A蛋白晶体和交联晶体及其使用方法

专利名称：A蛋白晶体和交联晶体及其使用方法
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该申请要求于2009年9月15号提交的美国临时申请第61/242，537号的权益，其公开内容通过引用以其整体结合于本文中。背景
A蛋白是最初在细菌金黄色葡萄球菌{Staphylococcus aureus)的细胞壁中发现的40-60 kDa表面蛋白。由于其结合免疫球蛋白的能力，所以其可用于生化研究。A蛋白结合来自许多哺乳动物物种的蛋白，最著名的是IgG。其通过与重链相互作用，与免疫球蛋白的Fe区结合。重组的葡萄球菌A蛋白往往在大肠肝菌(JL coif)中生产用于免疫学及其它的生物研究。A蛋白常与其它分子例如荧光染料、酶、生物素、胶体金或放射性碘偶联而不影响抗体结合位点。其还广泛用于与磁珠、胶乳珠粒和琼脂糖珠粒偶联。A蛋白常固定化于固相 支持体上并用作用于从粗制蛋白混合物例如血清或腹水液中纯化总IgG的可靠方法，或与以上标记物中的一种偶联以检测抗体的存在情况。利用与珠粒缀合的A蛋白的免疫沉淀研究也常用于通过针对目的蛋白或蛋白复合体的抗体间接地纯化蛋白或蛋白复合体。此外，其广泛用于来自多种来源的单克隆抗体的纯化。发明简述
本发明部分涉及A蛋白交联蛋白晶体(CLPC)的制备，例如生产以便开发用于抗体的纯 化的革新A蛋白系统(例如色谱系统)。A蛋白CLPC提供了高度浓缩的A蛋白活性联合高稳定性和耐化学性的优点。浓缩的A蛋白的浓度减小了柱的大小(若使用的话)、缓冲液体积和处理时间。此外，A蛋白晶体的交联可防止或减少例如免疫球蛋白(例如抗体)的纯化(例如，使用色谱)期间A蛋白的浸出(leaching)。总之,这可减少抗体生产时间和成本。本发明涉及A蛋白的晶体及其交联形式(“A蛋白-CLPC或CLPC”)或其衍生物及其在纯化免疫球蛋白/抗体或相应的Fab片段或Fe片段(例如来自细胞培养物的多克隆抗体、单克隆抗体；治疗性抗体；来自细菌培养物、血清、血浆的抗体)中的用途，A蛋白的此类晶体用于免疫沉淀和体外装置的用途。本文公开了包含A蛋白的结晶形式的组合物。该实施方案为包含A蛋白的交联晶体(CLPC)形式的组合物。在另一个实施方案中，A蛋白晶体用戊二醛交联。在一些实施方案中，A蛋白晶体用约0. 02%-约4% (重量体积比)的戊二醛交联。在又另外的实施方案中，A蛋白晶体用约1.00% (重量体积比)的戊二醛交联。本文公开的组合物比A蛋白的非结晶形式更有活性，因为其具有更高的结合容量。在该实施方案中，A蛋白的结晶形式的结合容量在pH 7下比可溶的固定化形式的结合容量闻至少约100%。在又一个实施方案中，交联的A蛋白晶体具有A蛋白的非晶体固定化形式的结合容量的至少约150%。在本发明的实施方案中，本发明的A蛋白晶体在约pH 2-约pH 12是稳定的(保
持其结合容量)。在另一个实施方案中，本文公开的A蛋白晶体与固定化的非晶体A蛋白相比具有
0. 0%蛋白浸出。
本文还公开了晶体A蛋白组合物在预填充柱中作为柱材料或在膜(浸溃的)中或在体外装置中的用途。在本发明的又一个实施方案中，本文公开了包含在此公开的晶体A蛋白组合物的试剂盒。此类试剂盒可包含其它试剂、纯化装置以及使用本文所述的晶体A蛋白组合物的说明书。在一个实施方案中，晶体A蛋白可预填充于柱中用作抗体和抗体片段的纯化材料，例如从哺乳动物细胞培养物中纯化单克隆抗体、纯化表达于转基因奶中的单克隆抗体或纯化血清中产生的多克隆抗体。本文还公开了从重组的可溶性A蛋白中产生蛋白晶体的方法。本文还公开了包含A蛋白晶体及其交联形式("CLPC")的组合物，例如药物组合物。
在一个方面，本发明提供了交联A蛋白晶体。交联剂可为多功能的，并且在某些实施方案中，该试剂为双功能试剂，例如戊二醛。在某些实施方案中，A蛋白晶体用基本不改变结合容量的浓度的戊二醛交联，例如以至少约0.02%(重量体积比)的浓度。在一些实施方案中，A蛋白晶体的交联水平等于通过用0. 02%(重量体积比)戊二醛进行的处理产生的交联水平。交联水平可通过本领域已知或本文公开的方法例如确定蛋白浸出的水平来确定。本发明还提供了 A蛋白晶体，例如与可溶性A蛋白相比具有较高结合容量例如高至少约100%、200%、300%、400%、500%或更多的A蛋白晶体。本发明还提供稳定化例如交联的A蛋白晶体，其中所述稳定化晶体在酸性条件下保留的结合容量和/或稳定性为相似的酸性条件(例如在约2-3的酸性pH)下由可溶性A蛋白保留的结合容量和/或稳定性的至少2倍、3倍。在一些实施方案中，在酸性条件下稳定化A蛋白晶体具有比可溶性A蛋白多至少约200%、300%、400%的结合容量和/或稳定性。本发明还提供稳定化例如交联的A蛋白晶体，其中在蛋白酶存在下所述稳定化晶体保留的结合容量和/或稳定性为相似条件下由可溶性A蛋白保留的结合容量和/或稳定性的至少2倍、3倍。在一些实施方案中，稳定化A蛋白晶体在蛋白酶存在下具有比可溶性A蛋白多至少约200%、300%、400%的结合容量和/或稳定性。所述蛋白酶可选自例如胃蛋白酶、糜蛋白酶或胰酶中的一种或多种。在其它的实施方案中，稳定化或可溶性A蛋白的结合容量在将稳定化晶体或可溶性A蛋白暴露至酸性条件和/或蛋白酶达预定时间长度(例如至少一、二、三、四或五小时)后检测。在相关方面，本发明表征了一种交联的A蛋白晶体，其在可变的pH条件(例如约pH 2.0或3至约pH 7. 5或约pH 8. 5至约pH 10-14)下和/或蛋白酶(例如蛋白酶可选自以下的一种或多种胃蛋白酶、糜蛋白酶或胰酶)存在下基本稳定。在又另外的实施方案中，交联晶体在酸性条件(例如约2-3的酸性pH)下和存在如本文所述的蛋白酶下保留其结合容量为由可溶性A蛋白保留的结合容量的至少约2倍、3倍。在另外的实施方案中，稳定化A蛋白晶体在酸性条件(例如约2-3的酸性pH)下和存在如本文所述的蛋白酶下比可溶性A蛋白更稳定至少200%、300%、400%。本文还公开了包含所述晶体和/或交联的A蛋白晶体的组合物例如药物组合物。在一些实施方案中，所述晶体包含具有与天然来源例如金黄色葡萄球菌或相关菌株中存在的A蛋白序列相同或基本相同的序列的A蛋白。在其它的实施方案中，A蛋白通过重组的方式产生。在另一个方面，本发明提供浸溃有交联蛋白晶体的膜、生产及使用所述膜的装置、系统和方法用于各种合适的应用，包括，例如抗体和抗体片段的纯化以及透析治疗期间免疫球蛋白的去除。在这点上，本发明的A蛋白浸溃膜可结合抗体和抗体片段。这可有效使纯化所需的缓冲液的量最小化，从而最大限度降低成本。在另一个实施方案中，本发明提供了包含浸溃有约3. 25mg/cm2或更少交联蛋白晶体的膜的材料。优选地，膜用交联A蛋白晶体(“A蛋白CLPC”)浸溃。用A蛋白-CLPC浸溃的膜可用于分离和纯化免疫球蛋白并可类似于固定化A蛋白重复使用。
