中该癌症选自肺癌和食管癌，[23] 一种用于诊断或检测癌症的试剂盒，包含用于检测ADAMTS18基因的转录或翻译产物的试剂，[24] [23]的试剂盒，其中该试剂包含结合ADAMTS18基因的转录产物的核酸或结合ADAMTS18基因的翻译产物的抗体，
[25]用于诊断或检测癌症的试剂，其包含结合ADAMTS18基因的转录产物的核酸或结合ADAMTS18基因的翻译产物的抗体，并[26] [23]或[24]的试剂盒，或[25]的试剂，其中该癌症选自肺癌和食管癌。本文中描述的方法的一个优点是在检测到肺癌和食管癌的明显临床症状之前就鉴定出疾病。根据下面的详细描述及根据权利要求，本发明的其它特征和优点会变得明显。本领域技术人员会理解，本发明的一个或多个方面能符合某些目的，而一个或多个其它方面能符合某些其它目的。每个目的可以不是在它的所有方面同等适用于本发明的每一个方面。因此，前述目的可视为关于本发明的任何一个的备选。本发明的这些和其它目的和特征在阅读下面的详细描述连同附图和实施例之后会变得更加清楚明白。然而，要理解，上面的发明概述和下面的详细描述都是优选实施方案，而非对本发明或本发明其它备选实施方案的限制。附图简述在考虑下面的附图简要描述和发明详细描述及其优选实施方案之后，本发明的各个方面和应用对熟练技术人员会变得明显[图la-b]图I描绘肺癌和食管癌和正常组织中ADAMTS18的表达部分A描绘通过半定量RT-PCR分析检测的15例临床肺癌(肺ADC、肺SCCjP SCLC ;顶部小图)和15种肺癌细胞系(底部小图)中ADAMTS18基因的表达。部分B描绘通过半定量RT-PCR分析检测的10例临床ESCC(顶部小图)和10种食管癌细胞系(底部小图)中ADAMTS18基因的表达。[图lc-d]图I描绘肺癌和食管癌和正常组织中ADAMTS18的表达部分C描绘通过半定量RT-PCR分析检测的5例临床ESCC的癌性组织和正常组织中ADAMTS18基因的表达。部分D描绘通过Northern印迹分析检测的正常人组织中ADAMTS18的表达。[图2]图2描绘针对ADAMTS18的siRNA对NSCLC和ESCC细胞的生长的抑制顶部小图描绘半定量RT-PCR的结果，通过半定量RT-PCR分析确认DMSl 14和TE4细胞中响应针对 ADAMTS18 的 siRNA (si-ADAMTS18-#l 或 #2)或对照 siRNA (EGFP 或 LUC)ADAMTS18 的表达。中部和底部小图描绘对用si-ADAMTS18或对照siRNA转染的肿瘤细胞进行的MTT和集落形成测定的结果。[图3a]图3描绘外源ADAMTS18对细胞生长的影响在部分A中，左边小图描绘通过Western印迹检测的C0S-7细胞中外源ADAMTS18的瞬时表达。右边小图描绘用 ADAMTS18cDNA或对照siRNA转染的C0S-7细胞的MTT测定的结果。[图3b]图3描绘外源ADAMTS18对细胞生长的影响在部分B中，描绘外源 ADAMTS18对细胞生长的影响。左边小图描绘通过Western印迹检测的A549细胞中外源 ADAMTS 18的瞬时表达，而右边小图描绘用ADAMTS18cDNA或对照siRNA转染的A549细胞的 MTT测定的结果。[图4a_b]图4描绘外源ADAMTS18蛋白的翻译后修饰、亚细胞定位和向培养基中的分泌在部分A中描绘与N-糖苷酶一起温育后外源ADAMTS18蛋白的Western印迹的结果。在部分B中描绘与DAPI免疫共染色，通过抗FLAG检测的C0S-7细胞中外源ADAMTS18 蛋白的亚细胞定位。[图4c_d]图4描绘外源ADAMTS18蛋白的翻译后修饰、亚细胞定位和向培养基中的分泌在部分C中描绘通过半定量RT-PCR分析检测的C0S-7细胞中ADAMTS18的表达。 在部分D中描绘通过Western印迹分析检测的外源ADAMTS18蛋白向培养基中的分泌。[图5a]图5描绘通过将ADAMTS18导入哺乳动物细胞中而诱导的对细胞侵袭的增强、及外源或内源ADAMTS18的MMP活性在部分A中描绘测定的结果，证明ADAMTS18表达质粒转染后Madrigal基质中C0S-7细胞的侵袭性质。显示了吉姆萨染色(放大倍数， xlOO;下部小图)和侵袭穿过经Matrigel包被的滤膜的细胞的相对数目(上部小图)。测定在一式两份的孔中进行两次。[图5b_d]图5描绘通过将ADAMTS18导入哺乳动物细胞中而诱导的对细胞侵袭的增强、及外源或内源ADAMTS18的MMP活性在部分B中描绘与Matrigel测定同时实施的细胞生长测定的结果。在部分C中描绘通过MMP测定试剂盒评估的C0S-7细胞中外源 ADAMTS 18的MMP活性。在部分D中描绘si_ADAMTS18#l对DMS114细胞中内源ADAMTS18的 MMP活性的阻抑。发明详述虽然任何与本文中描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于实施或测试本发明的实施方案，但是现在描述优选的方法、装置、和材料。然而，在描述本发明的材料和方法之前，要理解，本发明不限于本文中描述的特定大小、形状、尺度、材料、方法、方案、 等，因为这些可依照常规实验和优化而变化。还要理解，该描述中使用的术语只是出于描述特定样式或实施方案的目的，而非意图限制本发明的范围，本发明的范围只会由所附权利要求来限制。通过述及明确地将此说明书中提到的每一篇出版物、专利或专利申请的公开内容完整收入本文。然而，本文中无一处可解释为承认本发明没有资格凭借发明在先而早于此类公开。除非另有定义，否则这里使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员所共同理解的相同的意思。如果有冲突，当以本说明书，包括定义为准。定义如本文中使用的，词语“一个/种”、“该”、和“所述”意味着“至少一个/种”，除非另有明确说明。与物质(例如多肽、抗体、多核苷酸、等)联用的术语“分离的”和“纯化的” 表示该物质基本上不含至少一种也可包括于天然来源中的物质。如此，分离的或纯化的抗体指基本上不含细胞材料诸如碳水化合物、脂质、或其它来自衍生该蛋白质(抗体)的细胞或组织来源的污染性蛋白质的抗体，或当化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品的抗体。术语“基本上不含细胞材料”包括这样的多肽制备物，其中多肽被与用于分离或重组生产它的细胞的细胞成分分离。因此，基本上不含细胞材料的多肽包括这样的多肽制备物， 其具有少于约30%、20%、10%、或5% (按干重计)的异源蛋白质(在本文中也称作“污染性蛋白质”)。当多肽系重组产生时，其还优选基本上不含培养基，包括具有少于约20%、 10%、或5%的蛋白质制备物体积的培养基的多肽制备物。当多肽通过化学合成产生时，其优选基本上不含化学前体或其它化学品，包括具有少于约30 %、20%、10 %、5 % (按干重计)的蛋白质制备物体积的与该蛋白质合成有关的化学前体或其它化学品的多肽制备物。 例如，在蛋白质制备物的十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳及凝胶的考马斯亮蓝染色等等之后出现单一条带，可以显示特定蛋白质制备物含有分离的或纯化的多肽。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体和多肽是分离的或纯化的。“分离的”或“纯化的”核酸分子，诸如cDNA分子，当通过重组技术产生时，可基本上不含其它细胞材料或培养基，或当化学合成时可基本上不含化学前体或其它化学品。在一个优选的实施方案中，编码本发明抗体的核酸分子是分离的或纯化的。术语“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该等术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是经过修饰的残基或非天然存在的残基(诸如相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。术语“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及与天然存在的氨基酸发挥相似功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及在细胞中在翻译后经过修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、和O-磷酸丝氨酸)。短语“氨基酸类似物”指与天然存在的氨基酸具有相同的基础化学结构(α碳与氢、羧基、氨基、和R基团结合)但具有经过修饰的R基团或经过修饰的主链的化合物(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)。短语“氨基酸模拟物”指与具有与一般氨基酸不同的结构但发挥与一般氨基酸相似的功能的化学化合物。氨基酸在本文中可以通过它们公知的由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的三字母符号或单字母符号来指称。除非另有明确陈述，术语“基因”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核苷酸”、“核酸”和 “核酸分子”可交换使用，并且与氨基酸类似，以普遍接受的单字母代码来表示。类似于氨基酸，它们涵盖天然存在的和非天然存在的核酸聚合物。多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、核酸、 或核酸分子可包含DNA、RNA或其组合。除非另有定义，术语“癌症”指过表达ADAMTS18基因的癌症，特别是肺癌，包括腺癌(ADC)、鳞状细胞癌(SCC)、大细胞癌(LCC)、和小细胞肺癌(SCLC)，和食管癌。如本文中使用的，术语“双链分子”指抑制靶基因表达的核酸分子，包括例如短干扰RNA (siRNA ；例如双链核糖核苷酸(dsRNA)或小发夹RNA (shRNA))和短干扰DNA/ RNA(siD/R-NA ;例如DNA和RNA的双链嵌合物(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小发夹嵌合物 (shD/R-NA))。在本文中，“双链分子”也称作“双链核酸”、“双链核酸分子”、“双链多核苷酸”、“双链多核苷酸分子”、“双链寡核苷酸”和“双链寡核苷酸分子”。如本文中使用的，术语“靶序列”指靶基因的mRNA或cDNA序列内的这样的核苷酸序列如果将靶向该序列的双链分子导入表达靶基因的细胞中的话，会导致靶基因的整个mRNA的翻译受到阻抑。对于基因的mRNA或cDNA序列内某个核苷酸序列，如果包含与靶序列对应的序列双链分子抑制表达该基因的细胞中该基因的表达，则可确定其为靶序列。当靶序列用cDNA序列来显示时，使用双链cDNA的有义链序列(即mRNA序列转变成DNA序列的序列)来限定靶序列。双链分子包含具有与靶序列对应的序列的有义链，和具有与靶序列互补的序列的反义链，而且该反义链与该有义链在互补序列处杂交以形成双链分子。在本文中，短语“与...对应”表示依照构成双链分子有义链的核酸的种类来转换靶序列。例如，当靶序列以DNA序列显示且双链分子的有义链具有RNA 区时，该RNA区内的碱基“t”用碱基“u”替换。另一方面，当靶序列以RNA序列显示且双链分子的有义链具有DNA区时，该DNA区内的碱基“u”用“t”替换。例如，当靶序列以RNA序列SEQ ID NO : 11或12显示且双链分子的有义链具有由DNA构成的3’侧半区时，“与靶序列对应的序列”为 “5 ^ -GCCAGUAUCUCAAGAAATT-3 ' ”(对于 SEQ ID NO 11)或 “ 5 ' -GGGCACAACUTTGGUATGA-3 ' ”(对于 SEQ ID NO : 12)。还有，对于双链分子的反义链，与靶序列互补的序列可依照构成反义链的核酸的种类来限定。例如，当靶序列以 RNA序列SEQ ID NO :11或12显示且双链分子的反义链具有由DNA构成的5’侧半区时， “与靶序列互补的序列”为 “ 3 ' -CGGUCAUAGAGTTCTTTAA-5 ' ”(对于 SEQ ID NO : 11)或 “3' -CCCGUGUUGAAACCATACT-5' ” (对于 SEQ ID NO :12)。另一方面，当双链分子由RNA构成时，与SEQ ID NO :11或12中所示靶序列对应的序列为SEQ ID NO :11或12的RNA序列，且与SEQ ID NO :11或12中所示靶序列对应的互补序列为 RNA 序列 “ 3 ' -CGGUCAUAGAGUUCUUUAA-5 ' ”(对于 SEQ ID NO : 11)或 “3' -CCCGUGUUGAAACCAUACU-5' ” (对于 SEQ ID NO :12)。除了与靶序列对应的序列及其互补序列之外，双链分子还可具有一个或两个长度为2至5个核苷酸的3’突出端(例如im)和/或连接有义链和反义链的环序列以形成发
夹结构。本文中使用的术语“siRNA “指阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA 导入细胞的标准技术，包括其中以DNA为模板转录RNA的那些。所述siRNA包括有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、反义核酸序列(亦用“反义链”指代)或两者。所述siRNA可如此构建使得单个转录物具有靶基因的有义核酸序列与其互补的反义核酸序列，例如，发夹结构。所述siRNA可为dsRNA或shRNA。本文中使用的术语“dsRNA”指包含相互互补序列的两个RNA分子的构建体，所述两个RNA分子通过所述互补序列退火以形成双链RNA分子。所述两条链的核苷酸序列可不仅包含选自靶基因序列中蛋白质编码序列的“有义”或“反义” RNA，亦可包括具有选自所述靶基因的非编码区域的核苷酸序列的RNA分子。在本说明书中使用的术语“shRNA”是指具有茎-环结构的siRNA，其包含彼此互补的第一区和第二区(即有义链和反义链)。两个区的互补程度和方向足以使两个区之间发生碱基配对，所述第一区和第二区通过环区连接在一起，而所述环是因为环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shRNA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链(intervening single-strand) ”在本说明书中使用的术语“siD/R-NA”是指包含RNA和DNA 二者的双链多核苷酸分子，包括RNA和DNA的杂合体和嵌合体，其阻止靶mRNA的翻译。在本说明书中，杂合体表示这样的分子，其中由DNA组成的多核苷酸和由RNA组成的多核苷酸相互杂交形成双链分子；而嵌合体表示组成所述双链分子的链中的一条或两条可以同时含有RNA和DNA。使用将siD/R-NA导入细胞的常规技术。所述siD/R-NA包括有义核酸序列(亦用“有义链”指代)、反义核酸序列(亦用“反义链”指代)或两者。siD/R-NA可以这样构建，使单个转录物同时具有来自靶基因的有义核酸序列和互补反义核酸序列，例如发夹。siD/R-NA可以是 dsD/R-NA 或 shD/R-NA。在本文中使用的术语“dsD/R-NA”是指这样两个分子的构建体，所述两个分子包含彼此互补的序列并且已经藉由所述互补序列退火在一起而形成双链多核苷酸分子。两条链的核苷酸序列可以不仅仅包含选自靶基因序列的蛋白编码序列的“有义”或“反义”多核苷酸序列，还可以包含具有选自靶基因的非编码区的核苷酸序列的多核苷酸。组成dsD/R-NA 的两个分子中的一个或两个由RNA和DNA 二者组成(嵌合体分子)，或者一个分子由RNA组成而另一个由DNA组成(杂合双链)。在本文中使用的术语“shD/R-NA”是指具有茎-环结构的siD/R-NA，其包含彼此互补的第一区和第二区，即有义链和反义链。所述区的互补程度和方向足以使它们之间发生碱基配对，第一区和第二区通过环区连接，所述环是因为在环区内的核苷酸(或核苷酸类似物)之间缺乏碱基配对而形成的。shD/R-NA的环区是介于有义链和反义链之间的单链区，也可以称作“间插单链”。本说明书中使用的“分离的核酸”是指从本来的环境(例如自然出现时的自然环境)中被取出，从而与其自然状态相比发生了合成性的改变的核酸。在本发明的背景中，分离的核酸包括DNA、RNA和它们的衍生物。I. ADAMTS18 多核苷酸和 ADAMTS18 多狀本发明部分基于下述发现自患病患者获得的肺癌和食管癌细胞中ADAMTS18基因的表达升高。人ADAMTS18基因的核苷酸序列显示于SEQID NO :1，而且也可作为GenBank 登录号匪199355获得。在本文中，ADAMTS18基因涵盖人ADAMTS18基因以及其它动物的 ADAMTS18基因，包括但不限于非人灵长类动物、小鼠、大鼠、犬、猫、马、和牛，而且进一步包括等位突变体和在其它动物中找到的与ADAMTS18基因对应的基因。由人ADAMTS18基因编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO :2，而且也可作为 GenBank登录号NP 955387. I获得。在本发明的背景中，由ADAMTS18基因编码的多肽称作 “ADAMTS18”，而且有时称作“ADAMTS18多肽”或“ADAMTS18蛋白”。依照本发明的一个方面，功能性等同物也包括在ADAMTS18蛋白中。在本文中， 蛋白的“功能性等同物”为具有与该蛋白等同的生物学活性的多肽。也就是，任何保留 ADAMTS18蛋白的生物学能力的多肽可用作本发明中的每种蛋白的此类功能性等同物。ADAMTS 18蛋白的生物学活性包括例如对细胞分化的调节活性和癌细胞增殖活性 (癌细胞增殖增强活性)。另外，ADAMTS18蛋白的生物学活性可包括N-糖基化活性、侵袭活性和MMP (基质金属蛋白酶)活性。此类功能性等同物包括那些对ADAMTS18蛋白的天然存在氨基酸序列替代、删除、 添加、和/或插入一个或多个氨基酸的。或者，多肽可以是包含与ADAMTA18蛋白的序列(例如SEQ ID NO 2)具有至少约80%同源性(也称作序列同一性)，更优选至少约90%至95% 同一性，甚至更优选96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的多肽。在其它实施方案中，多肽可以由在严格条件下与ADAMTS18基因的天然存在核苷酸序列杂交的多核苷酸编码。短语“严格(杂交)条件”指下述条件，在该条件下，核酸分子会与其靶序列杂交，通常在核酸的复杂混合物中，但没有与其它序列的可检测的杂交。严格条件取决于序列，而且在不同情况中会有所变化。较长的序列在较高的温度发生特异性杂交。对于核酸杂交详尽指导可见于 Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。一般地，严格条件选择为在限定的离子强度和pH，比特定序列的热熔点(Tm)低约5-10°C。Tm是如下的温度 (在限定的离子强度、pH、和核酸浓度下)，其中50%的与靶互补的探针在平衡时与靶序列杂交(因为靶序列过量存在，所以在Tm，在平衡时50%的探针被占据)。严格条件也可以通过添加去稳定剂(诸如甲酰胺)来实现。对于选择性或特异性杂交，阳性信号是背景的至少两倍，优选背景杂交的10倍。例示性的严格杂交条件可以如下50%甲酰胺、5x SSCJP I % SDS,在 42°C温育，或 5x SSC、I % SDS、在 65°C温育，用 O. 2x SSC 和 O. I % SDS 在 50°C清洗。在本发明的背景中，用于分离编码与人ADAMTS18蛋白在功能上等同的多肽的 DNA的杂交条件可由本领域技术人员常规选择。例如，可如下进行杂交在68摄氏度用 “Rapid-hyb buffer”(Amersham LIFE SCIENCE)进行30分钟或更长的预杂交,添加经过标记的探针，并在68摄氏度温育I小时或更长。下面的清洗步骤可在例如低严格度条件中进行。一种例示性的低严格度条件可包括42°C、2x SSC、0. 1% SDS，优选50°C、2x SSC,O. 1% SDS。常常优选使用高严格条件。一种例示性的高严格条件可包括在室温在2x SSC.0. 1% SDS中清洗3次各20分钟，然后在Ix SSC、0. 1% SDS中在37摄氏度清洗3次各20分钟， 并在Ix SSC、0. I % SDS中在50摄氏度清洗2次各20分钟。然而，数种因素，诸如温度和盐浓度，可影响杂交的严格度，而且本领域技术人员可选择合适的因素以达到所需的严格度。一般而言，蛋白中一个、两个或更多个氨基酸的修饰不会影响蛋白的功能。事实上，已知突变的或经过修饰的蛋白(即包含通过替代、删除、插入和/或添加而修饰一个、两个或更多个氨基酸残基的氨基酸序列的肽)保留原始的生物学活性(Mark et al. , Proc Natl Acad Sci USA 81 :5662-6 (1984) ；ZoIIer and Smith, Nucleic Acids Res 10 :6487-500(1982) ；Dalbadie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13(1982))。因而，本领域技术人员会认识到，对氨基酸序列进行个别添加、删除、插入、或替代，这改变单个氨基酸或少数氨基酸，或者被认为是“保守修饰”的那些修饰——其中蛋白的改变产生具有相似功能的蛋白，这些都是本发明的背景中可接受的。如此，在一个实施方案中，本发明的肽可具有在人ADAMTS18序列中添力卩、插入、删除、和/或替代一个、两个或甚至更多个氨基酸的氨基酸序列。只要保持蛋白的活性，氨基酸突变的数目不受特别限制。然而，一般优选改变氨基酸序列的5%或更少。因而，在一个优选的实施方案中，在此类突变体中要突变的氨基酸数目一般为30个氨基酸或更少，优选20个氨基酸或更少，更优选10个氨基酸或更少，更优选 6个氨基酸或更少，甚至更优选3个或4个氨基酸或更少。要突变的氨基酸残基优选突变为保持该氨基酸的侧链特性的另一种氨基酸(称为保守性氨基酸替代的过程)。氨基酸侧链特性的例子有疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W， Y，V)、亲水性氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S，T)、和具有下列共同官能团或特征的侧链 脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P);含有羟基基团的侧链(S，T，Y);含有硫原子的侧链(C，M);含有羧酸和酰胺的侧链(D，N, E，Q);含有碱的侧链(R，K，H);和含有芳香族的侧链(H，F，Y， W)。提供功能相似氨基酸的保守性替代表在本领域是公知的。例如，下列8个组各种包含彼此构成保守性替代的氨基酸I)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；
