专利名称：人乳头瘤病毒药物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因工程方法制备技术领域，特别是来自人乳头瘤(HPV)的病毒样颗粒(VLPs)的药物组合物及其制备方法。
背景技术：
人乳头瘤病毒(HPV)是一类双链小分子DNA病毒，具有严格的种属特异性，主要感染人的皮肤和黏膜组织，引起相应部位上皮组织的增生性病变。在临床上，根据HPV亚型致病力大小或致癌危险性大小不同可将HPV分为低危型和高危型两大类。低危型HPV主要引起肛门皮肤及男性外生殖器、女性大小阴唇、尿道口、阴道下段的外生性疣类病变和低度子宫颈上皮内瘤，其病毒亚型主要有HPV6、11、30、39、42、43型及HPV44型。高危型HPV除可引起外生殖器疣外，更重要的是引起外生殖器癌、宫颈癌及高度子宫颈上皮内瘤，其病毒亚型主要有 HPV16、18、31、33、35、45、51、52、56、58 型和 HPV61 型。最新研究表明HPV除了直接导致子宫颈癌，还与支气管肺癌、直肠癌、口腔癌和皮肤癌有重大关系。根据国际卫生组织WHO的有关资料显示，除了导致子宫颈癌，HPV感染还能导致60%的皮肤癌，60%的食管癌，50%的肺癌、50%的乳腺癌、25%的口腔癌等人类重大疾病。HPV编码包括八个早期(El E7)和两个晚期(Li L2)基因，Ll蛋白是主要衣壳蛋白，并具有阳 60KDa的分子量，Ll蛋白或Ll和L2蛋白组合在酵母菌，昆虫细胞、哺乳动物细胞或细菌中的表达可以导致病毒样颗粒(VLPs)的自组装(参见Papillomaviruses Reviews Current Research on Papillomaviruses ；Lacey, ed. Leeds, UK :Leeds Medical Information, pp 101-12(1996))，VLPs形式上与真实的病毒体相似，并且一旦给予动物或人类，能够引起高滴度的中和抗体，由于VLPs不包含潜在致癌的病毒基因组，因此作为HPV 疫苗有很高的安全性。用HPV病毒样颗粒(VLPs)作为有潜力的疫苗预防HPV，在本领域是众所周知的。现已经证明，接种VLPs 二价HPV16和HPV18和四价HPV6、11、16和18的疫苗在患者体内产生免疫应答是有效的，但成功的疫苗不仅要求在机体内产生免疫应答，而且还可以有效地激发机体产生免疫记忆，当再次遇到病原体时，产生迅速而有效的免疫应答。免疫记忆的维持依赖于抗原特异性的细胞免疫与体液免疫。T淋巴细胞是抗原特异性细胞免疫系统的效应细胞，主要包括辅助性T细胞(⑶4+)和细胞毒性T细胞(CTL)(⑶8+)，二者在清除或控制感染的过程中发挥着重要的作用。CD4+T细胞主要发挥MHC-II类分子限制的辅助B淋巴细胞(TH2)产生抗体及产生与维持抗原特异性⑶8+T记忆细胞(THl)的作用.其调节活性主要包括(1)对B细胞的辅助作用，促进B细胞的抗体亚型转换，同源染色体突变及生发中心的B细胞分化为浆细胞与记忆性细胞；(2)⑶4+T细胞对naive⑶8+T细胞的辅助作用，促进其向效应性细胞和记忆性细胞分化，并维持功能状态；(3)CD4+T细胞对巨噬细胞和APCs的调节作用。而具有相对较短效应阶段的CD8+T细胞应答对靶细胞直接发挥MHC-I类分子限制的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)作用或是通过释放细胞因子来阻止病原体的生长和存活，其效应功能只有在抗原存在下才能发挥，可见抗原的存在是作为以即时开启方式存活的效应T细胞的开关。随着抗原的清除效应功能终止并形成记忆性CD8+T细胞，定位于病原体入侵的黏膜部位，当再次遇到抗原时既迅速发展成为效应细胞。体液免疫应答的多种成分在病原体感染的防御过程中发挥着不同的作用。由Bl群B细胞分化发育的浆细胞分泌多特异性抗体(自然抗体)，构成病原体感染防御的的第一道防线，这些抗体具有多种作用如在感染的初始阶段限制病原体的扩散，形成免疫复合物激活获得性免疫应答，被招募到生发中心及激活补体，同时起到连接天然免疫与获得性免疫的桥梁作用；由长寿命浆细胞分泌的记忆性抗体是第二道防线，主要分布在外周循环及黏膜部位，具有高亲和力与高特异性，可以更有效的防御病原体感染；记忆性B细胞构成免疫防御的第三道防线，发挥有两种作用，一方面当再次遇到抗原时产生迅速而有效的应答反应，另一方面作为长寿命浆细胞的支持系统，保持长寿命浆细胞数量的平衡。