在又一个实施方案中，本发明提供了生产浸溃有交联蛋白晶体(优选A蛋白-CLPC)的膜的方法。该方法包括制备制膜液。所述制膜液包含含聚合物基质材料(例如聚氨酯)的溶剂例如I-甲基-2-吡咯烷酮(“NMP”)、二甲基甲酰胺(“DMF”)等或其组合。所述制膜液还可包含填充剂例如氧化锆和试剂例如聚乙烯吡咯烷酮(“PVP)以使膜更亲水。接着将制膜液与适量的A蛋白-CLPC混合，使得将所述膜用约3. 25mg/cm2的A蛋白-CLPC浸溃。然后可将该溶液散布于支持材料(例如合成的网状材料)上，并在合适的条件下浸于含水介质中，从而形成膜沉淀物。随后将所述膜沉淀物在甘油溶液(优选40:60比率的甘油和水的混合物)中干燥。本发明的一个优点在于提供了改良的蛋白浸溃膜，其适用于各种不同的应用例如抗体纯化和免疫沉淀。本发明的另一个优点在于提供了改良材料，其与固定化A蛋白不同，能够结合抗体而无需任何惰性支持物。在又一个方面，本发明提供了一种通过给予包含如本文所公开的A蛋白晶体例如交联A蛋白晶体的组合物例如药物组合物来降低受试者中的免疫球蛋白浓度(与升高的免疫球蛋白浓度相关的病症)的方法。在该方面的一个实施方案中，A蛋白晶体通过交联剂例如戊二醛来稳定。组合物的给予可导致免疫球蛋白浓度减少至少约10%、至少约20%、至少约30 %、或至少约40 %或更多。在一些实施方案中，所述组合物通过口服或经由体外装置给予。在另一个实施方案中，体外装置为导管，例如涂布有A蛋白晶体的导管。在又一个实施方案中，降低哺乳动物中的免疫球蛋白浓度的方法包括测定哺乳动物生物样品(例如血液、血浆或血清样品)中的免疫球蛋白浓度的步骤。在另一个方面，本发明提供了包含A蛋白晶体例如交联A蛋白(例如如本文公开的晶体和/或交联晶体)的组合物，例如药物组合物。在又一个方面，本发明提供了一种治疗哺乳动物的方法，所述方法通过给予有效量的包含A蛋白晶体例如交联A蛋白晶体(例如如本文公开的晶体和/或交联晶体)的药物组合物/将有效量的所述药物组合物作为在透析装置(体外装置)中的吸附剂来进行。在又一个实施方案中，结晶步骤包括浓缩纯化的蛋白，接着加入沉淀试剂从而形成结晶蛋白。所述结晶步骤还可包括使结晶蛋白与交联剂例如本文公开的交联剂(例如戊二醛)接触。所用交联剂的浓度可为约0. 01%-20%重量体积比；典型地约0. 02%-10%重量体积比；更典型地约0. 02%、0. 5%或1%重量体积比。 在其它的实施方案中，制备中结晶蛋白的收率为可溶性A蛋白悬浮液中存在的特定蛋白的至少约50%、60%、70%、80%。在其它实施方案中，结晶蛋白的收率为可溶性制备物中存在的特定蛋白的至少约90%、95%或更高。在又另外的实施方案中，结晶蛋白的收率为可溶性制备物中存在的特定蛋白的至少约50%、60%、70%、80%。本发明还提供了由本文公开的方法产生的蛋白晶体(例如A蛋白晶体)。在一些方面，本公开内容表征了 A蛋白晶体。在一些方面，本公开内容表征了 A蛋白交联蛋白晶体(CLPC)，例如，如本文所述交联的A蛋白交联蛋白晶体。在一些方面，本公开内容表征了包含A蛋白晶体和另一种成分(例如缓冲液，例如Tris缓冲液)的组合物。在一些方面，本公开内容表征了包含A蛋白交联蛋白晶体(CLPC)和另一种成分 (例如缓冲液，例如Tris缓冲液)的组合物。在一些方面，本公开内容表征了制备例如如本文所述的A蛋白晶体的方法。在一些方面，本公开内容表征了包含制备例如如本文所述的A蛋白交联蛋白晶体(CLPC)的方法。在一些方面，本公开内容表征了包含A蛋白晶体和另一种组分(例如使用说明书)的试剂盒。在一些方面，本公开内容表征了包含A蛋白交联蛋白晶体(CLPC)和另一种组分(例如使用说明书)的试剂盒。在一些方面，本公开内容表征了使用例如如本文所述的A蛋白晶体例如以纯化免疫球蛋白例如抗体(例如治疗性抗体)的方法。在一些实施方案中，防止或减少A蛋白的浸出(例如相比于相同条件下使用非晶体形式的A蛋白时的浸出量减少了约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约100%或减少至约1/2、约1/5或约1/10)。在一些方面，本公开内容表征了使用例如如本文所述的A蛋白交联蛋白晶体(CLPC)例如以纯化免疫球蛋白例如抗体(例如治疗性抗体)的方法。在一些实施方案中，防止或减少A蛋白的浸出(例如相比于相同条件下使用非晶体形式的A蛋白时或非交联形式的A蛋白晶体时的浸出量减少了约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约100%或减少至约1/2、约1/5或约1/10)。在一些方面，本公开内容表征了使用例如如本文所述的A蛋白晶体例如以纯化免疫球蛋白例如抗体(例如治疗性抗体)的方法。在一些实施方案中，每mL A蛋白的结合容量增加了(例如相比于固定化条件(例如使用支持物)下使用非晶体形式的A蛋白时的结合量增加了约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约100%或更多或者增加至约2倍、约5倍或约10倍或更多)。在一些方面，本公开内容表征了使用例如如本文所述的A蛋白交联蛋白晶体(CLPC)例如以纯化免疫球蛋白例如抗体(例如治疗性抗体)的方法。在一些实施方案中，A蛋白的结合容量增加了(例如相比于固定化条件(例如使用支持物)下使用非晶体形式的A蛋白时或非交联形式的A蛋白晶体时的结合量增加了约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约100%或更多或增加至约2倍、约5倍或约10倍或更多)。
在一些方面，本公开内容表征了包含A蛋白晶体的柱(例如层析柱)。在一些方面，本公开内容表征了包含A蛋白交联蛋白晶体(CLPC)的柱(例如层析柱)。在一些方面，本公开内容表征了包含A蛋白晶体的膜(例如全纤维(holofiber)系统)。在一些方面，本公开内容表征了包含A蛋白交联蛋白晶体(CLPC)的膜(例如全纤维系统)。本文公开了使A蛋白结晶的方法，其中使A蛋白溶解或浓缩，和向溶解或浓缩的蛋白加入沉淀试剂以形成晶体。本文公开了纯化免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤(a)将包含免疫球蛋白的 介质与具有在约pH 7. 0-pH 10范围内的pH并包含阳离子和阴离子的组合的缓冲溶液混合，以提供缓冲的免疫球蛋白介质；(b)将所述缓冲的免疫球蛋白介质与固定化A蛋白(A蛋白-CLPC :通过使A蛋白分子结晶和交联来固定化A蛋白)吸附剂接触以在所述固定化A蛋白吸附剂上吸附所述缓冲的免疫球蛋白介质中存在的免疫球蛋白；(c)用所述缓冲溶液洗涤其上吸附有免疫球蛋白的A蛋白-CLPC吸附剂；(d)将其上吸附有免疫球蛋白的所述A蛋白-CLPC吸附剂与具有约pH 2-pH 6范围内的pH的缓冲溶液接触以从A蛋白-CLPC吸附剂中移出被吸附的免疫球蛋白；和(e)以基本纯的形式回收移出的免疫球蛋白。在该方法的另一个实施方案中，所述方法在包含本文所述的A蛋白的晶体组合物的柱中完成。