专利名称：一种可诱导和激活癌靶向t细胞的融合蛋白及制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白及制备方法及用途，属于生物医药领域。
背景技术：
表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)、血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial cell growth factor, VEGF)、促性腺激素释放激素 (Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)禾口促胃液素释放妝(gastrin-releasing peptide, GRP)等的受体在各种肿瘤组织中大量表达，例如在肠黏膜肿瘤中的EGF受体比正常组织高出300倍(Gastroenterology，98，961-967，1990)。所以，异常高表达的 EGF受体、VEGF受体、GnRH受体、GRP受体等成为引人注目的癌治疗靶点。转化生长因子-a (Transforming growth factor- α , TGF- α )的受体与 EGF 的受体相同。上面这些细胞因子以及激素和多肽等可以与癌细胞上的相对应的受体 (Receptor)相互作用。所以在它们的后面连接一个效应物例如毒素蛋白而形成融合蛋白，就可以靴向性攻击癌细胞(J Biol Chem, 267, 24034-24040,1992 ；Proc Natl Acad Sci USA,99,7866-7871,2002 ；Cancer Res，54，5154-5159，1994；J Biol Chem,272, 11597-11603，1997 ；Cancer Res，57，290-294，1997)。T细胞的有效活化需要两个信号的参与，即需要抗原肽-MHC复合物与T细胞上的 TCR-CD3结合提供第1信号，以及共刺激分子(Costimulatory molecules) B7介导的第2信号。最基本的共刺激信号由抗原递呈细胞表达的B7. 1(⑶80)、B7. 2(^86)分子与T细胞上表达的相应受体(C^8*CTLA-4)提供(Amj Respir Crit Care Med，162，5164-5168，2000 ； Immunol Cell Biol,77,304-311,1999 ；Clin Cancer Res,13,5271-5279, 2007 ；Trends Immunol，24，313-318，2003)。研究发现，转导B7. 1基因使头颈部鳞状上皮细胞癌细胞表面表达B7. 1蛋白能诱导淋巴细胞更好的增殖，在淋巴细胞-肿瘤细胞混合培养时能更有效地产生抗肿瘤效应细胞(Ce 11 Immunol，201，132-143，2000)。转导B7分子的肿瘤细胞不仅能激活未致敏T细胞， 还能增强树突状细胞的抗原递呈能力并活化肿瘤特异性T细胞，提示使肿瘤细胞表达B7分子能增强T细胞应答。作为药物的应用，B7. I-Fc和B7. 2-Fc可以诱导和激活抗癌的T细胞，显示出抗肿瘤的生物活性(Cancer Res, 59,4964-4972,1999 ；Clin Cancer Res，11，8492-8502，2005 ； JImmunol,172，1347-1354,2004 ；Cancer Res，62，5727-5735，2002)。在抗癌的靶向性药物中，抗体是很流行的手段，但是抗体只是封闭癌细胞，与T淋巴细胞无关。肿瘤组织富含大血管和毛细血管，这些血管不仅给肿瘤输送营养，而且血管中有大量的淋巴细胞，其中70-80%是T淋巴细胞，但是这些T细胞是没有癌细胞特异性，是不会攻击肿瘤的。利用这些没有癌细胞特异性的T细胞来靶向性攻击癌细胞，是一种抗癌领域中的新的强有力的手段，这样的药物是不同于抗体的，现在没有报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白。本发明的第二个目的是提供一种含有可诱导和激活癌靶向T细胞的编码融合蛋白的核苷酸序列的重组载体。本发明的第三个目的是提供一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白的制备方法。