因此，现阶段开发的目标是在保持完整的VLPs构型的前提下，延长VLPs的保存期限，同时不仅要增强机体对VLPs的免疫应答，而且还要通过添加相关成分，激发机体对VLPs产生免疫记忆，并在患者体内产生长效免疫。佐剂是一类与抗原合用并能增强和调节抗原免疫应答的物质。在疫苗中添加佐剂可以使疫苗更好的发挥作用效果并提高保护效率，因此佐剂是疫苗研究中一个重要的环节。至今文献发表的新佐剂，约有数百种，不同的佐剂有不同促进免疫反应的机制。佐剂可以改变免疫系统的功能，影响细胞因子的产生和调节功能。有的佐剂可加强整个免疫系统的功能；多数佐剂则可以加强某些细胞因子的分泌或抑制。现已知人和鼠的免疫T细胞有Thl和Th2。Thl主要促进补体结合抗体和迟缓型过敏反应，相关的细胞因子有IFN-γ、IL-2、IL-12等；Th2促进循环抗体，分析型抗体，包括IgE的产生，相关细胞因子有IL-4、IL-5和IL-10等。有的佐剂可以加强Thl，有的佐剂加强Th2。虽然佐剂种类繁多，但并不是所有佐剂都适合人体使用。现阶段被批准上市的佐剂也只用几种。而且某种佐剂也只被批准用于某种特定的疫苗，并不意味着可用于其他疫苗。将传统佐剂用于新型疫苗，也不一定能起到良好的免疫效果，所有的新疫苗与佐剂的配伍必须经过严格的动物实验和人体临床实验，才能确定其是否具有实用价值。细胞因子是机体内免疫细胞或非免疫细胞产生的一组具有广泛生物学活性的异质性肽类调节因子，在体内能激活和调节免疫性细胞，对免疫应答的产生和调节具有重要作用。每种细胞因子的调节作用都具有多样性。目前，对各种细胞因子确定的作用机制虽然尚不清晰，但通过大量研究表明，细胞因子可以有效的刺激细胞免疫，与疫苗联合使用对机体产生良好的免疫促进作用。并且现阶段已经有多种细胞因子批准上市，在临床上使用多年，对其作用效果和不良反应比较明晰，将其作为疫苗的组分，被认为是安全可靠的。但细胞因子在体内半衰期短且造价昂贵，如与靶向抗原单独使用，其作用时间与机体免疫应答时间不同步，因此无法达到良好的免疫效果。如与传统佐剂联合使用，可以有效的避免自身的弊端，延长其在体内的半衰期，并可以减少用量。同时也可以有效的补充传统佐剂自身对机体的细胞免疫不足的缺陷。因此现阶段需要找到一种可长期保持HPV VLPs稳定性和增强其免疫原性的新的药物组合物，明确配伍关系，并且生产工艺简单，生产成本较低，对人体安全可靠是至关重要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种储存稳定并能起到长效免疫的人乳头瘤(HPV)病毒样颗粒(VLPs)的药物组合物及其应用。根据我们多次实验得出在VUs溶液中使用适宜的盐浓度、缓冲液和PH值能有效的防止VLPs的吸附，减少VLPs的聚集并增加其稳定性，并不影响其免疫原性，其中加入相关的细胞因子免疫促进剂可以显著性的增加该药物的免疫原性，使的该药物可以高效并持续的刺激人体自身免疫系统，产生高滴度的中和性抗体，并产生免疫记忆，从而达到对HPV所引起相关疾病的预防和治疗的目的。因此本发明使用的药物组合物，具有生产成本低，工艺简单，安全可靠等诸多优点。本发明的目的是这样实现的本发明提供了一种用于预防和治疗由HPV感染而导致相关疾病的人乳头瘤病毒药物组合物，它包括下述成份及用量范围组成(I)HPV病毒样颗粒(VLPs)吸附于佐剂，其VLPs浓度范围为10 60 μ g/ml ；(2)细胞因子免疫促进剂，其活性范围为1 5000万国际单位；(3)NaCl盐溶液，其浓度范围为0. IM 0. 4M ；(4) 一种注射用的缓冲液，其浓度范围5mM 20mM，保持疫苗的pH在5. 5 7. 5 ；(5)非离子表面活性剂，其浓度范围0. 0005% 0. 05% ；(6)以注射用水溶解。本发明根据需要，还加入药物组合物总量的0. 1 10%。pH调节剂。本发明所选用的免疫原性物质包括HPV6a、HPV6b、HPVll、HPV16、HPV18、HPV31或 HPV32的一种、二种或二种以上任意组合，及其他HPV亚型所形成的VLPs，由于形成机理相同，同样也适合本药物组合物。据研究表明其中各型的HPV VUs的最适含量为10 60 μ g/ ml，选择含量如低于10 μ g/ml，体内将无法产生高滴度的中和性抗体，从而无法达到长效免疫的目的。如要达到相同的免疫效果，需短期内频繁给药，这样不仅增加患者痛苦，反复免疫将降低机体的免疫力，从而破坏患者自身免疫系统。