在该方法的又一个实施方案中，缓冲的免疫球蛋白介质与A蛋白-CLPC吸附剂的接触在包含A蛋白-CLPC吸附剂的柱中完成。在该方法的另一个实施方案中，包含免疫球蛋白的介质为正常的哺乳动物血清、或免疫哺乳动物血清，例如血浆或腹水液。在其它的实施方案中，免疫球蛋白介质获自杂交瘤、组织培养液、细胞培养液、哺乳动物细胞培养液、细菌细胞培养液、转基因来源的液体、植物提取物或酵母培养液。在纯化方法的一些实施方案中，缓冲溶液具有在约pH 7.0-约pH 10范围内的PH并且所述缓冲溶液为甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液或磷酸盐缓冲液。在纯化方法的又另外的实施方案中，缓冲溶液具有约0. OlM-约0. 25M或约0. 05M-约0. 5M的浓度范围。在纯化方法的又另外的实施方案中，缓冲溶液具有在约pH 2-约pH 6范围内的pH并具有约0. OlM-约0. 25M的浓度。在纯化方法的一些实施方案中，缓冲溶液为醋酸-醋酸盐缓冲液并具有在约pH 2-约pH 6范围内的pH。在纯化方法的另一个实施方案中，缓冲溶液包含约I. OM-约I. 5M浓度的钾离子和磷酸根离子。在纯化方法的另一个实施方案中，缓冲溶液包含约I. OM-约I. 5M浓度的铵离子和磷酸根离子。在纯化方法的又一个实施方案中，缓冲溶液包含约I. OM-约I. 5M浓度的铵离子和硫酸根离子。在纯化方法的一些实施方案中，缓冲溶液包含约I. OM-约I. 25M浓度的钠离子和硫酸根离子。在又另外的实施方案中，缓冲溶液包含约I. OM-约I. 25M浓度的钠离子、磷酸根离子和氯离子。在该纯化方法的又另外的实施方案中，固定化A蛋白吸附剂为不含任何支持物的结晶和交联的A蛋白。在又另外的实施方案中，所述吸附剂为与磁性颗粒连接的不含任何支持物的结晶和交联的A蛋白。本文公开了利用A蛋白层析法从污染溶液中来纯化蛋白的方法，所述方法包括以下步骤(a)将待纯化的蛋白吸附至固定的固相结晶并交联的A蛋白；(b)通过用具有约5-约7范围内的pH并包含选自氯化四甲铵(TMAC)、氯化四乙铵(TEAC)、氯化四丙铵和氯化四丁铵的电解质的电解质溶剂洗涤固相，来移除与固相结合的污染物；和(c)从固体中回收蛋白。在该方法的一些实施方案中，待纯化的蛋白为免疫球蛋白、抗体或其片段。在该方法的又另外的实施方案中，待纯化的蛋白为多克隆抗体、单克隆抗体或嵌合抗体或其片段。在该方法的另外的实施方案中，所述固相为在柱中的结晶A蛋白或在柱中的结晶交联A蛋白。在从污染溶液中纯化蛋白的方法的一些实施方案中，所述电解质溶剂包含氯化四甲铵(TMAC)或氯化四乙铵(TEAC)。在该方法的又另外的实施方案中，电解质溶剂中电解质的浓度为约0. I-约I. 0 M或约0. 25-约0. 5 M0在从污染溶液中纯化蛋白的方法的另外实施方案中，污染物为中国仓鼠卵巢蛋 白(CHOP)。在该方法的一些实施方案中，污染溶液包含含重组抗体的收获的细胞培养液(HCCF)。在从污染溶液中纯化蛋白的方法的实施方案中，步骤(C)的洗脱缓冲液涉及用具有约2. 0-约5. 0或约2. 5-约3. 5范围内的pH的洗脱缓冲液来洗脱蛋白。本文公开了一种利用A蛋白层析法纯化由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的蛋白的方法，所述方法包括以下步骤(a)将蛋白吸附至通过使A蛋白结晶和交联产生固相而完成固定化的A蛋白；(b)通过用包含选自氯化四甲铵(TMAC)、氯化四乙铵(TEAC)、氯化四丙铵和氯化四丁铵的电解质的电解质溶剂洗涤固相，来移除与固相结合的中国仓鼠卵巢蛋白(CHOP)污染物；和(c)从固相中回收蛋白。本文还公开了一种利用A蛋白层析法纯化由中国仓鼠卵巢(CHO)细胞产生的蛋白的方法，所述方法包括以下步骤(a)将蛋白吸附至通过结晶和交联产生固相而完成固定化的A蛋白；(b)通过用具有约5-约7范围的pH并包含选自氯化四甲铵(TMAC)、氯化四乙铵(TEAC)、氯化四丙铵和氯化四丁铵的电解质溶剂的电解质溶剂洗涤固相，来移除与固相结合的中国仓鼠卵巢蛋白(CHOP)污染物，其中所述电解质溶剂中电解质的浓度为约0. 25-约0. 5M;和(c)从固相中回收蛋白。本文公开了一种治疗哺乳动物中与升高的免疫球蛋白浓度相关的病症的方法，所述方法包括以足以减少与所述病症相关的一种或多种症状的量将A蛋白晶体给予哺乳动物。在该方法的一些实施方案中，所述病症与免疫功能相关。本文公开了一种生产膜的方法，所述方法包括以下步骤(a)制备由含聚合物基质材料的溶剂组成的制膜液；(b)向制膜液中加入足量的交联蛋白晶体；(c)将制膜液施用于支持材料上；(d)将制膜液和支持材料浸入含水介质中；(e)形成膜复合材料；(f)用流体介质干燥膜复合材料。在该方法的一些实施方案中，所述聚合物基质材料由合适的聚合物(包括聚氨酯)组成。在该方法的又另外的实施方案中，所述交联蛋白晶体包含选自以下的蛋白A蛋白、G蛋白、L蛋白及其组合。在该方法的又另外的实施方案中，所述溶剂选自I-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基甲酰胺及其组合。在该方法的一些实施方案中，所述流体介质包含甘油。
公开了生产A蛋白浸溃的膜的方法，所述方法包括以下步骤(a)形成包含含聚氨酯和填充剂的溶剂的制膜液；(b)将A蛋白-CLPC加入制膜液中；(c)在含水介质中处理制膜液；(d)形成用A蛋白-CLPC浸溃的膜沉淀物。在该方法的一些实施方案中，填充剂选自氧化锆、磷酸锆、碳及其组合。在另一个实施方案中，生产浸溃膜的方法包括用甘油溶液干燥膜沉淀物的另外的步骤。本文公开了能够在透析治疗期间从透析液或体液中移除免疫球蛋白的材料，所述材料包括浸溃有交联蛋白晶体的膜，其中所述膜已用流体介质干燥。在该方法的一个实施方案中，所述交联蛋白晶体包含选自以下的蛋白A蛋白、G蛋白、L蛋白及其组合。在又另外的实施方案中，所述膜包含选自氧化锆、磷酸锆、碳及其组合的填充剂。在该方法的又另外的实施方案中，所述流体介质包含甘油。