本发明的第四个目的是提供一种可诱导和激活癌靶向T细胞的用途。本发明的技术方案概述如下一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白，包括与癌细胞作用的肽和共刺激分子B7. 1 (又名CD80)，所述与癌细胞作用的肽选自缩写为TGF- α的转化生长因子_ α、缩写为EGF的表皮生长因子、缩写为VEGF的血管内皮细胞生长因子、缩写为&iRH的促性腺激素释放激素或缩写为GRP的促胃液素释放肽，TGF-α -Β7. 1由SEQ ID Νο4所示；EGF-B7. 1由 SEQ ID Νο6 所示；VEGF-B7. 1 由 SEQ ID Νο8 所示；GnRH_B7. 1 由 SEQ ID NolO 所示；GRP-B7. 1 由 SEQ IDNo 12 所示。一种重组载体，含有编码上面所述融合蛋白的核苷酸序列，编码SEQ ID No4的核苷酸序列为SEQ ID No3所示；编码SEQ ID No6的核苷酸序列为SEQ ID No5所示；编码SEQ ID No8的核苷酸序列为SEQ ID No7所示；编码SEQ ID NolO的核苷酸序列为SEQ ID No9 所示；编码SEQ ID Nol2的核苷酸序列为SEQ ID Noll所示。一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白的变异体或人为改造的突变序列。一种宿主细胞，该宿主细胞含有上面所述的重组载体。可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白的制备方法，培养上面所述宿主细胞，收集表达的相应的融合蛋白 TGF- α -Β7. 1 ；EGF-B7. 1 ；VEGF-B7. 1 ；GnRH_B7. 1 ；GRP-B7. 1。上面所述可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白与癌症有关。上面所述可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白能够诱导和激活T细胞。上面所述可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白在制备治疗癌症和抗实体肿瘤的药物的应用。本发明的优点本发明的融合蛋白具有癌靶向作用，一方面可分别与VEGF的受体VEGFR、EGF和 TGF-α的受体EGFR、GnRH的受体GnRH-R、或GRP的受体GRP-R作用，另一方面又与T细胞上表达的相应受体⑶观和CTLA-4相互作用，这样就将T细胞靶向性定位到大量表达VEGFR、 EGFR、GnRH-R、或GRP-R的癌细胞周围，从而诱导T细胞攻击癌细胞。T细胞可分泌的细胞因子例如干扰素-Y (Interferon- γ，IFN- y )、穿孔素和颗粒酶并诱导靶细胞产生Fas等导致癌细胞凋亡，所以上面的融合蛋白对于实体肿瘤有着很明显的杀伤作用。实验证明，本发明的融合蛋白能够抑制肿瘤生长和引起癌细胞的凋亡。
图1表示三种本发明的融合蛋白抑制肉瘤肿瘤SarCOma(S180)生长，图中表示的是小鼠的肿瘤重量。图2利用常规免疫组化检测到的T细胞，棕色小点是T细胞。(图中2-1为对照；
2-2为 B7. 1 ;2-3 为 TGF- α -Β7. 1 ；2-4 为 EGF-B7. 1 ;2_5 为 VEGF-B7. 1)图3利用常规免疫组化检查3种本发明的融合蛋白与肿瘤的结合能力。(图中
3-1为 TGF- α -Β7. 1 ;3_2 为 EGF-B7. 1 ；3-3 为 VEGF-B7. 1)图4利用常规免疫组化检测干扰素-Y (IFN- y )，棕色部分就是T细胞分泌的 IFN- Y。(图中4-1 为对照；4-2 为 B7. 1 ；4-3 为 TGF- α -Β7. 1 ；4-4 为 EGF-B7. 1 ；4-5 为 VEGF-B7. 1)图5显示的是被T细胞攻击的癌细胞，大细胞是癌细胞，小细胞是T细胞。(图中 5-1肝癌细胞；5-2肺癌细胞)图6显示的是凋亡的癌细胞，大细胞是癌细胞，小细胞是T细胞，颜色深的大细胞即癌细胞正在凋亡。(图中6-1肝癌细胞；6-2肺癌细胞)