选择含量如高于60 μ g/ml，机体将出现轻微的不良反应，如高于100 μ g/ml，机体不良反应较严重。本发明所选用的佐剂包括铝佐剂、Ca3(P04)2、MF59、SAF、QS-21、3-0_去酰化单磷酸类脂(3D-MPL)、免疫刺激复合物(ISC0M)、聚丙乙交酯(PLG)、AGP、脂质A衍生物和CpG的一种、二种或二种以上任意组合。其中优选的佐剂为铝佐剂、ISCOM佐剂、3-0-去酰化单磷酸类脂(3D-MPL)佐剂、Cei3(PO4)2佐剂或MF59佐剂。铝佐剂的包含范围比较广泛，包括氢氧化铝(Al (OH)3)佐剂，磷酸铝(AlPO4)佐剂， 羟基磷酸铝佐剂，非晶形的羟基磷酸铝硫酸盐(AAiB)佐剂，明矾(KAl (SO4)-12H20)佐剂或纳米铝佐剂。长期以来，铝佐剂一直是疫苗上应用最广泛的佐剂，当以合适的剂量使用时，铝佐剂是被认为最为安全可靠的。现世界上大部分国家已经批准，将铝佐剂作为人用佐剂使用。 虽然现阶段铝佐剂的作用机理研究的还不是很清晰，但通常认为将抗原吸附在铝佐剂上， 铝佐剂可以有效的刺激体液免疫，产生更高滴度的IgG、IgE，激活Th2细胞。本发明的细胞因子免疫促进剂选自干扰素(IFN)，白细胞介素(IL)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或趋化因子(TCA)的一种、二种或二种以上任意组合。本发明所述的细胞因子免疫促进剂选自白细胞介素(IL)，其白细胞介素(IL)优
5选为白细胞介素(II)。本发明所述药物组合物的应用，其给药途径为皮内注射、皮下注射、皮下输液、肌内注射、静脉注射或静脉输液。本发明所选用的细胞因子免疫促进剂是一类由活化的免疫细胞(淋巴细胞、单核巨噬细胞等)和相关细胞(纤维细胞、内皮细胞等)产生的具有调节细胞功能的高活性、多功能蛋白质多肽分子或糖蛋白，它们通过与高亲和力的特异性受体相互作用，在体内能激活和调节免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能， 使机体在短时间内快速高效的产生高滴度的HPV中和性抗体和免疫记忆。与相关佐剂联合使用，可以有效的避免细胞因子在体内作用时间短，刺激不长久的避端。延长其在局部组织的存留时间，起到缓慢释放的作用。其中IL-2可以作用于多种细胞，包括T、B淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞等，对免疫应答具有广泛的上调作用。据研究表明将靶向抗原与IL-2肌肉注射小鼠体内，所得到的抗体滴度和CD4+T细胞增殖均提高100倍以上，体外检测脾细胞分泌的各种细胞因子的量， 发现IL-2大幅度地加强了 IFN- y、IL-2的分泌，而对IL-4只有轻微的加强，说明IL-2主要是加强了机体的Thl型免疫应答，并且有助于打破免疫耐受，一般认为大部分感染性疾病的预防及肿瘤的治疗，能够激发机体产生Thl型免疫应答的疫苗才是有效的，因此本专利优先选择将铝佐剂与IL-2联合使用。这样可以有效的弥补铝佐剂无法激活机体Thl细胞的缺陷。IL-12在体内主要参与细胞免疫应答，将靶向抗原与IL-12肌肉注入小鼠体内，T 细胞明显增加，CTL活性显著提高。但对体液免疫应答起到抑制作用，表现为抗体滴度下降和B细胞减少。GM-CSF在免疫应答反应中主要通过调节抗原递呈细胞的数量和功能来增强免疫应答强度。与靶向抗原一起注入小鼠体内，抗体的阳转率明显提高，经检测其特异性CD4+T 细胞的增殖和CTL活性均增强。IFN-Y主要通过参与Th细胞向Thl型分化来调节免疫应答，但对体液免疫应答呈抑制作用或无任何影响。TCA3是β趋化细胞因子家族中一员，能够募集和激活单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。与靶向抗原一起注入小鼠体内可以特异性CTL效应显著提高，使IgGh略有上升， 说明TCA3可以加强原诱生的Thl型免疫应答。本发明所选用的盐溶液为NaCl，此盐溶液的选择为本领域所公知，从机体的适应性考虑，最适盐浓度为0. 1 0. 2M,但据研究发现，增加盐溶液的离子强度可以提高HPV VLPs的稳定性和溶解度，进而有效的防止由于温度升高而导致的VLPs间的相互聚集。由于高盐浓度在注射剂中是受到限制的，因此从稳定性方面考虑，优选盐浓度为0. 25 0. 35M。 