本文公开了从在透析治疗期间使用的透析液或体液中移除免疫球蛋白的装置，其中所述装置包含限定具有入口和出口的内部的机体，所述内部包含浸溃有交联蛋白晶体的膜层，其中所述膜已用流体介质干燥。在该装置的一些实施方案中，交联蛋白晶体包含选自以下的蛋白A蛋白、G蛋白、L蛋白及其组合。在该装置的另外的实施方案中，所述流体介质包含甘油。本文公开了一种提供透析治疗的系统，该系统包含能够在透析期间移除免疫球蛋白的装置，其中所述装置包含限定具有入口和出口的内部的机体，所述内部包含浸溃有交联蛋白晶体的膜层，其中所述膜已用流体介质干燥。在该系统的实施方案中，交联蛋白晶体包含选自以下的蛋白A蛋白、G蛋白、L蛋白及其组合。在另外的实施方案中流体介质包含甘油。本文公开了一种提供透析治疗的方法，所述方法包括以下步骤(a)将透析液或体液通过包含浸溃有交联蛋白晶体的膜层的装置，其中所述膜已用甘油溶液干燥，和(b)从透析液或体液中移除治疗有效量的免疫球蛋白。在该方法的实施方案中，交联蛋白晶体包含选自以下的蛋白A蛋白、G蛋白、L蛋白及其组合。本文公开了包含A蛋白的结晶形式的组合物。在一些实施方案中，A蛋白的来源是金黄色葡萄球菌菌株。在又另外的实施方案中，A蛋白通过重组的方法产生或为化学合成的。在一些实施方案中，A蛋白具有全长的天然蛋白序列。在又另外的实施方案中，A蛋白包含至少一个抗体结合域。在又另外的实施方案中，A蛋白是化学修饰的。在另外的实施方案中A蛋白具有突变或为天然A蛋白的功能性衍生物。本文公开了包含A蛋白的交联结晶形式的组合物。在一些实施方案中，所述组合物用戊二醛交联。本文公开了一种纯化免疫球蛋白的方法，所述方法包括使所述免疫球蛋白与包含A蛋白的结晶形式和/或A蛋白的交联结晶形式的组合物结合的步骤。在一些实施方案中，所述免疫球蛋白为抗体、单克隆抗体、Fab片段、Fe片段、单链抗体、嵌合抗体、完全人抗体或人源化抗体。在另外的实施方案中，所述免疫球蛋白属于IgG类，在该方法的又另外的实施方案中，所述免疫球蛋白是化学修饰的。本文公开了一种利用悬滴蒸汽扩散结晶法或分批结晶法制备A蛋白的结晶形式的方法，所述方法包括以下步骤(a)以1:1蛋白试剂比将A蛋白置于去离子水中，其中所述试剂选自包含2M硫酸铵、0. I M 二甲胂酸盐缓冲液pH 6. 5和0. 2 M氯化钠的组合物；包含含2 M硫酸铵的柠檬酸盐缓冲液pH 5. 5的组合物；包含I M柠檬酸钠、0. I M Tris-HCl缓冲液PH 7和0. 2 M氯化钠的组合物；包含含0. 8 M NaH2PO4/1. 2 M K2PO4的0. I M醋酸盐缓冲液PH 4. 5的组合物；以及包含2M硫酸铵、Tris-HCl缓冲液pH 7和0. 2M硫酸锂的组合物；和(b)温育直至形成晶体。在该方法的一些实施方案中，步骤(a)的A蛋白在去离子水中的浓度为约10 mg/ml或约300 mg/ml A蛋白。在该方法的又另外的实施方案中，步骤(a)的A蛋白在去离子水中的浓度为约50 mg/ml或约120 mg/ml A蛋白。本文公开了一种制备A蛋白的交联结晶形式的方法，所述方法包括将A蛋白的结晶形式与戊二醛混合。在该方法的一些实施方案中，戊二醛的终浓度为约0. 2-约4%。在该方法的另外的实施方案中，戊二醛的终浓度为约1%。本文提及的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献通过引用以其整体结合。在冲突的情况下，以包括定义在内的本说明书为准。此外，材料、方法和实例仅为阐述性的而并非意指限制。本发明的一个或多个实施方案的细节陈述于附图
及以下的说明书。 附图简述
图I.悬滴中的A蛋白晶体。用Wizard II结晶筛选将重组A蛋白(120 mg/ml，在DIH2O中)以悬滴结晶。图2.分批中的A蛋白晶体。用Wizard II结晶筛选将重组A蛋白(53 mg/ml，在H2O中)以I ml批量结晶。图3.交联的A蛋白晶体。A蛋白晶体用1%戊二醛交联20分钟和用0. 33%戊二醛交联I小时。发明详述
本发明涉及包含晶体A蛋白和交联A蛋白的组合物，以及制备此类晶体组合物的方法和使用此类晶体组合物用于从微生物、血清、血浆、哺乳动物细胞培养物中分离免疫球蛋白/抗体或Fe-片段、Fab片段、单链抗体和单克隆抗体的方法。本文所述的晶体组合物具有从在其它物质的混合物中包含免疫球蛋白的液体中通过免疫球蛋白的Fe-部分结合至少一种免疫球蛋白的能力。在不希望受任何特定的理论限制的情况下，本发明特征在于将包含所述免疫球蛋白/抗体的液体与由晶体交联A蛋白物质组成的固相接触，所述晶体交联A蛋白物质在所述液体中不可溶并且具有至少一个或多个免疫球蛋白或其Fe-片段结合区。免疫球蛋白的Fe-部分或Fe-片段能够结合A蛋白-CLPC以使所述A蛋白-CLPC与所述免疫球蛋白/抗体的Fe-部分或与Fe-片段结合但不与液体中的污染物质结合，因此将含剩余污染物的液体与固相分离并任选还将被结合的抗体与所述固相分离。本发明的方法与用于相同目的的已知方法不同，因为其避免了，利用除其它之外的离子交换层析以及另外的固相支持体例如琼脂糖等的复杂多级操作。通过新方法，讨论中的免疫球蛋白/抗体/片段以出人意料地纯的形式在便利条件下以非常简单的方式和高收率获得。讨论中的A蛋白-CLPC是极其有价值的，因为其与常规的固定化A蛋白相比能够以非常高的结合容量特异性地可逆结合免疫球蛋白，这是因为键合在免疫球蛋白的Fe-部分处实现。讨论中的免疫球蛋白可来源于不同的动物物种，首选脊椎动物，优选哺乳动物。正如已知的，免疫球蛋白可属于不同的免疫球蛋白类别，例如A类(IgA)、D类(IgD)、E类(IgE)、G类(IgG)和M类(IgM)。本发明的一个有价值的方面在于其可与能够将其自身与属于IgG类的免疫球蛋白结合的A蛋白-CLPC结合应用，因为该类别尤其在数量上在免疫球蛋白中占主导。免疫球蛋白的Fe-部分可通过已知的酶方法从其中分裂出，从而获得游离的Fe-部分。特定的免疫球蛋白的Fe-部分在不同的动物物种中常常结构相似。因为例如来自金黄色葡萄球菌的A蛋白与IgG的Fe-部分反应，本发明的方法常常能够使不同动物物种的IgG彼此替换。依照本发明，多肽(A蛋白-CLPC)可为来自金黄色葡萄球菌的所谓A蛋白或所述蛋白的片段，所述片段具有多肽性质并且具有在免疫球蛋白的Fe-部分结合至少一种免疫球蛋白的能力。来源于金黄色葡萄球菌的所述多肽(A蛋白及片段)可在属于IgG类的免疫球蛋白的Fe-部分结合所述免疫球蛋白。其它的实例为来自表皮葡萄球菌{Staphylococcus epidermidis)和来自其它细菌菌株的多妝。
依照本发明，当实施方法时应使用不可溶于液体的A蛋白-CLPC(聚合物质)，其中所述聚合物质具有至少一个免疫球蛋白或其Fe-片段结合区。因此所述A蛋白-CLPC在洗涤操作期间不能从固相中溶解出来或从其中移除。优选A蛋白-CLPC通过经由共价性质的键的方式交联A蛋白晶体而形成。A蛋白-CLPC可用于由预填充于柱中的晶体微颗形式的交联A蛋白组成的柱中，所述柱提供对来自不同来源的多克隆抗体、单克隆抗体、Fab片段的简易亲和纯化。晶体交联A蛋白用交联方法制备，这导致优良的蛋白稳定性和结合特性。所述柱预期用于传统的重力流程序。或者，可通过使多肽例如蛋白与聚合物结合时常规使用的方法(例如通过卤化氰、异氰酸酯等)，将A蛋白-CLPC与聚合物(固体表面)或磁性颗粒结合。所用的不溶性聚合物可为通常可用于相似目的的那些，即具有当将蛋白与聚合物结合时可使用的官能团的聚合物。此类官能团的实例为羟基、巯基、伯氨基和仲氨基、羰基、酰肼基、重氮基和羧基。当通过常规方法形成从聚合物到蛋白的桥时可使用这些基团，在本情况中所述蛋白为A蛋白-CLPC然而，不溶于所用液体中的聚合物可在所述液体中溶胀。例如当使用含水液体时其可在水中溶胀。所述聚合物可由例如通过交联聚合物(例如多糖)获得的三维网络组成。因此，可使用非常不同的聚合物，例如纤维素、琼脂糖、聚氨基苯乙烯、交联聚合物(例如交联的多糖例如用环氧氯丙烷(Sephadex )或双环氧化合物(例如用1，4_ 丁二醇二缩水甘油醚)交联的葡聚糖)或者淀粉或纤维素衍生物或者用环氧氯丙烷或双环氧化合物交联的聚乙烯醇。其它实例为通过将四亚乙基五胺或六亚甲基二胺与环氧氯丙烷或双环氧化合物反应获得的不溶聚合物。另一个实例为被对氨基苯基取代的交联聚丙烯酰胺聚合物(Enzacryl )。所述固相可以晶体交联A蛋白存在或包埋于聚合物或膜中。在许多情况下使用微粒形式的A蛋白可为合适的。其他实例包括结合有A蛋白-CLPC以纯化免疫球蛋白或其Fe-片段(例如IgG或其Fe-片段)的聚合物试管壁。通过本文所述方法将相关免疫球蛋白/抗体/片段从其中分离的物质，可具有广泛不同的特性。因此，此类免疫球蛋白可从来自产生相关抗体的微生物的多肽(例如蛋白)、多糖、核酸或低分子量物质中纯化出。
