丹参酮ⅱa或其药物学上可接受的盐在制备治疗或预防肺高血压疾病药物中的应用的制作方法

专利名称：丹参酮ⅱa或其药物学上可接受的盐在制备治疗或预防肺高血压疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及丹参酮IIA的新应用，尤其是涉及丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐在制备治疗或预防肺高血压疾病药物中的应用。
背景技术：
肺高血压病具有病因复杂、发病率高、误诊率高、危害性强、死亡率高的特点，其主要临床表现为平均肺动脉大于或等于25mmHg。肺高血压早期常无明显自觉症状，有时虽然肺动脉高压已引起右心室肥厚及慢性高压性肺源性心脏病，但症状并不一定显著，而多在 20 40岁间才逐渐出现气急、乏力、呼吸困难或有咯血、心悸、声音嘶哑等症状。由于心排血量降低，可有四肢寒冷、脉搏细小、周围性紫绀、心绞痛、晕厥等，紫绀在早期常不严重，但在有右至左分流的情况下却可出现显著的紫绀。传统治疗的方法包括抗凝、地高辛和吸氧， 但是效果都不理想。丹参为唇形科植物丹参feidix Salvia Miltiorrhiza bge.的干燥根及根茎，始载于《神农本草经》，味苦，性微寒，具有破症除瘕，止烦满，益气等功效，列为上品，归心、肝二经，历代本草均有收载。丹参酮IIA，是从中药丹参中提取出的有效单体，其分子式是 C19H18O3,目前临床主要应用于治疗心血管疾病方面，具有抗动脉粥样硬化、抑制左心室肥厚、抗心肌缺氧、改善血管平滑肌状态、抗心律失常等作用。

发明内容
本发明的目的在于提供丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐的新用途，即丹参酮 IIA及其衍生物在制药中的新应用。具体地，本发明目的在于提供丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐作为制备治疗或预防肺高血压疾病的药物中的应用。而肺高血压疾病根据不同的病因分为以下几种不同的类型1 肺动脉高压病；2 左心疾病相关性肺动脉高压病；3 与呼吸系统疾病和/或缺氧相关的肺高血压病；4 慢性血栓栓塞性肺高血压病；5 未明确的多种因素所致肺高血压病。尽管上述几种类型的肺高血压疾病的发病机理不同，但是经发明人研究发现，它们都会导致肺高血压病患者的上气道阻塞，从而造成肺组织的慢性缺氧，此机制被认为是肺部血管收缩增强和血管重塑的主要诱因。研究发现，肺小动脉的异常增生和持续性血管收缩是造成肺高血压的重要因素，而肺血管平滑肌细胞内Ca2+浓度失衡是肺高血压发病的关键因素，正是由于细胞内游离钙浓度的增加引起细胞收缩及平滑肌细胞增殖，从而引起肺血管的压力持续性升高，造成血管重塑，最终导致肺高血压。而细胞内Ca2+浓度的增加主要是通过以下几种途径(1)细胞内肌浆网释放Ca2+ ；⑵Ca2+从细胞外液通过L型电压依赖Ca2+通道(VDCC)，受体操纵性Ca2+ 通道(ROCC)以及钙池操纵性Ca2+通道(SOCC)进入细胞内。经发明人研究发现低氧时SOCC 上调才是引起平滑肌细胞内钙离子失衡的主要原因。
本发明人通过实验发现，丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够抑制低氧引起的细胞内钙浓度升高、作用于SOCC通道降低细胞内钙离子浓度、能通过影响TRPC6mRNA的表达而影响细胞内钙离子浓度、能降低肺动脉高压模型大鼠肺动脉平滑肌组织上TRPCl蛋白的表达、有效降低肺动脉高压模型大鼠肺动脉平滑肌组织上TRPC6蛋白的表达、有效降低肺动脉高压模型大鼠右心室压以及有效抑制肺动脉高压大鼠模型的右心代偿性增生以及能够降低低氧性肺动脉高压大鼠模型的肺小血管平滑肌层的病理改变，说明丹参酮IIA 或其药物学上可接受的盐能够用于治疗上述各类型的肺高血压疾病。因此实际上，本发明涉及丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐作为制备治疗或预防肺动脉高压病的药物中的应用。涉及丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐作为制备治疗或预防左心疾病相关性肺动脉高压病的药物中的应用。涉及丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐作为制备治疗或预防与呼吸系统疾病和/或缺氧相关的肺高血压病的药物中的应用。