专利名称：一种基于交联技术的仿生骨界面、构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过同双官交联技术偶联生物信号重组纤维连接蛋白/钙粘附蛋白与双相钙磷陶瓷的仿生学界面。属于界面组织工程领域。
背景技术：
为使骨修复材料具有良好的生物活性和组织相容性，可按照仿生学原则进行修饰，即在不改变基体性能的前提下，将生物活性分子固定在人工合成材料或天然材料表面， 设计具有特定生物、理化特性的组织工程化材料，将“惰性”界面转变为利于种子细胞提供黏附、增殖和分化信号的生物界面。细胞在基材表面的特异性黏附主要由吸附的蛋白分子层决定。基材植入体内后， 可从周围体液中选择和摄取某些蛋白组分(如纤连蛋白，层粘连蛋白，玻璃粘连蛋白)，而多种蛋白在材料界面的竞争性吸附和解吸附的最终状态——Vroman效应，则决定了材料表面性质和种子细胞的生物学行为。由此出发，仿生修饰策略旨在通过物理、化学、生物学手段在基质材料-细胞作用界面“重建”具有一定三维结构和分子信号的的微环境，提高种子细胞在材料表面的种植密度、粘附效率和信号强度，诱导特定的细胞信号级联反应，引导细胞向特定组织靶点生长分化。其优势在于其充分认识到细胞外基质(hracellular Matrix,ECM)在骨发育、维持、愈合及重建中的作用，即ECM微环境与成骨细胞、骨祖细胞的对话和通讯的重要性。对材料进行表面修饰可以采用具有粘附特性的蛋白或多肽。早期多采用天然蛋白，如FN、胶原、层粘连蛋白，但成本高，可控性低，易引起免疫和交叉反应等因素限制了其使用。后期发现以上蛋白的细胞粘附位点仅由数个氨基酸组成的基序所决定，如位于 10FNIII的R⑶基序。多年来的深入研究已经较理想的通过仿生手段实现了 FN对组织工程材料的界面改性。其中最先选择，使用最广泛的是含RGD序列的多肽(模拟肽)，如四肽 RGDS,六肽GRGDSY，七肽GRGDSPC等。事实上，RGD并非仅存于FN，它是一类存在于多种粘附蛋白结构中的共有基序，如骨唾液蛋白和骨桥蛋白，因此将其修饰到材料表面可通过多种途径提高粘附效率。由此，第一代仿生表面修饰材料应运而生，即将RGD肽通过被动吸附的方法固定至材料表面。实验表明该表面对成骨细胞的粘附和成骨分化具有正向调控作用。 如Dee，Bearinger等在体外实验中分别将R⑶肽圈定在硼硅玻璃、石英、互穿聚合物网络等材料表面，发现其可增强成骨细胞粘附、增殖、和分化。此外，经RGD肽接合的植入物可更有效的促进植入物周边新生骨形成。Ferri^Kantlenheler等发现该界面上新生骨量面积、厚度等指标均优于空白对照。国内学者郑启新将RGD七肽共价交联至PLGA表面，发现其可更有效的促进间充质干细胞的粘附，细胞骨架再组装和早期成骨标志碱性磷酸酶活性增强。尽管与天然蛋白相比，RGD肽可控性强，然而由于缺乏附属或调节性结构域存在， 使其难以达到天然蛋白的高级结构和空间构象，故其生物活性受限。此外，表面参数如形态、构象、使用密度等，可严重影响RGD序列的功能。如有研究发现环形肽(cyclo-RGDFX) 在重建关节软骨时较线性肽(GRGDSPC)具有更长的生物半衰期和更低的基础效应密度。此