增加盐浓度虽然能解决上述问题，但高盐浓度的注射剂会导致血浆的渗透压紊乱，无法进行静脉途径给药，同样皮下、肌肉、腹腔途径给药时将增加人体的疼痛感。因此本专利优选药物组合物的盐浓度为HPV VLPs浓度低于100μ g/ml时选用等渗NaCl溶液，浓度为 0. 15M。HPV VLPs浓度高于200 μ g/ml时选用NaCl溶液浓度为0. 32M。本发明中所选用溶剂pH值在5. 5 7. 5的范围内，其HPV VLPs才能保持稳定并形成完整的空间构象。据研究表明，低PH值可以使高浓度HPV VUs之间带上相同电荷，减少聚集，避免聚沉而导致的蛋白变性，从而使疫苗失去免疫原性。因此本专利优选药物组合物的PH值为HPV VLPs浓度低于120 μ g/ml时选用pH值为6. 5 7. 5。HPV VLPs浓度高于180 μ g/ml时选用pH值为5. 5 6. 5。本发明中所选用的缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液，缓冲液的浓度为 5mM 20mM。磷酸盐缓冲液是本领域较常用的缓冲体系，其缓冲范围为pH值6 8。组氨酸缓冲液的缓冲范围为pH值5. 5 6. 5。据研究表明，磷酸盐缓冲液由于其产生的离子能与铝佐剂相互作用，导致疫苗注射剂的稳定性下降，因此其与铝佐剂不能同时使用。如需同时使用，需增加铝佐剂在药物组合物中的浓度。同时磷酸盐缓冲液在低温保存时，会导致磷酸盐的吸出，致使注射剂PH值漂移。高浓度HPV VUs会由于pH值的不稳定而聚沉。从而导致免疫原性下降。组氨酸缓冲液的缓冲范围适用于高浓度HPV VLPs的保存，低温不会引起缓冲体系的不稳定，因此本专利优选药物组合物的缓冲体系为HPV VUs浓度低于 130 μ g/ml时选用磷酸盐缓冲液。HPV VLPs浓度高于200 μ g/ml时选用组氨酸缓冲液。本发明中所选用的表面活性剂为非离子表面活性剂，其中包括聚山梨酯80 (如 TWEEN 80 )、聚山梨酯20 (如TWEEN 20 )。其中优选的活性剂为聚山梨酯80。据研究表明，聚山梨酯80不仅可以起到增加HPV VLPs在药物组合物中的溶解度，而且还能保护HPV VUs铝佐剂在运输的过程中，避免由于剧烈的震荡而导致的蛋白活性的降低。但由于过高浓度的聚山梨酯80在机体内会起到轻微的降压与溶血的作用，因此本专利优选聚山梨酯 80在药物组合物中的浓度范围为0. 0005% 0. 5% (重量/体积)。本发明的特点是应用本发明提供的方法，可以生产一种免疫原性好、相容性好、储存时间长且稳定的HPV多价疫苗。本发明还具有制备方法简单、生产成本低、应用效果好等特点。
图1为HPV16 VUs吸附在不同铝佐剂上，保存在2 8°C的条件下，不同药物组合物稳定性比较情况。图2为HPV18 VLPs与MPL混合，吸附在不同铝佐剂上，保存在2 8°C的条件下， 不同药物组合物稳定性比较情况。图3为HPV6 VLPs与ISCOMATRIX 混合，吸附在不同铝佐剂上，保存在2 8°C 的条件下，不同药物组合物稳定性比较情况。图4为HPVll VLPs与QS-21与MPL分别吸附在明矾上，保存在2 8°C的条件下， 不同药物组合物稳定性比较情况。图5为HPV16 VLPs吸附在( (PO4)2佐剂上，保存在2 8°C的条件下，不同药物
组合物稳定性比较情况。图6为HPV18 VLPs吸附在MF59佐剂上，保存在2 8°C的条件下，不同药物组合物稳定性比较情况。
具体实施例方式下面将通过实施例对本发明做进一步说明，但下述的实例仅是本发明其中的例子，并不代表本发明所限定的权利范围。
将HPV6 VLPs, HPVll VLPs, HPV16 VLPs, HPV18 VLPs (纯度在 95% 以上)分别保存在0. 5M NaCl, 0. 003% Tween 80，pH6. 2的溶液中，无菌过滤，稀释至浓度为lmg/ml， 在-70°C的条件下储存。实施例1 选用铝佐剂配制药物组合物，监测HPV VLPs长期保存的稳定性及其相
关应用。药物组合物稳定性考察配制以Al (OH)3作为佐剂的HPV16 VLPs
成分
HPV16 VLPs
Al (OH) 3 佐剂(Sigma 公司) NaCl
L-组氨酸