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6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如 Creighton, Proteins 1984)。此类保守性修饰多肽包括在本发明的ADAMTS18蛋白中。然而，本发明并不仅限于此，而且ADAMTS18蛋白包括非保守性修饰，只要它们保留ADAMTS18蛋白的至少一种生物学活性即可。另外，经过修饰的蛋白并不排除多态变体、种间同源物、和那些由这些蛋白的等位基因编码的。此外，本发明的ADAMTS18基因涵盖编码ADAMTS18蛋白的此类功能性等同物的多
核苷酸。II.诊断癌症II-1.用于诊断癌症或发生癌症的倾向性的方法发现ADAMTS18基因的表达在患有癌症，尤其是肺癌和食管癌细胞的患者中特异性升高。因而，ADAMTS18基因，及其转录和翻译产物可以在诊断上用作过表达ADAMTS18基因的癌症，诸如肺癌和食管癌的标志物。此外，通过测量源自受试者的生物样品，诸如细胞样品中ADAMTS18基因的表达，能诊断或检测肺癌或食管癌。此类诊断或检测可通过在源自受试者的样品和正常样品之间比较ADAMTS18基因的表达水平来实施。更特别地，本发明提供了一种用于在受试者中检测或诊断癌症和/或发生癌症的倾向性的方法，其通过测定源自受试者的生物样品中ADAMTS18基因的表达水平来进行。要通过本方法诊断或检测的优选癌症包括肺癌和食管癌。在本发明的背景中，“肺癌”包括小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)。类似地，“NSCLC”包括腺癌、鳞状细胞癌(SCC)和大细胞癌。或者，本发明提供了一种用于检测或鉴定源自受试者的肺或食管组织样品中的癌细胞的方法，所述方法包括测定源自受试者的组织样品中ADAMTS18基因表达水平的步骤， 其中所述表达水平与正常对照水平相比的升高指示组织中存在或怀疑存在癌细胞。此类结果可以与别的信息组合来帮助医生、护士、或其它从业人员诊断受试者患有疾病或倾向于发生疾病。或者，本发明可以给医生提供有用信息来诊断受试者患有疾病。 例如，依照本发明，当关于自受试者获得的组织中癌细胞的存在有疑问时，医生通过考虑这项观察和其它方面，包括组织的病理学发现、血液中的已知肿瘤标志物的水平、或受试者的临床过程等，会做出临床决策。例如，血液中的一些公知的诊断性肺癌标志物包括ACT、BFP、 CA 19-9, CA50、CA72-4、CA130、CA602、CEA、IAP、KMO-U SCC、SLX、SPU Span-1, STN、TPAjP 细胞角蛋白19片段。或者，血液中的诊断性食管肿瘤标志物诸如CEA、DUPAN-2、IAP、NSE、 SCC、SLX和Span-I也是公知的。就是说，在一个具体实施方案中，依照本发明，也可提供检查受试者状况的中间结果。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于检测癌症的诊断标志物的方法，该方法包括检测源自受试者的生物样品中ADAMTS18基因的表达(作为癌症的诊断标志物) 的步骤。优选的要通过本方法诊断的癌症包括肺癌和食管癌。在本发明的背景中，术语“诊断”意欲涵盖预测和似然性分析。本方法意欲用于临床以对关于治疗模式作出决定，治疗模式包括治疗介入、诊断标准诸如疾病的分期，以及针对癌症的疾病监视和监测。根据本发明，还可提供用于检查受试者状况的中间结果。所述中间结果可与其它信息结合起来以协助医生、护士或其它从业人员确定受试者罹患所述疾病。或者，本发明可用于检测源自受试者的组织中的癌性细胞，并给医生提供有用信息来诊断受试者患有所述疾病。要通过本方法诊断的受试者优选为哺乳动物。例示性哺乳动物包括但不限于人类、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马、和牛。为实施诊断，优选从要对其进行诊断的受试者采集生物样品。任何生物学材料均可作为用于测定的生物样品，只要它能由于癌症而包括目标的ADAMTS18基因转录或翻译产物。所述生物样品包括，但不限于，身体组织与体液，例如血液，痰，与尿液。生物样品优选含有这样的细胞群体，该群体包括上皮细胞，更优选源自怀疑为癌性的组织的肺或食管上皮细胞。进一步，如果必要，可从所得的身体组织与体液中纯化所述细胞，并将其用为生物样品。或者，生物样品可以是自怀疑为癌性的区域收集的组织样品。优选地，所述组织样品可以是肺组织样品或食管组织样品。根据本发明，测定在所述源自患者的生物样品中ADAMTS18基因的表达水平。表达水平可在转录产物(即mRNA)水平确定，使用本领域熟知的方法。举例而言，ADAMTS18基因的mRNA可通过杂交方法(例如,Northern杂交)使用探针定量。所述检测可在滤器、芯片或阵列上实施。对检测包括ADAMTS18基因在内的多个基因(例如，多种癌症特异性基因) 的表达水平而言，优选使用阵列。本领域技术人员可利用ADAMTS18基因的序列信息制备上述探针。举例而言，ADAMTS18基因的cDNA可用作探针。如需要，所述探针可用合适的标记物例如染料或同位素来标记，且所述基因的表达水平可以作为发生杂交的标记物的强度来加以检测。进一步，ADAMTS18基因的转录产物可通过基于扩增的检测技术(例如，RT-PCR) 使用引物定量。上述引物亦可基于所述基因已知的序列信息制备。举例而言，用于实施例的引物(SEQ ID N0:3和4)可用于通过RT-PCR的检测，但本发明并不仅限于此。具体而言，本方法所用的探针或引物在严格条件、中等严格条件与低严格条件下与ADAMTS18基因的mRNA杂交。如本文中使用的，短语“严格(杂交)条件”是指这样的条件，在该条件下，探针或引物将与其靶序列杂交，但不与其它序列杂交。严格条件是依赖于序列的，在不同的环境下会不同。较长序列的特异杂交与较短序列相比在较高温度下发生。一般地，严格条件的温度选择为比特定序列在限定的离子强度和PH下的热熔点(Tm) 低大约5°C。Tm是(在限定的离子强度、pH和核酸浓度下)平衡状态下有50%的与靶序列互补的探针与靶序列杂交的温度。因为靶序列一般过量存在，因此在Tm下，平衡时50%的探针被占据。典型地，严格条件是这样的其中盐浓度小于大约I. OM钠离子，典型地大约 0.01-1. OM钠离子(或其它盐)，ρΗ7· 0-8. 3，温度对于较短的探针或引物(例如10-50个核苷酸)是至少大约30°C，用于较长的探针或引物是至少大约60°C。严格条件也可以通过添加去稳定剂例如甲酰胺来实现。探针或引物可以是特定大小。该大小选自下组至少10个核苷酸、至少12个核苷酸、至少15个核苷酸、至少20个核苷酸、至少25个核苷酸、至少30个核苷酸，而且探针和引物的大小范围可以为5-10个核苷酸、10-15个核苷酸、15-20个核苷酸、20-25个核苷酸和 25-30个核苷酸。或者，本发明的诊断或检测可以通过检测ADAMTS18基因的翻译产物(即蛋白质) 来进行。例如，可以确定ADAMTS18蛋白的量。测定作为翻译产物的蛋白量的方法包括免疫测定，此类方法使用特异识别所述蛋白的抗体。抗体可以是单克隆或多克隆的。而且，任何抗体片段或经修饰抗体(例如嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等)均可用于检测,只要它们保留对ADAMTS18蛋白的结合能力即可。制备这些类型的用于检测蛋白的抗体的方法是本领域众所周知的，并且在本发明中可以使用任何方法制备这些抗体和它们的等价物。作为另一种基于ADAMTS18的翻译产物检测其基因的方法，可利用针对ADAMTS18蛋白的抗体通过免疫组织化学分析观察其染色的强度。即，观察到强染色表明所述蛋白质的存在增加， 且同时表明ADAMTS 18的高表达水平。另外，翻译产物可基于其生物学活性来检测。具体而言，在本文中证明了 ADAMTS18 蛋白涉及癌细胞生长。因此，可使用ADAMTS18蛋白的癌细胞生长促进能力作为生物样品中存在的ADAMTS18蛋白的指标。在本文中，细胞生长促进活性也称作“细胞增殖活性”或“细胞增殖增强活性”。另外，除ADAMTS18基因的表达水平外，亦可确定其它癌症相关基因，例如已知在肺癌或食管癌中有差异表达的基因的表达水平，以提高所述诊断的准确性。如上所述，本发明的方法将源自受试者的生物样品中ADAMTS18基因的表达水平与“对照水平”比较。在本发明的背景中，短语“对照水平”指在对照样品中检测到的ADAMTS18基因的表达水平，而且涵盖正常对照水平和癌症对照水平二者。短语“正常对照水平”指在正常健康个体中或在已知没有罹患癌症的个体群体中检测到的ADAMTS18基因表达水平。正常对照指没有肺癌和食管癌临床症状的个体。正常对照水平可使用自非癌性组织获得的正常细胞来测定。“正常对照水平”也可以是在已知没有罹患肺癌或食管癌的个体或群体的正常健康组织或细胞中检测到的ADAMTS18基因的表达水平。另一方面，短语“癌症对照水平”指在罹患肺或食管癌的个体或群体的癌性组织或细胞中检测到的ADAMTS 18基因的表达水平。源自受试者的样品中检测到的ADAMTS18基因表达水平较之正常对照水平的升高表明受试者(获得样品的来源)罹患或有风险发生肺癌或食管癌。在本发明的背景中，源自受试者的样品可以是任何自待测受试者(例如已知具有或怀疑具有癌症的患者)获得的组织。例如，组织可包括上皮细胞。更特别地，组织可以是癌性上皮细胞。或者，可以将样品中的ADAMTS18基因表达水平与ADAMTS18基因的癌症对照水平比较。样品的表达水平和癌症对照水平之间的相似性表明受试者(获得样品的来源)罹患或有风险发生癌症。在本文中，当基因表达水平较之对照水平增加了例如10%，25%或50%的话，或增加至少O. I倍、至少O. 2倍、至少O. 5倍、至少2倍，至少5倍，至少10倍或者更多，则认为基因表达水平是“增加”的。因而，若生物样品中癌标志物基因(包括ADAMTS18基因)的表达水平较之响应癌标志物基因的正常对照水平增加了例如10 %或更多、25 %或更多、或 50%或更多，或者增加到超过I. I倍、超过I. 5倍、超过2. O倍、超过5. O倍、超过10. O倍、 或更多，则可认为它是升高的。靶基因的表达水平可通过检测(例如测定)核酸探针对样品中基因转录物的杂交强度来确定。对照水平可以与测试生物样品同时确定，使用先前从疾病状态(癌性或非癌性) 已知的受试者收集和保存的样品。或者，对照水平可以借助统计方法，根据通过分析先前测定的来自疾病状态已知的受试者的样品的ADAMTS18基因表达水平获得的结果加以确定。 进一步，对照水平可以是来自先前测试过的细胞的表达模式数据库。而且，根据本发明的一个方面，可以将生物样品中ADAMTS18基因的表达水平与从多个参考样品确定的多个对照水平比较。优选地使用从来自与源自患者的样品组织类型相似的组织类型的参考样品确定的对照水平。而且，优选地，使用具有已知的疾病状态的群体中ADAMTS18基因表达水平的标准值。标准值可以通过本领域已知的任何方法获得。例如，平均值+/-2S.D.或平均值 +/-3S. D.的范围可以用作标准值。总之，从已知非癌性的生物样品确定的对照水平称作“正常对照水平”。另一方面，如果对照水平从癌性生物样品确定，则会称作“癌性对照水平”。在本发明的背景中，当 ADAMTS18基因的表达水平相比正常表达水平有所提高或与癌性对照水平相似，则受试者可诊断为正罹患或有风险发生癌症。进一步，当比较多种癌症相关基因的表达水平时，样品与癌性参照之间基因表达模式的相似性表明受试者正罹患或有风险发生癌症。测试生物样品的表达水平与对照水平间的差异，可以相对已知表达水平不会随着细胞的癌或非癌状态改变的对照核酸(例如管家基因)的表达水平加以标准化。示例对照基因包括，但不仅限于，肌动蛋白、甘油醛_3磷酸脱氢酶和核糖体蛋白P1。另外，本发明提供了 ADAMTS18基因作为癌性标志物的用途。ADAMTS18基因特别可用作肺癌和食管癌性标志物。例如，可以通过检测ADAMTS18基因的表达水平作为癌性标志物来确定生物样品是否含有癌性细胞，尤其是肺或食管癌性细胞。具体地，生物样品中ADAMTS18基因的表达水平与正常对照水平相比升高表明该生物样品含有癌性细胞。 ADAMTS18基因的表达水平可通过如上所述检测该基因的转录产物或翻译产物来确定。ΙΙ-2.评估癌症治疗的功效在正常和癌性细胞之间差异表达的ADAMTS18基因还允许对癌症治疗的过程进行监视，而且上述用于诊断癌症的方法可用于评估治疗对癌症的效力。具体地，治疗对癌症的效力可以通过确定来自接受治疗的受试者的细胞中ADAMTS18基因的表达水平进行评估。 如果期望，在不同的时间点，治疗前、治疗中和/或治疗后，从受试者获得测试细胞群体。 ADAMTS18基因的表达水平可以例如按照上文“ΙΙ-1.用于诊断癌症或发生癌症的倾向性的方法”项下描述的方法加以确定。在本发明的语境中，用来与检测到的表达水平比较的对照水平优选是从没有暴露于目标处理的细胞内的ADAMTS18基因表达获得的。如果ADAMTS18基因的表达水平与从正常细胞或不含癌细胞的细胞群体获得的对照水平进行比较，则表达水平相似表明目标治疗是有效的，表达水平不同表明治疗的临床结果或预后不利。另一方面，如果比较是针对从癌细胞或含有癌细胞的细胞群体获得的对照水平，则表达水平不同表明是有效的治疗，而表达水平相似表明临床结果或预后不利。而且，可以根据本发明的方法比较ADAMTS18基因在治疗之前和之后的表达水平， 以评估治疗的效力。具体地，将治疗后来自受试者的生物样品中检测到的表达水平(即治疗后水平)与来自同一受试者的在治疗开始前获得的生物样品中检测到的表达水平(即治疗前水平)进行比较。治疗后水平与治疗前水平相比降低，表明目标治疗是有效的，而治疗后水平与治疗前水平相比增加或相似则表明临床结果或预后不利。如这里所使用的，术语“有效”是指治疗导致受试者体内被病理上调基因的表达降低，被病理下调基因的表达增加或者癌的大小、普遍性或转移潜力降低。当预防性地应用感兴趣的治疗时，“有效”是指治疗可延缓或防止肿瘤的形成，或者延缓、防止或减轻癌症的至少一种临床症状。受试者体内肿瘤状况的评估可以用标准临床规程实施。此外，治疗的有效性可以联合任何已知的用于诊断癌症的方法加以确定。癌症可以通过例如鉴定症状性异常，例如体重减轻、腹痛、背痛、食欲不振、恶心、呕吐和全身性不适、虚弱和黄疸，来加以诊断。以本发明的方法和组合物在“预防”和“防范”的语境下有用为限，这两个术语在本文中可互换使用，指降低源自疾病的死亡率或发病率负担的任何活动。预防和防范可发生于“一级、二级和三级预防水平”。一级预防和防范避免疾病的发生，而二级和三级预防和防范水平涵盖旨在预防和防范疾病的进展与症状的出现、以及通过恢复功能和减轻疾病相关并发症来降低已建立的疾病的负面影响的活动。或者，预防和防范可包括旨在减轻特定病症的严重性(例如降低肿瘤的增殖和转移等)的广泛的预防性疗法。治疗和/或预防癌症和/或预防其手术后复发包括任何下述步骤，诸如手术去除癌细胞、抑制癌性细胞生长、肿瘤衰退或消退、诱导癌症减退和阻抑癌症发生、肿瘤消退、及降低或抑制转移。癌症的有效治疗和/或预防可降低患癌个体死亡率及改善其预后，降低其血液中肿瘤标志物的水平，及减轻其伴随癌症的可检测症状。例如，症状的减轻或改善构成有效治疗和/或预防，包括10 %、20 %、30 %或更多降低，或病情稳定。III.试剂盒和试剂本发明还提供了用于检测或诊断癌症的试剂，即ADAMTS18基因的能检测转录或翻译产物的试剂。此类试剂的例子包括能够在源自受试者的生物样品中(a)检测 ADAMTS 18 基因的 mRNA ；(b)检测 ADAMTS18 蛋白；和 / 或(c)检测ADAMTS18蛋白的生物学活性，的试剂。合适的试剂包括特异性结合或鉴定ADAMTS18基因的转录产物的核酸。例如，特异性结合或鉴定ADAMTS18基因的转录产物的核酸包括例如具有与ADAMTS18基因转录产物一部分互补的序列的寡核苷酸(例如探针和引物)。此类寡核苷酸例如对感兴趣基因的mRNA 特异性的引物和探针，它们可基于本领域公知的方法来制备。或者，抗体可例示用于检测该基因的翻译产物的试剂。可提到上文‘n-ι.用于诊断癌症或发生癌症的倾向性的方法’项下描述的探针、引物、和抗体作为此类试剂的合适例子。这些试剂可用于上文所述癌症，特别是肺癌和食管癌的诊断或检测。使用这些试剂的测定形式可以是Northern杂交或夹心式ELISA，二者都是本领域公知的。检测试剂可以以试剂盒的形式包装在一起。例如，可以将检测试剂包装在不同的容器中。另外，检测试剂可以与检测必需的其它试剂包装在一起。例如试剂盒可包括作为检测试剂的核酸或抗体(或与固体基质结合，或与使其与基质结合的试剂分开包装)、对照试剂(阳性和/或阴性)、和/或可检测标记物。本发明的试剂盒可进一步包括其它从商业和用户角度而言期望的材料，包括缓冲液、稀释液、滤器、针头、注射器。这些试剂之类的可以包含在带有标签的容器中。合适的容器包括瓶、管状瓶(vials)和试管。所述容器可从多种材料制得，例如玻璃或塑料。试剂盒中还可以包括实施测定的说明(例如书面说明书、 磁带、VCR、CD-ROM 等)。虽然本试剂盒适合于检测和诊断肺癌和食管癌，但是它也可用于评估癌症预后和 /或监测癌症治疗的功效。作为本发明的一个方面，可以将用于诊断或检测癌症的试剂固定在固体基质上， 诸如多孔条(porous strip)，以形成至少一个用于检测癌症的位点。多孔条的测量或检测区可以包括多个位点，每个位点都含有检测试剂(例如核酸)。测试条也可以包含阴性和/ 或阳性对照的位点。或者，对照位点可以设置于与测试条不同的条上。任选的是，不同检测位点可以包含不同量的固定化检测试剂(例如核酸)，即第一个检测位点的量较多，后续位点的量较少。添加测试生物样品后，展现出可检测信号的位点数目提供了样品中的ADAMTS 18基因表达水平的定量指标(quantitative indication)。检测位点的形状可以设置成任何合适的可检测形状，一般为跨越测试条宽度的条状或点状。IV.筛诜方法使用ADAMTS18基因、由该基因编码的多肽或其片段、或该基因的转录调节区，有可能筛选改变该基因的表达或由基因编码的多肽的生物学活性的物质。此类物质可作为药物用于治疗或预防癌症，特别是肺癌和食管癌。因此，本发明提供了使用ADAMTS18基因、由该基因编码的多肽或其片段、或该基因的转录调节区筛选用于治疗或预防癌症的候选物质的方法。通过本发明的筛选方法分离的物质是预期抑制ADAMTS18基因的表达、或该基因的翻译产物的活性的物质，因此是用于治疗或预防可归于例如细胞增殖性疾病的疾病，诸如癌症(特别是肺癌和食管癌)的候选者。就是说，认为通过本方法筛选的物质具有临床好处且可进一步测试其在动物模型或测试受试者中预防癌细胞生长的能力。在本发明的背景中，待通过本筛选方法鉴定的物质可以是任何化合物或包含数种化合物的组合物。而且，在本发明的筛选方法中暴露于细胞或蛋白的测试物质可以是单种化合物或多种化合物的组合。当在方法中使用化合物组合时，各化合物可以顺次或同时加以接触。任何测试物质，例如，细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物、纯化或粗蛋白质、肽、非肽化合物、合成微分子化合物(包括核酸构建体， 例如反义RNA、siRNA、核酶、等等)以及天然化合物，均可用于本发明的筛选方法中。在本文所述筛选中有用的测试物质也可以是特异性结合感兴趣蛋白或其缺失原蛋白的体内生物学活性的部分肽的抗体。也可使用本领域熟知的很多组合文库方法中的任何途径来获得本发明的测试物质，包括(I)生物文库，(2)空间可寻址平行固相或液相文库(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries),(3)需要解卷积(deconvolution)的合成文库法，(4) “一珠一化合物”(“one-bead one-compound”)文库法，以及(5)使用亲和层析选择的合成文库法。使用亲和层析选择的生物文库法限于肽文库，而其它四种途径适用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des. 12 :145-67)。合成分子文库方法的例子可在现有技术中找到(Deffitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993,90 6909-13 ；Erb et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1994,91 :11422-6 ；Zuckermann et al., J Med Chem 37 :2678-85,1994 ；Cho et al. , Science 1993, 2611303-5 ；Care11 et al., Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 :2059 ；Carell et al.,Angew Chem Int Ed Engl 1994， 33 :2061 ；Gallop et al. , J Med Chem 1994,37:1233-51)。化合物文库可提供于溶液中(参见 Houghten, Bio/Techniques 1992,13:412-21)或珠子上(Lam, Nature 1991,354: 82-4)、芯片上(Fodor, Nature 1993，364 :555-6)、细菌上(美国专利 5，223，409)、孢子上 (美国专利 5，571，698，5，403，484 与 5，223，409)、质粒上(Cull et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1992，89 :1865-9)或噬菌体上(Scott and Smith, Science 1990，249 :386-90 ; Devlin, Science 1990,249 :404-6 ；Cwirla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 6378-82 ；Felici, J Mol Biol 1991，222 :301-10 ;美国专利申请 2002103360)。