3外尚受使用密度和构象特异性限制，且存在在特定力场作用下脱吸附问题。为提高提高生物利用度，同时兼顾整合素亚型的特异性(如α 5 β 1)和非RGD位点结合的整合素亚型(如α2β1)的作用，第二代仿生修饰表面的改良策略是在RGD序列周围圈定足够的功能位点，以通过整合素和非整合素受体途径发挥作用。其中方法之一是多种短肽混合修饰，如Rezania等运用RGD和FHRRIKA (肝素结合基序)混合修饰表面可增加成骨细胞黏附和矿化。方法之二是核心基序R⑶和辅助序列PHSRN的互补性修饰。如 Dillow和Kao等将如上序列偶联或单独修饰于聚乙二醇多聚物表面，发现其与α 5β 1整合素的耦合强度、与巨噬细胞的粘附均显著增强。针对第一、二代仿生界面的修饰特点，Garcia等在大量针对FN分子结构和功能学研究的基础上，开发出一种可模拟天然蛋白一级、二级和三级结构的高分子量配基，如 FNII17-10、FNII19-10。该分子可在原核或真核生物系统内合理修饰、高效表达，理想地模拟了天然蛋白的构象效应，具有与血浆FN相同的生物效应。在促粘、促成骨分化方面具有其他多肽分子无可比拟的优越性。Cultler将FNIII7-10交联于聚苯乙烯表面，通过离心粘附实验和免疫荧光法发现该表面对成骨细胞MC3T3-E1的粘附效果和粘附斑的组装效率显著提高。Petrie通过系统的体内外实验分析了 FNIII7-10的作用效果及其机制。体外实验中将FNIII7-10接合在烷烃硫醇自组装分子层表面，利用表面等离子共振技术和ELISA调整优化材料表面配体密度，发现其较RGD七肽和RGD-PHSRN偶联肽具有更强的促进细胞增殖、黏附作用和粘附斑激酶磷酸化水平，同O时阐明其作用途径主要通过α 5β 1整合素。体内实验中，FNIII7-10被修饰在以乙二醇分子层为本底的医用钛板表面并植入兔胫骨皮质缺损处，发现4周后，此表面较单纯钛板和RGD修饰表面可更有效到促进骨髓干细胞在材料表面的成骨分化、基质矿化，硬组织切片和染色显示基质材料被更多的新生骨所替代。如上研究表明FNIII7-10 仿生修饰界面可在体内外更为高效的促进生物力学整合，在骨组织工程和再生医学领域具有巨大潜能。
发明内容
本发明为解决现有技术的不足，本发明提供一种基于DTBP交联模式的生物信号蛋白(⑶H-11-E(V2/FN III7_1Q)修饰的pBCP生物界面，其目的有二其一，旨在通过 FNIII7-10的“异嗜性”和CDH 11(⑶Hherin 11)的“同嗜性”作用增强骨祖细胞在材料界面的定植密度和骨细胞间作用强度，同时通过特异性整合素亚型介导的诱导作用提高成骨能力和矿化程度。其二，解决传统所用的涂层技术存在的吸收效率低下和特定情况下脱吸附的不足，本发明利用共价反应实现信号蛋白与支架材料间的稳固连接，提高生物配基在界面的分布强度，构建具有良好组织相容性的表面仿生微环境。本发明的技术解决方案如下本发明涉及一种通过同双官交联技术偶联生物信号重组纤维连接蛋白/钙粘附蛋白与双相钙磷陶瓷微孔界面，所述生物信号蛋白为携PHSRN和R⑶基序的FN 1117-10片段和钙粘附蛋白胞外功能域1-2 (OTH 11EC1-2)的重组蛋白，该蛋白命名为⑶H-11-ECh/FN III7-K1,支架材料为微孔双相钙磷陶瓷，命名为PBCP，交联分子为DTBP，一种属亚氨酸酯类的同双官交联剂，所述交联分子的间隔臂两端通过与氨基的乙酰化反应形成⑶H-Il-ECV2/
4FN 1117_1Q与pBCP间的桥接(NH2......NH2)。所述仿生界面命名为CDH-11-EC1VFN
III7_10-pBCP ；种子细胞为骨髓间充质干细胞、成骨细胞或成软骨细胞，根据所构建界面的组织工程类型选择。本仿生界面的主要构建步骤如下1.生物信号蛋白⑶H-Il-EC1VFN III7_1(1的设计、制备及纯化，参考专利文献 CN101463090 “纤连蛋白与钙粘附蛋白-11的融合蛋白、制备方法及应用”。2.支架材料pBCP的制备，由四川大学国家生物材料重点实验室提供。其制备方法为湿化学沉淀和发泡法。试样经X射线衍射测试，其中HA和TCP含量比为60/40 ；表面孔隙率在60% -70%,表面孔直径约50-500 μ m。