Tween80 (Fluka 公司)余量为注射用水。按上述药物组合物的配方进行配制，调节pH值至6. 2 士 0. 1，定容至55ml。将此无菌药物组合物分装至无菌的西林瓶中，每瓶加入0. 5ml，分装100支，在整个配制过程中通过无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成HPV16 VUs药物组合物。配制以AAHS作为佐剂的HPV16 VLPs
成分含量
HPVl 6 VLPs160pg/ml
AAHS 佐齐Ij450|ag/ml
NaCl0.32M
L-组氨酸IOmM
Tween80 (Fluka 公司)0.01%余量为注射用水。按上述药物组合物的配方进行配制，调节pH值至6. 2 士 0. 1，定容至55ml。将此药物组合物分装至无菌的西林瓶中，每瓶加入0. 5ml，分装100支，在整个配制过程中通过无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成HPV16 VLPs药物组合物。将以Al (OH)3作为佐剂的HPV16 VLPs药物组合物与以AAHS作为佐剂的HPV16VLPs 药物组合物各100支置于2 8°C的冰箱中，定期取样进行BIAcore分析(利用一种HPV16 VUs的中和性抗体进行分析)目的蛋白的百分含量。每次检测时以-70°C保存的HPV6 VLPs 药物组合物作为阳性对照。检测结果见图1。实施例2 选用新型MPL佐剂配制药物组合物，监测HPV VLPs长期保存的稳定性及其相关应用。
含量 16(^g/ml 45(^g/ml 0.32M IOmM 0.01%
药物组合物稳定性考察配制以MPL/A1 (OH)3 作为佐剂的 HPV18 VLPs
成分
HPVl 8 VLPs
MPL (Corixa 公司)
Al (OH) 3 佐剂(Sigma 公司)
NaCl
NaH2P04.2H20 TritonX-IOO (Sigma 公司)
80pg/ml lOOpg/ml lmg/ml
150mM 8mM 0.02%余量为注射用水。按上述药物组合物配方进行配制，调节pH值至7. 2 士 0. 1，定容至55ml。将此药物组合物分装至无菌的西林瓶中，每瓶加入0. 5ml，分装100支，在整个配制过程中通过无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成HPV18 VLPs药物组合物。配制以MPL/A1P04 作为佐剂的 HPV18 VLPs 余量为注射用水。按上述药物组合物的配方进行配制，调节pH值至7. 2 士 0. 1，定容至55ml。将此药物组合物分装至无菌的西林瓶中，每瓶加入0. 5ml，分装100支，在整个配制过程中通过无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成HPV18 VLPs药物组合物。将以MPL/A1 (OH)3作为佐剂的HPV18 VLPs药物组合物与以MPL/A1P04作为佐剂的 HPV18 VLPs药物组合物各100支置于2 8。C的冰箱中，定期取样进行BIAcore分析(利用一种HPV18 VUs的中和性抗体进行分析)目的蛋白的百分含量。每次检测时以-70°C保存的HPV18 VUs药物组合物作为阳性对照。检测结果见图2。实施例3 选用新型ISCOMATRIX 佐剂配制药物组合物，监测HPV VLPs长期保存的稳定性及其相关应用。药物组合物稳定性考察
配制以ISCOMATRIX /AAHS 作为佐剂的 HPV6 VLPs
成分
HPV18 VLPs MPL (Corixa 公司) AlPO4佐剂 NaCl
NaH2P04.2H20 TritonX-100 (Sigma 公司)
lOOpg/ml
lmg/ml 150mM 8mM 0.02%
含量 80μ^ηι1
9成分含量HPV6 VLPs80pg/mlISCOMATRIX 120μ_1AAHS佐剂450μβ/mlNaCl0.32ML-咪唑IOmMTween20 (Fluka 公司)0.01%余量为注射用水。按上述药物组合物的配方进行配制，调节pH值至6. 2 士 0. 1，定容至55ml。将此药物组合物分装至无菌的西林瓶中，每瓶加入0. 5ml，分装100支，在整个配制过程中通过无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成HPV6 VLPs药物组合物。配制以ISCOMATRIX /AlPO4 作为佐剂的 HPV6 VLPs