涉及丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐作为制备治疗或预防慢性血栓栓塞性肺高血压病的药物中的应用。涉及丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐作为制备治疗或预防未明确的多种因素所致肺高血压病的药物中的应用。本发明所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐可单独使用或以药物组合物的形式使用，所述的药物组合物包括丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐类以及药物载体。所述的药物组合物中还可以包括丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐类以及药物载体与前列环素及其类似物(如依前列醇)、内皮素-1受体拈抗剂(如波生坦)及5型磷酸二酯酶抑制剂(如西地那非)中的一种或多种组成的治疗肺高血压疾病的药物组合。所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐的治疗有效量是为个体给药后产生降低细胞内钙离子浓度和降低肺动脉压等活性作用的剂量。而给予个体单剂或多剂量时， 给药剂量根据多种因素而不同，包括丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐的药代动力学性质、给药途径、患者情况何特性(性别、年龄、体重、健康情况、体型)、症状程度、并存的治疗、治疗频率和期望的效果。通常情况下，所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐单独用药即可达到治疗的效果。所述丹参酮IIA或其衍生物作为活性成分作用于个体的每次剂量为40 SOmg/ 次，一天两次，就可达到显著降低细胞内钙离子浓度、降低肺动脉压、抑制肺动脉高压导致的右心代偿性增生和降低肺小血管平滑肌层的病理改变的期望的有效治疗效果。所述的丹参酮IIA及其药物学上可接受的盐可由多种途径进行个体给药，给药途径包括口服、静脉注射等。相应地，所述的丹参酮IIA或其衍生物可以与可药用载体制备成口服制剂和注射剂。其中，口服制剂包括片剂、胶囊剂、微胶囊剂、软胶囊剂、颗粒剂、滴丸、 口服液和散剂。注射剂包括静脉注射剂和粉针剂。还可以根据剂型需要可配以不同的可药用载体，同时可加入抗氧化剂、乳化剂、稳定剂和防霉剂。本发明的有益效果如下1.本发明对已知化合物丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
2.丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐对肺高血压有良好的治疗作用，安全性良好，具有很好的应用前景。而丹参酮IIA及其药物学上可接受的盐类与目前临床上用的治疗肺高血压的药物相比，价格便宜，极具市场前景。


图1是用钙离子实时显像技术方法检测丹参酮IIA对原代培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞内基础钙的影响，P < 0. 05，有统计学意义。图2是用钙离子实时显像技术方法检测丹参酮IIA对原代培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞内SOCE峰值的影响，P < 0. 01，有统计学意义。图3是用RT-PCR方法检测丹参酮IIA对原代培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞内 TRPClmRNA表达量的影响，P < 0. 05，有统计学意义。图4是用RT-PCR方法检测丹参酮IIA对原代培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞内 TRPC6mRNA表达量的影响，P < 0. 05，有统计学意义。图5用western-blot方法检测丹参酮IIA对肺动脉高压大鼠模型肺动脉平滑肌组织上TRPCl蛋白表达量的影响，P < 0. 05，有统计学意义。