3. CDH-11-EC^/FN III7_10-pBCP仿生界面的组装依次经过BSA封闭、PBS洗涤、 DTBP预交联、PBS洗涤、⑶H-II-EC1^FN III7^10融合蛋白孵育、PBS洗涤、甘氨酸溶液终止反应，完成界面制备。4. CDH-11-E(V2/FN III7_1(1-pBCP仿生界面的表征评价利用扫描电镜(SEM)、X光电子能谱(XPQ、蛋白吸附与表面密度测定等方法完成。5.体外功能学研究MTT法检测CDH-II-EC1VFn III7_10-pBCP仿生界面hMSCs细胞增殖情况，SEM观察hMSCs生长形态变化。离心促粘附实验检测对hMSCs细胞的粘附能力。 成骨标志物骨钙素(OCN)基因、蛋白表达和钙结节染色分析⑶H-Il-EC1ViFN III7_10-pBCP 仿生界面对hMSCs成骨分化和基质钙化的影响。本发明采用基于DTBP的交联策略，其反应条件温和，与亲核组蛋白的非特异反应少，亚氨酸酯反应产物并不影响蛋白的整体载荷，保留了蛋白的天然构象和生物活性。且所含特征性的二硫键(-S-S-)，便于对交联效率进行XPS检测。本发明所得的⑶H-11-E(V2/FN III7_1(1-pBCP仿生骨界面在应用方面具有促粘附、 促成骨的双重生物信号蛋白，并赋以支架材料的微孔空间结构以增加表面修饰面积和细胞粘附、基质矿化体积等优点。本发明可在组织工程化骨、软骨、骨膜的构建中使用，为生物活性支架材料界面的建立提供一种有效的技术方法。
图1 示 CDH-II-EC1Vfn III7_10-pBCP 仿生界面的构建模式a. CDH-11_EC1_2/FN III7_1Q三维立体结构显示位于融合蛋白中的赖氨酸基团(lysine) ；b. DTBP的分子结构式； c. CDH-11-ECn/FNIII^-pBCP仿生界面的构建流程和尺寸比例；图2示CDH-11-EC1VFN II 17_1(1仿生修饰对BCP界面微观结构的影响。a_d，未修饰界面在lk、5k、10k和20k倍下的SEM图像；e_h，修饰后界面在lk、5k、10k和20k倍下的 SEM图像；图3示XPS技术下全谱分析仿生修饰前后各表面元素分布a，阴性对照组单纯 BCP 表面主要存在四种元素碳(Cc_c = 248. 8eV，Cc = 0 = 289. 4eV)、钙(Ca 2p = 346. 6eV, Ca 2s = 437. 8eV)、磷(P 2p = 133. OeV, P 2s = 190. OeV)和氧(531. 8eV)。d :试样组 CDH-II-EC1VFn III7_1Q-pBCP表面在401. OeV附近出现一个明显的氮峰；b、c为对照组(CDH ll-pBCP、FN-pBCP)。图4示CDH-II-EC1VfN III7^10在pBCP表面的蛋白吸附与表面密度测定结果a. SDS-PAGE法定量未吸附蛋白；b.表面配基密度统计图5 示 hMSCs 细胞在 CDH-II-EC1VFn III7_1(1-pBCP 的生长曲线；图6 示 CDH-II-EC1VFn III7_10_pBCP 界面对 hMSCs 生长形态的影响:A_B，C-D, E-F. G-H,低倍(250 X)和高倍(1800 X)下 hMSCs 分别在 BCP、CDH-pBCP、FN-pBCP 和 CDH-II-EC1VFNIII7_1Q-pBCP 界面的生长形态；图7示hMSCs在不同BCP处理表面粘附的定量、定性分析(a)不同条件下BCP表面密度与细胞粘附数量的关系。(b)-(e)荧光显微镜下细胞在不同BCP表面的粘附状况。 (标尺200 μ m)图 8 示 CDH-II-EC1VFn III7_1(|-pBCP 表面 hMSCs 的 OCN 基因、蛋白表达水平；图9示PCR反应条件图；图10示CDH-I 1-ECh/FN III7_10-pBCP表面钙结节形成情况(a)未染色前于光镜下观察到的钙结节；(b)不同BCP表面hMSCs经茜素红染色后钙结节差异性表达1-4分别为空白组(BCP)、对照组 1 (CDH 11 -pBCP)、对照组 2 (FN-pBCP)、试样组(CDH-11-EC1V FNIII7_10-pBCP)。