尽管测试物质文库的构建是本领域众所周知的，在下文中还是进一步提供了鉴定测试物质和构建用于本筛选方法的这些测试物质的文库的指导。在本文中，揭示了阻抑ADAMTS18的表达水平和/或生物学活性导致癌细胞生长的阻抑。因此，当某种物质阻抑ADAMTS18的表达和/或活性时，该阻抑指示受试者中的潜在治疗效果。在本发明的背景中，潜在治疗效果指具有合理预期的临床好处。此类临床好处的例子包括但不限于(a)ADAMTS18基因表达的减少，(b)受试者中癌症的尺寸、患病率(prevalence)、或转移潜力的降低，(C)预防癌症发生，或(d)预防或缓解癌症的临床症状。A.分子律樽:对具有目标性质的化合物的分子结构和/或对ADAMTS18蛋白的分子结构的知识为人们构建测试物质文库提供了便利。预筛选适于进一步评估的受试物质的方法之一，利用对受试物质与其靶标的相互作用进行计算机建模。计算机建模技术为选定分子的三维原子结构的可视化以及会与该分子相互作用的新化合物的合理设计提供了可能。三维构建典型地依赖于来源于选定分子的X-射线晶体分析或NMR成像的数据。分子动力学需要力场数据。计算机图形系统为预测新化合物如何连接靶分子，以及实验操作化合物和靶分子的结构以完善结合特异性提供了可能。为了预测当分子和化合物之一或二者都发生细小改变时分子-物质相互作用是什么样的，需要分子力学软件和计算密集型计算机，它们通常耦联着分子设计程序和用户之间的用户友好的、菜单驱动的界面。上文一般性描述的分子建模系统的一个实例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation, Waltham, Mass。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行构建、图形建模和分子结构分析。利用QUANTA可进行分子相互行为的互动性构建、修饰、可视化和分析。关于与特异蛋白相互作用的药物的计算机建模主题已经发表了多篇文献，其例子包括 Rotivinen et al. Acta Pharmaceutica Fennica 1988,97 :159-66 ;Ripka, New Scientist 1988，54-8 ;McKinlay&Rossmann， Annu Rev Pharmacol Toxiciol 1989,29: 111-22 ；Perry&Davies, Prog Clin Biol Res 1989,291 :189-93 ；Lewis&Dean, Proc R Soc Lond 1989,236 :125-40,141-62 ;以及关于核酸组分模型受体的 Askew et al.，JAm Chem Soc 1989，111 1082-90o其它可筛选并图形描述化学物质的计算机程序可以从例如Mississauga， Ontario，Canada 的 BioDesign，Inc.，Pasadena，Calif.，Allelix，Inc 公司、Cambridge，Ontario 的Hypercube，Inc.等公司获取。见例如DesJarlais et al.，J Med Chem 1988，31 722-9 ；Meng et al.，J Computer Chem 1992,13 :505-24 ；Meng et al.，Proteins 1993， 17 :266-78 ；Shoichet et al.，Science 1993，259 :1445_50。一旦鉴定出推定的抑制剂，可使用组合化学技术基于鉴定出的推定抑制剂的化学结构构建任何数量的变体，如下所述。所得的推定抑制剂文库可使用本发明的方法筛选，以鉴定适于治疗和/或预防癌症和/或预防癌症术后复发的物质，特别是肺癌和食管癌。B.组合化学合成测试物质的组合文库可以作为合理药物设计程序的一部分来制备，合理药物设计程序涉及有关已知抑制剂中存在的核心结构的知识。这种策略使得文库可以保持合理的规模，便于进行高通量筛选。或者，可通过简单地合成构成文库的分子家族的所有排列，来构建简单的，特别是短的、聚合物性的分子文库。后一种方法的一个实例是由所有长度为6个氨基酸组成的肽文库。这种肽文库包含所有六氨基酸序列排列。这种类型的文库称作线性组合化学文库。组合化学文库的制备是本领域技术人员所熟知的，可以通过化学或生物合成来产生。组合化学文库包括，但不仅限于，肽文库(见例如美国专利5，010，175 ;Furka，Int J Pept Prot Res 1991，37 :487-93 ;Houghten et al.，Nature 1991，354 :84-6) 也可以使用其它用于产生化学多样性文库的化学。这些化学包括，但不仅限于，肽(例如PCT公布 WO 91/19735)，被编码的肽(例如WO 93/20242)，随机生物寡聚体(例如WO 92/00091)， 苯并二氮卓(benzodiazepines)(例如美国专利5，288，514)，diversomer如乙内酰脲、苯并二氮卓和二肽(DeWitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90 :6909-13)，插烯化 (vinylogous)多月太(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 :6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非妝类妝模拟物(Hirschmann et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 9217-8)，小化合物文库的模拟物有机合成(analogous organic synthese) (Chen et al.， J. Amer Chem Soc 1994，116 :2661)，寡聚氛基甲酸盐(Cho et al.，Science 1993,261 1303)，和 / 或妝酸勝酸酯(peptidylphosphonates) (Campbell et al.，J Org Chem 1994， 59:658)，核酸文库(见 Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology 1995 补充; Sambrook et al.，Molecular Cloning A Laboratory Manual，1989，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，USA)，肽核酸文库(见例如美国专利5，539，083)，抗体文库(见例如 Vaughan et al. ,Nature Biotechnology 1996,14(3) :309-14和PCT/US96/10287)，碳水化合物文库(见例如 Liang et al. ,Science 1996，274 :1520-22 ;美国专利 5，593，853)，和有机小分子文库(见例如苯并二氮卓，Gordon EM. Curr Opin Biotechnol. 1995 Dec I ；6 (6) 624-31 ;类异戊二烯(isoprenoids)，美国专利 5，569，588 ;噻唑焼酮(thiazoIidinones) 和偏硫杂氮杂环己焼(metathiazanone)，美国专利5，549，974 ;卩比咯焼(pyrrolidines)， 美国专利5，525，735和5，519，134 ;吗啉代化合物，美国专利5，506，337;苯并二氮卓， 5，288，514;等)。用于制备组合文库的设备是可商购的(见例如357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech，Louisville KY, Symphony, Rainin，Woburn, MA，433A Applied Biosystems, Foster City，CA，9050 Plus，Millipore，Bedford，MA)。此外，有多种组合文库本身也是商业可得的(见例如 ComGenex，Princeton，N. J.，Tripos，Inc.，St. Louis，MO，3D Pharmaceuticals，
23Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD,等等)。C.其它候诜物:另一种手段是使用重组细菌噬菌体来产生文库。使用“噬菌体方法”(Scott&Smith，Science 1990, 249 :386-90 ；Cwirla et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 :6378-82 ；Devlin et al. , Science 1990，249 :404-6)，可以构建非常大的文库 (例如106-108个化学实体)。再一种手段主要使用化学方法，其实例包括Geysen方法 (Geysen et al. ,Molecular Immunology 1986,23 :709-15 ；Geysen et al. ,J Immunologic Method 1987，102 :259-74)和 Fodor 等的方法(Science 1991,251:767-73)。Furka 等 (14th International Congress of Biochemistry 1988, Volume#5, Abstract FR :013 ； Furka, Int J Peptide Protein Res 1991,37 :487-93), Houghten (美国专利 4，631，211) 和Rutter等(美国专利5，010, 175)记载了产生肽混合物的方法，可以将这些肽作为激动剂或拮抗剂加以测试。适体是由紧密结合特定分子祀的核酸构成的大分子。Tuerk和Gold(Science. 249 505-510(1990))披露了 SELEX(通过指数式富集进行的配体系统性进化)方法来选择适体。 在SELEX方法中，核酸分子的大型文库(例如IO15种不同分子)可用于筛选。通过本发明任何筛选方法筛选到的化合物的一部分结构通过添加、删除、和/或置换方式被转换而得到的化合物，包括在通过本发明筛选方法鉴定的物质之内。此外，当所筛选的测试物质是蛋白质时，为了获得编码该蛋白的DNA，可以确定蛋白的全部氨基酸序列，以此推定该编码蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸序列，根据该序列制备寡DNA作为探针，并用该探针筛选cDNA文库，以获得编码该蛋白的DNA。所得的DNA 可用于制备作为治疗或预防癌症的候选物的测试物质。IV-1.基于蛋白质的筛诜方法依照本发明，ADAMTS18基因的表达对于癌细胞，特别是肺癌和食管癌细胞的生长和/或存活是至关重要的。另外，在本发明中证明了 ADAMTS18蛋白具有N-糖基化活性、侵袭活性及MMP (基质金属蛋白酶)活性。因而，会假设阻抑ADAMTS18多肽功能的物质抑制癌细胞的生长和/或存活，并因此可用于治疗或预防癌症。因此，本发明提供了使用ADAMTS18 多肽来筛选用于治疗或预防癌症的候选物质的方法。另外，本发明还提供了使用ADAMTS18 多肽来筛选用于抑制癌细胞生长和/或存活的候选物质的方法。除了 ADAMTS18多肽之外，该多肽的片段也可用于本筛选，只要该片段保留天然存在的ADAMTS18多肽的至少一种生物学活性。在优选的实施方案中，ADAMTS 18多肽的片段可包括该多肽的金属蛋白酶域(例如SEQ ID NO 2的293至494)。或者，ADAMTS18的成熟多肽(例如SEQ ID NO 2的285至1221)可用于本发明的筛选方法。ADAMTS 18蛋白可借助体外翻译系统在体外产生。要与测试物质接触的ADAMTS18多肽可以是例如纯化的多肽、可溶性蛋白质或与其他多肽融合的融合蛋白。用于本发明方法的多肽或片段可从自然界作为天然存在蛋白质通过常规纯化方法获得，或基于所选择的氨基酸序列通过化学合成获得。例如，可用于合成的常规肽合成法包括I)Peptide Synthesis, Interscience, New York,1966 ；
2)The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York,1976 ；3) Peptide Synthesis (日语)，Maruzen Co. , 1975 ；4) Basics and Experiment of Peptide Synthesis (日语)，Maruzen Co. , 1985 ；5) Development of Pharmaceuticals (第二 卷)(日语)，Vol. 14 (peptide synthesis), Hirokawa,1991 ；6)W099/67288 ;和7) Barany G. &Merrif ield R. B. , Peptides Vol.2, “Solid Phase Peptide Synthesis”，Academic Press, New York,1980，100-118。或者，可通过用于产生多肽的任何已知基因工程方法来获得该蛋白质(例如 Morrison J. , J Bacteriology 1977,132 :349-51 ；CIark-Curtiss&Curtiss, Methods in Enzymology (Wu等人编辑)1983,101 :347-62)。例如，首先制备以可表达形式(例如位于包含启动子的调节序列的下游)包含编码目标蛋白质的多核苷酸的适合的载体，然后转化入合适的宿主细胞，接着培养宿主细胞以产生蛋白质。更具体的说，通过将编码ADAMTS18 多肽的基因插入用于表达外来基因的载体诸如pSV2neo、pcDNA I、pcDNA3. I、pCAGGS或 PCD8，在宿主(例如动物)细胞等中表达该基因。启动子可用于表达。可使用任何常用的启动子，包括例如 SV40 早期启动子(Rigby in Williamson(编)，Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 1982,83-141)、EF_ α 启动子(Kim et al. ,Gene 1990,91 217-23)、CAG启动子(Niwa et al. ,Gene 1991，108 :193)、RSV LTR启动子(Cullen，Methods in Enzymology 1987，152 :684-704)、SR α 启动子(Takebe et al. ,Mol Cell Biol 1988， 8 :466)、CMV 立即早期启动子(Seed et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1987,84:3365-9)、 SV40 晚期启动子(Gheysen et al.，J Mol Appl Genet 1982，I :385-94)、腺病毒晚期启动子(Kaufman et al. ,Mol Cell Biol 1989，9 :946)、HSV TK 启动子等。可根据任何方法将载体导入宿主细胞以表达ADAMTS18基因，例如电穿孔法(Chu et al. ,Nucleic Acids Res 1987，15 :1311-26)、磷酸钙法(Chen et al. , Mol Cell Biol 1987，7 :2745-52)、DEAE 右旋糖苷法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 1984,12 :5707-17 ；Sussman et al.，Mol Cell Biol 1985，4 :1641-3)、脂转染法(Deri jard B，Cell 1994，7 :1025-37 ;Lamb et al.， Nature Genetics 1993,5 :22-30 ；Rabindran et al. , Science 1993,259 :230-4)等。所述多肽或其片段可进一步连接其他物质，只要该多肽及片段保留至少一种生物学活性即可。可利用的物质包括肽、脂质、糖和糖链、乙酰基、天然和合成聚合物等。可使用此类修饰来赋予该多肽及片段别的功能或使其稳定。例如，对于多肽，可以把特异性已知的单克隆抗体的识别位点(表位)导入该多肽的N或C端，从而将该多肽表达为包含该表位的融合蛋白。或者，可以使用商品化的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13:85-90(1995))。能够利用其多克隆位点表达与例如β_半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S转移酶和绿色荧光蛋白(GFP)形成的融合蛋白的载体是可商购的。本文中还提供了如下的融合蛋白，其通过导入仅由数个到十二个(adozen)氨基酸构成的小型表位加以制备，使得融合不会改变原多肽的性质。可以使用例如多组氨酸 (His-标签)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因 10蛋白(T7-标签)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV-标签)、E-标签(单克隆噬菌体上的一种表位)等表位，和识别它们的抗体作为检测多肽之间的结合活性的表位-抗体系统 (Experimental Medicine 13:85-90(1995))。IV-1-1.鉴定与多肽结合的物质与蛋白质结合的物质可能改变编码该蛋白质的基因的表达或该蛋白质的生物学活性。因此，作为一方面，本发明提供了一种筛选用于治疗或预防癌症的候选物质的方法， 包括步骤a)将测试物质与ADAMTS18多肽或其片段接触；b)检测多肽或片段与测试物质之间的结合(或结合活性)；并c)选择与多肽结合的测试物质作为用于治疗或预防癌症的候选物质。依照本发明，可评估测试物质抑制细胞生长或候选物质用于治疗或预防ADAMTS18 相关疾病(例如癌症)的治疗效果。因此，本发明还提供了使用ADAMTS18多肽或其片段筛选用于抑制细胞生长的候选物质或用于治疗或预防ADAMTS18相关疾病(例如癌症)的候选物质的方法，其包括下述步骤a)使测试物质与ADAMTS18多肽或其片段接触；b)检测该多肽或片段和该测试物质之间的结合(或结合活性)；并c)将b)的结合与测试物质或化合物的治疗效果关联起来。或者，依照本发明，还可评估或评价测试物质或化合物治疗或预防癌症的潜在治疗效果。在一些实施方案中，本发明提供了用于评估或评价测试物质治疗或预防与 ADAMTS 18过表达有关的癌症或抑制癌症的治疗效果的方法，该方法包括下述步骤(a)使测试物质与由ADAMTS18的多核苷酸编码的多肽接触；(b)检测该多肽和该测试物质之间的结合活性；并(c)将潜在治疗效果和测试物质关联起来，其中当物质结合多肽时，显示潜在治疗效果。在本发明的背景中，可以将治疗效果与对ADAMTS18多肽或其功能性片段的结合水平关联起来。例如，当测试物质结合ADAMTS18多肽或其功能性片段时，该测试物质可鉴定或选择为具有所需治疗效果的候选物质。或者，当测试物质不结合ADAMTS18多肽或其功能性片段时，该测试物质可鉴定为没有显著治疗效果的物质。在本发明中，揭示了阻抑ADAMTS18表达降低癌细胞生长。如此，通过筛选结合 ADAMTS18多肽的候选物质，可鉴定出可用于治疗或预防癌症的候选物质。这些候选物质可通过二次和/或更进一步筛选来评估治疗或预防癌症的潜力以鉴定用于癌症的治疗剂。测试物质与ADAMTS18多肽的结合可以例如通过使用针对该多肽的抗体的免疫沉淀来检测。因此，为了进行上述检测，优选用于筛选的ADAMTS18多肽或其片段含有抗体识别位点。用于筛选的抗体可以是识别ADAMTS18多肽的抗原区(例如表位)的抗体。制备此类抗体的方法是本领域众所周知的，并且任何方法都可用于本发明中来制备上述抗体及其等价物。或者，ADAMTS 18多肽或其片段可作为在其N-或C-末端包含单克隆抗体的识别位点(表位)的融合蛋白而得到表达。所述抗体的特异性已被揭示是针对该多肽的N-或 C-末端的。可使用市售的表位-抗体系统(Experimental Medicine 1995,13:85-90)。通过利用其多克隆位点能表达具有例如β -半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)等的融合蛋白的载体是市售的，并能用于本发明。此外，本领域还已知含有小得多的表位的融合蛋白，所述表位可通过与针对它的抗体的免疫沉淀而得以检测(Experimental Medicine 1995,13:85-90)。上述由几个到几十个氨基酸组成的、不会改变ADAMTS18多肽或其片段的特性的表位也可用于本发明。例子包括多组氨酸(His标签)、流感病毒聚集体(influenza aggregate) HA、人c_myc、FLAG、水泡性口膜炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7标签)、人单纯疱疹病毒糖蛋白(HSV标签)、E标签(单克隆噬菌体上的一种表位)等，而且识别它们的单克隆抗体可作为表位-抗体系统用于筛选结合 ADAMTS18 多肽的蛋白质(Experimental Medicine 13:85-90(1995))。谷胱甘肽S-转移酶(GST)也是一种熟知的作为要通过免疫沉淀进行检测的融合蛋白的配对物(counterpart)。当GST用作为要与ADAMTS18多肽或其片段融合以形成融合蛋白的蛋白质时，可用针对GST的抗体或与GST特异性结合的物质，诸如谷胱甘肽(例如谷胱甘肽-Sepharose 4B),来检测该融合蛋白。在免疫沉淀中，通过添加抗体UPjljADAMTSlS多肽或其片段自身，或标记到该多肽或片段上的表位)到ADAMTS18多肽和测试物质的反应混合物中形成免疫复合物。如果测试物质具有与该多肽结合的能力，那么所形成的免疫复合物应由ADAMTS18多肽、测试物质和抗体组成。反之,如果测试物质缺乏上述能力,那么所形成的免疫复合物仅由ADAMTS18 多肽和抗体组成。因此，可通过例如测量所形成的免疫复合物的大小来检查测试物质与 ADAMTS18多肽结合的能力。任何用于检测化合物大小的方法皆可使用，包括层析、电泳等。 例如，当小鼠IgG抗体用于检测时,蛋白A或蛋白G Sepharose可用于定量所形成的免疫复合物。免疫沉淀详见例如Harlowet al. ,Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York, 1988, 511-52。SDS-PAGE分析被普遍使用于分析经免疫沉淀的蛋白，可以利用结合蛋白的分子量使用合适浓度的凝胶来分析该蛋白。检测可以使用常规染色方法，诸如考马斯染色或银染色来实现，或者，对于难以检测的蛋白质，可以通过如下的方法提高蛋白的检测灵敏度在含有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白，并检测该蛋白。当蛋白的分子量已知时，可以直接从 SDS-聚丙烯酰胺凝胶上纯化出靶蛋白并测定其序列。此外，用于筛选与其结合的物质的ADAMTS18多肽或其片段可结合于载体。可用于结合多肽的载体的例子包括不溶性多糖，诸如琼脂糖、纤维素和右旋糖苷；及合成树脂，诸如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅；优选可以使用由上述材料制备的市售的珠和板(例如多孔板、生物传感器芯片等)。使用珠时，可以将其填入柱子。或者，在本领域中也已知使用磁珠，可以借助磁性容易地分离结合在珠上的多肽和物质。多肽与载体的结合可根据常规方法进行，诸如化学键合和物理吸附。或者，多肽可藉由特异性识别蛋白质的抗体与载体结合。此外，还可以借助于相互作用的分子，诸如亲合素与生物素的组合来进行多肽与载体的结合。利用上述结合于载体的ADAMTS18多肽或其片段的筛选包括例如将测试物质与结合于载体的多肽接触，温育该混合物，洗涤载体，并检测和/或测量与结合于载体的物质。 该结合可在缓冲液中进行，例如但不限于磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液，只要所述缓冲液不抑制该结合即可。