图6用western-blot方法检测丹参酮IIA对肺动脉高压大鼠模型肺动脉平滑肌组织上TRPC6蛋白表达量的影响，P < 0. 05，有统计学意义。图7用western-blot方法检测丹参酮IIA对肺动脉高压大鼠模型肺动脉平滑肌组织上TRPC1、TRPC6的蛋白表达电泳图。图8是用丹参酮IIA进行药物干预对肺动脉高压大鼠模型右心室平均压的影响， P<0. 05，有统计学意义。图9是用丹参酮IIA进行药物干预对肺动脉高压大鼠模型右心肥厚指数的影响， P <0.01，有统计学意义。图10是用丹参酮IIA进行药物干预对肺动脉高压大鼠模型肺组织HE染色结果A 常氧对照组的大鼠肺组织切片HE染色结果，箭头示肺小动脉，管壁未见增生， 管腔未见狭窄；B 常氧上药组的大鼠肺组织切片HE染色结果，箭头示肺小动脉，与常氧对照组未见差异；C 低氧(10% O2)对照组的大鼠肺组织切片HE染色结果，箭头示肺小动脉，可见肺小动脉管壁和平滑肌层明显增厚，管腔狭窄；D 低氧(10% O2)上药组的大鼠肺组织切片HE染色结果，肺形态学变化与低氧对照组比较明显减轻。
具体实施例方式以下通过实施例进行说明丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐在医药领域中的新用途，但是以下实施例仅用于说明本发明的目的，并不限制本发明的保护范围。实施例一丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够抑制低氧引起的细胞内钙浓
度升高材料及方法
一、主要实验材料1、SPF级SD大鼠体重200g_250g，广东省实验动物中心2、低糖DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、I型胶原酶美国 Gibico公司3、木瓜蛋白酶、大鼠α-actin单抗Sigma公司4、戊巴比妥钠广州化学二厂5、Cy3标记羊抗大鼠IgG Jackson公司6、Fura_2 荧光染料Invitrogen 公司二、主要仪器1、钙离子荧光影像系统=InCyt Iml 公司2、荧光倒置显微镜=Nikon公司3、微量移液器Gilson公司三、实验方法1、肺动脉平滑肌细胞的原代培养无菌操作取SD大鼠心肺组织，置于4°C平衡盐溶液(Hank' s Balanced Salt Solution, HBSS) 0清洗去血渍，体式显微镜下用显微器械分离出肺微小动脉。仔细剥除动脉外膜(纤维脂肪层)，后将血管条纵向剪开，内面朝上用弯头小镊子自上而下刮除内膜。 将中膜组织置于消化液(消化液成分为1750U/ml I型胶原酶，9. 5U/ml木瓜蛋白酶，2mg/ml 牛血清白蛋白，ImM 二硫苏糖醇，溶于无钙离子的HBSS液)中在35 37°C消化15-20min， 至组织块松软、边缘发毛，呈一定程度的破碎状；加入10%胎牛血清的低糖DMEM培养基中和消化液，离心，吸除上清液，加PBS清洗1次并离心，吸除上清液，再加入新的混合培养基， 使细胞悬浮于培养基中，调整细胞密度为1 2 X IO5细胞/ml并种植于培养板，置于37°C、 5% CO2培养箱内静置培养，3-4天后换培养液，当细胞生长至对数生长期，即完成原代细胞培养，获得原代培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞。2、低氧细胞模型的制作将培养获得的大鼠肺动脉平滑肌细胞分为四组常氧对照组细胞，常氧上药组， 低氧对照组和低氧上药组，其中低氧对照组和低氧上药组置于低氧细胞培养箱(37°C、5% CO2,4% O2)培养60小时。常氧上药组和低氧上药组均用10mg/L丹参酮IIA磺酸钠进行药物干预，常氧对照组和低氧对照组加生理盐水。3、测细胞内钙离子浓度测钙前将各组得到的原代肺动脉平滑肌细胞用0. 3%血清培养基培养M小时后， 加入5μΜ Fura-2,37°C,5% CO2孵育1小时，用钙离子荧光影像系统对细胞内钙浓度进行测量。试验结果如图1所示，常氧对照组细胞基础钙为130. 63士 16. 06nM，常氧上药组细胞基础钙为98. 05士 10. 91nM;低氧对照组细胞基础钙(4% 02,60h)为237. 12士40. 13nM， 低氧上药组细胞基础钙(4% 02，60h，10mg/L丹参酮IIA磺酸钠)为103. 05士20. 20nM。结论丹参酮IIA能够抑制低氧引起的细胞内基础钙浓度的升高。实施例二丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够作用于SOCC通道降低细胞内钙离子浓度