本发明的方法在液体存在下进行。所用液体首选为含水液体，例如具有合适的pH例如接近中性点pH的含水缓冲的NaCl溶液。根据本发明与A蛋白-CLPC结合的相关抗体/其片段可在温和条件下易于从CLPC中释放出来，例如通过改变pH或离子强度。本文所述的A蛋白晶体(A蛋白-CLPC)可结合抗体或其Fab片段，并可在无需任何固相支持体的情况下用于自多种来源纯化或用于多种来源的免疫学或免疫沉淀研究。A蛋白晶体(A蛋白-CLPC)还可在哺乳动物中通过体外装置中的免疫吸附来减少血浆中的免疫循环复合体或IgG。本文描述了用A蛋白/CLPC晶体来纯化抗体的方法。此外，提供了 A蛋白晶体和交联晶体(CLPC)，以及包含和使用所述晶体的组合物。还公开了从A蛋白的可溶形式生产大量的蛋白晶体/CLPC的方法。
为了使本发明可更易于理解，首先定义某些术语。另外的定义阐述于整个详述中。本文所用“完全抗体或抗体片段”意指本发明的完全抗体或抗体片段例如单链Fv片段或Fab抗体片段，为功能性抗体或抗体片段，即在体外或体内能够识别并结合其特异性抗原，并且可以起始与抗体结合相关的任何后续作用，例如直接的细胞毒性、补体依赖的细胞毒作用(CDC)、抗体依赖的细胞毒性(ADCC)。术语“抗体”意指分子量约150kD的糖蛋白，其由脊椎动物的免疫系统的体液支臂应答于体内存在的外来分子而产生。抗体对于微生物(例如寄生虫、细菌和病毒)的感染的预防和消退是必不可少的。抗体通过以高度特异的方式识别和结合蛋白(或有时，包括多糖、糖蛋白、脂质或核酸在内的其它有机分子)构型(被称为抗原(或表位)，包括入侵的微生物及其产物上的那些)来行使该功能。抗体通过抗体上被称为抗原结合位点的高变域与表位本身之间高度特异的相互作用来结合其靶抗原。在与抗原结合后，抗体激活免疫系统中一种或多种有助于中和、破坏和消除感染微生物或其它含抗原实体例如癌细胞的许多效应系统。抗体还通过其特异性结合和随后中和涉及疾病状态的细胞靶标，来用于癌症、炎症、心血管疾病和移植排斥的治疗，例如，单克隆抗体英利昔单抗结合肿瘤坏死因子并通过阻断其与细胞表面受体的相互作用中和其在炎症中的作用；而利妥昔单抗通过结合恶性B淋巴细胞的细胞表面的CD20抗原来靶向恶性B淋巴细胞。单个抗体分子具有由彼此共价结合的两条完全相同的重链(各自分子量为约50kD)和各自共价结合一条重链的两条完全相同的轻链(各自分子量为约25kD)构成的结构。四条链以经典的“Y”基序排列。“Y”底部的“腿”被称作Fe区(“c”表示“可结晶的”或“结合补体的”)并用于锚定细胞膜内的抗体，并且还结合巨噬细胞和激活补体。“Y”顶部的两条“臂”被称作Fab区(“ab”表示“结合抗原的”)。Fab区各自包含恒定区(在Fab区与Fe区的连接处)和可变区(其延伸至“Y”的尖端)。可变区各自在“Y”的各尖端包含完全相同的抗原结合位点(可变区内被称为“高变”区的区域处)。因此，Fab区各自具有一个抗原结合位点，因此完整的抗体分子有两个抗原结合位点(即为“二价的”)。天然存在的抗体上的两个抗原结合位点彼此完全相同，因此该抗体对一种抗原有特异性(即为“单价的”)。迄今已分离抗体分子的许多分子片段。这些天然并不存在，但工程改造自一种或多种完整的抗体分子。这些片段包括Fab片段(通过用酶木瓜蛋白酶进行的消化分离自完整抗体的单个Fab)以及F(ab’)2片段(彼此共价结合的两个Fab，通过用酶胃蛋白酶消化抗体产生)。Fab片段是单特异性的，而F(ab’)2片段是双特异性的。近来，已引入许多工程改造的抗体片段。这些包括双链Fv(dSFv)片段和单链Fv(ScFv)片段(在两种情况下“v”表示“可变的”)。dsFv片段由Fab片段减去恒定区组成，即仅由彼此共价结合的重链和轻链的可变区组成。scFv片段为单个多肽链，由经由肽接头与轻链可变区连接的重链可变区组成。典型地，dsFv片段和scFv片段两者均为单价的(因此单特异性的)。然而，两个dsFv片段或两个scFv片段它们自身可连接形成双特异性片段(其与无恒定区的F(ab’)2片段类似)。此外，可连接具有不同抗原结合位点(即不同特异性)的两个dsFv片段或scFv片段，以形成双特异性片段。此类片段可用作研究工具或治疗试剂或诊断试剂。人中有五类抗体(也被称作免疫球蛋白):IgG、IgM、IgA、IgD和IgE，其各自具有 其自己独特的特征和功能。IgG、IgD和IgE全部由一个抗体分子组成，而IgA可由一个、两个或三个此类分子组成，IgM由五个此类分子组成。此外，在人中，IgG有四个亚类(IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)，IgM和IgA各自有两个亚类(分别为I和2)。例如，单克隆抗体利妥昔单抗(Rituxan )为IgGl抗体。尽管天然存在的抗体来源于单一物种，但工程改造的抗体及抗体片段可来源于多于一种动物物种，即可为嵌合的。迄今，已产生小鼠(鼠)/人嵌合抗体，但其它物种的组合是可能的。嵌合抗体已进一步被分为两个亚型嵌合的和人源化的。嵌合的鼠/人抗体包含分别约75%人和25%小鼠的氨基酸序列。人的序列代表抗体的恒定区，而小鼠的序列代表抗体的可变区(因而包含抗原结合位点)。使用此类嵌合体的理论根据在于保留小鼠抗体的抗原特异性但减少小鼠抗体的免疫原性(鼠抗体可在除小鼠外的物种中引起针对其的免疫应答)，从而能够在人类治疗中采用该嵌合体。嵌合抗体还包括含有来自不同人抗体的CDR区的那些。CDR区，也被称为高变区，为抗体分子可变区内产生抗原结合位点的序列。CDR区如此命名是因为结合位点在形状和电荷分布上与抗原上识别的表位互补。或者，嵌合抗体包含来自一种抗体的框架区和来自另一种抗体的CDR区。嵌合抗体还包括含有来自至少两种不同的人抗体的⑶R区的那些。人源化抗体包含约90% (或更多)的人的氨基酸序列。唯一存在的鼠序列为高变区的序列(其为可变区内包含的实际的抗原结合位点)。人源化抗体与嵌合抗体相比具有最小的小鼠的免疫原性。通常有两种类型的抗体多克隆抗体和单克隆抗体，其可通过其特异性区分。多克隆抗体为作为血液的免疫球蛋白部分存在的抗体，基本上为对个体已暴露的不同抗原有特异性的许多不同类型的抗体的多克隆混合物(即其起源于B淋巴细胞(B细胞)(即产生抗体的细胞)的许多不同的克隆)。