具体实施例方式小鼠肿瘤中的一种S180癌细胞上表达大量的EGFR和VEGFR(Clin Cancer Res 13，2998-3005，2007 ；PLoS One 5，el5368，2010)，所以这里采用小鼠肿瘤S180用于小鼠荷瘤模型实验。人和小鼠的细胞因子例如VEGF、EGF和TGF- α在结构上有很大的相似性，可以发生交叉反应(Biochemistry 40，8930-8939，2001 ； J Control Release，82，71-82，2002 ； J Biol Chem 270，4334-4340，1995 ；J Biol Chem 276，19166-19171，2001 ;Dev Dyn 204， 228-239，1995)。同样，人来源的B7. 1 (CD80)和B7. 2(CD86)也可以在小鼠中发挥作用(Clin Cancer Res, 11,8492-8502，2005)。所以这里可以在小鼠荷瘤模型中分析融合蛋白的生物活性，下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。实施例1 B7. 1(⑶80)表达载体的构建根据GenBank数据库的人来源的B7. 1基因(又名⑶80)的信息(NM_005191)，委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括一个连接肽和一个B7. 1基因(编码细胞外部分的208个氨基酸)和在整个片断的前面HindIII及后面B10I限制酶切点的几个碱基，将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用HindIII 和BioI处理后，把这片段插入pET2^质粒上，这样就产生了表达载体pET2^-B7. 1，可表达B7. 1蛋白。序列表(SEQ ID NO. 2)仅仅是B7. 1蛋白，前面的连接肽可见另一个序列表 (SEQ ID N0. 14)。实施例2TGF- α -Β7. 1表达载体的构建根据GenBank数据库的人来源的TGF-α基因的信息(ΝΜ_003236)，委托TAKARA 公司合成一个核酸序列片段包括TGF-α基因及在TGF-α前面再增加限制内切酶位点 BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了 MlI和HindIII的限制内切酶位点。 将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用 BamHI和HindIII处理后，把这个片段插入pET2^_B7. 1质粒上，这样就产生了表达载体 pET22b-TGF- α -Β7. 1，可表达 TGF- α -Β7. 1 融合蛋白(见序列表 SEQ ID Ν0. 4)。实施例3EGF-B7. 1表达载体的构建根据GenBank数据库的人来源的EGF基因的信息(NM_001963和NM_001178130)，委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括EGF基因及在EGF前面再增加限制内切酶位点BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了 Mil和HindIII的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用 BamHI和HindIII处理后，把这个片段插入ρΕΤ2^_Β7. 1质粒上，这样就产生了表达载体 pET22b-EGF-B7. 1，可表达 EGF-B7. 1 融合蛋白(见序列表 SEQ ID NO. 6)。实施例4VEGF-B7. 1表达载体的构建根据GenBank数据库的人来源的VEGF基因的信息(NM_003376)以及参考论文 (J. Biol. Chem. ,266,11947-11954，1991)，委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括 VEGF基因(121个氨基酸)及在VEGF前面再增加限制内切酶位点BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了 Mil和HindIII的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用BamHI和HindIII处理后， 把这个片段插入pET2^-B7. 