专利名称：二氧化钛纳米棒阵列嫁接rgd生物信号分子的方法
技术领域：
本发明涉及一种在二氧化钛纳米棒阵列表面嫁接RGD生物信号分子的方法。
背景技术：
二氧化钛因为其良好的稳定性和优异的生物相容性和无毒性被广泛应用于骨组织修复材料。另一方面，二氧化钛纳米棒阵列可以提供更多的接触点，即更多的表面区域来与生命机体识别并结合，具有更好的生物学响应性(Hydrothermal growth of rutile Τ 02 nanorod films on titanium substrates, Thin Solid Films. Volume 519, Issue 15, 31 May 2011， p.4634-4640)。细胞识别是指细胞膜表面受体和细胞外基质中配体的相互识别，在种植体和生物有机体整合过程中起着重要作用。调控细胞和细胞外基质之间细胞识别的主要是整联蛋白，它存在于细胞膜表面，会和细胞外基质中的各种信号产生响应，同时也可以反应细胞内的各种信息，决定了细胞内外信号的传递和交换，最终影响细胞的粘附、迁移、增殖、分化和死亡等过程。为了增强生物种植体和生命有机体的相互识别和结合，可在传统的生物材料上添加被整联蛋白识别的配体，使得细胞识别并且接受种植体为“自体”的一部分，诱导促进骨整合和骨形成能力。Arg-Gly-AspjP* RGD序列，是存在于纤连蛋白和某些细胞外基质蛋白肽链中的“精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D) ”三肽序列，可被一些整联蛋白所识别，并与之结合，能有效地促进细胞对生物材料的粘附。曹馨等(口腔医学研究2 O 1 1 年4月第2 7卷第4期)利用不同的方法在二氧化钛纳米管表面构建RGD生物信号分子。 Patrick H. Blit 等人(JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH Α. 15 SEP 2010 VOL 94A, ISSUE 4，p. 1226-1235)已说明表面修饰R⑶的多孔材料促进了细胞的粘附和增殖，Hyun Suk Seo 等人(Applied Surface Science. 257 (2010) p. 596 - 602)表明在钛金属表面修饰RGD有利于成骨细胞分化和骨形成。Ganesan Balasundaram等人(Journal of Biomedical Materials Research Part A. 6 July 2007. p. 447—453) fflilP日丰及金属表面构建纳米管结构，且嫁接BMP-2来增强骨形成。但是，各种手段的嫁接RGD基本都在种植体表面，未深入材料内部，且仍未见利用二氧化钛纳米棒的多作用点和表面修饰RGD 双重手段深化促进生物种植体和生物有机体的相互识别和结合。
发明内容
本发明的目的在于提供一种在二氧化钛纳米棒阵列上嫁接RGD生物信号分子的方法。本发明首先是通过利用硅烷偶联剂将二氧化钛纳米棒阵列和硅烷相连，末端用氨基修饰，接着再通过酰胺反应将RGD嫁接到二氧化钛纳米棒阵列的表面，最终形成RGD生物信号分子表面修饰的纳米棒阵列。本发明的二氧化钛纳米棒阵列嫁接RGD生物信号分子的方法，其具体步骤如下1)将纳米棒阵列基板用去离子水清洗后，在0.02-0. 05M/L NaOH溶液中浸泡30分钟， 再次用去离子水清洗，紫外照射30分；
2)将500 IOOOul3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解在IOOml乙醇中，搅拌下放入37°C水浴中，并放入步骤1)处理的纳米棒阵列基板反应4小时后，用乙醇清洗，放入烘箱中干燥；
3)将0.3g1-乙基-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于100ml MES缓冲液中，搅拌下放入37°C水浴中，并放入步骤2)处理的纳米棒阵列基板反应6小时后，依次用MES缓冲液和PBS缓冲液清洗；
4)将经步骤3)处理的纳米棒阵列基板放入100 300ug/ml的Arg-Gly-Asp/PBS缓冲液中，在37°C空气气氛中静置4小时后，取出依次用PBS缓冲液和去离子水冲洗，冷冻干