具体实施例方式以下结合实施例详细说明本发明的构建过程1. CDH-II-EC1VFn III7_10-pBCP 仿生界面的组装，参见图 1 采用同双官交联的方法，将融合蛋白⑶H-11-E(V2/FN III7_10通过共价结合的方式固定到材料界面。所采用的同双官交联剂为DTBP(C8H18N2Oj2Cl2)，该物质属于亚氨酸酯类， 具有水溶性，可透膜，其间隔臂(spacer arm)两端可通过与氨基的特异性反应形成两种分子之间的桥梁样结构，是目前用于蛋白连接反应的常用试剂。该仿生界面构建的简要步骤如下所述，(1).封闭BCP置于85°C热变性1 %的BSA溶液中浸泡过夜)，封闭材料表面的非特异性结合位点，同时为材料表面提供充足的氨基基团。(2).洗涤PBS溶液洗涤上述BCP :5minX2次。(3).交联适当体积的DTBP溶液(20mM，pH 8. 5，以淹过材料表面为准)，室温孵育 l-2hr。(4)洗涤PBS溶液洗涤上述BCP :5minX 2次。(5).连接过量的融合蛋白溶液，4°C孵育过夜。(6).洗涤PBS溶液洗涤上述BCP :5minX 2次。(7).终止适当体积的甘氨酸溶液，使终浓度为50mM，终止反应。2. CDH-II-EC1VFn III7_1Q-pBCP 仿生界面的表征评价，为考察⑶H-11-EC^/FN III7_1(1-pBCP仿生界面的生物、理化性质，以期了解该界面在表面化学、微观形貌、粗糙度、亲疏水性和表面配基密度等特征，并判断该界面上细胞生长的适宜程度和组织相容性。(1).扫描电镜(SEM)，参见图2 利用聚焦的电子束照射试样表面，通过二次电子或被散射电子成像进行形貌观察。试样制备界面室温晾干48hr后，真空抽干Mhr，喷射仪表面镀钼金膜后即可用于SEM 检测。
操作步骤如下①样品放入电镜试样室放气一降低平台高度一固定样品杯一抽真空10_3帕。②图像获取根据试样性质选择加速电压30kV —平移、倾斜样品台一先低倍后高倍获得原始图像。③图像分析调节物镜电流一调整焦距一获得、分析图像。O). X光电子能谱(XPS)，参见图3 ①.试样制备界面室温晾干48hr后，真空抽干Mhr即可用于XPS检测。②.检测方法样品仓真空压力为2X10_7torr，样品台倾斜角为20°，采用AlKa 靶源作为离子枪进行激发，工作电压和电流设置为UkeV和15mA。首先通过对样品在整个光电子能量范围(O-IlOOeV)进行全扫描(全谱)，以确定样品中存在的元素；然后再对所选择的峰峰进行窄扫描，以确定化学状态(半谱)。校正标准为有机污染碳的Cls的结合能 (284. 8eV)。③.分析方法定性分析以实测光电子谱图与标准谱图相对照，根据元素特征峰位置(及其化学位移)确定固态样品表面中存在哪些元素(及这些元素存在于何种化合物中)，参照标准为Perkin-Elmer公司的X射线光电子谱手册。定量分析灵敏度因子法。利用SPSS10. 0软件首先对各组样本数据进行均值检验，得到各组均值及标准差，在此基础上采用独立样本T检验分析各组有无统计学差异及其有效性，P < 0. 05为显著统计学差异。(3).蛋白吸附与表面密度测定参见图4 ①BCP依次经1 % BSA封闭，过夜)、20mM DTBP交联(室温，2hr)和梯度浓度 CDH-II-EC1ViFN ΙΙΙ7_1(Ι (0、0· 1、1. 