材料及方法一、主要实验材料1、SPF级SD大鼠体重200g_250g，广东省实验动物中心2、低糖DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、I型胶原酶美国 Gibico公司3、戊巴比妥钠广州化学二厂4、木瓜蛋白酶、CPA、硝苯地平Sigma公司5、Fura_2 荧光染料Invitrogen 公司二、主要仪器1、钙离子荧光影像系统InCyt Iml 公司2、荧光倒置显微镜=Nikon公司3、微量移液器Gilson公司三、实验方法1、肺动脉平滑肌细胞的原代培养同实施例一。2、低氧细胞模型的制作同实施例一。3、测细胞内SOCE的变化测钙前将各组得到的原代肺动脉平滑肌细胞用0. 3%血清培养基培养M小时后， 加入5 μ M Fura-2, 37°C,5% CO2孵育1小时，依次用有钙的HPSS液灌流细胞5分钟，无钙的含5uM硝苯地平和IOuM CPA的HPSS液灌流细胞lOmin，有钙的含5uM硝苯地平和IOuM CPA的HPSS液灌流细胞lOmin，有钙的HPSS液灌流细胞10分钟，然后用钙离子荧光影像系统对细胞内钙浓度变化进行实时测量，分析丹参酮IIA对细胞SOCE变化的影响。试验结果如图2所示，常氧对照组细胞SOCE峰值为196. 64士Μ. 44nM，常氧上药组细胞SOCE峰值为143. 82 士 13. 20ηΜ，低氧对照组细胞02，60h，生理盐水)SOCE峰值为307. 12士5. 47nM，低氧上药组细胞(4% 02，60h，10mg/L丹参酮IIA磺酸钠)SOCE峰值为 119.01士19. 36nM。结论丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够抑制低氧时SOCE的上调，说明丹参酮能够作用于SOCC通道降低细胞内钙离子浓度。实施例三丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐通过影响TRPClmRNA的表达而影响细胞内钙离子浓度材料及方法一、主要实验材料1、SPF级SD大鼠体重200g_250g，广东省实验动物中心2、戊巴比妥钠广州化学二厂3、低糖DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、I型胶原酶美国 Gibico公司5、木瓜蛋白酶Sigma公司6、Trizol :Invitrogen 公司
7、PrimeScript RT reagent Kit／aKaRa公司
8、SsoFast gvaGreen SupermixBiorad公司
二、主要仪器
l、微量移液器Gilson公司
2、普通PCR仪、CgX96荧光定量PCR仪Biorad公司
三、实验方法
l、肺动脉平滑肌细胞的原代培养
同实施例一。
2、低氧细胞模型的制作
方法与实施例一相同，常氧上药组和低氧上药组均用5mg／L丹参酮IIA磺酸钠进行药物干预，常氧对照组和低氧对照组加生理盐水。
3、检测细胞中／RPCImRNA表达的差异
按照／rizol操作手册提取培养的各组细胞的总RNA，然后进行逆转录，获得cDNA，逆转录过程如下
反应体系(20u1)
5~PrimerScript Buffer4ulPrimerScript R丁Enzyme Mix 1 lulOligo Dt PrimerlulRamdom 6 merslulRNase Free dH203ul[o1oo]RNA1000ng(10u1)
将反应体系吹打混匀，
反应条件
37℃反应15min，再在85℃下反应5sec。
以／RPCI的引物进行R／一PCR检测
大鼠TRPCI引物正义链序列5’一AGCCTCTTGACAAACGAGGA一3’[o106] 反义链序列5’一ACCTGACATCTGTCCGAACC一3’[o107] 反应体系(15u1)
SsoFast EvaGreen superMix (2x)7.5ul
上游引物(IOuM)0.6ul
下游引物(IOuM)0.6ul
cDNA2ul