1质粒上，这样就产生了表达载体pET2^-VEGF-B7. 1，可表达 VEGF-B7. 1融合蛋白(见序列表SEQ ID NO. 8)。实施例5GnRH_B7. 1表达载体的构建根据GenBank数据库的人来源的GnRH基因的信息(NM_021081和NM_000825等)， 委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括&iRH基因及在&iRH前面再增加限制内切酶位点BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了 Mil和HindIII的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用 BamHI和HindIII处理后，把这个片段插入ρΕΤ2^_Β7. 1质粒上，这样就产生了表达载体 pET22b-GnRH-B7. 1，可表达 GnRH_B7. 1 融合蛋白(见序列表 SEQ ID NO. 10)。实施例6GRP-B7. 1表达载体的构建根据GenBank数据库的人来源的GRP基因的信息(NM_002091、NM_001012512和 NM_001012513等)，委托TAKARA公司合成一个核酸序列片段包括GnRH基因及在GnRH前面再增加限制内切酶位点BamHI和EcoRI的几个碱基，在片断的后面包含了 Mil和HindIII 的限制内切酶位点。将这个合成好的核酸片段插入T载体并进行DNA测序鉴定，然后再用双酶切方法即用BamHI和HindIII处理后，把这个片段插入ρΕΤ2^_Β7. 1质粒上，这样就产生了表达载体pET22b-GRP-B7. 1，可表达GRP-B7. 1融合蛋白(见序列表SEQ ID NO. 12)。实施例7各种蛋白的表达、变性和复性以及纯化将各种表达质粒pET22b-B7. 1、pET22b_TGF_ α -B7. 1、pET22b-EGF_B7. 1、 pET22b-VEGF-B7. l、pET22b-GnRH_B7. 1 和 pET2^_GRP_B7. 1 分别用电穿孔法转入大肠杆菌 BL21(DE3)，利用抗生素Amp(Ampicillin)筛选阳性菌。接下来各种蛋白的表达、变性和复性以及纯化的过程大致相同，操作如下含有表达质粒的大肠杆菌BL21(DE!3)先进行大规模37°C培养，然后加入IPTG (Iso propylthio-β -D-galactoside)使之浓度达到ImM并过夜30°C培养，从而诱导表达蛋白。 第2天离心培养液和收集菌体，用超声波法破细胞壁，离心收集包含体沉淀，这里的蛋白是以包含体形式存在。包含体蛋白用6M尿素变性溶解，然后进行多阶段透析，透析溶液是逐步稀释的尿素例如3M、2M和1M，接下来是0. 5M尿素，0. 4M L-精氨酸，375 μ M氧化型谷胱甘肽GSSG，1. 875mM还原型谷胱甘肽GSH，透析后进行离心，所得上清液就是蛋白的复性溶液。 用His 'Bind Purification Kit试剂盒(Novagen公司)对于蛋白进行纯化，先用BindingBuffer冲洗凝胶柱，同时也在蛋白溶液里加入Binding Buffer，将蛋白样品上柱，用Wash Buffer漂洗，然后用Elute Buffer洗脱，用蛋白质电泳进行鉴定，将纯度为一条带的蛋白用于以后的实验。这样得到6种高纯度蛋白B7. 1、TGF-α -B7. 1、EGF-B7. 1、VEGF-B7. 1、 GnRH-B7. 1和GRP-B7. 1，其中B7. 1是用于对照实验的。实施例8抑制肿瘤实验首先选择雄性ICR小鼠，4-5周，18_22g，分成5组，每组30只小鼠。小鼠肉瘤细胞S180是从ATCC购买，先进行体外培养，再注射到ICR小鼠腹腔，进行体内大规模培养，最后，取出腹腔内的S180细胞，将2xl06小鼠肉瘤细胞S180接种于另外五组的ICR小鼠的右侧腋下，然后隔天往腹腔内分别注射B7. UTGF-a-B7. U EGF-B7. 1和VEGF-B7. 1蛋白溶液 0. 