0、2· 5、5· 0、10. 0、15. 0 μ g/ml)连接后 G°C，过夜)。②BCP收集残液，向其中加入等量2X SDS样品缓冲液(0. lmol/L Tris · Cl, 20% 甘油，4% SDS,0. 溴酚蓝，10% 3-1幻，沸水加热5!^11制成样品液。③SDS-PAGE电泳分别将如上标本50ul用微量移液器加入凝胶上样孔内，接通电源，70V电泳约20min，待样品电泳至分离胶界面时，将电压升为100V，继续电泳至溴酚蓝指示剂达凝胶下缘，停止电泳。④考马斯亮蓝R250染色、冰醋酸脱色。⑤Doc 2000凝胶扫描系统记录图像，分析条带光密度值。⑥分析将预设标准浓度的0、0. 1,1. 0,2. 5,5. 0,10. 0、15. 0 μ g/ml蛋白行 SDS-PAGE电泳，建立蛋白条带光密度标准曲线。目的蛋白条带光密度值与标准曲线对照，从而得到测量值。表面配基密度采用上述结果，根据下方公式计算而得
蛋白初始量-未吸附蛋白量(fmol)
表面配基密度=_
蛋白分子量(dalton)x表面积(cm2)3.人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的分离培养1.经体检正常的门诊病人知情同意后，采用髂前上棘穿刺的方法获得骨髓，加入无菌肝素抗凝管低温保存(具体由新桥医院血液科完成)。2.采用密度梯度离心贴壁筛选法，具体操作步骤如下
(1)收集骨髓:3ml，加入等量无菌PBS液轻柔洗涤，1000rpm/min离心5min收集细胞。(2)弃上清及脂肪层，收集沉淀，加入无菌PBS液3ml重悬细胞，充分混勻。(3)将细胞悬液缓慢加入等体积的percoll细胞分离液(Pharmacia，美国)上， 2000rpm/min低温离心2min，收集白膜层的单个核细胞。(4)无菌 PBS 液洗涤、离心(1000rpm/min，5min) 2 次，弃上清。(5)加入含10% 85的01^1/^12培养基(Hyclone，美国)重悬细胞，按IO5-IO6的密度接种于无菌50ml培养瓶内。在37 °C、50 % C02、饱和湿度恒温细胞培养箱内培养Mhr。(6)细胞转种Mhr后行首次换液，弃去未贴壁细胞，加入含10% FBS的DMEM/F12 培养基，在37°C、50% C02、饱和湿度恒温细胞培养箱内连续培养。(7)后每日在倒置像差显微镜下观察细胞生长情况，每2-3天换液一次，带细胞生长至3-6代、融合率达70% -80%时即可用以成骨诱导分化实验。4. CDH-II-EC1VFn III7_10-pBCP 对 hMSCs 增殖率和活力的影响，参见图 5 采用MTT法检测hMSCs细胞增殖情况，绘制细胞生长曲线，不同处理方式BCP界面是否影响其增殖和存活。具体方法如下(1)界面处理将制备好的BCP界面置于96孔细胞培养板，蛋白面朝上。(2)细胞接种常规方法制备hMSCs单细胞悬液(第3-6代)，以2000/孔的初密度接种于96孔培养板，每孔培养基总量200 μ 1。37°C,5% C02、适度饱和的培养箱中培养 1-9天，隔日换液一次。(3)加入5mg/ml的MTT液(Sigma，美国)100 μ 1，细胞培养箱中继续孵育3_4hr。(4)吸出孔内培养液，加入DMSO液(150 μ 1/孔)，将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10-20min，使结晶物溶解。(5)将变色的各孔溶液转入另一 96孔培养板内，酶标仪检测并记录各孔OD值(检测波长570nm)。