H2O4.3ul将反应体系吹打均勻，95°C下变性:3min。反应条件95°C变性 5sec ；60°C变性 15sec，共 40 个循环。试验结果如图3所示，常氧上药组相对于常氧对照组TRPClmRNA的表达量为 97. 92士9. 03，低氧对照组相对于常氧对照组的表达量为178. 86士9. 79，低氧上药组 02，60h，5mg/L丹参酮IIA磺酸钠)相对于常氧对照组的表达量为87. 16士6. 40。结论丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够降低肺动脉高压细胞模型 TRPClmRNA的表达，TRPClmRNA通过翻译成TRPCl蛋白，而TRPCl蛋白是SOCC钙通道的组成蛋白，则丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够通过影响TRPClmRNA的表达而影响细胞内钙离子浓度。实施例四丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够通过影响TRPC6mRNA的表达而影响细胞内钙离子浓度材料及方法一、主要实验材料同实施例三。二、主要仪器同实施例三。三、实验方法1、肺动脉平滑肌细胞的原代培养同实施例一。2、低氧细胞模型的制作同实施例三。3、检测细胞中TRPClmRNA表达的差异反应系统及条件同实施例三。大鼠TRPC6 引物正义链序列5' -TACTGGTGTGCTCCTTGCAG-3 ‘反义链序列5'-GAGCTTGGTGCCTTCAAATC-3‘。试验结果如图4所示，常氧上药组相对于常氧对照组TRPC6mRNA的表达量为 126. 10士26. 31，低氧对照组(4% 02，60h)相对于常氧对照组的表达量为176. 78士 19. 96， 低氧上药组02，60h，5mg/L丹参酮IIA磺酸钠)相对于常氧对照组的表达量为 101. 37 士 7. 32。结论丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够降低肺动脉高压细胞模型TRPC6mRNA的表达，TRPC6mRNA通过翻译成TRPC6蛋白，而TRPC6蛋白是SOCC钙通道的组成蛋白，则丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够通过影响TRPC6mRNA的表达而影响细胞内钙离子浓度。实施例五丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够有效降低肺动脉高压模型大鼠肺动脉平滑肌组织上TRPCl蛋白的表达一、主要实验材料1、兔抗大鼠TRPCl —抗美国Sanda公司2、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig-G 二抗大连博瑞德公司3、预染蛋白分子量Marker 美国BIO-RAD公司4、RIPA细胞裂解液中国碧云天生物技术研究所5、DC蛋白浓度测定试剂盒美国BIO-RAD公司6、兔抗大鼠actin抗体美国Sigma公司二、主要仪器1、电泳仪美国BIO-RAD公司2、转膜仪美国BIO-RAD公司三、实验方法1、低氧性肺动脉高压大鼠模型的制作将大鼠分为常氧对照组、常氧上药组、低氧对照组和低氧上药组。常氧对照组和常氧上药组在正常饲养环境饲养，低氧对照组和低氧上药组动物置于低氧动物饲养箱内，在 10% O2浓度下饲养21天。常氧上药组和低氧上药组每天腹腔注射30mg/kg体重丹参酮IIA 磺酸钠，常氧对照组和低氧对照组给予相同剂量的生理盐水。2、肺血管平滑肌组织总蛋白的提取依据分组分别处死实验大鼠，显微分离实验动物肺血管平滑肌层。将平滑肌组织加入蛋白裂解液(预冷)的EP管中，超声粉碎后12000rpm 4°C离心20min取上清。上述操作均在冰上进行，以避免蛋白降解。蛋白浓度以DC分析法确定。3、样品蛋白浓度的测定采用DC显色法，按照DC蛋白浓度测定试剂盒的操作手册进行测定。4、Western blotting(1)制备10%的SDS-聚丙烯酰胺分离胶将下列试剂的混合液加入边条约2mm的两块玻璃制胶板中间，使液面达加样梳下缘约Icm处，缓慢加入一层无水乙醇，室温静置待其凝胶自然聚合凝集。
丙烯酰胺贮液2.5 ml分离胶缓冲液2.5 ml去离子水4.85 ml10%SDSIOOul10%过硫酸胺50 ulTEMED5ul
分离胶聚合后小心倾弃上层的无水乙醇，去离子水冲洗数次后用滤纸小心吸干， 再注入浓缩胶。(2)制备4%浓缩胶