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当上述结合于载体的ADAMTS18多肽或其片段和组合物(例如细胞提取物、细胞裂解物等)用作为筛选方法中的测试物质时，这样的方法通常被称为亲和层析。例如，可将 ADAMTS18多肽固定在亲和柱的载体上，然后将含有能与该多肽结合的物质的测试物质施加于该柱子。在上样测试物质后，洗涤柱子，接着用合适的缓冲液洗脱与多肽结合的物质。在本发明中，作为检测或定量所结合物质的手段，可以使用利用表面等离子体共振现象的生物传感器。当使用这样的生物传感器时，仅使用少量的多肽，而无需标记(例如 BIAcore, Pharmacia),即可以表面等离子体共振信号的形式实时观察ADAMTS18多肽与测试物质之间的相互作用。因此,有可能利用生物传感器,如BIAcore，来评估多肽与测试物质之间的结合。通过将固定在载体上的特定蛋白质暴露于与可特定蛋白质结合的分子，来在合成化合物、或者天然物质库或随机噬菌体肽展示文库中筛选此类分子的方法，以及基于组合化学技术(ffrighton et al.，Science 1996,273 :458-64 ；Verdine, Nature 1996,384 11-3)来分离蛋白质和化合物的高通量筛选方法，也是本领域技术人员周知的。这些方法还可用于筛选与ADAMTS18蛋白或其片段结合的物质(包括激动剂和拮抗剂)。当测试物质为蛋白质时,例如West-Western印迹分析(Skolnik et al. , Cell 1991,65 :83-90)可用于本发明的方法。具体来说，可通过首先利用噬菌体载体(例如ZAP) 由预期表达至少一种与ADAMTS18多肽结合的蛋白质的细胞、组织、器官或培养细胞(例如PC细胞系)制备cDNA文库，在LB-琼脂糖上表达由cDNA文库的载体编码的蛋白质，将所表达的蛋白质固定在滤膜上，让经过纯化和标记的ADAMTS18多肽与上述滤膜反应，并根据ADAMTS18多肽的标记物来检测表达与ADAMTS18多肽结合的蛋白质的噬斑，从而获得与 ADAMTS18多肽结合的蛋白质。在此方法中，标记物质，诸如放射性同位素(例如3H、14C、32P、33P、35S、125I、mI)、g| (例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶、葡糖苷酶)、荧光物质(例如异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明)和生物素/亲合素等，可用于ADAMTS18多肽的标记。当蛋白质用放射性同位素标记时，可通过液体闪烁法进行检测或测量。或者，当蛋白质用酶标记时，可通过添加酶的底物来检测底物的酶促改变诸如利用吸收光度计(absorptiometer) 检测颜色产生来检测或测量。此外，在荧光物质用作为标记物的情况下，可利用荧光光度计来检测或测量所结合的蛋白质。此外，可通过利用特异性结合ADAMTS18多肽或融合至ADAMTS18多肽的肽或多肽 (例如GST)的抗体来检测或测量结合至蛋白质的ADAMTS18多肽。在本发明筛选中使用抗体的情况下，该抗体优选用上述标记物质之一进行标记，并基于该标记物质进行检测或测量。或者，可使用针对ADAMTS18多肽的抗体作为第一抗体，用标记有标记物质的第二抗体来检测该抗体。此外，可利用蛋白G或蛋白A柱来检测或测量在此筛选中与ADAMTS18多肽结合的抗体。要在本筛选方法中使用的抗体可以使用本领域公知的技术来制备。要用于制备抗体的抗原可来源于任何动物物种，但优选来源于哺乳动物，诸如人、小鼠、家兔、或大鼠，更优选来自人。用作抗原的多肽可以重组生产或自天然来源分离。要用作免疫抗原的多肽可以是完整蛋白质或自完整蛋白质衍生的部分肽。可以用抗原免疫任何哺乳动物；然而，优选考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常使用哨齿目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或灵长目(Primate)的动物。 啮齿目动物包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目动物包括例如野兔、鼠兔、和家兔。灵长目动物包括例如狭鼻猿(Catarrhini)(东半球猴(old world monkey))诸如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(rhesus monkey)、狒狒(sacred baboon)和黑猩猩(chimpanzee)。用抗原免疫动物的方法是本领域公知的。腹膜内注射或皮下注射抗原是免疫哺乳动物的标准方法。更具体的说，可以在适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮抗原。如果需要，可将抗原悬浮液与适量的标准佐剂诸如弗氏(Freund)完全佐剂混合，制成乳状液，然后施用于哺乳动物。优选的是，其后每4-21天施用数次与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原。还可使用适宜的载体进行免疫。如上所述进行免疫后，通过标准方法检验血清中所需抗体的量的增加。可以如下制备多克隆抗体从经过免疫的哺乳动物(该哺乳动物经检验其血清中所需抗体增加)收集血液,并通过任何常规方法从血液中分离血清。多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，以及从所述血清中分离的、含有该多克隆抗体的级分。可以使用例如偶联有目标多肽的亲和柱从仅识别该多肽的级分中制备免疫球蛋白G或M，并进一步使用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分。为了制备单克隆抗体，从经过抗原免疫并如上所述检查出血清中所需抗体水平升高的哺乳动物收集免疫细胞，并进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选获自脾。其它要与上述免疫细胞融合的优选的亲本细胞包括例如哺乳动物的骨髓瘤细胞，更优选具有为了用药物选择融合细胞而获得的特性的骨髓瘤细胞。根据已知的方法,例如Milstein 等(Galfre 和 Milstein, Methods Enzymol 73: 3-46 (1981))的方法，可与将上述免疫细胞与骨髓瘤细胞进行融合。通过在标准选择培养基诸如HAT培养基(含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养基) 中进行培养，可以选择出由细胞融合得到的杂交瘤。通常，细胞培养在HAT培养基中连续进行数天至数周，这段时间足以使除了所需杂交瘤之外的所有其它细胞死亡。然后，进行标准有限稀释(standard limiting dilution)来筛选和克隆生成所需抗体的杂交瘤细胞。除了上述用抗原免疫非人动物来制备杂交瘤的方法外，还可以在体外用抗原、 表达该抗原的细胞或其溶胞物免疫人淋巴细胞，诸如那些感染了 EB病毒的人淋巴细胞。 然后，使经过免疫的淋巴细胞与能够无限分裂的人源骨髓瘤细胞诸如U266融合，以产生生成所需的能够与所述抗原结合的人抗体的杂交瘤(已公开但未审查的日本专利申请 No. (JP-A)Sho 63-17688)。随后可以将所得杂交瘤移植入小鼠腹腔，并可以抽取腹水。所得单克隆抗体可通过例如硫酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或携带目标抗原的亲和柱进行纯化。针对ADAMTS18多肽的抗体不仅可用于本筛选方法，而且可用于检测生物样品中的该多肽作为癌症标志物，如“II.诊断癌症”中描述的。它们可进一步充当感兴趣多肽的激动剂和拮抗剂的候选者。另外，此类抗体(充当拮抗剂的候选物)可应用于涉及ADAMTS 18 多肽的疾病，包括如下文描述的肺癌和食管癌，的抗体治疗。如此获得的单克隆抗体也可以使用遗传工程技术来重组制备(参见例如 Borrebaeck and Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies， published in the United Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，可以从生成抗体的免疫细胞诸如杂交瘤或经免疫淋巴细胞克隆编码抗体的DNA，将该DNA插入合适的载体，并导入宿主细胞以制备重组抗体。此类重组抗体也可用于本筛选的背景中。此外，筛选中使用的抗体等可以是抗体片段或经过修饰的抗体，只要它们保留初始的结合活性。例如，抗体片段可以是Fab、F(ab’)2、Fv或将来自H链和L链的Fv 片段通过合适的接头连接而成的单链Fv(scFv) (Huston et al. , Proc Natl Acad Sci USA 85 =5879-83 (1988)) ο更具体的说，可以通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来生成抗体片段。或者，可以构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体，并在合适的宿主细胞中表达(参见例如 Co et al. , J Immunol 152 :2968-76 (1994) ；Better and Horwitz, Methods Enzymol 178 :476-96(1989) ；Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178 :497-515 (1989) ；Lamoyi, Methods Enzymol 121 :652-63 (1986) ；Rousseaux et al. , Methods Enzymol 121 :663-9(1986) ；Bird and Walker, Trends Biotechnol 9 132-7(1991))。抗体可以通过与多种分子诸如聚乙二醇(PEG)缀合来修饰。可通过化学修饰抗体来获得修饰抗体。这些修饰方法是本领域常规的。可以将如上获得的抗体纯化至同质。例如，可依照用于一般蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，可以通过适当选择和组合的柱层析诸如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等来分出和分离抗体(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow 和 David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988));然而,本发明并不局限于此。蛋白A柱和蛋白 G柱可以用作亲和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如Hyper D、POROS和Sepharose F. F. (Pharmacia)。除亲和层析外的例示性层析包括例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析、等等(Strategies for Protein Purification 和 Characterization : A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996))。可以通过液相层析来进行层析规程,诸如HPLC和FPLC。或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可使用利用细胞的双杂交系统 (“MATCHMAKER双杂交系统”、“哺乳动物MATCHMAKER双杂交测定试剂盒”、“MATCHMAKER单杂交系统”(Clontech) ;“HybriZAP双杂交载体系统(Stratagene) ” ；参考文献Dalton et al. ,Cell 1992，68 :597-612 和 Fields et al. ,Trends Genet 1994,10:286-92)。在双杂交系统中，将ADAMTS18多肽或其片段与SRF结合区或GAL4结合区融合，并在酵母细胞中表达。由预期表达至少一种与ADAMTS18多肽结合的蛋白质的细胞制备cDNA文库，使得该文库在表达时是与VP16或GAL4转录活化区融合的。然后将cDNA文库导入上述酵母细胞，并从检测为阳性的克隆分离出来源于所述文库的cDNA(当在酵母细胞中表达出能与ADAMTS18 多肽结合的蛋白质时，两者的结合激活报告基因，使阳性克隆可被检出)。通过将上述分离的cDNA导入大肠杆菌并表达蛋白质,可以制备由该cDNA编码的蛋白质。除了 HIS3基因外，合适报道基因的例子包括但不限于Ade2基因、IacZ基因、CAT 基因、萤光素酶基因等。认为通过这种筛选分离的物质是ADAMTS18多肽的激动剂或拮抗剂的候选物。术语“激动剂”指通过与多肽结合从而激活其功能的分子。与此相反，术语“拮抗剂”指通过与多肽结合而抑制其功能的分子。此外，通过这种筛选作为拮抗剂被分离的物质是抑制ADAMTS18多肽与分子(包括核酸(RNA和DNA)和蛋白质)体内相互作用的候选者。IV-1-2.通过检测多肽的生物学活性来鉴定物质本发明还提供了使用ADAMTS18多肽或其片段来筛选用于治疗或预防癌症的候选物质的方法，包括下述步骤a)使测试物质与ADAMTS18多肽或其片段接触；b)检测步骤(a)的该多肽或片段的生物学活性；并c)选择与在测试物质不存在时的生物学活性相比降低该多肽的生物学活性的测试物质。依照本发明，可评估测测试物质抑制细胞生长或候选物质用于治疗或预防 ADAMTS18相关疾病的治疗效果。因此，本发明还提供了使用ADAMTS18多肽或其片段筛选用于抑制细胞生长的候选物质或用于治疗或预防ADAMTS18相关疾病的候选物质的方法，包括下述步骤a)使测试物质与ADAMTS18多肽或其功能性片段接触；b)检测步骤(a)的该多肽或片段的生物学活性；并c)将b)的生物学活性与测试物质的治疗效果关联起来。或者，在一些实施方案中，本发明提供了用于评估或评价测试物质治疗或预防与 ADAMTS 18过表达有关的癌症或抑制癌症的治疗效果的方法，该方法包括下述步骤(a)使测试物质与由ADAMTS18基因的多核苷酸编码的多肽接触；(b)检测步骤(a)的该多肽的生物学活性；并(C)将潜在治疗效果和测试物质关联起来，其中当与在测试物质不存在时检测到的由ADAMTS18基因的多核苷酸编码的多肽的生物学活性相比，该物质阻抑所述多肽的生物学活性时，显示潜在治疗效果。在本发明中，可以将治疗效果与ADAMTS18多肽或其功能性片段的生物学活性关联起来。例如，当与在测试物质不存在时检测到的水平相比，该测试物质阻抑或抑制 ADAMTS18多肽或其功能性片段的生物学活性时，该测试物质可鉴定或选择为具有治疗效果的候选物质。或者，当与在测试物质不存在时检测到的水平相比的，该测试物质不阻抑或抑制ADAMTS18多肽或其功能性片段的生物学活性时，该测试物质可鉴定为没有显著治疗效果的物质。在本发明中，揭示了阻抑ADAMTS18表达降低癌细胞生长。因此，通过筛选阻抑该多肽的生物学活性的候选物质，可鉴定出可用于治疗或预防癌症的候选物质。这些候选物质可通过二次和/或更进一步筛选来评估治疗或预防癌症的潜力以鉴定用于癌症的治疗剂。例如，当结合ADAMTS18蛋白的物质抑制上文所述癌症活性时，可得出此类物质具有 ADAMTS 18特异性治疗效果的结论。任何物质可用于筛选，只要它阻抑或降低ADAMTS18多肽的生物学活性。在本发明的背景中，短语“阻抑或降低生物学活性”涵盖与不存在该物质时比使ADAMTS18的生物学活性阻抑至少10%，更优选地阻抑至少25%、50%或75%，最优选地阻抑至少90%。此类阻抑可充当本筛选方法的指标。在优选的实施方案中，使用不表达ADAMTS18多肽的对照细胞。因而,本发明还提供了使用ADAMTS18多肽或其片段筛选用于抑制细胞生长的候选物质或用于治疗或预防ADAMTS 18相关疾病的候选物质的方法，包括下述步骤a)在测试物质存在下培养表达ADAMTS18多肽或其功能性片段的细胞和不表达 ADAMTS 18多肽或其功能性片段的对照细胞；b)检测表达该蛋白的细胞和对照细胞的生物学活性；并c)选择与在对照细胞中及在所述测试物质不存在时检测到的增殖相比抑制表达该蛋白的细胞中生物学活性的测试化合物。依照本发明，证明了 ADAMTS18多肽是肺癌和食管癌细胞的生长或存活力必需的。可用作筛选指标的ADAMTS18多肽生物学活性包括人 ADAMTS 18多肽的此类细胞生长促进活性。在本文中，细胞生长促进活性也称作“细胞增殖活性”或“细胞增殖增强活性”。还有，ADAMTS18多肽具有N-糖基化活性、侵袭活性或基质金属蛋白酶(MMP)活性。如此，这些活性也可用作筛选指标。当本方法中要检测的生物学活性是细胞增殖增强活性时，它可例如，通过制备表达ADAMTS18多肽或其片段的细胞，在测试物质存在下培养该细胞，并测定细胞增殖速度， 测量细胞周期等，以及通过检测伤口愈合活性、进行Matrigel侵袭测定和测量集落形成活性，来加以检测。当评估细胞增殖增强活性时，优选使用不表达ADAMTS18多肽的对照细胞。因而， 本发明还提供了使用ADAMTS18多肽或其片段筛选用于抑制细胞生长的候选物质或用于治疗或预防癌症的候选物质的方法，包括下述步骤a)在测试物质存在下培养表达ADAMTS18多肽或其功能性片段的细胞；b)检测表达该多肽的细胞的生物学活性；并c)选择与在该测试物质不存在时检测到的增殖相比抑制表达该多肽的细胞中生物学活性的测试物质。当本方法中要检测的生物学活性是N-糖基化活性时，它可例如如下检测使表达 ADAMTS 18多肽或其具有N-糖基化活性的功能性等同物的细胞或纯化的ADAMTS18多肽与测试物质接触，并在适合ADAMTS18多肽N-糖基化的条件下检测该ADAMTS18多肽或该功能性等同物的N-糖基化水平。由此鉴定调控ADAMTS18多肽或功能性等同物的糖基化水平的测试物质。在本发明的背景中，ADAMTS 18多肽的N-糖基化水平可通过本领域已知的方法来测定。例如，可以通过比较分子量来检测多肽的N-糖基化。通过添加糖苷链，N-糖基化的蛋白质的分子量比根据多肽的氨基酸序列计算的预测分子量要大。用于估算蛋白质分子量的方法是公知的。或者，可使用放射性标记的N-糖基化供体来检测对多肽添加糖苷链。可以例如通过SDS-PAGE电泳和荧光显影来检测放射性标记物向ADAMTS18蛋白的转移。或者，在反应后，可以通过过滤将ADAMTS18多肽与糖基供体分开，并通过闪烁计数对保留在滤器上的放射性标记物的量定量。可以将其它合适标记物附着至糖基供体，诸如产色标记物和荧光标记物，而且检测这些标记物向ADAMTS18多肽的转移的方法是本领域已知的。或者，可通过选择性识别多肽糖基化位点的试剂来测定ADAMTS18多肽的N-糖基化水平。例如，将 ADAMTS18多肽和候选物质在能够糖基化多肽的条件下温育后，可通过免疫学方法来检测多肽的N-糖基化水平。任何使用识别糖基化多肽的抗体的免疫学技术均可用于该检测。例如，用识别糖基化多肽的抗体进行的ELISA或免疫印迹可用于本发明。