成分含量HPV6VLPs8(^g/mlISCOMATRIX AlPO4佐剂45(^g /mlNaCl0.32ML-咪唑IOmMTween20 (Fluka 公司)0.01%余量为注射用水。按上述药物组合物的配方进行配制，调节pH值至6. 2 士 0. 1，定容至55ml。将此药物组合物分装至无菌的西林瓶中，每瓶加入0. 5ml，分装100支，在整个配制过程中通过无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成HPV6 VLPs药物组合物。将以ISCOMATRIX /AAHS作为佐剂的HPV6 VLPs药物组合物与以ISCOMATRIX /AlPO4作为佐剂的HPV6 VLPs药物组合物各100支置于2 8°C的冰箱中，定期取样进行 BIAcore分析(利用一种HPV6 VLPs的中和性抗体进行分析)目的蛋白的百分含量。每次检测时以-70°C保存的HPV6 VUs药物组合物作为阳性对照。检测结果见图3。实施例4 选用新型QS-21佐剂配制药物组合物，监测HPV VLPs长期保存的稳定性及其相关应用。药物组合物稳定性考察配制以QS-21/MPL/明矾作为佐剂的HPVll VLPs 成分含量HPVll VLPs80pg/mlQS-21 (ANTIGENICS 公司)ΙΟΟμ^ηιΙMPLΙΟΟμ^ιπΙ明矾佐剂lmg/mlKCl150mMNaH2P04.2H208mMTriton X-114 (Sigma 公司)0.02%余量为注射用水。按上述药物组合物的配方进行配制，调节pH值至7.2 士 0. 1，定容至55ml。将此药物组合物分装至无菌的西林瓶中，每瓶加入0. 5ml此药物组合物，分装100 支，在整个配制过程中通过无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成HPVll VUs药物组合物。配制以QS-21/明矾作为佐剂的HPVll VLPs
成分
HPVll VLPs
QS-21 (ANTIGENICSSg)
明矾佐剂 KCl
NaH2P04.2H20 Triton X-114 ( Sigma 公司)余量为注射用水。按上述药物组合物的配方进行配制，调节pH值至7. 2 士 0. 1，定容至55ml。将此药物组合物分装至无菌的西林瓶中，每瓶加入0. 5ml，分装100支，在整个配制过程中通过无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成HPVll VLPs药物组合物。将以QS-21/MPL/明矾作为佐剂的HPVll VUs药物组合物与以QS-21/明矾作为佐剂的HPVll VLPs药物组合物各100支置于2 8°C的冰箱中，定期取样进行BIAcore分析 (利用一种HPVll VUs的中和性抗体进行分析)目的蛋白的百分含量。每次检测时以-70°C 保存的HPVll VUs药物组合物作为阳性对照。检测结果见图4。实施例5 选用Qi3 (PO4) 2佐剂配制疫苗药物组合物，监测HPV VLPs长期保存的稳定性及其相关应用。配制相关溶液配制以Cei3(PO4)2 作为佐剂的 HPV31 VLPs
含量
80Hg/ml 120μ^ιη1 lmg/ml 150mM 8mM 0.02%成分含量
HPV3 IVLPs80pg/ml
C^3(PO4)2 佐剂(Fluka 公司)lmg/ml
Na2SO480mM
NaH2PO4^H2O8mM
NP-40 (Sigma 公司)0.01%
余量为注射用水。按上述药物组合物配方进行配制，调节pH值至7. 2 士 0. 1，定容至55ml。将此药物组合物分装至无菌的西林瓶中，每瓶加入0. 5ml，分装100支，在整个配制过程中通过无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成HPV31 VLPs药物组合物。将以Qi3(PO4)2作为佐剂的HPV31 VLPs药物组合物各100支置于2 8°C的冰箱中，定期取样进行BIAcore分析(利用一种HPV31 VUs的中和性抗体进行分析)目的蛋白的百分含量。每次检测时以-70°C保存的HPV31 VUs药物组合物作为阳性对照。检测结果见图5。实施例6 选用新型MF59佐剂配制疫苗药物组合物，监测HPV VLPs长期保存的稳定性及其相关应用。药物组合物稳定性考察配制以MF59作为佐剂的HPV33 VLPs
HPV33 VLPs150pg/ml