丙烯酰胺贮液500ul浓缩胶缓冲液1.26 ml去离子水3.16 ml10%SDS50ul10%过硫酸胺25ulTEMED5ul上述混合液体注入两层玻璃板之间后，小心插入加样梳，室温静置，待其聚合后小心拔去加样梳，用电泳缓冲液冲洗加样孔数次以免孔中残留有凝胶。(3)样品处理取含等量蛋白的各组样本，分别加入含β-巯基乙醇的2X蛋白上样缓冲液混勻， 于沸水中煮5分钟后迅速放入冰中使蛋白变性。(4)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamidedel gelelectrophoresis, SDS-PAGE)样品蛋白用SDS-PAGE分离。电泳先用恒压80V，当溴酚蓝行至浓缩胶与分离胶交界处时，将电压调至100V继续电泳，在溴酚兰接近分离胶底部时结束电泳。(5)转膜将凝胶上已被电泳分离的蛋白电转至硝酸纤维素膜上。卸下胶板，切取含有被分离样品蛋白的分离胶部分，将滤纸6张和硝酸纤维素膜剪成与胶大小一致，浸于转移缓冲液中，约lOmin，依次从上到下放置滤纸3张、SDS-PAGE凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸3张，用玻璃棒赶走各层之间的气泡，放好电极板，进行湿式电转移。(6)封闭转移完毕后的膜用5%牛血清封闭过夜。(7)杂交与洗膜封闭后的膜与单克隆兔抗小鼠TRPC6(I抗)4°C杂交孵育lh，再与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体(二抗)室温孵育杂交lh。抗体均用抗体缓冲液适当稀释，杂交时轻摇抗体使之与膜均勻、充分接触，每次杂交完毕均用TTBS洗去残余未结合抗体。(8)化学发光与曝光将硝酸纤维素膜浸于DAB显色液中，于暗处观察，观察有清晰的特异条带出现时， 用大量的水冲洗硝酸纤维素膜以终止显色反应。5、结果条带分析用凝胶成像系统将琼脂糖电泳图和Western blotting曝光胶片进行图像扫描及条带光密度半定量分析。为消除扫描和分析中的误差，重复三次该过程，采用SPASS13.0软件分析结果，组间比较采用单因素方差分析，P < 0. 05认为有统计学意义。试验结果如图5、图7所示，常氧上药组相对于常氧对照组TRPCl蛋白的表达量为1.02士0. 11，低氧对照组(10% 02，21天)相对于常氧对照组的表达量为1.91 士0. 11， 低氧上药组(10% O2, 21天，30mg/kg丹参酮IIA磺酸钠)相对于常氧对照组的表达量为 1. 43 士 0. 12。结论丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够降低肺动脉高压模型大鼠肺动脉平滑肌组织上TRPCl蛋白的表达，TRPCl蛋白是SOCC钙通道的重要组成蛋白，则丹参酮IIA 或其药物学上可接受的盐能够通过影响TRPCl蛋白的表达而影响肺动脉血管的收缩和重塑。实施例六丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够有效降低肺动脉高压模型大鼠肺动脉平滑肌组织上TRPC6蛋白的表达—、主要实验材料1、兔抗大鼠TRPC6 —抗美国Sanda公司2、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig-G 二抗大连博瑞德公司3、预染蛋白分子量Marker 美国BIO-RAD公司4、RIPA细胞裂解液中国碧云天生物技术研究所5、DC蛋白浓度测定试剂盒美国BIO-RAD公司6、兔抗大鼠actin抗体美国Sigma公司二、主要仪器1、电泳仪美国BIO-RAD公司2、转膜仪美国BIO-RAD公司三、实验方法同实施例五。试验结果如图6、图7所示，常氧上药组相对于常氧对照组TRPC6蛋白的表达量为0. 97士0. 14，低氧对照组(10% 02，21天)相对于常氧对照组的表达量为2. 48士0. 14， 低氧上药组(10% O2, 21天，30mg/kg丹参酮IIA磺酸钠)相对于常氧对照组的表达量为 1. 72 士 0. 04。结论丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够降低肺动脉高压模型大鼠肺动脉平滑肌组织上TRPC6蛋白的表达，TRPC6蛋白是SOCC钙通道的重要组成蛋白，则丹参酮IIA 或其药物学上可接受的盐能够通过影响TRPC6蛋白的表达而影响肺动脉血管的收缩和重塑。实施例七丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够有效降低肺动脉高压模型大鼠右心室压材料及方法一、主要实验材料1、SPF级SD大鼠体重200g_250g，广东省实验动物中心2、戊巴比妥钠广州化学二厂3、肝素钠二、主要仪器1、16通道小动物生理仪BI0PAC公司2、小动物手术器械上海医疗器械有限公司手术器械厂