代替使用抗体，可使用以高亲和力选择性结合糖苷链的试剂来检测糖基化蛋白质。此类试剂是本领域已知的。例如，公知凝集素是糖苷链特异性探针。缀合有可检测标记物诸如碱性磷酸酶的凝集素试剂有市售。细胞中多肽的N-糖基化水平可通过分离细胞裂解物来评估。例如，可使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶将多肽分离。将在凝胶中分离后的多肽转移至硝酸纤维素膜，进行免疫印迹分析。当与本方法相关的要检测的生物学活性是侵袭活性时，它可例如如下检测制备表达ADAMTS18多肽的细胞，并使用例如Matrigel侵袭测定对侵袭细胞数计数，如图5A所示。选择可减少侵袭细胞数的物质作为用于治疗或预防肺癌或食管癌的候选物质。当与本方法相关的要检测的生物学活性是MMP活性时，它可例如如下检测使表达ADAMTS18多肽或其功能性等同物的细胞或纯化的ADAMTS18多肽或其功能性等同物与测试物质接触，接着实施MMP测定来评估MMP活性。MMP测定可通过本领域公知的方法来进行。例如，MMP测定可使用包括MMP的底物的商品化测定试剂盒来进行。通过本筛选方法分离的物质是ADAMTS18多肽的拮抗剂的候选物，故而也是抑制该多肽与分子(包括核酸(RNA和DNA)和蛋白质)的体内相互作用的候选物。IV-2.基于核苷酸的筛选方法IV-2-1.俥用ADAMTS18某闵的筛诜方法如上详述，通过控制ADAMTS18基因的表达水平，可以控制癌症的发病和进展。因此，通过使用ADAMTS18基因的表达水平作为指标的筛选可鉴定能用于治疗或预防癌症的物质。在本发明的上下文中，这样的筛选可包括例如以下步骤a)将测试物质与表达ADAMTS18基因的细胞接触；b)检测ADAMTS18基因的表达水平；c)将表达水平与在不存在测试物质下检测到的表达水平比较；并d)选择降低表达水平的测试物质作为用于治疗或预防癌症的候选物质。依照本发明，可评估测试物质抑制细胞生长或候选物质用于治疗或预防癌症的治疗效果。因此，本发明还提供了筛选用于阻抑癌细胞增殖的候选物质的方法，及筛选用于治疗或预防癌症的候选物质的方法。在本发明的背景中，此类筛选可包括例如下述步骤a)使测试物质与表达ADAMTS18基因的细胞接触；b)检测ADAMTS18基因的表达水平；并c)将b)的表达水平与测试物质的治疗效果关联起来。或者，在一些实施方案中，本发明还提供用于评估或估计测试物质治疗或预防与 ADAMTS 18过表达有关的癌症或抑制癌症的治疗效果的方法，该方法包括下述步骤(a)使候选物质与表达ADAMTS18的细胞接触；并；(b)将潜在治疗效果和测试物质关联起来，其中当与对照相比，物质降低 ADAMTS 18的表达水平时，显示潜在治疗效果。在本发明的背景中，可以将治疗效果与ADAMTS18基因的表达水平关联起来。例如，当与在测试物质不存在时检测到的水平相比，该测试物质降低ADAMTS18基因的表达水平时，可鉴定或选择该测试物质作为具有治疗效果的候选物质。或者，当与在测试物质不存在时检测到的水平相比，该测试物质不降低ADAMTS18基因的表达水平时，可鉴定该测试物质为没有显著治疗效果的物质。在本发明中，揭示了阻抑ADAMTS18表达降低癌细胞生长。因此，通过筛选降低 ADAMTS18表达水平的候选物质，可鉴定出可用于治疗或预防癌症的候选物质。这些候选物质可通过二次和/或更进一步筛选来评估其治疗或预防癌症的潜力以鉴定用于癌症的治疗剂。可通过将表达ADAMTS18基因的细胞与测试物质接触，然后测定ADAMTS18基因的表达水平，从而鉴定抑制ADAMTS18基因的表达的物质。当然，也可使用一群表达该基因的细胞代替单个细胞进行该鉴定。在存在测试物质的条件下检测到与不存在该物质的条件下的表达水平相比降低的表达水平表明该测试物质能作为ADAMTS18基因的抑制剂，提示该测试物质具有抑制癌症用途的可能性，从而作为用于治疗或预防癌症的测试物质。基因的表达水平可通过本领域众所周知的方法来评估。例如，可遵循上文标题 ‘1-1.用于诊断癌症或发生癌症的倾向性的方法’之下所述的方法来测定ADAMTS18基因的表达水平。用于上述鉴定的细胞或细胞群可以是任何细胞或任何细胞群，只要其表达 ADAMTS18基因即可。例如，该细胞或细胞群可以是或包含来源于组织的肺和食管上皮细胞。 或者，该细胞或细胞群可以是或包含来源于癌性细胞，包括肺癌和食管癌的永生化细胞。表达ADAMTS18基因的细胞包括例如从癌症建立的细胞系(例如肺癌和食管癌细胞系诸如 NCI-H1781、NCI-H1373、LC319、A549、PC-14、SK-MES-1、NCI-H520、NCI-H1703、NCI-H2170、 LU61、TE1、TE2、TE3、TE4、TE5、TE6、TE8、TE9、TE10、SBC-3、SBC-5、DMS114、DMS273 等)。此外，该细胞或细胞群可以是或包含已用ADAMTS18基因转染的细胞。本发明的方法容许筛选各种上述测试物质，特别适用于筛选功能性核酸分子，包括反义RNA、siRNA等。IV-2-2.俥用ADAMTS18某闵转录调节区的筛诜方法根据另一方面，本发明提供了一种方法，其包括以下步骤a)使测试物质与其中导入有载体的细胞接触，该载体包括ADAMTS18基因的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报告基因；b)检测所述报告基因的表达或活性；c)将该表达水平或活性与在该物质不存在时检测到的表达水平或活性比较；并d)选择降低所述报告基因的表达或活性物质作为用于治疗或预防癌症的候选物质。依照本发明，可评估测试物质抑制细胞生长或候选物质用于治疗或预防癌症的治疗效果。因此，本发明还提供了筛选用于阻抑癌细胞增殖的候选物质的方法，及筛选用于治疗或预防癌症的候选物质的方法。依照另一个方面，本发明提供了一种方法，其包括下述步骤a)使测试物质与其中导入有载体的细胞接触，该载体包括ADAMTS18的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报告基因；b)检测所述报告基因的表达或活性；并c)将b)的表达水平与测试物质的治疗效果关联起来。
或者，在一些实施方案中，本发明还提供用于评估或评价测试物质治疗或预防与 ADAMTS 18过表达有关的癌症或抑制癌症的治疗效果的方法，该方法包括下述步骤(a)使测试物质与其中导入有载体的细胞接触，该载体包括ADAMTS18的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报告基因；(b)测量所述报告基因的表达或活性；并(C)将潜在治疗效果和测试物质关联起来，其中当测试物质降低所述报告基因的表达或活性时，显示潜在治疗效果。在本发明中，可以将治疗效果与所述报告基因的表达或活性关联起来。例如，当与在测试物质不存在时检测到的水平相比，该测试物质降低所述报告基因的表达或活性时， 该测试物质可鉴定或选择为具有治疗效果的候选物质。或者，当与在测试物质不存在时检测到的水平相比，该测试物质不降低所述报告基因的表达或活性时，该测试物质可鉴定为没有显著治疗效果的物质。在本文中，揭示了阻抑ADAMTS18表达降低细胞生长。因此，通过筛选降低报告基因的表达或活性的测试物质，可鉴定出可用于治疗或预防癌症的候选物质。这些候选物质可通过二次和/或更进一步筛选来评估治疗或预防癌症的潜力以鉴定用于癌症的治疗剂。适合的报道基因和宿主细胞是本领域众所周知的。可使用ADAMTS18基因的转录调节区来制备筛选所需要的报道构建体，所述转录调节区可基于该基因的核苷酸信息作为含有转录调节区的核苷酸区段自基因组文库获得。转录调节区可以是例如ADAMTS18基因的启动子序列。筛选所需的报告构建体可以通过将报告基因序列连接于ADAMTS18基因的转录调节区来制备。本文中ADAMTS18基因的转录调节区域是如下的区域，从起始密码子到上游至少500bp，优选地上游l，000bp，更优选地上游5，000或10，OOObp0含有转录调节区的核苷酸区段可以从基因组文库中分离或者可以通过PCR扩增。鉴定转录调节区的方法以及测定方案是众所周知的(Molecular Cloning third edition chapter 17,2001, Cold Springs Harbor Laboratory Press)。当使用与ADAMTS18基因的调节序列(例如启动子序列)可操作连接的报告基因转染细胞时，通过检测报告基因产物的表达水平可以鉴定物质是抑制还是增强ADAMTS18 基因的表达。例示性报告基因包括但不限于萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、DiSCOSOma sp.红色荧光蛋白(DsRed)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、lacZ和β -葡糖醛酸糖苷酶(⑶S)，而且宿主细胞为C0S7、HEK293、HeLa、Ade2基因、HIS3基因、和其它本领域公知的。用于检测这些基因的表达的方法是本领域众所周知的。可以用含有所述报告构建体的载体感染宿主细胞，并通过本领域众所周知的方法检测报告基因的表达或活性(例如使用光度计、吸收光度计、流式细胞仪等)。在本发明的背景中，短语“降低表达或活性”涵盖比不存在化合物时使报告基因的表达或活性降低至少 10 %，更优选地降低至少25 %、50 %或75 %，最优选地降低至少95 %。IV-3.选择适合于特定个体的治疗性物质或治疗剂个体遗传组成的差异可导致其代谢各种药物的相对能力出现差异。可在受试者体内被代谢从而起到抗肿瘤物质作用的物质可在受试者的细胞中诱导癌性状态特征性基因表达样式向非癌性状态特征性基因表达样式的转变，从而表现出自身。因此，利用在此披露的在癌性细胞与非癌性细胞之间差异表达的ADAMTS18基因，可以在来自选定受试者的测试细胞群中测试推定的癌症治疗性或预防性抑制剂，从而确定该物质在该受试者中是否为合适的癌症抑制剂。为鉴定适合于特定受试者的癌症抑制剂，将来自该受试者的测试细胞群暴露于候选治疗性物质或治疗剂，并测定ADAMTS18基因的表达。在本发明方法的背景中，测试细胞群含有表达ADAMTS18基因的癌细胞。优选的， 测试细胞是肺和食管上皮细胞。具体来说，可在存在候选治疗性物质或治疗剂的条件下温育测试细胞群，测量测试细胞群中ADAMTS18基因的表达，并将其与一个或多个对照谱，例如癌性参照表达序型或非癌性参照表达谱比较。测试细胞群中ADAMTS18基因的表达相对于含有癌细胞的参照细胞群的降低表明该物质具有治疗潜力。或者，测试细胞群中ADAMTS18基因的表达相对于不含癌症的参照细胞群的相似性表明该物质具有治疗潜力。V.用于治疗或预防癌症的药物组合物通过本发明任何筛选方法筛出的物质，针对ADAMTS18基因的反义核酸和双链分子(例如s i RNA)及针对ADAMTS 18多肽的抗体抑制或阻抑ADAMTS 18基因的表达或ADAMTS 18 多肽的生物学活性，还抑制或破坏癌细胞周期调节、癌细胞增殖和细胞侵袭。因此，本发明提供了用于治疗或预防癌症的组合物，其中该组合物包括通过本发明任何筛选方法鉴定出的物质，诊断ADAMTS18基因的反义核酸或双链分子或针对ADAMTS18多肽的抗体。本发明的组合物可用于治疗或预防癌症，特别是诸如肺癌和食管癌的癌症。该组合物可用作为用于人或其他哺乳动物的药物，所述哺乳动物诸如小鼠、大鼠、 豚鼠、兔、猫、犬、绵羊、猪、牛、猴、狒狒和黑猩猩。在本发明的背景中，适合于详述如下的本发明活性成分(包括所筛出的物质、反义核酸、双链分子、抗体等)的药物剂型包括适于口服、直肠、鼻、局部(包括口腔和舌下)、 阴道或肠胃外(包括肌内、皮下和静脉内)施用的，或适于通过吸入或吹入施用的药物剂型。优选地，通过静脉内施用。制剂任选以离散的剂量单位包装。适合于供口服施用的药物剂型包括各自包含预定量活性成分的胶囊、微囊剂、扁囊剂和片剂。适合的剂型还包括粉剂、酏剂、粒剂、溶液、混悬液和乳剂。活性成分可以任选以大丸剂(bolus)、药糖剂(electuary)或糊剂(paste)的形式施用。或者，视需要，药物组合物可以无菌溶液或与水或任何其他药学上可接受的液体的混悬液注射的形式非口服施用。例如，可将本发明的活性成分与药学上可接受的载体或介质混合，具体来说，为无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、助悬物质、表面活性剂、稳定剂、芳香剂、赋形剂、媒介物、防腐剂、粘合剂等等，以通常可接受的药物配制方法所要求的单位剂量形式存在。包含于上述制剂中的活性成分的量为可获得的指定范围内的合适剂量。可掺入片剂和胶囊中的添加剂的例子包括但不限于粘合剂，诸如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和阿拉伯胶；赋形剂，诸如结晶纤维素；溶胀剂，诸如玉米淀粉、明胶和海藻酸；润滑剂，诸如硬脂酸镁；甜味剂，诸如蔗糖、乳糖或糖精；及芳香剂，诸如薄荷油、白珠 (Gaultheria adenothrix)油和楼桃。片剂可通过压缩或模制来制备，其中任选含有一种或多种配方成分。压制片剂可通过如下方法制备将活性成分以自由流动的形式(诸如粉末或颗粒)任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂或分散剂混合，并在适当的机器中进行压制。模制片剂可通过如下方法制备在适当的机器中对利用惰性液体稀释剂湿润的粉末化合物的混合物进行模制。所述片剂可根据本领域众所周知的方法进行包衣。片剂可任选配制以提供活性成分在体内的缓释或控释。片剂的包装中可以包含每月服用的一片药物。此外，当单位剂量形式为胶囊时,在上述成分之外还可包括液体载体,诸如油。口服液体制剂可以例如含水或含油混悬液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂的形式存在，或可以干燥产物存在用于在使用前与水或其他适合的媒介物复原。上述液体制剂可含有常规添加剂，诸如助悬剂、乳化剂、非水媒介物(可包括食用油类)或防腐剂。用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与目标受者的血液等渗的溶质；及水性和非水性无菌悬浮液，其可含有助悬剂和增稠剂。所述制剂可以单位剂量或多剂量容器提供，例如密封的安瓿和小管， 还可以在冷冻干燥(冻干)条件下保存，这样仅需要临使用前添加无菌液体载体，例如盐水、注射用水。或者，可提供用于连续输注的制剂。即配即用的注射溶液和混悬液可由前述类型的无菌粉剂、颗粒和片剂制备。此外，可使用适合于注射的媒介物诸如蒸馏水，按照普通的药物配制方法配制供注射用的无菌混合物。生理盐水、葡萄糖和其它等渗液体包括佐剂，诸如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠可用作注射用的水溶液。它们可与适当的增溶剂，诸如醇，例如乙醇；多元醇，诸如丙二醇和聚乙二醇；及非离子型表面活性剂，诸如Polysorbate 80 (TM)和 HC0-50 一起使用。芝麻油或大豆油可用作为油质液体，可与苯甲酸苄酯或苯甲醇组合使用作为增溶剂，还可与缓冲液，诸如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液；镇痛剂，诸如盐酸普鲁卡因；稳定剂，诸如苯甲醇和酚；和/或抗氧化剂一起配制。制备的注射剂可以装入到合适的安瓿中。用于直肠给药的制剂包括具有标准载体诸如可可脂或聚乙二醇的栓剂。用于口内局部给药，例如口腔或舌下给药的制剂包括锭剂和软锭剂，其中锭剂在调味基质诸如鹿糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中包含活性成分，而软锭剂在基质诸如明胶、甘油、蔗糖或阿拉伯胶中包含活性成分。对于鼻内施用活性成分，可使用液体喷雾剂、可分散粉剂，或以滴剂的形式使用。滴剂可用水性或非水性基质配制，该基质中还含有一种或多种分散剂、增溶剂或助悬剂。对于通过吸入给药,可以由吹入器、雾化器、加压包装(pressurized pack)或其它递送气溶胶喷雾的便利装置方便地递送组合物。加压包装可含有适宜的推进剂，诸如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适宜气体。在加压气溶胶的情况下， 可通过提供递送计量数量的阀门来确定剂量单位。或者，对于通过吸入或吹入给药，组合物可以采取干粉组合物的形式，例如活性成分与适合的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末组合物可以单位剂量形式提供，例如胶囊、药筒(cartridge)、凝胶(gelatin)或泡罩包装(blister pack),借助吸入器或吹入器，可由上述单位剂量形式施用所述粉末。其它的制剂包括可释放治疗剂的可植入装置和粘性贴片。期望时，可以采用适于缓释活性成分的上述制剂。药物组合物中还可以含有其它活性成分，诸如抗微生物剂、免疫抑制剂或防腐剂。应当理解，在上述具体提及的成分外，本发明的制剂可含有本领域对于所述制剂类型常用的其它药剂，例如适于口服给药的制剂可以含有调味剂。优选的单位剂量制剂是含有如下文标题‘IV.用于治疗或预防癌症的方法’中所述的每种本发明活性成分或其适宜部分的有效剂量的那些制剂。V-1.包含所筛出的物质的药物组合物本发明提供了包含通过上述本发明筛选方法鉴定出的任何物质、用于治疗或预防癌症的组合物。通过本发明方法鉴定出的物质可直接施用或根据以上详述的任何常规药物制备方法配制为剂量形式。
_5] V-2.包含双链分子的药物组合物针对ADAMTS18基因的双链分子可用于降低该基因的表达水平。在此，术语“双链分子”指抑制靶基因表达的核酸分子，包括例如短干扰RNA(siRNA ;例如双链核糖核酸 (dsRNA)或小发夹RNA(shRNA))和短干扰DNA/RNA (siD/R-NA ;例如DNA和RNA的双链嵌合物(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小发夹嵌合物(shD/R-NA))，如“定义”中描述的。在本发明的背景中，双链分子包含针对ADAMTS18基因的有义核酸序列和反义核酸序列。构建该双链分子使得其包含靶基因(即ADAMTS18基因)的有义序列和互补反义序列二者的一部分，而且也可以是具有发夹结构的单一构建体，其中有义和反义链经单链连接。当将双链分子导入细胞中时，双链分子充当RISC复合物识别mRNA中同源序列的向导。鉴定出的靶mRNA受到Dicer核酸酶活性的切割和降解，藉此双链分子最终降低或抑制由该RNA编码的多肽的产生(表达)。因而，本发明的双链分子可通过其生成在严格条件下与ADAMTS18基因的mRNA特异性杂交的单链的能力来加以限定。在本文中，mRNA中与自双链分子生成的单链杂交的部分称作“靶序列”或“靶核酸”或“靶核苷酸”。在本发明中， “靶序列”的核苷酸序列不仅可使用mRNA的RNA序列来显示，而且还可以使用自mRNA合成的cDNA的DNA序列来显示。在本发明的背景中，双链分子的长度优选少于500、200、100、50或25个碱基对。更优选地，双链分子的长度为19-25个碱基对。例示性的针对ADAMTS18基因的双链分子的靶序列包括SEQ ID NO :11和12的核苷酸序列。因此，例如，本药物组合物可包括这样的双链 RNA 分子(即 siRNA)，其包含核苷酸序列 5' -GCCAGUAUCUCAAGAAAUU-3’ (对于 SEQ ID NO 11)和 5' -GGGCACAACUUUGGUAUGA-3’(对于 SEQ ID NO 12)作为有义链。为了增强双链分子的抑制活性，可将3’突出端添加到有义和/或反义链中靶序列的3’末端。要添加的核苷酸的数目为至少2个，通常为2-10个，优选2-5个。所添加的核苷酸在双链分子的有义和/或反义链的3’末端形成单链。要添加的核苷酸优选但不限于 “u” 或 “t”。可将由任意核苷酸序列组成的环序列放置于有义序列与反义链之间，以便形成发夹环结构。因此，本发明的药物组合物中包含的双链分子可采取通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’ 或5’-[A’]-[B]-[A]-3’，其中[A]为含有对应于靶序列的序列的有义链，[B]为间插单链， 而[A’ ]为含有互补于[A]的序列的反义链。在本文中，包括对应于靶序列的序列的多核苷酸链可称作“有义链”。在优选的实施方案中，[A]为有义链；[B]为由3至23个核苷酸组成的单链多核苷酸；而[A’ ]为包括反义链的多核苷酸链，其包含靶序列的互补序列，与ADAMTS 18基因的mRNA或cDNA特异性杂交(即与有义链[A]的靶序列杂交的序列)。在本文中，包括靶序列的互补序列、与ADAMTS18基因的mRNA或cDNA特异性杂交的多核苷酸链可称作“反义链”。[A]区与[A’]区杂交，然后形成由[B]区组成的环。环序列的长度可优选为3_23个核苷酸。环序列例如可选自如下序列(www.ambion.com/techlib/tb/tb_506. html) :CCC、CCACC 或 CCACACC Jacque JM et al. , Nature 2002，418 :435_8。UUCG :Lee NS et al. , Nature Biotechnology 2002,20 :500-5 ；Fruscoloni P et al. , Proc Natl Acad Sci USA 2003,100(4) 1639-440UUCAAGAGA Dykxhoorn DM et al. ,Nature Reviews Molecular Cell Biology 2003，4 :457_67。“UUCAAGAGA(在 DNA 中为“ttcaagaga”)”是特别适合的环序列。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供有活性的siRNACJacque J-M et al. , Nature 2002,418:435-8)。适用于 ADAMTS18 基因的例示性的发夹 siRNA 包括，5’ -GCCAGUAUCUCAAGAAAUU- [b] -AAUUUCUUGAGAUACUGGC-3’；(SEQ ID NO: 11 的靶序列)；5’-AAUUUCUUGAGAUACUGGC_[b]_GC CAGUAUCUCAAGAAAUU-3’；(SEQ ID NO 11 的靶序列)和；5’-GGGCACAACUUUGGUAUGA-[b]_UCA UACCAAAGUUGUGCCC-3’；(SEQ ID NO :12 的靶序列)；5’ -UCAUACCAAAGUUGUGCCC-[b] -GGGCAC AACUUUGGUAUGA-3’ ； (SEQ ID NO :12 的靶序列)。可使用能得自 Ambion 网站(www. ambion. com/techlib/misc/siRNA finder, html)的siRNA设计计算机程序设计适合的本发明双链分子的其它核苷酸序列。该计算机程序基于以下流程选择用于双链分子合成的核苷酸序列。双链分子的靶位点的选择:I.从目标转录物的AUG起始密码子开始向下游扫描，寻找AA 二核苷酸序列。记录每个AA的出现及其3’侧邻近的19个核苷酸作为潜在的祀位点。Tuschl et al. Genes Cev 1999,13(24) :3191_7，不推荐针对5’和3’非翻译区(UTR)和邻近起始密码子的区域 (75个碱基之内)设计siRNA，因为上述区域可能富含调节蛋白结合位点。UTR结合蛋白和 /或翻译起始复合物可干扰siRNA内切核酸酶复合物的结合。2.将所述潜在靶位点与人基因组数据库进行比较，不考虑与其它编码序列显著同源的任何祀序列。可采用可见于NCBI服务器www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/的 BLAST(Altschul SF et al.，Nucleic Acids Res 1997,25 :3389-402 ；J Mol Biol 1990， 215 :403-10)进行同源性搜索。3.选择合格的靶序列用于合成。在Ambion，可优选顺着待评估的基因的长度选择数个靶序列。本发明的双链分子可使用本领域已知的任何化学合成方法来制备。例如，根据化学合成方法，分别合成有义和反义单链多核苷酸，然后采用适当的方法使它们退火到一起， 来获得双链分子。或者，本发明的双链分子或siRNA分子也可用体外翻译来合成。在此实施方案中，编码包括靶序列和其反义的核苷酸序列的DNA在体外转录成双链分子。在退火的一个实施方案中，将合成的单链多核苷酸以至少约3 7、例如约4 6、例如基本上等摩尔量(即约5 5的摩尔比)的摩尔比混合。然后，将混合物加热到双链分子解离的温度，再缓慢冷却。经退火的双链多核苷酸可以采用本技术领域公知的常用方法来纯化。纯化方法的例子包括利用琼脂糖凝胶电泳的方法，或者其中任选地除去剩余的单链多核苷酸(例如利用适当的酶进行降解)的方法。