MF59 佐剂45(^g/ml
NaCl0.32M
L-甘氨酸IOmM
Pluronicl21 (BASF 公司)0.02%余量为注射用水。按上述药物组合物配方进行配制，调节PH值至6. 2 士 0. 1，定容至55ml。将此药物组合物分装至无菌的西林瓶中，每瓶加入0. 5ml，分装100支，在整个配制过程中通过无菌过滤的氮气以排除瓶中空气，最后轧盖制成HPV33 VLPs药物组合物。将以MF59作为佐剂的HPV33 VUs药物组合物各100支置于2 8°C的冰箱中，定期取样进行BIAcore分析(利用一种HPV33 VLPs的中和性抗体进行分析)目的蛋白的百分含量。每次检测时以-70°C保存的HPV33 VUs药物组合物作为阳性对照。检测结果见图 6。实施例7 =VLPs的免疫原性实验根据上述实施例1 4所述的药物组合物配方配制HPV16 VLPs药物组合物用于相关的免疫检测和动物免疫实验。小鼠免疫实验选取8 12周BALB/c小鼠，随机分组，每组12只；按下述方案(见表一)在小鼠右侧径前肌肉处注射免疫。免疫血清抗体检定第二次免疫后14天，对小鼠进行摘除眼球取血，用15ml —次性离心管收集血液， 在4°C条件下，IOOOOg离心30min，收集血清，_20°C保存备用。用HPV16 VLPs作包被抗原， ELISA方法检测免疫小鼠血清中的HPV16抗体效价。其中，A组免疫血清均未检测到抗体活性，B组免疫血清的抗体滴度约1 1000，C组免疫血清的抗体滴度约1 3000，D、E、F组免疫血清的抗体滴度约1 5000，G、H组免疫血清的抗体滴度约1 7000。 小鼠红细胞血凝抑制实验由于HPV病毒具有凝集小鼠红细胞的能力，但此特性可以被相应的特异性抗体所抑制，所以我们利用其特性，设计实验来检测免疫小鼠的血清中是否产生了针对VLPs的特异性抗体和其含量。经检测小鼠红细胞悬液与倍比稀释的HPV16 VUs相互作用，结果当IOM倍稀释时，VUs使鼠红细胞呈“++”凝集的最高稀释倍数，即定义为一个病毒单位。血凝抑制实验选取4个病毒单位即VLPs按1 256 (618. 54ng/孔)稀释。以618. Mng/孔VUs与不同倍比稀释的小鼠免疫血清进行红细胞凝集抑制实验， 实验结果(见表二)，B组免疫血清的血凝抑制效价为1 8，C组免疫血清的血凝抑制效价为1 16，D、E、F组免疫血清的血凝抑制效价为1 32，G、H组免疫血清的血凝抑制效价为1 1沘。免疫小鼠产生的抗体能与VLPs正确地结合即能阻止VLPs与红细胞表面受体结合。本实验的结果证实了小鼠免疫血清的抗体能识别VLPs构象表位，并且具有血凝抑制活性。实施例8 疫苗中不同配比对小鼠Thl/Th2型细胞因子变化的影响根据上述实施例1所述的药物组合物配方，采用Al (OH)3佐剂加入相关免疫促进剂配制HPV16 VLPs药物组合物用于相关的免疫检测和动物免疫实验。小鼠免疫实验选取8 12周BALB/c小鼠，随机分6组，每组25只。其中设立对照组(Al (OH) 3 佐剂)，IL-2组，IL-12组，GM-CSF组，IFN- γ组，TCA3组共6组，小鼠腿部肌肉注射疫苗各 150 μ 1/只，免疫方案为0，30天，2针免疫，分别于初次免疫后的1，2，3，4周及加强免疫后第2周，所有小鼠均经眼眶静脉取血，分离血清后储存于-20°C。检测血清中细胞因子水平使用BDTM Cytometric Bead Array (CBA)Mouse Thl/Th2 Cytokine Kit和流式细胞仪(FACS Calibur)，对不同的血清样品同时进行5个细胞因子(TNF，IFN-γ，IL_5，IL-4， IL-2)的定量测定。实验结果证实免疫促进剂加入后，可以刺激小鼠产生较强的细胞免疫应答，诱导产生的Th 1/Th2型细胞因子均随时间的变化而变化。五种细胞因子均在第4周达到最大值。 其中IL-2和IFN- γ组在第2、3、4周都能显示诱导小鼠产生较高的细胞因子水平，明显高于对照组。说明该种免疫促进剂初次免疫能增强疫苗的非特异性免疫应答，对增强疫苗的免疫原性有较好的作用。实施例9 =HPV感染患者临床体外实验