单克隆抗体为单一特异性的抗体，即其来源于B淋巴细胞(B细胞)的单一克隆。这些抗体对其靶抗原具有强烈的特异性并且还可高量(即高滴度)生产。它们可用作特异性抗原(例如，癌抗原)的标记物、诊断剂(例如，在检测病毒如HLV-I的测定中)和治疗齐U。完全的单克隆抗体为具有包含两条完整重链和两条完整轻链的典型分子结构的那些。这区别于抗体片段，例如Fab、F(ab’)2、Fc片段、dsFv片段和scFv片段。传统上，单克隆抗体通过使产抗体的B细胞与永生化杂交瘤细胞融合以得到B细胞杂交瘤来产生，所述杂交瘤在细胞培养物中持续产生单克隆抗体。传统上用于得到单克隆抗体的另一种方法涉及用噬菌体展示技术在细菌细胞培养物中表达单克隆抗体。然而，目前，单克隆抗体可在遗传修饰的动物和植物中在体内大量产生，所述动物为例如牛和山羊(Genzyme Transgenics)、猪和兔(Medarex, PPL Therapeutic)以及鸡(Tranxenogen),所述植物为例如烟草和玉米(Epicyte, Integrated Protein Technologies, MeristemCroptech,和其他)。例如，大量单克隆抗体可存在于遗传修饰的山羊(GenzymeTransgenics)的奶中。根据本发明，A蛋白-CLPC可用于纯化所有此类来源的抗体。此外，作为转基因的结果，已修饰小鼠以包含并表达整个人B细胞基因组(其编码人抗体)。因此，此类转基因小鼠(Abgenix)为可用本发明的A蛋白-CLPC纯化的人抗体的来源。应注意的是，糖基化对产抗体的动物是特异的。例如，非人来源的人抗体具有精细地不同的糖基化概况。因此，本发明的完全抗体或单链Fv抗体片段或Fab抗体片段可显示修饰的糖基化或去糖基化。可用本发明A蛋白-CLPC纯化的抗体也包括衍生化抗体。此类抗体包括用聚乙二醇或至少一个碳水化合物部分或至少一个甲基或乙基衍生的那些。临床相关的抗体也可根据其待应用的治疗领域将其分类。这样的抗体包括例如，用于治疗癌症(例如胰腺癌)、炎性疾病(如自身免疫性疾病、关节炎)、心血管疾病(例如 中风)、感染性疾病(例如HIV/AIDS)、呼吸系统疾病(例如哮喘)、组织移植排斥和器官移植排斥的抗体。此类抗体还包括用于放射免疫治疗的抗体。可根据本发明纯化的抗体包括例如阿昔单抗、帕利珠单抗、莫罗单抗-CD3、吉妥珠单抗、曲妥珠单抗、巴利昔单抗、达克珠单抗、依那西普和替伊莫单抗。本文所用“含水有机溶剂的混合物”意指包含n%有机溶剂和水的混合物，其中 n 为 1-99，m 为 100_n。本文所用“生物相容的聚合物”意指非抗原性(当不用作佐剂时)、无致癌性、无毒且不另外固有地与活生物体不相容的聚合物。实例包括聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(缩酚肽)、聚(酯)例如聚(乳酸)或PLA、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚(￠-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)和聚(二噁虼S4 );聚乙二醇、聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)膦腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、马来酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖(glycaminoglycan)、硫酸化多糖、其混合物和共聚物。本文所用“生物可降解的聚合物”意指被水解或溶解降解的聚合物。降解可为不均质的(主要发生于颗粒表面)或为均质的(在聚合物基质各处均匀降解)。本文所用“生物样品”是从细胞、组织、器官或生物体中收集例如以检测分析物的生物材料。示例性生物样品包括流体、细胞或组织样品。生物流体包括例如血清、血液、血衆、唾液、尿液或汗液。细胞或组织样品包括活组织检查、组织、细胞悬浮液或其它样本和样品，例如临床样品。本文所用共聚物意指用多于一种单体物类制得的聚合物。本文所用乳化剂为减少聚合物涂布的晶体和溶液之间的界面张力的表面活性剂。“晶体”为物质固态的一种形式，包含以在三维中周期性重复的模式排列的原子(参见例如，Barret, Structure of Metals (金属结构)，第二版，McGraw-Hill, New York(1952))。多肽的晶体形式例如有别于第二种形式无定形固态。晶体显示特有的特征，包括形状、晶格结构、溶剂百分比和光学性质(例如，折射率)。本文所用“蛋白的交联晶体形式”具有以下性质当加入溶液中时交联蛋白晶体保持不溶性并呈固态。“体外装置”为以下结构，其在个体治疗中不在体内用于使体液与A蛋白晶体接触。优选体外装置为用于透析(包括肾透析)的装置、用于连续动静脉血液滤过的装置、体外膜充氧器或用于从血流中过滤废产物的其它装置。类似地，过滤废产物的装置的组件包含于该术语内，例如包括管、多孔材料或膜。具体地，体外装置可为透析装置。其还可为透析装置的膜。A蛋白的“功能性片段”为保留了 A蛋白的针对抗体或其Fab片段的一种或多种结合活性(例如用于抗体纯化的能力)的A蛋白多肽的一部分。除另外说明之外，本文所用的功能性片段可包含一端或两端的末端截短。例如，功能性片段可自A蛋白多肽的氨基端 和/或羧基端除去I个、2个、4个、5个、6个、8个、10个、12个、15个、或20个或更多个残基。优选所述截短并不超过一端或两端的20个氨基酸。功能性片段可任选与一个或多个异源序列或A蛋白的原始天然序列中任何氨基酸的突变物连接。术语“个体”或“受试者”是指任何的哺乳动物，包括但不限于如此分类的任何动物，包括人、非人灵长类、灵长类、狒狒、黑猩猩、猴、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠)、兔、猫、狗、马、牛、绵羊、山羊、猪等。蛋白的不可溶和稳定形式为不溶于含水溶剂、有机溶液或含水有机溶剂混合物并显示出比蛋白的可溶形式更大的稳定性的蛋白形式。按照本发明的备选实施方案，短语“蛋白的不可溶和稳定形式”可为不溶于干制剂和湿制剂的蛋白。在任一个实施方案中，不可溶形式的交联蛋白晶体可为有活性的。术语“分离的”是指基本不含其天然环境的分子。例如，分离的蛋白基本不含其所来源的细胞或组织来源的细胞材料或者其它蛋白。该术语是指制备物，其中分离的蛋白足够纯以给予为治疗组合物，或至少70% -80% (重量比)纯，更优选至少80%90% (重量比)纯，甚至更优选 90% -95% 纯，和最优选至少 95%、96%、97%、98%、99%、99. 5%,99. 8% 或 100%