三、实验方法1、低氧性肺动脉高压大鼠模型的制作同实施例五。2、大鼠右心室压力的测量将实验大鼠进行麻醉，固定在小动物手术台上，剪开其颈部皮肤，钝性分离大鼠颈静脉，结扎远心端，剪开血管，用2mm 口径的硅胶管插入血管，进入右心室，连通压力换能器，用小动物生理仪对右心室压、心率进行测量。试验结果如图8所示，常氧对照组大鼠右心室平均血压为12. 04士0. 579mmHg, 常氧上药组大鼠右心室平均血压为12. 25 士0. 364mmHg，低氧对照组大鼠右心室平均血压为 26. 58 士0. 812mmHg，低氧上药组右心室平均血压为18. 43 士0. 369mmHg。结论丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够有效降低肺动脉高压模型大鼠右心室压，可以降低肺动脉高压大鼠肺动脉压。实施例八丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够有效抑制肺动脉高压大鼠模型的右心代偿性增生材料及方法一、主要实验材料1、SPF级SD大鼠体重200g_250g，广东省实验动物中心2、戊巴比妥钠广州化学二厂二、主要仪器1、分析天平梅特勒-托利多公司2、小动物手术器械上海医疗器械有限公司手术器械厂三、实验方法1、低氧性肺动脉高压大鼠模型的制作同实施例五。2、大鼠右心肥厚指数的测定取各实验组动物心脏，分离其右心室壁及左心室壁，洗去血污，吸干水分，进行精
确称量，右心室壁重量/左心室壁重量即为右心肥厚指数。试验结果如图9所示，常氧对照组大鼠右心肥厚指数为0. 士0.013，常氧上药组大鼠右心肥厚指数为0.沈士0. 012，低氧对照组大鼠右心肥厚指数为0. 55 士0. 016，低氧上药组右心肥厚指数为0. 39 士 0. 021。结论丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够有效抑制肺动脉高压大鼠模型的右心代偿性增生，防止右心的失代偿。实施例九丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够降低低氧性肺动脉高压大鼠模型的肺小血管平滑肌层的病理改变材料及方法一、主要实验材料1、SPF级SD大鼠体重200g_250g，广东省实验动物中心2、戊巴比妥钠广州化学二厂3、中性甲醛Sigma公司
4、苏木素广州化学试剂二厂5、伊红广州化学试剂二厂二、主要仪器1、Citadel 1000组织脱水机英国Shandon公司2、BM-II水浴式生物组织包埋机深圳新安毅达电子厂3、光学显微镜日本Olympus公司4、数码摄影一体化系统日本Nikon公司5、荧光倒置显微镜德国Leica公司三、实验方法1、低氧性肺动脉高压大鼠模型的制作同实施例五。2、大鼠肺组织病理学研究麻醉处死各组实验大鼠，分离气管，用4%多聚甲醛灌注全肺进行固定，取肺组织进行常规病理学切片处理，HE染色，显微镜下观察。病理标本的制备如下取大鼠肺组织置于4%的多聚甲醛固定1)脱水70%乙醇2h — 80%乙醇Ih — 95%乙醇Ih — 95%乙醇Ih —无水乙醇 2h —无水乙醇1. 5h —无水乙醇1. 5h ；2)透明二甲苯0. 5h — 二甲苯Ih — 二甲苯0. 5h3)浸蜡低温(50°C )浸蜡Ih —浸蜡Ih4)包埋浸蜡后的组织放入60°C石蜡中包埋5)切片4um连续切片6)摊片49°C温水中摊片7)烘片55°C 烘 20min8)透明和水化二甲苯IOmin — 二甲苯IOmin —无水乙醇5min —无水乙醇5min — 95%乙醇 5min — 80% 乙醇 5min — 70% 乙醇 5min —流水冲洗 IOmin9) HE 染色苏木素染色Imin —流水冲洗Imin — 1 %盐酸酒精脱色IOsec —流水冲洗IOmin — 伊红染色IOsec —流水冲洗IOmin — 55°C烘20min —中性树胶封片。试验结果如图10的A和B所示，常氧对照组和常氧上药组大鼠肺组织结构未有明显异常，肺小动脉内膜完整平滑，肌层无增厚；如图10的C和D所示低氧对照组可见肺小动脉管壁和平滑肌层明显增厚，管腔狭窄；低氧上药组的肺形态学变化与低氧对照组比较明显减轻。结论丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐能够降低低氧性肺动脉高压大鼠模型的肺小血管平滑肌层的病理改变，减轻肺动脉高压时肺血管的重塑。