2ml (250pmol)/只，而对照组注射等量生理盐水(0. 9% NaCl)，9天后处死小鼠。观察小鼠肿瘤生长情况以及处死后肿瘤的重量。图1表示各组小鼠解剖后的肿瘤的重量，结果表明TGF- α -Β7. 1、EGF-B7. 1和VEGF-B7. 1融合蛋白很有效地抑制肿瘤生长，而注射Β7. 1的效果不太好。实施例9肿瘤组织内T淋巴细胞的检测TGF- α -Β7. 1、EGF-B7. 1和VEGF-B7. 1融合蛋白和Β7. 1蛋白处理以及对照组生理盐水的小鼠S180肿瘤组织切成小块，用石蜡包埋制成石蜡切片，然后进行免疫组织化学实验。为了检测肿瘤组织内的T细胞，使用Santa Cruz Biotechnolog公司的抗 CD3 抗体，然后用二抗以及 avidin-biotin-perxidase complex(Zymed 公司),最后用 Diaminobenzidine(DAB)显色。经 TGF-α -B7. 1、EGF-B7. 1 和 VEGF-B7. 1 注射的小鼠肿瘤组织内发现有大量的T细胞(图2显示的棕色小点为T细胞)，这说明在TGF-α -Β7. 1、 EGF-B7. 1和VEGF-B7. 1诱导下，肿瘤组织内充满了浸润性(Infiltrating) T细胞。而B7. 1 处理小组的肿瘤内只有少量的T细胞，而生理盐水处理的对照组几乎没有什么T细胞。这里的结果表明融合蛋白能够靶向性的将T细胞富集到实体肿瘤的组织内部。实施例10三种融合蛋白对于癌细胞的结合能力的检查 由于pET22b载体上有6个组氨酸的标签，所以本发明的融合蛋白的C末端都带有这个标签，所以可用抗6个组氨酸抗体(Santa Cruz Biotechnolog公司)来检测融合蛋白的存在。用TGF-α -B7. 1、EGF_B7. 1和VEGF-B7. 1融合蛋白溶液孵育肿瘤组织石蜡切片，然后用抗6个组氨酸抗体进行检测。发现TGF- α -Β7. 1、EGF-B7. 1和VEGF-B7. 1融合蛋白都可以与S180癌细胞结合(图3中的棕色部分)，表明融合蛋白中的人来源的TGF- α、EGF和 VEGF可与小鼠癌细胞上的EGFR和VEGFR先后作用。实施例11肿瘤组织内干扰素-γ (IFN- y )的检测用免疫组织化学方法检测肿瘤组织内由T细胞分泌的细胞因子IFN-γ，抗体是 SantaCruz Biotechnolog公司的抗IFN-γ抗体。图4是测定的结果，表明在TGF-α-Β7. 1、 EGF-B7. 1和VEGF-B7. 1诱导下，肿瘤组织内的T细胞分泌了大量的IFN-γ (图4中4_3、 4-4和4-5中的棕色部分)，而Β7. 1组只有很少的阳性反应(图4-2)，生理盐水组(图4-1) 没有什么IFN-Y分泌。实施例12GnRH-B7. 1和GRP-B7. 1诱导T淋巴细胞活性外周血细胞购自天津血液中心，用Ficoll密度离心和尼龙毛柱方法取得T淋巴细胞(JClin Invest，91，1490-1498，1993)，这些T细胞用DMEM培养基培养。然后分别加入B7. l、GnRH-B7. 1 和 GRP-B7. 1。在6孔板上用DMEM培养基培养T细胞，然后加入5pmol量的3种蛋白，然后用 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)的 IFN-γ 试齐Ll盒(R&D Systems 公司)来检测培养基中的IFN-γ的含量。表1为分析B7. 1、GnRH-B7. 1和GRP-B7. 1蛋白刺激T细胞的能力，检测的是细胞因子IFN-γ。表IIFN-γ (pg/ml)
B7. 1GnRH-B7. 1GRP-B7. 125h60h25h60h25h60h4.2±0. 713.8±3. 13.6±0.814. 5±2. 95. 1±0. 915. 1±2.8结果表明GnRH-B7. 1和GRP-B7. 1融合蛋白与B7. 1 一样可以激活T细胞，使得T 细胞分泌细胞因子IFN-Y。同时，在不加蛋白的对照组(只有癌细胞和T细胞)中，则没有检测到IFN-γ。实施例13GnRH_B7. 1和GRP-B7. 1融合蛋白杀伤癌细胞在6孔板上用DMEM培养基培养人癌细胞来源的肝癌细胞H印G2和肺癌细胞 A549，浓度为2xl05个/孔，然后加入T细胞，再分别加入B7. 