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所述位于靶序列侧翼的调控序列可为相同或不同的，以使得它们的表达能够独立地，或者以时间性或空间性方式被调控。所述双链分子可通过将ADAMTS18基因模板克隆入载体(例如含有来自小核RNA(snRNA)U6的RNA多聚酶III转录单元或人类HlRNA启动子的载体)以在胞内进行转录。本领域已知用于将双链分子导入细胞中的标准技术。例如，可以能与mRNA转录物结合的形式将双链分子直接导入细胞。在这些实施方案中，双链分子通常进行如下所述关于反义分子的修饰。其他修饰也是可用的，例如，偶联有胆固醇的双链分子显示出具有改善的药理特性(Song et al.，Nature Med 2003,9 :347-51)。这些常规使用的技术也可应用于本组合物中包含的双链分子。或者，编码双链分子的DNA可携带于载体(以下也称为“siRNA载体”)中，而且双链分子可以以能够在体内表达双链分子的载体的形式包含在本组合物中。可通过例如将靶序列足以抑制靶基因体内表达的部分克隆入在该序列侧翼可操作连接有调节序列(例如来自小核RNA (snRNA) U6的RNA聚合酶III转录单位或人HlRNA启动子)的表达载体中，以容许两条链都表达(通过该DNA分子的转录)的方式产生上述载体(Lee NS et al. ,Nature Biotechnology 2002，20 :500-5)。例如，通过第一启动子(例如所克隆的DNA3’侧的启动子序列)转录与靶基因的mRNA反义的RNA分子，通过第二启动子(例如所克隆的DNA 5’ 侧的启动子序列)转录对于靶基因的mRNA为有义链的RNA分子。有义链与反义链在体内杂交以产生用于沉默靶基因表达的双链分子构建体。或者，有义和反义链可以在一个启动子的帮助下一起转录。在这种情况下，有义和反义链可以经多核苷酸序列连接以形成具有二级结构，例如发夹的单链构建体。因而，本发明用于治疗或预防癌症的药物组合物可包含双链分子(例如siRNA)或在体内表达双链分子的载体。特别地，本发明提供了用于治疗或预防癌症的药物组合物，其包括抑制ADAMTS18基因表达的双链分子，或在体内表达该双链分子的载体。另外，本发明还提供了用于抑制癌细胞增殖的药物组合物，该组合物包括抑制ADAMTS18基因表达的双链分子，或在体内表达该双链分子的载体。为了将双链分子载体导入细胞，可使用转染增强剂。FuGENE6 (Roche diagnostics)、Lipofectamine 2000 (Invitrogen)、01igofectamine (Invitrogen)和 Nucleofector (Wako pure Chemical) 可用作为转染增强剂。因此，本发明的药物组合物可进一步包括上述转染增强剂。在另一个实施方案中，本发明还提供本发明的双链核酸分子或编码它的载体在制备用于治疗表达ADAMTS 18基因的癌症的药物组合物中的用途。例如，本发明涉及下述双链核酸分子在制备用于治疗表达ADAMTS18基因的癌症的药物组合物中的用途该分子在过表达ADAMTS18基因的细胞内抑制该基因的表达，其中该分子包含有义链和与之互补的反义链，二者彼此杂交而形成该双链核酸分子，且该分子以SEQ ID NO :11或12的序列为靶标。或者，本发明进一步提供在治疗表达ADAMTS18基因的肺癌中使用的本发明双链核酸分子。或者，本发明还提供生产用于治疗表达ADAMTS18基因的癌症的药物组合物的方法或工艺。该方法或工艺包括将药学或者生理学可接受的载体与作为活性成分的下述双链核酸分子一起制剂化的步骤，其中所述双链核酸分子抑制细胞内ADAMTS18基因的表达，且该分子包含有义链和与之互补的反义链，二者彼此杂交而形成该双链核酸分子，且该分子以SEQ ID NO :11或12的序列为靶标。在另Iv实施方案中，本发明还提供生广用于治疗表达ADAMTS 18基因的癌症的药物组合物的方法或工艺，其中所述方法或工艺包括将活性成分与药学上或生理学上可接受的载体混合的步骤，其中所述活性成分是这样的双链核酸分子，其在过表达ADAMTS18基因的细胞中抑制该基因的表达，该分子包含有义链与与其互补的反义链，二者相互杂交以形成双链核酸分子，并以SEQ ID NO 11或12的序列为靶标。V-3.包含反义核酸的药物组合物靶向ADAMTS18基因的反义核酸可用于降低在癌性细胞，包括肺癌和食管癌细胞中上调的该基因的表达水平。此类反义核酸可用于治疗癌症，特别是肺癌和食管癌，因此也包含在本发明中。反义核酸通过与ADAMTS18基因的核苷酸序列或其相应的mRNA结合起作用，从而抑制该基因的转录或翻译，促进mRNA的降解，和/或抑制该基因所编码的蛋白质的表达。因此，结果是，反义核酸抑制ADAMTS18蛋白在癌性细胞中发挥功能。在此，短语 “反义核酸”指与靶序列特异性杂交的核苷酸，不但包括与该靶序列完全互补的核苷酸，还包括包含一个或多个核苷酸错配的、与该靶序列互补的核苷酸。例如，本发明的反义核酸包括在ADAMTS18基因或其互补序列的至少15个连续核苷酸的跨度上具有至少70%或更高、 优选至少80%或更高、更优选至少90%或更高、甚至更优选至少95%或更高同源性的多核苷酸。本领域中已知的算法可用于测定上述同源性。本发明的反义核酸通过与ADAMTS18基因的DNA或mRNA结合，作用于产生该基因所编码蛋白质的细胞，抑制它们的转录或翻译，促进mRNA的降解，并抑制该蛋白质的表达， 最终抑制该蛋白质发挥功能。通过与对核酸无活性的适合基质材料混合，可将本发明的反义核酸制备为外用制剂，例如搽剂(liniment)或審剂(poultice)。同样，根据需要，通过添加赋形齐 、等渗齐 、增溶齐 、稳定齐 、防腐齐 、镇痛剂等，可将本发明的反义核酸配制成片剂、粉末、颗粒、胶囊、脂质体胶囊、注射剂、溶液、滴鼻剂和冷冻干燥剂。反义封固介质(antisense-mounting medium)也可用于增加耐久性和膜通透性。 所述反义封固介质的例子包括但不限于脂质体、聚L-赖氨酸、脂质、胆固醇、脂质转染剂或它们的衍生物。可通过下列已知方法制备它们。本发明的反义核酸抑制ADAMTS18基因的表达并具有抑制该蛋白质生物学活性的用途。此外，包含本发明反义核酸的表达抑制剂是有用的，因为它们能抑制ADAMTS18蛋白的生物学活性。本发明的反义核酸还包括经过修饰的寡核苷酸。例如，硫代(thioated)寡核苷酸可用来赋予寡核苷酸以核酸酶抗性。V-4.包含抗体的药物组合物可通过施用如下化合物抑制在癌症，特别是肺癌和食管癌中过表达的ADAMTS18 基因的基因产物的功能，所述化合物能与该基因产物结合或以其它方式抑制其功能。针对 ADAMTS18多肽的抗体可作为这样的化合物被提及，并可用作为用于治疗或预防癌症的药物组合物的活性成分。本发明涉及针对ADAMTS18基因所编码的蛋白质的抗体或该抗体的片段的应用。如本文中所使用的，术语“抗体”指具有特定结构、只与用于合成该抗体的抗原(即上调标志的基因产物)或与该抗体密切相关的抗原相互作用(即结合)的免疫球蛋白分子。包含用于合成抗体的抗原的分子和包含为抗体所识别的该抗原的表位的分子可作为与该抗体密切相关的抗原被提及。此外，用于本发明药物组合物中的抗体可以是抗体片段或经过修饰的抗体，只要其与ADAMTS18基因所编码的蛋白质结合即可(例如抗ADAMTS18抗体的免疫学活性片段)。 举例来说，抗体片段可以是Fab、F (ab’)2、Fv或单链Fv (scFv)，其中来自H和L链的Fv片段通过合适的接头连接(Huston JS et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1988,85:5879-83)。 可通过用酶诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体来产生这样的抗体片段。或者，可构建编码抗体片段的基因，将其插入表达载体，并在适宜的宿主细胞中表达(参见例如Co MS et al.，J Immunol 1994，152 :2968-76 ；Better M et al.，Methods Enzymol 1989,178 476-96 ；Pluckthun A et al. ， Methods Enzymol 1989，178 :497-515 ;Lamoyi E， Methods Enzymol 1986，121 :652-63 ；Rousseaux J et al.，Methods Enzymol 1986，121 :663-9 ； Bird RE et al.，Trends Biotechnol 1991,9 :132-7) 0 可通过与多种分子诸如聚乙二醇 (PEG)偶联来修饰抗体。本发明包括这样的经过修饰的抗体。可通过化学修饰抗体来获得经过修饰的抗体。上述修饰方法是本领域中常规的。或者，用于本发明的抗体可以是具有来源于针对ADAMTS18多肽的非人抗体的可变区和来源于人抗体的恒定区的嵌合抗体，或包含来源于非人抗体的互补决定区(CDR)、来源于人抗体的框架区(FR)和恒定区的人源化抗体。可使用已知技术制备上述抗体。可通过用啮齿类动物的CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列来进行人源化(参见如Verhoeyen et al. , Science 1988，239 :1534-6)。因而，这样的人源化抗体是嵌合抗体，其中完整人可变域已被来自非人物种的相应序列所替代。在人框架区和恒定区外还包含人可变区的完整人抗体也是可以利用的。这样的抗体可利用本领域已知的各种技术制备。例如，体外方法包括使用在噬菌体上展示的人抗体片段的重组文库(例如 Hoogenboom et al.，J Mol Biol 1992,227:381-8)。类似的，可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物例如内源免疫球蛋白基因部分或完全灭活的小鼠来制备人抗体。该方法描述于例如美国专利Nos. 6，150，584 ;5，545，807 ;5，545，806 ； 5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;和 5，661，016。当要将所获得的抗体施用于人体(抗体治疗)时，优选人抗体或人源化抗体，因为它们具有降低的免疫原性。可将如上获得的抗体纯化至均质。例如，可根据用于普通蛋白质的分离和纯化方法进行抗体的分离和纯化。例如，通过适当选择和组合使用柱层析诸如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等,可以分开和分离抗体(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow and D Lane,Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 但并不局限于此。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。例示性的可使用的蛋白A柱包括例如 Hyper D, POROS 和 Sepharose F. F. (Pharmacia)。除亲和层析外，例示性的层析包括例如离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(Strategies for Protein Purification and Characterization A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring HarborLaboratory Press (1996))。可以通过液相层析,诸如HPLC和FPLC进行层析操作。VI.用于治疗或预防癌症的方法针对癌细胞中发生的特定分子变化的癌症疗法已经通过下述抗肿瘤药物的临床开发和管理机构的批准被认定为有效诸如用于治疗晚期癌症的曲妥单抗(trastuzumab) (Herceptin)、用于治疗慢性髓细胞样白血病的甲磺酸伊马替尼(imatinib methylate) (Gleevec)、用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)的吉非替尼(Iressa)、及用于治疗B细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤的利妥昔单抗(rituximab)(抗⑶20mAb) (Ciardiello F et al., Clin Cancer Res 2001, 7 :2958-70,Review ；Slamon DJ et al.，N Engl J Med 2001,344 783-92 ；Rehwald U et al.，Blood 2003,101 :420-4 ；Fang G et al.，Blood 2000,96 2246-53)。这些药物临床上是有效的，并且比传统抗肿瘤剂具有更好的耐受性，因为它们仅仅靶向转化细胞。因此，这些药物不仅改善了癌症患者的存活率和生活质量，而且验证了分子靶向癌症疗法的理念。另外，当靶向药物与标准化疗组合使用时，可以增强标准化疗的效力(Gianni L, Oncology 2002,63Suppl I :47-56 ；Klejman A et al. , Oncogene 2002,21 5868-76)。因此，未来的癌症治疗将很可能涉及将常规药物与针对肿瘤细胞不同特性诸如血管发生和侵袭的靶特异性药剂组合。这些调节方法可以离体(ex vivo)、体外(例如通过在作用剂的存在下培养细胞) 或体内(例如通过给受试者施用药剂)来进行。所述方法包括施用蛋白质或蛋白质的组合、 或者核酸分子或核酸分子的组合，作为对抗差异表达基因的异常表达或其基因产物的异常活性的疗法。可以用拮抗(即降低或抑制)过表达基因的活性的治疗剂来治疗特征在于基因和基因产物的表达水平或生物学活性(相对于未患有疾病或病症的受试者)分别有所升高的疾病和病症。可以治疗性或预防性的施用拮抗活性的治疗剂。因此，在本发明背景中可利用的治疗剂包括例如⑴过表达的ADAMTS18基因的多肽或其类似物、衍生物、片段或同源物；(ii)针对过表达的基因或基因产物的抗体；(iii) 编码过表达的基因的核酸；(iv) “功能不良的”(即由于过表达基因的核酸中的异源插入所致)的反义核酸或核酸；(V)双链分子(例如siRNA);或(vi)调节剂(即改变过表达的多肽与其结合配偶体之间相互作用的抑制剂、拮抗剂)。功能不良的反义分子通过同源重组被用于“敲除”多肽的内源功能(参见例如Capecchi，Science 1989，244 :1288-92)。通过获取患者组织样品(例如从活检组织)并在体外测定其RNA或肽水平、所表达的肽(或表达有所改变的基因的mRNA)的结构和/或活性，定量肽和/或RNA，从而可以容易的检测出水平的升高。本领域中众所周知的方法包括但不限于免疫测定(例如Western 印迹分析、免疫沉淀后续十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫细胞化学等)和 /或用于检测mRNA表达的杂交测定(例如Northern测定、斑点印迹、原位杂交等)。在疾病的明显临床症状出现之前进行预防性给药，使得疾病或病症得以预防或延迟其发展。本发明的治疗方法可包括施用一种或多种可调制ADAMTS18基因产物的活性的作用剂的步骤。可调制蛋白质活性的作用剂的例子包括但不限于核酸、蛋白质、上述蛋白质的天然存在关联配体、肽、肽模拟物和其他小分子。因此，本发明提供了通过降低ADAMTS18基因的表达或该基因产物的活性在受试者中治疗或缓解癌症症状、或预防癌症的方法。本发明的方法特别适用于治疗或预防肺癌和食管癌。
可预防性或治疗性施用适合的治疗剂给患有癌症或有风险发生癌症(或怀疑发生癌症)的受试者。可通过使用标准临床方法或通过检测ADAMTS18基因的异常表达水平 (“上调”或“过表达”)或该基因产物的异常活性来鉴定这样的受试者。根据本发明的一方面，通过本发明筛选方法鉴定的物质可用于治疗或预防癌症。 可使用本领域技术人员众所周知的方法将这些物质施用给患者，例如，动脉内、静脉内或经皮注射或鼻内、经支气管、肌内或口服给药。如果所述物质为DNA所能编码的，则可将DNA 插入用于基因疗法的载体，并可施用该载体给患者以实施该疗法。根据待治疗患者的体重、 年龄、性别、症状、状况及给药方法改变给药剂量和方法；然而，本领域技术人员可常规选择合适的剂量和给药方法。例如，尽管与ADAMTS18多肽结合或调节该多肽活性的物质的剂量取决于上述多种因素，当正常体重成年人(60kg) 口服给药时，该剂量通常为约O. Img到约IOOmg每天、优选约L Omg到约50mg每天、更优选约I. Omg到约20mg每天。当以注射剂形式向正常体重成年人^Okg)肠胃外给药时，尽管根据患者、靶器官、症状和给药方法存在一些差异，但静脉内注射约O. Olmg到约30mg每天、优选约O. Img 到约20mg每天、更优选约O. Img到约IOmg每天的剂量是合适的。在其它动物的情况下，可通过转换为60kg体重常规计算出合适的剂量。类似地，本发明的药物组合物可用于治疗或预防癌症。可使用本领域技术人员众所周知的方法将所述组合物施用于患者，例如动脉内、静脉内或经皮注射或鼻内、经支气管、肌内或口服给药。对于前述每一种情况，可以约O. I-约250mg/kg每天的剂量范围口服或通过注射来施用所述组合物，例如多肽和有机化合物。成人的剂量范围通常为约5mg到约17. 5g/天、 优选约5mg到约IOg/天、最优选约IOOmg到约3g/天。片剂或其它以离散单元提供的单位剂量形式可方便地含有以这样的剂量或者作为多个这样的剂量有效的量，例如含有约5mg 到约500mg、通常为约IOOmg到约500mg。所用剂量依赖于多种因素，包括受试者的年龄、体重和性别，所治疗的确切疾患及其严重程度。此外，给药途径也随疾患及其严重程度而变化。然而无论怎样，本领域技术人员都能在考虑上述因素的基础上常规计算出合适的和最佳的剂量。具体来说，可通过将针对ADAMTS18基因的反义核酸直接施用于病痛部位或注射入血管中使之到达病痛部位，从而施用于患者。根据患者状况，本发明的反义核酸衍生物的剂量可作适当调节并以所需量使用。例如，可施用O. l-100mg/kg、优选O. l_50mg/kg的剂量范围。在优选的实施方案中，本发明的方法包括将针对ADAMTS18基因的双链分子施用于受试者的步骤。要施用的双链分子的优选例在“V-2.包含双链分子的药物组合物”项和下面的“VII.双链分子和编码它们的载体”项下描述。应理解，本发明的所述双链分子降解亚化学计量的ADAMTS18基因。虽不愿拘于任何理论，认为本发明的所述双链分子以催化方式造成靶mRNA的降解。因此，与常规的癌症疗法相比，为实施治疗效应而需要输送到癌症的位置或其附近的双链分子要少得多。本领域技术人员在考虑了受试者的体重、年龄、性别、疾病类型、症状及其它条件、 施用途径、以及是局部施用还是全身施用等因素的基础上，能够容易地确定本发明的双链分子的有效量。一般而言，本发明双链分子的有效量是在癌症部位或其附近胞间浓度为大约I纳摩尔(nM)到约ΙΟΟηΜ，优选大约2nM到大约50nM，更优选大约2. 5nM到大约ΙΟηΜ。 考虑可使用更多或更少量的双链分子。本领域一般技术人员可方便地及常规地确定特定情况下所需的确切剂量。本发明的方法可用于抑制癌症，例如肺癌，尤其是肺癌和食管癌，的生长或转移。 为了治疗癌症，还可以将本发明的双链分子与不同于所述双链分子的药剂组合来施用于受试者。或者，本发明的双链分子还可以与其它旨在用于癌症治疗的治疗方法组合来施用于受试者。举例而言，本发明所述双链分子可与现在用于治疗癌症或预防癌症转移的治疗方法(例如，放射疗法，外科手术，以及使用化疗剂的治疗)组合施用。在本发明方法的背景中，双链分子可以裸双链分子的形式、以与投递试剂相组合的形式，或者以表达双链分子的重组质粒或者病毒载体的形式施用于受试者。用于与本发明的双链分子组合施用的合适的投递试剂包括Mirus Transit TKO亲脂性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、或聚阳离子(例如聚赖氨酸)、或脂质体。一种优选的投递试剂是脂质体。脂质体能够帮助将双链分子投递至特定的组织如视网膜或肿瘤组织中，还能够增加双链分子的血中半衰期。适合在本发明的背景中使用的脂质体可以是由常规的囊泡形成性脂质(vesile-forming lipids)形成的,囊泡形成性脂质通常包括中性或带负电荷的磷脂，以及留醇，诸如胆固醇。对一些因素的考虑通常可以为脂质的选择提供指导，如期望的脂质体大小以及在血流中的脂质体的半衰期等。有多种制备脂质体的方法是公知的，例如 Szoka 等，Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9 :467 ;美国专利第 4，235，871 号；第 4，501，728 号；第4，837，028号；第5，019，369号；将上述文献的全部内容援引并入本说明书。优选地，封装本发明的双链分子的脂质体包含能够将脂质体输送至癌症部位的配体分子。优选的配体是与肿瘤或血管内皮细胞中常见的受体结合的配体，例如与肿瘤抗原或内皮细胞表面抗原结合的单克隆抗体。特别优选地，封装本发明的双链分子的脂质体经过了修饰以免被单核巨噬细胞和网状内皮系统清除，例如，由于其结构的表面结合有调理作用抑制部分(opsonization inhibition moities)。