权利要求
1.丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐在制备治疗或预防肺高血压疾病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐在制备治疗或预防肺高血压疾病药物中的应用，其特征是，所述的治疗或预防肺高血压疾病药物为治疗或预防肺动脉高压病药物。
3.根据权利要求1所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐在制备治疗或预防肺高血压疾病药物中的应用，其特征是，所述的治疗或预防肺高血压疾病药物为治疗或预防左心疾病相关性肺动脉高压病药物。
4.根据权利要求1所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐在制备治疗或预防肺高血压疾病药物中的应用，其特征是，所述的治疗或预防肺高血压疾病药物为治疗或预防与呼吸系统疾病和/或缺氧相关的肺高血压病药物。
5.根据权利要求1所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐在制备治疗或预防肺高血压疾病药物中的应用，其特征是，所述的治疗或预防肺高血压疾病药物为治疗或预防慢性血栓栓塞性肺高血压病药物。
6.根据权利要求1所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐在制备治疗或预防肺高血压疾病药物中的应用，其特征是，所述的治疗或预防肺高血压疾病药物为治疗或预防未明确的多种因素所致肺高血压病药物。
7.根据权利要求1 6任一权利要求所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐在制备治疗或预防肺高血压疾病药物中的应用，其特征是，所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐单独使用。
8.根据权利要求1 6任一权利要求所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐在制备治疗或预防肺高血压疾病药物中的应用，其特征是，所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐以药物组合物的形式使用，所述的药物组合物包括丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐以及药物载体。
9.根据权利要求8所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐在制备治疗或预防肺高血压疾病药物中的应用，其特征是，所述的药物组合物中还包括前列环素、内皮素-1受体拈抗剂及5型磷酸二酯酶抑制剂中的一种或两种以上的组合物。
10.根据权利要求1 6任一权利要求所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐在制备治疗或预防肺高血压疾病药物中的应用，其特征是，所述的丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐与可药用载体制备成口服制剂或注射剂。
全文摘要
本发明公开了丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐作为制备治疗或预防肺高血压疾病药物中的应用。丹参酮IIA或其药物学上可接受的盐对肺高血压有良好的治疗作用，安全性良好，具有很好的应用前景。而丹参酮IIA及其药物学上可接受的盐类与目前临床上用的治疗肺高血压的药物相比，价格便宜，极具市场前景。
文档编号A61P11/00GK102160866SQ201110092218
公开日2011年8月24日 申请日期2011年4月13日 优先权日2011年4月13日
发明者万利梅, 区焕桃, 卢文菊, 张丹丹, 王健, 陈豫钦 申请人:呼吸疾病国家重点实验室, 广州医学院第一附属医院