O本发明中，所述的纳米棒阵列基板为纯钛金属基板或者光滑平整的硅基板。纳米棒阵列基板可以采用CN101973582A公开的方法制备得到。本发明制备过程中，步骤1)将纳米棒阵列基板浸泡在NaOH溶液中进行碱处理，是利用化学反应对基板表面除去酸性杂质离子，以免杂质对后续反应造成影响。步骤2)将纳米棒阵列基板用3-氨丙基三乙氧基硅烷进行表面硅烷化，是利用二氧化钛纳米棒表面羟基与硅烷化学键结合，修饰纳米棒阵列基板表面，绑定硅烷的末端为氨基，为后续嫁接RGD形成过度态。步骤3)采用1-乙基_ (二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐对纳米棒阵列基板进行处理，是对硅烷偶联剂的氨基进行活化，使之与RGD中的羧基顺利进行酰胺反应，成功以化学键形式嫁接RGD在纳米棒阵列基板表面。步骤4)嫁接RGD在纳米棒阵列基板表面，是通过化学反应后冷冻干燥，使RGD发挥更好的生物学效应，保持应有的活性，在生物实验或临床方面通过表面的RGD序列和生物机体相互识别，加强细胞对以纳米棒基板为主的生物种植体的粘附，促进骨整合。在骨修复材料生物医学领域，不同的RGD含量影响着其在二氧化钛纳米棒阵列表面的空间结构、修饰密度和它的自身活性，对骨细胞在骨植入体表面的生物学行为具有调控作用。通过本发明的化学改性方法有望研究制备出具有更高生物相容性、生物学响应性等性能的生物材料表面。本发明在二氧化钛纳米棒阵列上嫁接RGD生物信号分子，过程操作简单，所需仪器普遍，易于产业化，可应用于生物医学骨组织修复材料等领域。
图1是二氧化钛纳米棒阵列扫描电镜照片； 图2是二氧化钛纳米棒阵列接触角照片；
图3是硅烷化后二氧化钛纳米棒阵列接触角照片； 图4是嫁接RGD生物信号分子后二氧化钛纳米棒阵列接触角照片。
具体实施例方式以下结合具体实例来说明本发明。实施例1
将纳米棒阵列基板(见图1)用去离子水清洗3次，至表面洁净后，泡入0. 02M/L NaOH溶液中30分钟，将去离子水滴到经过干燥处理后的该步二氧化钛纳米棒阵列基板表面，其接触角为31. 3° (见图2);再次将纳米棒阵列基板用去离子水清洗3次，泡入去离子水中，经紫外照射30分；将250ul 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解在50ml乙醇中，并且不断搅拌，放入37°C水浴中加热，并且将处理后的纳米棒阵列基板放入该溶液中搅拌反应4小时， 待反应完成后，将纳米棒阵列基板用乙醇清洗3次，放入烘箱中干燥，将去离子水滴到该步二氧化钛纳米棒阵列基板表面，其接触角为50. 9° (见图3);将0.15g 1-乙基-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC · HCL)溶于50ml MES缓冲液中，并且不断搅拌，放入37°C 水浴中加热，并且将上述处理的纳米棒阵列基板放入溶液中反应6小时，待反应完成后，将纳米棒阵列基板用MES缓冲液清洗3次，用PBS缓冲液清洗1次；将纳米棒阵列基板放入 100ug/ml的Arg-Gly-Asp (RGD)/PBS缓冲液中，在37°C空气气氛中静置4小时；取出反应后的纳米棒阵列基板，用PBS缓冲液清洗3次，去离子水冲洗1次，冷冻干燥3天，得到嫁接 RGD生物信号分子的二氧化钛纳米棒阵列，将去离子水滴到该步二氧化钛纳米棒阵列基板表面，其接触角为37. 5° (见图4)。由图2、图3、图4可见，通过二氧化钛纳米棒阵列基板接触角的改变，证明RGD生物信号分子成功嫁接在纳米棒阵列基板的表面。实施例2
将纳米棒阵列基板用去离子水清洗3次，至表面洁净后，泡入0. 05M/L NaOH溶液中30 分钟；再次将纳米棒阵列基板用去离子水清洗3次，泡入去离子水中，经紫外照射30分； 将400ul 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解在50ml乙醇中，并且不断搅拌，放入37°C水浴中加热，并且将处理后的纳米棒阵列基板放入溶液中搅拌反应4小时，待反应完成后，将纳米棒阵列基板用乙醇清洗3次，放入烘箱中干燥；将0.15g 1-乙基-(二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐(EDC · HCL)溶于50ml MES缓冲液中，并且不断搅拌，放入37°C水浴中加热，并且将上述处理的纳米棒阵列基板放入溶液中6小时反应，待反应完成后，将纳米棒阵列基板用MES缓冲液清洗3次，用PBS缓冲液清洗1次；将纳米棒阵列基板放入lOOug/ml 的Arg-Gly-Asp (RGD)/PBS缓冲液中，在37°C空气气氛中静置4小时；取出反应后的纳米棒阵列基板，用PBS缓冲液清洗3次，去离子水冲洗1次，冷冻干燥3天，得到嫁接RGD生物信号分子的二氧化钛纳米棒阵列。实施例3