5. CDH-II-EC1VFn III7_1(1-pBCP 对 hMSCs 生长形态的影响，参见图 6 (1)常规无菌技术消化、离心收集hMSCs，将300 μ 1细胞悬液以1000/片的初密度接种在CDH-II-EC1VFN III7_10-pBCP界面，在37°C、50% C02、饱和湿度恒温细胞培养箱内连续培养2-4hr，直至细胞充分贴壁。补加FBS-DMEM/F12培养基至600 μ 1，持续培养48hr。⑵取出载有hMSCs 的 CDH-II-EC1VFn III7_1Q-pBCP，无菌 PBS 液漂洗一次。3% 戊二醛固定2小时以上。(3)梯度浓度酒精脱水(50 %、70%、80%、90%、95%各15分钟，室温)。(4)换相同梯度浓度叔丁醇连续脱水15分钟。(5)真空干燥Mhr。真空镀膜仪喷金镀膜后即可用于SEM检测。(6)样品放入电镜试样室放气一降低平台高度一固定样品杯一抽真空10-3帕。(7)图像获取根据试样性质选择加速电压30kV —平移、倾斜样品台一先低倍后高倍获得原始图像。(8)图像分析调节物镜电流一调整焦距一获得、分析。6. hMSCs细胞在CDH-II-EC1VFn III7_10-pBCP表面的粘附效果离心促粘附实验， 参见图7
(1)界面处理将制备好的BCP界面置于96孔细胞培养板，蛋白面朝上。(2)细胞处理将培养至3-6代、生长融合至70% -80%的hMSCs按照标准细胞操作技术消化、收集，制成密度为105/ml的单细胞悬液。(3)细胞核标记将0. 5mg/ml的Hoechst 33342 (Sigma，美国)母液加入单细胞悬液，使其终浓度为5μ g/ml。避光冰浴20min，使细胞核充分染色。(4)细胞种植将标记后细胞以100 μ 1/孔的体积(即IO4个细胞/孔)加入96 孔培养板各孔BCP表面，全程暗室避光操作。(5)正离心及计数将上述96孔培养板置入平板离心机卡槽，40C，100rpm/min离心5min，加速细胞贴壁。在360nm的激发波长和465nm的发射波长下，用酶标仪读取各孔初始荧光强度1并记录。(6)翻转离心将96孔培养板各孔用保鲜膜封闭，翻转置入平板离心机卡槽，4°C， lOOrpm/min离心5min。弃膜，弃培养基，并用消毒滤纸吸去多余液体使其干燥。在上述波长下读取、记录各孔荧光强度2。(7)加入胰酶ΙΟΟμ 1/BCP消化已粘附的hMSCs，用移液器反复吹打，直至充分洗
脱。同法读取、记录各孔荧光强度3。(8)置于细胞培养箱贴壁2_4hr，荧光倒置显微镜下观察各孔细胞粘附形态，并用 NikonTE-300相机拍摄记录。(9)统计与分析该检测过程中共读取荧光值3次，前2次反映IO4个细胞的总荧光强度，第3次为翻转离心后的荧光强度，反映了实际粘附的细胞数。按下式计算粘附细胞数量
粘附细胞数C个/BCP) = ^gsxiOOOO^
荧光强度17. hMSCs细胞在CDH-II-EC1VFn III7_1Q-pBCP表面的成骨能力和矿化(1)细胞处理诱导成骨分化。①hMSCs接种将生长至第3-6代、融合率达70% -80%的hMSCs常规消化收集， 制成密度为104/ml的单细胞悬液。以200 μ 1/孔的体积(即2000个细胞/孔)加入M孔培养板各孔BCP表面，补加含5% FBS的DMEM/F12培养基至0. 5ml，在37°C、50% C02、饱和湿度恒温细胞培养箱内连续培养Mhr。②成骨诱导将贴壁培养Mhr的hMSCs弃培养基，加入成骨诱导培养基各 0. 5ml (DXM0. ΟΙμΜ, β-GP 0. 01Μ, Vit-C 0.05mg/ml，均为(Roche，美国)产品在 37°C、50% C02、饱和湿度恒温细胞培养箱内连续培养10-14天。其间2-3更换成骨诱导培养基一次。