(重量比)纯。本文所用术语“约”是指由该术语限定的值的至多±10%。例如约50 mM是指50mM土 5mM;约 4% 是指 4% 土 0.4%。本文所用“大分子底物”意指大的生物分子，例如具有至少600-700道尔顿的分子量的蛋白或碳水化合物，其还为被由交联蛋白晶体组成的蛋白催化的反应的底物。术语“有机溶剂”意指非含水来源的任何溶剂。由本发明的交联蛋白晶体制剂组成的蛋白可为天然的或合成修饰的。其可为糖蛋白、未修饰蛋白或包含其它的修饰。本文所用“蛋白活性”意指选自以下的活性结合、催化或在使用所述蛋白的环境中产生功能性反应的活性，例如结合免疫球蛋白、免疫沉淀或其组合。术语“蛋白的可溶形式”意指溶液中并从晶格中解离的单独的蛋白分子。术语“治疗有效的剂量”或“治疗有效量”是指导致免疫相关病况(例如成年血小板减少性紫癜)的症状发作的预防、推迟或该症状的缓解的化合物的量。治疗有效量例如足以治疗、预防、与升高的免疫球蛋白/IgG或其亚类浓度相关的病症的一种或多种症状、降低所述症状的严重性、推迟所述症状的发作和/或减少所述症状出现的风险。有效量可通过本领域熟知的方法确定。术语“治疗”、“治疗方法”及其同源词是指已存在的病症的治疗和/或预防/防止措施。需要治疗的那些可包括已患有特定医学病症的个体以及处于病症风险中或患有病症的个体或者可最终获得病症的个体。例如通过与病症的发展相关的一种或多种风险因子的存在情况、病症的存在情况或进展、或患有病症的受试者对治疗的可能接受性，来评估治疗需求。治疗可包括减缓或逆转病症的进展。术语“聚合物”意指通过小的、简单的化学单元的重复建立的大分子。所述重复单元可为线性或带支链的以形成互连网络。所述重复单元通常等于或近似等于单体。本文所用聚合物载体意指用于包封A蛋白-CLPC以用于纯化或递送(包括生物递送)此类A蛋白-CLPC的聚合物。此类聚合物包括生物相容和生物可降解的聚合物。所述聚合物载体可为单一聚合物类型或其可由聚合物类型的混合物组成。可用作聚合物载体的 聚合物包括例如聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(缩酚肽)、聚(酯)例如聚(乳酸)或PLA、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚(@-羟基丁酸酯)、聚(己内酯))和聚(二Pf烷M );聚乙二醇、聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)膦腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、马来酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、白蛋白、天然及合成多肽、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、改性淀粉例如直链淀粉、支链淀粉、羟乙基淀粉、甲基丙烯酸酯淀粉和其它淀粉，以及包封蛋白晶体的任何常规材料。本文所用A蛋白是指来自金黄色葡萄球菌菌株的多肽。A蛋白为本领域已知的一群多肽，其能够结合免疫球蛋白或其Fe-片段。A蛋白为由金黄色葡萄球菌的数种菌株产生的细胞壁组分，由分子量42000的单多肽链组成并包含很少或不含碳水化合物。其由六个区组成，其中五个区结合IgG。A蛋白特异性结合免疫球蛋白分子、特别是IgG的Fe区。A蛋白分子包含能够与数个种类的Fe区相互作用的四个高亲和力(Ka = 108/M)结合位点。该分子是热稳定的并且当暴露于变性试剂(例如4 M尿素，4 M硫氰酸盐和6 M盐酸胍)时保持其天然构象。固定化A蛋白已广泛用于从哺乳动物的数种物种中分离IgG。然而，A蛋白与IgG之间的相互作用对于所有物种并不相等。甚至在一个物种内，A蛋白与IgG的一些亚群相互作用，而不与其它亚群相互作用。例如人IgG1UgG2和IgG4强烈地结合A蛋白，而IgG3并不结合A蛋白，而小鼠IgG1与八蛋白结合很差。还有许多实例其中单克隆抗体并不结合A蛋白，例如大多数大鼠的免疫球蛋白。尽管其可变的结合特征，但A蛋白具有IgG结合性质，这使得其对于IgG的亲和纯化是理想的。固定化A蛋白的一个分子可结合IgG的至少两个分子。另一种蛋白G蛋白，为来自G类链球菌ifitr印tococcf)的细胞表面蛋白，为III型Fe受体并以与A蛋白类似的非免疫机制结合IgG。大肠杆菌中产生的该蛋白的重组形式(其中天然蛋白的白蛋白结合区已被遗传缺失)，也可用于IgG的纯化。重组G蛋白包含两个Fe-结合区。 另一种抗体结合蛋白L蛋白为细菌菌种大消化链球菌(Peptostreptoccusmagnus)的细胞表面蛋白，并发现其通过L链相互作用结合Ig。其由719个氨基酸残基组成。从大消化链球菌的细胞壁中纯化的L蛋白的分子量最初在还原剂2-巯基乙醇存在下通过SDS-PAGE估计为95kD而在6 M盐酸胍存在下所述分子量通过凝胶层析确定为76kD。与结合免疫球蛋白(抗体)的Fe区的A蛋白和G蛋白不同，L蛋白通过轻链相互作用结合抗体。由于重链中没有一部分涉及结合相互作用，L蛋白与A蛋白或G蛋白相比结合更宽范围的抗体类别。L蛋白结合所有抗体类别的代表，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。单链可变片段(ScFv)和Fab片段也结合L蛋白。L蛋白的结合限于包含k轻链的抗体。考虑到有效结合的特定需要，固定化L蛋白的主要应用为从已知具有K轻链的腹水或细胞培养上清液中纯化单克隆抗体。
本发明适用于A蛋白的同种型以及那些同种型的糖形。A蛋白用于制备用于本文所述的方法的晶体。A蛋白可分离自例如天然来源或可来源于天然来源。本文所用术语“来源于”意指具有天然存在于来源中的氨基酸或核酸序列。例如来源于金黄色葡萄球菌的A蛋白包含金黄色葡萄球菌A蛋白多肽的基本序列，或由包含编码A蛋白的金黄色葡萄球菌中存在的序列或其简并物的核酸编码。来源于来源的蛋白或核酸包含分离自该来源的分子，重组产生的分子和/或化学合成或修饰的分子。本文提供的晶体可由包含A蛋白或保留抗体结合区的A蛋白功能性片段的氨基酸序列的多肽形成。优选A蛋白保留天然存在的A蛋白的至少一个功能结合特性，例如保留一种或多种结合至少一种抗体的能力。之前已分离A蛋白，因此其可获自金黄色葡萄球菌的许多菌株，包括Newman、Cowan等。A蛋白还可从商业供应商例如Sigma、Repligen和GE购买。从天然来源分离A蛋白的方法已描述于例如以下参考文献中“Nucleotide sequence analysis of the genefor protein A from Staphylococcus aureus Cowan I (NCTC8530) and its enhancedexpression in Escherichia coli.(金黄色葡萄球菌 Cowan I (NCTC8530)的 A 蛋白基因的核苷酸序列分析及其在大肠杆菌中的增强表达)” Shuttleworth H. L.，Dugglcby C. J.，Jones S. A., Atkinson T. , Minton N. P. Gene 58:283-295 (1987); “Structural studieson the four repetitive Fe- binding regions in protein A from Staphylococcus