将纳米棒阵列基板用去离子水清洗3次，至表面洁净后，泡入0. 03M/L NaOH溶液中30 分钟；再次将纳米棒阵列基板用去离子水清洗3次，泡入去离子水中，经紫外照射30分； 将250ul 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解在50ml乙醇中，并且不断搅拌，放入37°C水浴中加热，并且将处理后的纳米棒阵列基板放入溶液中搅拌反应4小时，待反应完成后，将纳米棒阵列基板用乙醇清洗3次，放入烘箱中干燥；将0.15g 1-乙基-(二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐(EDC · HCL)溶于50ml MES缓冲液中，并且不断搅拌，放入37°C水浴中加热，并且将上述处理的纳米棒阵列基板放入溶液中6小时反应，待反应完成后，将纳米棒阵列基板用MES缓冲液清洗3次，用PBS缓冲液清洗1次；将纳米棒阵列基板放入300ug/ml 的Arg-Gly-Asp (RGD)/PBS缓冲液中，在37°C空气气氛中静置4小时；取出反应后的纳米棒阵列基板，用PBS缓冲液清洗3次，去离子水冲洗1次，冷冻干燥3天，得到嫁接RGD生物信号分子的二氧化钛纳米棒阵列。实施例4将纳米棒阵列基板用去离子水清洗3次，至表面洁净后，泡入0. 04M/L NaOH溶液中30 分钟；再次将纳米棒阵列基板用去离子水清洗3次，泡入去离子水中，经紫外照射30分； 将400ul 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶解在50ml乙醇中，并且不断搅拌，放入37°C水浴中加热，并且将处理后的纳米棒阵列基板放入溶液中搅拌反应4小时，待反应完成后，将纳米棒阵列基板用乙醇清洗3次，放入烘箱中干燥；将0.15g 1-乙基-(二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐(EDC · HCL)溶于50ml MES缓冲液中，并且不断搅拌，放入37°C水浴中加热，并且将上述处理的纳米棒阵列基板放入溶液中6小时反应，待反应完成后，将纳米棒阵列基板用MES缓冲液清洗3次，用PBS缓冲液清洗1次；将纳米棒阵列基板放入300ug/ml 的Arg-Gly-Asp (RGD)/PBS缓冲液中，在37°C空气气氛中静置4小时；取出反应后的纳米棒阵列基板，用PBS缓冲液清洗3次，去离子水冲洗1次，冷冻干燥3天，得到嫁接RGD生物信号分子的二氧化钛纳米棒阵列。
权利要求
1.二氧化钛纳米棒阵列嫁接RGD生物信号分子的方法，其特征包括以下步骤1)将纳米棒阵列基板用去离子水清洗后，在0.02-0. 05M/L NaOH溶液中浸泡30分钟， 再次用去离子水清洗，紫外照射30分；2)将500 IOOOul3-氨丙基三乙氧基硅烷溶解在IOOml乙醇中，搅拌下放入37°C水浴中，并放入步骤1)处理的纳米棒阵列基板反应4小时后，用乙醇清洗，放入烘箱中干燥；3)将0.3g1-乙基-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐溶于100ml MES缓冲液中，搅拌下放入37°C水浴中，并放入步骤2)处理的纳米棒阵列基板反应6小时后，依次用MES缓冲液和PBS缓冲液清洗；4)将经步骤3)处理的纳米棒阵列基板放入100 300ug/ml的Arg-Gly-Asp/PBS缓冲液中，在37°C空气气氛中静置4小时后，取出依次用PBS缓冲液和去离子水冲洗，冷冻干燥。
2.根据权利要求1所述的二氧化钛纳米棒阵列嫁接RGD生物信号分子的方法，其特征是所述的纳米棒阵列基板为纯钛金属基板或者光滑平整的硅基板。
全文摘要
本发明公开的二氧化钛纳米棒阵列嫁接RGD生物信号分子的方法，其步骤包括首先是通过利用硅烷偶联剂将二氧化钛纳米棒阵列和硅烷相连，末端用氨基修饰，接着再通过酰胺反应将RGD嫁接到二氧化钛纳米棒阵列的表面，最终形成RGD生物信号分子表面修饰的纳米棒阵列。本发明在二氧化钛纳米棒阵列上嫁接RGD生物信号分子，过程操作简单，所需仪器普遍，易于产业化，可应用于生物医学骨组织修复材料等领域。
文档编号A61L27/50GK102327649SQ20111033897
公开日2012年1月25日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者刘洋, 杜丕一, 程逵, 翁文剑, 韩高荣 申请人:浙江大学