在一个实施方案中,本发明的脂质体可以同时包括调理作用抑制部分和配体。用于制备本发明的脂质体的调理作用抑制部分通常是与脂质体膜结合的大型亲水性聚合物。如在本说明书中所使用的，例如，当调理作用抑制部分化学地或物理地搭接在脂质体膜上时，例如通过脂溶性锚(anchor)插入膜本身，或者通过与膜脂质的活性基团直接结合，则调理作用抑制部分与脂质体膜“结合”。这些调理作用抑制性亲水性聚合物形成保护性表层，该表层显著地减少巨噬-单核细胞系统(“丽S”)和网状内皮系统(”RES”) 对脂质体的摄入；在例如美国专利第4，920，016号中对此有记载，后者的全部公开内容援引并入本说明书。因此，与未修饰的脂质体相比，被调理作用抑制部分修饰过的脂质体能够保留在血液循环中的时间显著更长。出于以上理由，这样的脂质体有时也被称为“隐形”(stealth)脂质体。已知隐形脂质体蓄积在依靠多孔性或“渗漏性”微血管系统供给的组织中。因此， 在以这样的微血管系统缺损为特征的靶组织，例如实体瘤中，这些脂质体会高效率地蓄积。参见 Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988，18 :6949_53。此外，RES 的摄入的减少阻止隐形脂质体在肝脏和脾脏中的显著蓄积，从而降低隐形脂质体的毒性。因此，用调理作用抑制部分修饰的本发明的脂质体能够将本发明的双链分子输送至肿瘤细胞。适用于修饰脂质体的调理作用抑制部分优选为分子量约500 约40，000道尔顿、更优选约2，000 约20，000道尔顿的水溶性聚合物。这样的聚合物中包括聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯； 合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直链状、分枝状或者树状聚酰胺胺 (polyamidoamine)；聚丙烯酸；聚醇(polyalchohols)，诸如化学结合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖醇，以及神经节苷脂，诸如神经节苷脂GM115 PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共聚体也是适合的。此外，抑制调理作用的聚合物可以是PEG与聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚亚乙基胺或者多核苷酸中的任何一种的嵌段共聚物。抑制调理作用的聚合物也可以是含有氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明质酸、果胶酸、神经氨酸、海藻酸、角叉胶；氨基化多糖类或寡糖(直链状或者分枝状)；或者羧基化的多糖或寡糖，例如，通过与碳酸的衍生物反应而生成了羧基结合的羧基化多糖类或寡糖。优选地，调理作用抑制部分为PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修饰的脂质体有时称为“PEG化脂质体”。调理作用抑制部分可以通过许多公知技术中的任何一种结合到脂质体膜上。例如，PEG的N-羟基琥珀酰亚胺酯能够与磷脂酰乙醇胺脂溶性锚(lipid-soluble anchor)结合，然后再结合到膜上。相似地，可以通过还原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性锚来将右旋糖酐聚合物衍生化，所述还原性氨基化中使用Na (CN) BH3和混合溶剂，如60°C的四氢呋喃与水的30 12比例混合物。下项中讨论了表达本发明的双链分子的载体。这样的表达至少一种本发明的双链分子的载体也可以直接施用或者与合适的投递试剂组合施用，所述合适的投递试剂包括 Mirus Transit LTl 亲脂性试剂、Lipofectin、Lipofectamine、Cellfectin、聚阳离子(例如聚赖氨酸)或脂质体。将表达本发明的双链分子的重组病毒载体输送到患者的癌症区域的方法在本技术领域的技术范围内。本发明的双链分子可以通过适于将双链分子递送到癌症部位的任何手段来施用给受试者。例如，双链分子可以通过基因枪、电穿孔、或者其它合适的非消化道或肠内施用途径来施用。合适的肠内施用途径包括口腔、直肠、或鼻内递送。合适的非消化道施用途径包括膀胱内和血管内施用(例如静脉内推注、静脉内输注、动脉内推注、动脉内输注和针对血管网络的导管滴注)，组织周围和组织内注射(例如肿瘤周围和肿瘤内注射)，皮下注射或沉积，包括皮下输注(例如利用浸透压泵)，直接施加到癌症部位或其附近的区域，例如借助导管或其它放置装置(例如，包含多孔性、非多孔性或明胶状材料的栓剂或植入物)，和吸入。优选通过注射或输注将双链分子或载体施用到癌症部位或其附近。本发明的双链分子可以以单一剂量或分多个剂量来施用。当本发明的双链分子的施用为输注方式时，输注可以是单个持续剂量，或者通过多次输注来施用。优选的是将作用剂直接注射到癌症部位或其附近的组织中。特别优选的是将作用剂多次注射到癌症部位或其附近的组织中。本领域技术人员可以容易地确定用于对给定受试者施用本发明双链分子的合适剂量方案。例如，双链分子可以一次性施用给受试者，例如以单次注射或者沉积的形式施用到癌症部位或其附近。或者，双链分子可以在约3 约28日、更优选约7 约10日的期间内每日一次或二次地施用给受试者。在优选的剂量方案中，双链分子可以在7日期间内一日一次地注射到癌症部位或其附近。当剂量方案包括多次施用时，应该理解的是，给受试者施用的双链分子的有效量，可以包含在整个剂量方案中施用的该双链分子的总量。在本发明中，可以用至少一种选自下组的活性成分来治疗过表达ADAMTS18的癌症(a)本发明的双链分子，(b)编码它们的DNA，和(c)编码它们的载体。要治疗的癌症的例子包括但不限于肺癌和食管癌。因而，在施用本发明的双链分子作为活性成分之前，优选确认要治疗的癌细胞或组织中ADAMTS18的表达水平是否与相同器官的正常细胞相比升高。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗(过)表达 ADAMTS18的癌症的方法，该方法可包括下列步骤i)检测自具有要治疗的癌症的受试者获得的癌细胞或组织中ADAMTS18的表达水平；ii)将所述ADAMTS18表达水平与正常对照比较；并iii)对具有与正常对照相比过表达ADAMTS18的癌症的受试者施用至少一种选自下组的成分(a)本发明的双链分子，(b)编码它们的DNA，和(c)编码它们的载体。或者，本发明还提供了一种药物组合物，其包含至少一种选自下组的成分，用于施用于具有过表达ADAMTS18的癌症的受试者(a)本发明的双链分子，(b)编码它们的DNA，和(c)编码它们的载体。换言之，本发明进一步提供了一种用于鉴定要用下述各项治疗的受试者的方法(a)本发明的双链分子，(b)编码它们的DNA，或(c)编码它们的载体，该方法可包括测定源自受试者的癌细胞或组织中ADAMTS18的表达水平的步骤， 其中所述水平与该基因正常对照相比的升高指示该受试者具有可用本发明的双链分子治
疗的癌症。下面会更加详细地描述本发明治疗癌症的方法。要用本方法治疗的受试者优选为哺乳动物。例示性的哺乳动物包括但不仅限于例如人类、非人灵长类、小鼠、大鼠、犬、猫、马、和牛。
根据本发明，测定在自受试者获得的癌细胞或组织中ADAMTS18的表达水平。使用本领域已知方法，可在转录(核酸)产物水平上确定表达水平。举例而言，可使用杂交方法 (例如Northern杂交)、芯片或阵列、探针、RT-PCT来测定ADAMTS18的转录产物水平。或者，可以检测翻译产物以进行本发明的治疗。例如，可以确定观察到的蛋白(SEQ ID NO 2)的量。作为另一种基于ADAMTS18基因的翻译产物检测其表达水平的方法，可利用针对 ADAMTS18蛋白的抗体通过免疫组织化学分析测量染色的强度。意即，在此测量中，强染色表明所述蛋白质的存在/水平增加，且同时表明ADAMTS18基因的高表达水平。用于检测或测量ADAMTS18多肽和/或编码它的多核苷酸的方法如上文(I.诊断癌症)例示的。VII.双链分子和编码它们的载体在本文中，证明了包括SEQ ID NO :11或12之任一序列的siRNA阻抑表达 ADAMTS18基因的细胞生长或细胞存活力。因此，认为包括任何这些序列的双链分子和表达该分子的载体充当用于治疗或预防涉及ADAMTS18基因表达细胞增殖的疾病，例如癌症，特别是肺癌和食管癌的优选药物。如此，依照一个方面，本发明提供了包括选自SEQ ID NO 11和12的靶序列的双链分子和表达该分子的载体。更具体地，本发明提供了在导入表达 ADAMTS18基因的细胞中时，抑制该基因表达的双链分子，其中该双链分子包括有义链和反义链，其中该有义链包括选自SEQ ID N0:11和12的核苷酸序列作为靶序列，且该反义链包括与该有义链的靶序列互补的核苷酸序列，使得该有义和反义链彼此杂交以形成该双链分子。或者，本发明提供了在导入表达ADAMTS18基因的细胞中时，抑制该基因表达的双链分子，其中该双链分子具有有义链和反义链，其中该有义链具有与选自SEQ ID N0:11和12的靶序列对应的核苷酸序列，且该反义链具有与该有义链的靶序列互补的核苷酸序列，使得该有义和反义链彼此杂交以形成该双链分子。有义链中所包括的ADAMTS18基因的靶序列可以由SEQ ID NO 1的一部分的序列组成，所述一部分少于约500、400、300、200、100、75、50或25个连续核苷酸。优选地，靶序列可以是来自核苷酸序列SEQ ID NO 1的约19至约25个连续核苷酸。本发明不限于此， 但合适的靶序列包括选自SEQ ID NO 11和12的核苷酸序列。本发明的双链分子可以由两个多核苷酸构建体构成，即一个包括有义链的多核苷酸和一个包括该反义链的多核苷酸。或者，该分子可以由一个多核苷酸构建体构成；即一个包括有义链和反义链二者的多核苷酸，其中有义和反义链经单链多核苷酸连接，从而能够通过形成发夹结构而导致有义和反义链内靶序列的杂交。在本文中，单链多核苷酸也可称作“环序列”或“单链”。连接有义和反义链的单链多核苷酸可以由3至23个核苷酸组成。 关于本发明双链分子的更多详情见“V-2.包括双链分子的药物组合物”项下。本发明中所述双链分子可包含一个或更多个修饰核苷酸和/或非磷酸二酯连接。本领域众所周知的化学修饰具有增加所述双链分子的稳定性、可用性和/或细胞摄入的能力。一般技术人员明白本发明分子可包含的其它类型的化学修饰(W003/070744 ； W02005/045037)。在一个实施方案中，可使用修饰以提供改善的抗降解性或改善的摄入。上述修饰的例子包括硫代磷酸酯联接、2’ -0-甲基核糖核苷酸(特别是在双链分子的有义链上)、2’ -脱氧-氟代核糖核苷酸、2’ -脱氧核糖核苷酸、“通用碱基”核苷酸、5’ -C-甲基核苷酸以及倒转脱氧脱碱基残基的掺入(US20060122137)。在另一个实施方案中，可以使用修饰来增强双链分子的稳定性或增加寻靶效率。 修饰包括双链分子两条互补链之间的化学交联、双链分子一条链的3’或5’末端的化学修饰、糖修饰、核碱基修饰和/或骨架修饰、2-氟代修饰的核糖核苷酸和2’-脱氧核糖核苷酸 (W02004/029212)。在另一个实施方案中，修饰可以用于增加或减少针对靶mRNA中和/或互补双链分子链中互补核苷酸的亲和力(W02005/044976)。例如，未修饰的嘧啶核苷酸可以用2-硫、5-炔基(5-alkynyl)、5-甲基或5-丙炔基(5-propynyl)嘧啶替代。另外，未修饰的嘌呤可以用7-脱氮(7-deZa)、7-烷基或7-烯基嘌呤取代。在另一个实施方案中，当双链分子是具有3’突出端的双链分子时，可以把3’ -末端核苷酸的突出核苷酸替换成脱氧核糖核苷酸(Elbashir SM 等，Genes Dev 2001 Jan 15，15 (2) :188-200)。关于进一步的细节，可以利用公开文献如US20060234970。本发明不限于这些实例，可以将任何已知化学修饰应用于本发明的双链分子，只要所得分子保留抑制靶基因表达的能力。此外，本发明的双链分子可以包含DNA和RNA 二者，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。 具体而言，由DNA链与RNA链形成的杂合多核苷酸或DNA-RNA嵌合体多核苷酸表现出提高的稳定性。可以形成DNA和RNA的混合，即由DNA链(多核苷酸)和RNA链(多核苷酸) 组成的杂合型双链分子、或在任一单链(多核苷酸)或两条单链(多核苷酸)上同时包含 DNA和RNA的嵌合型双链分子，诸如此类，来增强所述双链分子的稳定性。DNA链和RNA链的杂合体可以是这样的杂合体，其中有义链是DNA而反义链是RNA，或者相反，只要它在导入表达靶基因的细胞中后具有抑制该基因表达的活性。优选地，有义链多核苷酸是DNA而反义链多核苷酸是RNA。同样，嵌合型双链分子可以是这样的分子，其中有义链和反义链均由DNA和RNA组成，或者有义链或反义链中的任一条由DNA和RNA组成，只要在导入表达靶基因的细胞中时，所述双链分子具有抑制该基因表达的活性即可。为了提高双链分子的稳定性，分子中优选包含尽可能多的DNA;而为了诱导靶基因的表达抑制，要求分子在一定范围内是RNA，以充分地诱导表达抑制。作为嵌合型双链分子的一个优选实例，双链分子的上游部分区域(即位于有义链或反义链内的靶序列或其互补序列之侧翼的区域)为RNA。所述上游部分区表示有义链的5’侧(5’端)和反义链的 3’侧(3’端)。就是说，在优选实施方案中，反义链3’末端侧翼的区域由RNA组成，或者有义链5’末端侧翼的区域和反义链3’末端侧翼的区域均由RNA组成。例如，本发明的嵌合型或杂合型双链分子包含以下组合。有义链5，_[—DNA—]_3，3，-(RNA)-[DNA]-5，反义链，有义链5，-(RNA)-[DNA]-3，3，-(RNA)-[DNA]-5，反义链，和有义链5，-(RNA)-[DNA]-3，
3，_(—RNA)_5，反义链。上游部分区优选是由9-13个核苷酸组成的域，从双链分子的有义链或反义链内的靶序列或其互补序列的末端算起。此外，这种嵌合型双链分子的优选实例包括这样的实例链长为19-21个核苷酸，其中多核苷酸的至少上游的半区(对于有义链为5’侧区域而对于反义链为3’侧区域)是RNA，而另一半是DNA。在这样的嵌合型双链分子中，抑制靶基因表达的效果比反义链整体为RNA时强得多(US20050004064)。在本发明的背景中，双链分子可以形成发夹结构，例如短发夹RNA(ShRNA)以及由 DNA与RNA组成的短发夹(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是RNA序列或RNA和DNA的混合序列，其形成紧密的发夹转弯，可以用来通过RNA干扰来沉默基因表达。shRNA或shD/R-NA 在单一链上包含有义靶标序列和反义靶标序列，其中所述序列被环序列隔开。通常，发夹结构被细胞机制切割成dsRNA或dsD/R-NA，所述dsRNA或dsD/R-NA进一步与RNA诱导的沉默复合物(RISC)结合。这种复合物结合并切割与所述dsRNA或dsD/R-NA的靶标序列匹配的 mRNA。或者，本发明提供了包括具有有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸的组合中的每一种的载体，其中所述有义链核酸包括SEQ ID NOs: 11或12的核苷酸序列，且所述反义链核酸由与有义链互补的序列组成，其中所述有义链和所述反义链的转录物彼此杂交以形成双链分子，且其中所述载体在导入表达ADAMTS18的细胞中时抑制所述基因表达。优选地， 多核苷酸的有义链是长度介于约19个和约25个核苷酸之间的寡核苷酸(例如来自SEQ ID NO :1的核苷酸序列的连续核苷酸)。更优选地，多核苷酸组合包括单一核苷酸转录物， 其具有经单链核苷酸序列连接的有义链和反义链。更优选地，多核苷酸的组合具有通式 5，-[A]-[B]-[A，]-3，或 5，-[A，]-[B]-[A]-3，，其中[A]包含 SEQ ID N0:11 或 12 的核苷酸序列，[B]为由约3至约23个核苷酸组成的核苷酸序列，而[A’]为互补于[A]的核苷酸序列。本发明的载体可通过下述方法生成例如，将ADAMTS18序列克隆入表达载体中， 使调控序列可操作性地连接于ADAMTS18序列，以允许两条链的表达(通过DNA分子的转录)(Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002 May, 20 (5) :500-5)。例如，与 mRNA 反义的 RNA 分子由第一启动子(例如位于克隆DNA的3’末端侧翼的启动子序列)转录，对mRNA而言为有义链RNA分子由第二启动子(例如位于克隆DNA的5’末端侧翼的启动子序列)转录。 有义和反义链在体内杂交，产生用于沉默该基因的双链分子构建体。或者，使用分别编码双链分子之有义链和反义链的两个载体构建体来分别表达有义链和反义链，随后形成双链分子构建体。而且，克隆的序列可编码具有二级结构(例如发夹)的构建体，即，载体的单一转录物同时包含靶基因的有义序列和互补反义序列二者。也可以配置本发明的载体使得其实现在靶细胞的基因组中的稳定插入(关于同源重组盒载体的说明，参见Thomas KR&Capecchi MR, Cell 1987，51 :503-12)。可以参考例如=Wolff 等，Science 1990,247 :1465-8 ；美国专利第 5，580，859 号、第 5，589，466 号、第 5，804，566 号、第 5，739，118 号、第 5，736，524 号、第 5，679，647 号和 WO 98/04720。基于 DNA的输送技术的例子包括“裸DNA”、辅助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介导型) 输送、阳离子脂质复合体、和粒子介导型投递(“基因枪”)或压力介导型输送(例如参照美国专利第5，922，687号)。本发明的载体包括，例如，病毒载体或细菌载体。表达载体的例子包括牛痘或鸡痘等减毒病毒宿主(参照美国专利第4，722，848号)。该策略涉及例如使用牛痘病毒作为载体来表达编码双链分子的核苷酸序列。重组牛痘病毒在被导入表达靶基因的细胞时即表达该分子并由此抑制细胞的增殖。可使用的载体的其它例子包括卡介苗(BCG)。BCG载体在 Mover等，Nature 1991，351 :456-60中有记载。其它多种多样的载体可用于双链分子的治疗性施用与生产，例子包括腺病毒载体和腺随伴病毒载体、逆转录病毒载体、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)载体、脱毒的炭疽毒素载体等。可以参照例如Siata等，Mol Med Today 2000，6 :66-71 ;Shedlock 等，J Leukoc Biol 2000，68 :793-806 ；以及 Hipp 等，In Vivo 2000，14 :571-85。下面，本发明将参考实施例进行更加详细的说明。然而，下面的材料、方法和实施例仅仅是举例说明本发明的多个方面，并不意图对本发明的范围进行限制。因此，与这里所述相似或等同的方法和材料也可以用于实施或测试本发明。
实施例材料和方法细胞系和组织样品。此项研究中使用的15种人肺癌细胞系包括5种腺癌(ADC ；NCI-H1781, NCI-H1373，LC319，A549 和 PC-14)，5 种鳞状细胞癌(SCC ；SK-MES-1，NCI-H520，NCI-H1703， NCI-H2170 和 LU61)，1 种大细胞癌(LCC ；LXl)，和 4 种小细胞肺癌(SCLC ；SBC-3，SBC-5， DMS 114和DMS273)。此项研究中使用的10种人食管癌细胞系如下9种SCC细胞系(TE1， TE2，TE3，TE4，TE5，TE6，TE8，TE9JPTE10)和 1 种 ADC 细胞系(TE7) (Nishihira T，et al. J Cancer Res Clin Oncol 1993 ；119 :441-9.) 所有细胞在补充有 10%胎牛血清(FCS)的适宜培养基中以单层培养并在含5% CO2的增湿空气中于37°C维持。用作正常对照的人小气道上皮细胞(SAEC)在经过优化的培养基(Cambrex Bioscience, Inc)中培养。原发性肺癌和 ESCC 样品早前在知情同意下获得(Kikuchi T5Daigo Y，Katagiri T，et al. Oncogene 2003 ；22 :2192-205, Taniwaki Μ, Daigo Y, Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006 ；29 567-75, Yamabuki Τ, Daigo Y, Kato Τ,et al. Int J Oncol 2006 ;28 :1375—84)。半定量RT-PCR。使用随机弓I物(Roche Diagnostics)禾口 Superscript II (Invitrogen) 来自每份样品的总共3微克mRNA等份试样逆转录成单链cDNA。半定量RT-PCR实验用下述各组对人上皮细胞转化序列2(ADAMTS18)特异性的合成引物或用作为内部对照的β-肌动蛋白(ACTB)特异性引物进行ADAMTS18，5，-GGATTAGCCAGCTCAGCATA-3，(SEQ ID NO 3)禾口 5，-CTGTTTTTCAGAAGGCAACG-3，(SEQ ID NO 4) ；ACTB，5，-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3，(SEQ ID NO 5)和 5，-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3，(SEQ ID NO :6)。对 PCR 反应优化循环数以确保产物强度在扩增的线性期内。Northern 印迹分析。将涵盖23种组织的人多组织印迹(BD Bioscience)与ADAMTS18的[α -32P] -dCTP 标记的 226-bp PCR 产物(其使用引物 5' -TAGGGCAACATGGACTGTTTAAG-3 ‘ (SEQ ID N0:
517)和 5' -GCTGTGTTTTGTCATTTAGCTCC-3‘ (SEQ ID NO:8)制备成探针)杂交。预杂交、杂交、和清洗遵循制造商的说明书实施。将印迹于-80°C用增强屏放射自显影7天。RNA干扰测定。为了评价ADAMTS18在癌细胞中的生物学功能，使用针对靶基因的短发夹RNA。用于RNAi的合成寡核苷酸的靶序列如下对照1 (增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)，维多利亚水母(Aequorea victoria) GFP的突变体)， 5，-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3，(SEQ ID NO :9)；对照 2(萤光素酶(LUC)萤火虫 (Photinus pyralis)萤光素酶基因)，5，-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3，(SEQ ID NO: 10)； si-ADAMTS 18-#1,5' -GCCAGUAUCUCAAGAAAUU-3‘ (SEQ ID NO :11) ;si_ADAMTS18-#2，和 5' -GGGCACAACUUUGGUAUGA-3‘ (SEQ ID 而1幻。将 DMS114 和 TE4 细胞涂布到 ΙΟ-cm 盘上(每个盘1. 5xl06个细胞)，并使用24微升Lipofectamine 2000 (Invitrogen)依照制造商的指令用siRNA寡核苷酸(IOOnM)转染。温育7天后，这些细胞通过吉姆萨溶液染色以评估集落形成，并通过溴化3- ，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5_ 二苯基四唑(MTT)测定评估细胞数。ADAMTS18表达质粒的制备。为了调查ADAMTS18的生物学功能，制备了表达ADAMTS18全长片段的带p3XFLAG 标签(C端)的质粒。Western 印迹。将细胞在裂解缓冲液中裂解；50mmol/LTris-HCl (pH 8. 0), 150mmol/LNaCl, 0. 5% NP40,0. 5%脱氧胆酸钠，和蛋白酶抑制剂混合物组III(Calbiochem)。通过Bio-fcid 蛋白质测定系统(Bio-Rad)来测定每份裂解物的蛋白质含量，以牛血清白蛋白(BSA)作为标准品。每份裂解物取10微克在5-15%变性聚丙烯酰胺凝胶(带4%聚丙烯酰胺积层凝胶)上解析并电泳转移至硝酸纤维素膜(GE Healthcare Bio-sciences)。用TBST中的 5%无脂奶粉封闭后，膜与家兔中生成的抗FLAG抗体(SIGMA) —起于室温温育1小时。将免疫反应性蛋白质与缀合有辣根过氧化物酶的二抗(GE Healthcare Bio-sciences) 一起于室温温育1小时。用TBST清洗后，反应物使用增强型化学发光试剂盒(GE Healthcare Bio-sciences)显色。将细胞培养液应用于^festern印迹时，在以1，OOOXg，4°C离心10-15 分钟后收集上清液。然后，使用Amicon Ultra_15离心过滤装置(MILLIP0RE)依照制造商的指令浓缩上清液。细胞生长测定。将用表达ADAMTS18的带p3XFLAG标签(C端)的质粒或用模拟质粒转染的C0S-7 和A549细胞接种到6孔微量滴度板上(IxlO4个细胞/孔)。温育7天后，使用细胞计数试剂盒依照供应商(Wako)的指导评估这些细胞。N-糖苷酶测定。如上所述收获用表达ADAMTS18的带p3XFLAG标签(C端)的质粒或用模拟质粒转染的C0S-7细胞，并将每份样品与N-糖苷酶F(CALBIOCHEM)混合。于37°C温育16小时后， 实施Western印迹分析。免疫细胞化学分析。将细胞涂布到玻璃盖玻片(Becton Dickinson Labware)上，用4%低聚甲醛固定，并通过用含0.1 ^Triton X-100的PBS于室温处理3分钟使得可透。通过用 CASBLOCK(ZYMED)于室温处理10分钟来阻断非特异性结合。然后将细胞与含1 % BSA的 PBS中稀释的家兔中生成的抗FLAG抗体(SIGMA) —起于室温温育60分钟。用PBS清洗后， 将细胞用FITC缀合的二抗(SantaCruz)于室温染色60分钟。再次用PBS清洗后，每份标本用 Vectashield (Vector Laboratories)含有 4'，6_ 二脉 _2_ 苯基吲哚二盐酸盐(DAPI) 封固并用 Spectral 共焦扫描系统(TSC SP2A0BS, Leica Microsystems)显现。Matrigel 侵袭测定。将用表达ADAMTS18的带p3XFLAG标签(C端)的质粒或用模拟质粒转染的C0S-7 细胞在含有10% FCS的DMEM中培养至接近汇合。通过胰蛋白酶消化来收获细胞，在不添加血清或蛋白酶抑制剂的DMEM中清洗，并以IxlO5个细胞/ml的浓度在DMEM中悬浮。在制备细胞悬浮液之前，将干的Matrigel基质层(Becton Dickinson Labware)用DMEM于室温复水2小时。向24孔Matrigel侵袭室的每个下室中加入含有10% FCS的DMEM(0. 75ml)， 并向上室的每个插片中加入0.5ml (切104个细胞)细胞悬浮液。将插片的板于37°C温育 M小时。温育后，处理小室；将侵袭穿过Matrigel的细胞固定并用遵循供应商(Becton Dickinson Labware)的指导进行吉姆萨染色。在相同的时间点检查细胞生长测定。接着， 将用si-ADMTS18-#l或对照(EGFP)转染的DMSl 14细胞在转染M小时后接种在Matrigel 侵袭室中，并如上所述检查细胞侵袭。基质金属蛋白酶测定。制备两类细胞；将用表达ADAMTS18的带p3XFLAG标签(C端)的质粒或用模拟质粒转染的C0S-7细胞在含有10% FCS的DMEM中培养至接近汇合，而将用si-ADAMTS 18_#1 或用对照I(EGFP)转染的DMS114细胞温育48小时。然后，收集细胞培养液的上清液，并于4°C以1，OOOXg离心10-15分钟。收集上清液并使用knsoLyte 570通用测定试剂盒 (AnaSpec)依照制造商的指导检查基质金属蛋白酶(MMP)活性。将含有MMP的样品与ImM 4-氨基苯基乙酸汞一起温育2小时以活化MMP。混合样品和通用MMP底物(含有MMP_1，2， 7，8，9，10，13和14的底物)并启动酶促反应，于室温温育30分钟。用酶标仪(Microplate Reader)测量荧光强度。结果肺癌和食管癌和正常组织中的ADAMTS18表达。使用由27，648种基因或表达序列标签组成的cDNA微阵列对101例肺癌(86例 NSCLC和15例小细胞肺癌)和19例ESCC，以及30种正常器官进行了基因组范围表达谱 ^ff (Kikuchi T, Daigo Y, Katagiri T, et al. Oncogene 2003 ；22 :2192-205, Kakiuchi S, Daigo Y, Tsunoda T, et al. Mol Cancer Res 2003 ； 1 :485-99, Kakiuchi S, Daigo Y, Ishikawa N,et al. Hum Mol Genet 2004 ； 13 :3029-43,Kikuchi Τ,Daigo Y,Ishikawa N,et al.Int J Oncol 2006 ；28 :799-805,Taniwaki Μ,Daigo Y,Ishikawa N, et al. Int J Oncol 2006 ；29 :567-75, Yamabuki Τ, Daigo Y, Kato Τ, et al. Int J Oncol 2006;28:1375-84)。 鉴定出ADAMTS18转录物在绝大多数检查的肺癌和食管癌样品的癌细胞中表达升高(> =3 倍)。此外，在除睾丸外的四种正常组织中均没有观察到ADAMTS18表达(数据未显示)。 因此，认为ADAMTS18是用于进一步分析的较好分子候选。通过半定量RT-PCR实验在检查的7/15份肺癌组织、2/15份肺癌细胞系、5/10份ESCC组织、和1/10种ESCC细胞系中确认了它的过表达(图IA和1B)。在5名ESCC患者中，还比较了 ESCC组织及其正常食管组织之间的ADAMTS18表达(

图1C)。在所检查的23种正常人组织中使用ADAMTS18cDNA作为探针进行Northern印迹分析，仅在胎盘中鉴定出6. Ο-kb转录物(图1D)。ADAMTS18的小干扰RNA对癌细胞生长的抑制。为了评估ADAMTS18是否对肺癌和食管癌细胞的生长或存活至关重要，使用针对 ADAMTS18的siRNA的合成寡核苷酸，将其转染入内源表达高水平的ADAMTS18的DMSl 14 和TE4细胞。用si-ADAMTS 18-#1或-#2转染的细胞中ADAMTS 18_mRNA水平与用对照 siRNA转染的细胞相比显著降低(图2，顶部小图)。MTT测定和集落形成测定揭示了用 si-ADAMTS18-#l或-#2转染的细胞的数目的显著降低(图2，中部和底部小图)。外源ADAMTS18对细胞生长的影响。为了评估ADAMTS18在肿瘤发生中的潜在作用，制备了设计成表达ADAMTS18的质粒(pCAGGSn3FC-ADAMTS18)并转染入 C0S-7 细胞。通过 1Western 印迹确认了 ADAMTS18 表达(图3A，左边小图)后，进行了 MTT测定，发现C0S-7-ADAMTS18细胞的生长与用模拟载体转染的C0S-7细胞相比得到了显著程度的促进(图3A，右边小图)。接着，与C0S-7细胞一样转染A549细胞，显示外源ADAMTS18促进了 A549的细胞生长(图。ADAMTS18的翻译后修饰。为了检查外源ADAMTS18的翻译后修饰，实施了 N-糖苷酶测定。与N-糖苷酶一起温育后，Western印迹分析揭示了外源ADAMTS18蛋白的条带向下移动(图4A)。结果提示 ADAMTS18可能在翻译后发生N-糖基化。外源ADAMTS18蛋白的亚细胞定位。为了检查外源ADAMTS18蛋白的亚细胞定位，使用抗FLAG实施了免疫细胞化学分析。转染后72小时，外源ADAMTS18蛋白位于C0S-7细胞的细胞质(图4B)。ADAMTS18蛋白的定位看上去像颗粒状图样。它可能是分泌囊泡。外源ADAMTS18蛋白向培养基中的分泌。ADAMTS18被推测是分泌型蛋白质，所以使用不表达或很低地表达ADAMTS18的 C0S-7细胞来过表达ADAMTS18，以评估ADAMTS18蛋白向培养基中的分泌(图4C)。ADAMTS18 转染后48小时，更换培养基。然后，在转染后72小时时，收获培养基。离心后，浓缩培养基并应用于Wfestern印迹分析。外源ADAMTS18蛋白表现为分泌入培养基(图4D)。ADAMTS18对哺乳动物细胞侵袭的激活。因为ADAMTS18含有金属蛋白酶域，它消化ECM(细胞外基质)，所以使用哺乳动物细胞(C0S-7)通过Matrigel测定检查ADAMTS18在细胞侵袭中的可能作用。与模拟载体用转染的细胞相比，将ADAMTSlScDNA转染入细胞中显著增强了它们穿过Matrigel的侵袭活性(图5A)。而且，在与Matrigel测定同一时间点实施的细胞生长测定没有揭示它们之间的显著差异(图5B)。这个结果独立地提示ADAMTS18可能有助于癌细胞高度恶性的表型。ADAMTS18 的 MMP 活性。由于ADAMTS18含有金属蛋白酶域且具有细胞侵袭效应，通过MMP测定评估了 ADAMTS18的MMP活性。与用模拟载体转染的细胞相比，用ADAMTS18表达质粒转染的C0S-7 细胞显著增强了 MMP活性(图5C)。相反，与用对照SiRNA(EGFP)转染的细胞相比，用 si-ADAMTS 18-#1转染的肺癌细胞(DMS114)显著显示降低的MMP活性(图5D)。这些结果提示ADAMTS18可能拥有MMP活性且有助于癌细胞侵袭。碰通过激光显微解剖富集癌细胞后，使用含有27，648种基因的cDNA微阵列对101 例肺癌和19例ESCC实施了基因组范围表达谱分析。作为该分析的结果，鉴定出一些基因， 它们可能是用于开发新的诊断标志物、治疗性药物、和/或免疫疗法的潜在较好候选者，而且发现ADAMTS18在大多数肺癌和食管癌样品中频繁反式激活，而且它的基因产物在癌细胞的生长和进展中发挥不可缺少的作用。ADAM蛋白质家族，一种MMP相关金属蛋白酶家族，是涉及其它跨膜蛋白的蛋白水解加工、细胞粘附和细胞信号传导事件的多功能蛋白质(Mochizuki S and Okada Y. Cancer Sci 2007;98:621-8)。许多跨膜蛋白通过一个或多个蛋白水解步骤被加工成生物学活性构造。例子包括生长因子(诸如EGF,HB-EGF和TGF- α )和细胞因子(诸如TNF- α )，它们都是作为前体合成的。另外，有一些细胞表面受体在跨膜域附近被切割，该过程称作胞外域脱落(ectodomain shedding)。这些包括 TNF-α 受体-I、TNF-α 受体-II、CD44，L-选择蛋白和Erb4/HER4。这些受体的可溶性的、被释放的胞外域可以是响应于配体活化而发生的下调的一部分，或者它们可以具有它们自己的功能。在过去几年里已探明ADAM在这些过程中发挥主要作用。恶性肿瘤的关键特征是它们侵袭周围组织、到达血管和淋巴系统、和通过转移性传播而播撒至远端器官的能力。越来越多的证据证明蛋白水解酶诸如基质金属蛋白酶 (MMP)和密切相关的ADAM(解联蛋白和金属蛋白酶)和ADAMTS(具有血小板反应蛋白基序的解联蛋白和金属蛋白酶)在癌症发生和进展中的至关重要的作用。虽然关于ADAM和 ADAMTS在癌症中的功能的信息仍然有限，最近的研究提供了不同类型的癌症中各种ADAM 和ADAMTS失调的证据。因此，这些蛋白质引起了许多研究组的注意，而且以近来其中某些蛋白质的缺陷小鼠的产生为基础，人们正在进行ADAM和ADAMTS的功能分析。在本发明中，ADAMTS18被表征为涉及肺癌和食管癌的新的癌蛋白。评估了 ADAMTS18对癌细胞生长和/或存活的重要性。用阻抑ADAMTS18表达的特异性siRNA处理两种癌细胞导致了癌细胞生长的抑制。还获得了其他支持ADAMTS18在癌发生中的意义的证据。将外源ADAMTS18导入哺乳动物C0S-7细胞和A549肺癌细胞中导致对细胞生长的显著促进。另外，将外源ADAMTS18导入C0S-7细胞中激活了细胞侵袭。正如预期的，ADAMTS18 被分泌到培养基中，并且可能具有MMP活性。这些结果强烈提示ADAMTS18有可能对癌细胞生长和侵袭发挥重要作用，且可能导致肿瘤发生和转移。因为特定ADAM表现出促进癌症启动和进展，所以可合理预测阻断它们的作用会减缓或阻止肿瘤进展。在最近几年，针对少数 ADAM 的一些选择性合成抑制剂已有记载(Duffy MJ, McKiernan E，0&apos ；Donovan N, and McGowan PM. Clin Cancer Res 2009;15:1140-4)。因为 ADAMTS18 被正确归类为典型的癌症-胎盘抗原之一，所以用小分子化合物选择性抑制ADAMTS18酶活性是一种有希望的治疗策略，预期具有强有力的抗癌症生物学活性且不利事件的风险最低。总之，本文中的数据有助于设计特异性靶向ADAMTS18致瘤活性的新抗癌药物，用于治疗癌症患者。ADAMTS18被鉴定为新颖潜在治疗靶，用于具有肺癌和食管癌的患者。工业应用性本文中描述的使用基因组范围cDNA微阵列的癌症的基因表达分析鉴定出特定基因作为癌症预防和治疗的靶。基于ADAMTS18基因的差异表达，本发明提供用于诊断或检测癌症，特别是肺癌和食管癌的分子诊断标志物。本文中提供的数据增加对癌症的综合理解，便于开发新颖诊断策略，并为鉴定治疗药和预防剂的分子靶提供线索。此类信息有助于更加深刻地理解肿瘤发生，并为开发用于诊断、治疗、和最终预防癌症的新策略提供指标。如本文中证明的，细胞生长受到特异性靶向ADAMTS18基因的双链分子阻抑。因此，这些新双链分子可实际用作抗癌药物。ADAMTS18基因的表达在癌症，特别是肺癌和食管癌中与正常器官相比显著升高。 因而，此基因可方便地实际用作癌症，特别是肺癌和食管癌的诊断标志物，而且由其编码的蛋白可用于癌症的诊断测定。另外，本文中描述的方法可用于诊断癌症，包括肺癌和食管癌。此外，本发明提供用于治疗癌症，包括肺癌和食管癌的新治疗办法。ADAMTS18基因可实际用作用于开发抗癌药物的有用的靶。通过述及完整收录本文中引用的所有专利、专利申请、和出版物。另外，虽然已经详细地且参照其具体实施方案描述本发明，要理解的是，前面的描述在性质上是例示性的和解释性的，而且意图例示本发明及其优选实施方案。通过常规实验，本领域技术人员会容易地认识到可以在其中进行各种改变和修改，不偏离本发明的精神和范围。如此，本发明意图不受上文描述限定，而是由所附权利要求及其等同方案限定。
权利要求
1.一种用于在受试者中检测或诊断癌症或发生癌症的倾向性的方法，包括测定源自受试者的生物样品中ADAMTS18基因的表达水平的步骤，其中所述表达水平与所述基因的正常对照水平相比的升高指示所述受试者罹患或有风险发生癌症，其中所述表达水平是通过任何选自下组的方法测定的(a)检测ADAMTS18 基因的 mRNA ；(b)检测由ADAMTS18基因编码的蛋白质；和(c)检测由ADAMTS18基因编码的蛋白质的生物学活性。
2.权利要求I的方法，其中所述表达水平比该正常对照水平高至少10%。
3.权利要求I或2的方法，其中该生物学活性为细胞增殖活性、N-糖基化活性、侵袭活性或基质金属蛋白酶(MMP)活性。
4.一种筛选用于治疗或预防癌症的候选物质的方法，其中所述方法包括下述步骤(a)使测试物质与ADAMTS18多肽或其片段接触；(b)检测该多肽或片段和该测试物质之间的结合；并(c)选择结合该多肽或片段的测试物质作为用于治疗或预防癌症的候选物质。
5.一种筛选用于治疗或预防癌症的候选物质的方法，其中所述方法包括下述步骤(a)使测试物质与ADAMTS18多肽或其片段接触；(b)检测该多肽或片段的生物学活性；(c)将该多肽或片段的生物学活性与在该物质不存在时检测到的生物学活性比较；和(d)选择阻抑该多肽的生物学活性的测试物质作为用于治疗或预防癌症的候选物质。
6.权利要求5的方法，其中该生物学活性为细胞增殖活性、N-糖基化活性、侵袭活性或基质金属蛋白酶(MMP)活性。
7.一种筛选用于治疗或预防癌症的候选物质的方法，其包括下述步骤(a)使测试物质与表达ADAMTS18基因的细胞接触；(b)检测ADAMTS18基因的表达水平；(c)将该表达水平与在该测试物质不存在时检测到的表达水平比较；并(d)选择降低该表达水平的测试物质作为用于治疗或预防癌症的候选物质。
8.一种筛选用于治疗或预防癌症的候选物质的方法，其中所述方法包括下述步骤(a)使测试物质与其中导入有载体的细胞接触，该载体包含ADAMTS18基因的转录调节区和在该转录调节区控制下表达的报告基因；(b)测量所述报告基因的表达水平或活性；(c)将该表达水平或活性与在该测试物质不存在时检测到的表达水平或活性比较；并(d)选择降低该表达水平或活性的测试物质作为用于治疗或预防癌症的候选物质。
9.一种双链分子，其在导入表达ADAMTS18基因的细胞中时抑制该基因的表达，其中该双链分子包含有义链和反义链，其中该有义链包含与选自SEQ ID NO : 11和12的靶序列对应的核苷酸序列，且该反义链包含与该有义链的靶序列互补的核苷酸序列，使得该有义和反义链彼此杂交以形成该双链分子。
10.权利要求9的双链分子，其中该有义链与反义链在该靶序列处杂交以形成长度为 19-25个核苷酸对的所述双链分子。
11.权利要求9或10的双链分子，其中所述双链分子为单一多核苷酸构建体，该单一多核苷酸构建体包含经由单链连接的所述有义链和所述反义链。
12.权利要求11的双链分子，其具有通式5’_[A]-[B]-[A，]_3，，其中[A]为有义链， 其包含与选自SEQ ID NO 11和12的靶序列对应的核苷酸序列，[B]为单链且由3至23个核苷酸组成，且[A’]为反义链，其包含与选自SEQ ID NO 11和12的靶序列互补的核苷酸序列。
13.—种载体，其编码权利要求9至12任一项的双链分子。
14.载体，它们包含包括有义链核酸和反义链核酸的多核苷酸组合中的每一种，其中所述有义链核酸包含与SEQ ID NO : 11或12对应的核苷酸序列，且所述反义链核酸由与该有义链互补的序列组成，其中所述有义链和所述反义链的转录物彼此杂交以形成双链分子， 且其中所述载体在导入表达ADAMTS18基因的细胞中时抑制细胞增殖。
15.一种在受试者中治疗或预防癌症的方法，包括对所述受试者施用药学有效量的针对ADAMTS18基因的双链分子或编码所述双链分子的载体，其中该双链分子抑制ADAMTS18 基因的表达。
16.权利要求15的方法，其中该双链分子为权利要求9至12中任一项的双链分子。
17.权利要求15的方法，其中该载体为权利要求13或14的载体。
18.权利要求I至8和15至17中任一项的方法，其中该癌症选自肺癌和食管癌。
19.一种用于治疗或预防癌症的组合物，该组合物包含药学有效量的针对ADAMTS18基因的双链分子或包含所述双链分子的载体，其中该双链分子抑制ADAMTS18基因的表达，和可药用的担载体。
20.权利要求19的组合物，其中该双链分子为权利要求9至12中任一项的双链分子。
21.权利要求19的组合物，其中该载体为权利要求13或14的载体。
22.权利要求19至21中任一项的组合物，其中该癌症选自肺癌和食管癌。
23.一种用于诊断或检测癌症的试剂盒，其包含用于检测ADAMTS18基因的转录或翻译产物的试剂。
24.权利要求23的试剂盒，其中该试剂包含结合ADAMTS18基因的转录产物的核酸或结合ADAMTS18基因的翻译产物的抗体。
25.用于诊断或检测癌症的试剂，其包含结合ADAMTS18基因的转录产物的核酸或结合 ADAMTS18基因的翻译产物的抗体。
26.权利要求23或24的试剂盒或权利要求25的试剂，其中该癌症选自肺癌和食管癌。
全文摘要
本发明提供用于检测和诊断癌症的方法，此方法涉及测定ADAMTS18基因的表达水平。发现此基因可区分癌细胞与正常细胞。另外，本发明提供筛选可用于治疗癌症的治疗剂的方法和用于治疗癌症的方法。此外，本发明提供靶向ADAMTS18的双链分子，其均有望可用于治疗癌症。
文档编号A61K38/00GK102597235SQ20108004803
公开日2012年7月18日 申请日期2010年8月23日 优先权日2009年8月24日
发明者中村佑辅, 角田卓也, 醍醐弥太郎 申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司