子宫颈癌患者的血清抗体ELISA检测将适量的HPV16 VLPs PBS稀释的包被液100 μ 1/孔加入96孔酶标板中，置于4°C 包被过夜。倾去孔内液体，用PBS洗液洗涤3次。随后加入1 % BSA-PBS 100 μ 1/孔，室温封闭Ihr后PBS洗液洗涤3次。加入用0. 1 % BSA-PBSl 3000稀释的患者血清，室温孵育 Ihr后PBS洗液洗涤3次。之后加入用0. 1 % BSA-PBSl 3000稀释的HRP标记的羊抗鼠 IgGlOO μ 1/孔。室温静置Ihr后PBS洗液洗涤4次。每孔加入100 μ 1 OPD底物缓冲液，避光反应lOmin。最后每孔加入100 μ 1终止液终止反应。用酶标仪与490nm波长检测每孔光密度值，患者血清检测结果呈阳性，即患者血清抗体滴度在1 3000以上。通过ELISA检测得出子宫颈癌患者的血清抗体与HPV16 VUs产生免疫反应，结果表明患者血清抗体滴度较高，并且通过体外实验证实，HPV16 VUs可以在患者体内产生相应的抗体。从而对相应的适应症患者达到预防和治疗的目的。其中，由HPV感染而导致的各类疾病，其中包括由HPV所引起的子宫颈炎、子宫颈息肉、子宫颈肥大、尖锐湿疣、乳腺癌、支气管肺癌、直肠癌、食道癌、咽癌、口腔癌、皮肤癌等相关疾病。可以利用上述方法，但不局限于上述方法进行临床体外实验。
1权利要求
1.一种人乳头瘤病毒药物组合物，用于预防和治疗由人乳头瘤病毒所引起的相关疾病，其特征是它包括下述成份及用量范围组成(1)HPV病毒样颗粒(VLPs)吸附于佐剂，其VLPs浓度范围为10 60μ g/ml ；(2)细胞因子免疫促进剂，其活性范围为1 5000万国际单位；(3)NaCl盐溶液，其浓度范围为0.IM 0. 4M ；(4)一种注射用的缓冲液，其浓度范围5mM 20mM，保持疫苗的pH在5. 5 7. 5 ；(5)非离子表面活性剂，其浓度范围0.0005% 0. 05% ；(6)以注射用水溶解。
2.根据权利要求1中所述的药物组合物，其特征是所包含的HPVVUs选自HPV6a、 HPV6b、HPVll、HPV16、HPV18、HPV31 或 HPV32 的一种、二种或二种以上任意组合。
3.根据权利要求1中所述的药物组合物，其特征是佐剂选自铝佐剂、fe3(P04)2、MF59、 SAF、QS21、3D-MPL、ISC0M、PLG、AGP、脂质A衍生物或CpG的一种、二种或二种以上任意组合。
4.根据权利要求3中所述的药物组合物，其特征是铝佐剂选自氢氧化铝(Al(OH)3)佐剂，磷酸铝(AlPO4)佐剂，羟基磷酸铝佐剂，非晶形的羟基磷酸铝硫酸盐(AAiB)佐剂，明矾 (KAl (SO4)-12H20)佐剂或纳米铝佐剂。
5.根据权利要求1中所述的药物组合物，其特征是细胞因子免疫促进剂选自干扰素 (IFN)，白细胞介素(IL)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或趋化因子(TCA)的一种、二种或二种以上任意组合。
6.根据权利要求5中所述的药物组合物，其特征是所述的细胞因子免疫促进剂选自白细胞介素(IL)。
7.根据权利要求6中所述的药物组合物，其特征是所述的白细胞介素(IL)选自白细胞介素(II)、
8.根据权利要求1中所述的药物组合物，其特征是缓冲液选自磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液。
9.根据权利要求1中所述的药物组合物，其特征是非离子表面活性剂选自聚山梨酯 80或聚山梨酯20。
10.根据权利要求1中所述药物组合物的应用，其特征是其给药途径为皮内注射、皮下注射、皮下输液、肌内注射、静脉注射或静脉输液。
全文摘要
本发明涉及一种用于预防和治疗由人乳头瘤病毒所引起相关疾病的人乳头瘤病毒药物组合物，其特征在于由以下成分组成为活性成分的人乳头瘤病毒样颗粒(HPV VLPs)、为促进免疫反应的佐剂，为激活细胞免疫使之持久且高效产生免疫应答的细胞因子免疫促进剂、为维持VLPs完整空间构型和一定溶解度的盐溶液、维持一定pH值生理上可相溶的缓冲液、保护VLPs避免剧烈震荡而导致活性下降的非离子表面活性剂、余量为水。其特点是将HPV VLPs制备成保持其完整的空间构型的、高效免疫的、储存稳定的液体药物组合物。用于预防和治疗由于HPV感染所导致的各类疾病，具有使用安全、方便、经济、无任何副作用等特点。
文档编号A61K39/39GK102349996SQ20111031351
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者侯绪凤, 刘颖, 包士中, 娄竞, 李柯, 袁杰, 靳征 申请人:沈阳三生制药有限责任公司