1、GnRHi 1或GRP-B7. 1，蛋白的量都是5pmol。细胞毒作用或癌细胞杀伤效果采用MTT (Methabenzthiazuron)法测定 (Immunology，82，117-125，1994)，细胞生长抑制用 100-[ (Atest-Ab) / (Ac-Ab) ] χ 100 公式计算，Atest指的是有T细胞加入下的癌细胞生长，Ab指的是孔中只有培养基，Ac指的是癌细胞生长。以后每种癌细胞杀伤实验的次数都在20以上。效靶比是指T细胞与肿瘤细胞数量之比，在5 1、15 1的情况下，分别加入 5pmol量的B7. 1、GnRH-B7. 1或GRP-B7. 1，结果在表2 (下面)，随着T细胞数量的增加，肿瘤细胞杀伤效果也增加，在T细胞与肿瘤细胞15 1的条件下，经70小时培养后测定， GnRH-B7. 1和GRP-B7. 1杀伤率或细胞毒作用达到60(% )以上(表2)，而B7. 1的效果要比&1RH-B7. 1和GRP-B7. 1低。另外在不加蛋白仅加T细胞的情况下，细胞毒作用发现在 1-4(% )以下。表2为T细胞与癌细胞不同数量之比的共培养，在B7. 1、GnRH_B7. 1或GRP-B7. 1
诱导下，T细胞针对肿瘤细胞的细胞毒作用即杀伤作用。
权利要求
1.一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白，其特征是包括与癌细胞作用的肽和共刺激分子B7. 1，所述与癌细胞作用的肽选自缩写为TGF-α的转化生长因子-α、缩写为EGF 的表皮生长因子、缩写为VEGF的血管内皮细胞生长因子、缩写为&iRH的促性腺激素释放激素或缩写为GRP的促胃液素释放肽，TGF-α -Β7. 1由SEQ ID Νο4所示；EGF-B7. 1由SEQ ID Νο6 所示；VEGF-B7. 1 由 SEQID Νο8 所示；GnRH_B7. 1 由 SEQ ID NolO 所示；GRP-B7. 1 由 SEQ ID Nol2 所示。
2.一种重组载体，其特征在于含有编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列，编码 SEQIDNo4的核苷酸序列为SEQ ID No3所示；编码SEQ ID No6的核苷酸序列为SEQ ID No5 所示；编码SEQ ID No8的核苷酸序列为SEQ ID No7所示；编码SEQ ID NolO的核苷酸序列为SEQ IDNo9所示；编码SEQID Nol2的核苷酸序列为SEQ ID Noll所示。
3.权利要求1所述一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白的变异体或人为改造的突变序列。
4.一种宿主细胞，其特征在于该宿主细胞含有权利要求2所述的重组载体。
5.权利要求1所述可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白的制备方法，其特征在于培养权利要求4所述的宿主细胞，收集表达的权利要求1所述的融合蛋白。
6.权利要求1所述的融合蛋白与癌症有关。
7.权利要求1所述的融合蛋白能够诱导和激活T细胞。
8.权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗癌症和抗实体肿瘤的药物的应用。
全文摘要
本发明公开了一种可诱导和激活癌靶向T细胞的融合蛋白及制备方法及用途，该蛋白包括与癌细胞作用的肽和共刺激分子B7.1，所述与癌细胞作用的肽选自转化生长因子-α、表皮生长因子、血管内皮细胞生长因子、促性腺激素释放激素或促胃液素释放肽，本发明的融合蛋白具有癌靶向作用，一方面可分别与VEGFR、EGFR、GnRH-R、或GRP-R作用，另一方面又与T细胞上表达的相应受体CD28和CTLA-4相互作用，这样就将T细胞靶向性定位到大量表达VEGFR、EGFR、GnRH-R、或GRP-R的癌细胞周围，实验证明，本发明的融合蛋白能够抑制肿瘤生长和引起癌细胞的凋亡。
文档编号A61K38/09GK102391377SQ20111033888
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者孙嘉琳 申请人:孙嘉琳