O) OCN基因表达分析，参见图8 通过实时荧光定量-逆转录PCR(Realtime RT-PCR)的方法对成骨晚期标志物OCN 的基因表达水平进行鉴定。①hMSCs总RNA的提取取成骨诱导14天的hMSCs，无菌PBS液洗涤BCP表面2次。 加入RNA提取液Trizol (Invitrogen，中国)Iml/孔，反复剧烈吹打细胞使其裂解，倒置显微镜下观察直至细胞完全裂解为碎片。分装至无酶无菌EP管中，4°C，12000 X g离心5min，将上清转移至新的1.5ml EP管中。按氯仿Triz0I = I 5的比例加入冰冻氯仿200 μ 1/管，上下剧烈颠倒15s，室温静置10min，4°C，12000Xg，离心15min。吸取上层水样层，移至新的无酶无菌EP管，加入预冷的异丙醇(500 μ 1/lmlTrizol)，混勻后室温沉淀20min，4°C， 12000Xg离心lOmin。弃上清，加入Iml 75%乙醇(用DEPC处理过的水新鲜配制)，洗涤沉淀，4°C，7500 X g离心5min。弃上清，室温干燥5-10min，待RNA基本透明时，加入30 μ 1 RNase-free水，至完全溶解，行纯度检测取1μ 1 RNA溶液加入99μ1 DEPC水，在紫外线分光光度计上测定Α260和Α280的OD值，求出Α260/Α^0的比值，要求比值在1. 8 2. O之间方可用以后续逆转录。②OCN与GAPDH弓丨物设计在NCBI基因库Genebank中检索人来源OCN，设置GAPDH为内参照。根据Realtime PCR的要求，设计扩增片段长度100-200bp的引物对。引物信息详见下表
权利要求
1.一种基于交联技术偶联生物信号重组纤维连接蛋白/钙粘附蛋白与双相钙磷陶瓷的仿生界面，其特征在于，所述生物信号蛋白为纤连蛋白(FN)与钙粘附蛋白-11 (⑶H 11) 的融合蛋白，功能域为携PHSRN和RGD基序的FN 1117-10片段和钙粘附蛋白胞外功能域 1-2 (CDH 11 EC1-2)，命名为 CDH-Il-EC1Vi FN III7_10 ；支架材料为微孔双相钙磷陶瓷，命名为PBCP，交联分子为DTBP，一种属亚氨酸酯类的同双官交联剂，所述仿生界面命名为CDH-11-E(V2/FN III7_10-pBCP ；种子细胞为骨髓间充质干细胞、成骨细胞或成软骨细胞，根据所构建界面的组织工程类型选择。
2.根据权利要求1的仿生界面，其特征在于，所述交联分子的间隔臂两端通过与氨基的乙酰化反应形成⑶H-II-EC^2/ FN 1117_1(1与？80 间的桥接(NH2……NH2),属共价键连接， 不同于基于被动吸附原理的涂层/喷涂技术。
全文摘要
本发明涉及一种基于交联技术的仿生骨界面、构建方法及应用，策略为共价偶联生物信号——重组纤维连接蛋白/钙粘附蛋白与钙磷陶瓷微孔界面。目的是促进种子细胞在界面上的高效粘附和靶向分化。属于界面组织工程领域。所述信号蛋白为携PHSRN和RGD基序的FNIII7-10和钙粘附蛋白功能域EC1-2的重组蛋白。所述交联分子为同双官交联剂DTBP，可通过氨基乙酰化实现蛋白与材料间桥接。旨在通过信号蛋白“同嗜”和“异嗜”性粘附、及整合素亚型介导的成骨诱导，提高种子细胞在界面的定植密度和矿化能力。实施中从表观拓扑、表面化学、细胞相容性等角度鉴定界面特征。本发明适于复合细胞的生物活性组织工程替代材料的制作。
文档编号A61L27/54GK102430153SQ201110439419
公开日2012年5月2日 申请日期2011年12月24日 优先权日2011年12月24日
发明者初同伟, 周跃, 张峡, 张瑗, 朱洁 申请人:中国人民解放军第三军医大学第二附属医院