对金黄色葡萄球菌A蛋白的四个重复Fe-结合区的结构研究).”Sjoedahl J. Eur.J. Biochem. 78:471- 490 (1977);这些分离的A蛋白可用于形成晶体和本文所述的方法。或者，重组A蛋白可用于形成晶体和本文提供的方法。在一些情况下，重组A蛋白包含来自天然存在的A蛋白序列的序列或由所述序列编码。此外，本文描述了包含与天然存在的序列同源或基本相同的氨基酸序列的A蛋白。同样，提供了由与天然存在的编码A蛋白的核酸同源或基本相同的核酸编码的A蛋白，所述A蛋白可如本文所述结晶和/或给予。本文称为“重组的”多肽为通过重组DNA方法产生的多肽，包括通过依赖人工重组方法的程序(例如聚合酶链式反应(PCR)和/或用限制性内切酶克隆至载体中)产生的那些。“重组”多肽还为具有改变的表达的多肽，例如在细胞(例如宿主细胞)中具有重组修饰表达的天然存在的多肽。在一个实施方案中，A蛋白从与金黄色葡萄球菌A蛋白的核酸序列同源的核酸重组产生，并且有时其被修饰，例如以增加或优化异源宿主中的重组产生。可用于形成A蛋白晶体的A蛋白多妝可表达于宿主细胞，例如包含含有A蛋白多肽或其功能性片段的编码序列的核酸构建体的宿主细胞。用于表达A蛋白的合适的宿主细胞可为例如酵母细胞、细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞或者转基因植物、转基因动物或无细胞系统。优选宿主细胞能够糖基化A蛋白多肽(若需要的话)、能够二硫键合、能够分泌A蛋白和/或能够支持A蛋白多肽的多聚化。优选的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌(包括大肠杆菌Origami B和大肠杆菌BL21)、巴斯德毕赤酵母{Pichiapastor is)、酿酒酵母{Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母{Schizosaccharomycespombe)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is)、曲霉(Aspergillus)、Sf9细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)、293细胞(人胚肾)和其它人细胞。此外转基因植物、包括猪、牛、山羊、马、鸡和兔在内的转基因动物为产生A蛋白的合适的宿主。对于A蛋白的重组产生，宿主或宿主细胞应包含呈含有编码A蛋白或其功能性片段的至少一种核酸的质粒、载体、噬菌粒或转录盒或表达盒形式的构建体。可利用各种构建体，包括保持单个拷贝或多个拷贝或变得整合至宿主细胞染色体中的构建体。用于重组表达的许多重组表达系统、组分和试剂为市售的，例如从Invitrogen Corporation(Carlsbad, CA) ；U. S. Biological (Swampscott, MA) ；BD Biosciences Pharmingen (SanDiego, CA) ；Novagen (Madison, WI) ；Stratagene (La Jolla, CA)和Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), (Braunschweig, Germany)。A蛋白的重组表达任选受异源启动子控制，所述启动子包括组成型启动子和/或诱导型启动子。启动子例如H、醇氧化酶(AOX)启动子、二羟基丙酮合酶(DAS)启动子、Gal1，10启动子、磷酸甘油酸激酶启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、醇脱氢酶启动子、铜金属硫蛋白(CUPl)启动子、酸性磷酸酶启动子、CMV和启动子多角体蛋白也为合适的。具体的启动子基于宿主或宿主细胞来选择。此外，例如也可使用可被甲醇、硫酸铜、半乳糖、低磷酸盐、被醇(例如乙醇)诱导的启动子，其为本领域所熟知。编码A蛋白的核酸可任选包含异源序列。例如，在一些实施方案中分泌序列包含在A蛋白多肽的N-端。可使用信号序列，例如来自a交配因子、BGL2、酵母酸性磷酸酶(PH0)、木聚糖酶、a淀粉酶、来自其它酵母分泌蛋白以及来源于其它物种的能够指导自宿主细胞分泌的分泌信号肽的那些信号序列。类似地其它的异源序列例如接头(例如，包含切割位点或限制性内切核酸酶位点)以及一种或多个表达控制元件、增强子、终止子、前导序列以及一种或多种翻译信号在该描述的范围之内。这些序列可任选包含于构建体内和/或与编码A蛋白的核酸连接。除另外说明之外，“连接的”序列可直接或间接彼此相关。类似地，表位或亲和标签例如组氨酸、HA(血凝素肽)、麦芽糖结合蛋白、AviTag 、FLAG、或谷胱甘肽-S-转移酶可任选与A蛋白多肽连接。标签可任选在产生或纯化A蛋白后从A蛋白中裂解。技术人员可容易地选择合适的异源序列，例如，匹配的宿主细胞、构建体、启动子和/或分泌信号序列。A蛋白同源物或变体因一个或多个残基而不同于A蛋白参考序列。结构上相似的氨基酸可例如被一些指定的氨基酸取代。结构上相似的氨基酸包括(I、L和V) ; (F和Y);(K和R) ; (Q和N) ; (D和E)和(G和A)。氨基酸的缺失、添加或取代也包含于本文所述的A蛋白同源物中。此类同源物和变体包括(i)多态性变体和天然突变体或人工突变体，(ii)其中一个或多个残基被修饰的修饰多肽，以及(iii)包含一个或多个修改残基的突变体。若A蛋白多肽或核酸与参考序列为至少约40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或100%同一，则其为“同源的”(或为“同源物”)。若同源物与参考序列不同一，则其为“变体”。若同源物的核苷酸序列或氨基酸序列因不超过约1、2、3、4、5、8、10,20,50或更多个残基而不同于参考序列(例如通过截短、缺失、取代或添加)，并保留结合免疫球蛋白/抗体或其Fab片段的能力(或编码保留所述能力的多肽)，则所述同源物与参考A蛋白序列“基本同一”。A蛋白的片段可为包含变体和/或基本同一的序列的同源物。举例来说，同源物可来源于A蛋白的不同来源，或者其可通过截短、缺失、取代或添加突变来源于参考序列或与参考序列相关。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比可通过标准的比对算法来确定，所述算法为例如基本局部比对工具(Basic Local AlignmentTool, BLAST)，参见 Altschul 等，J. Mol Biol, 215:403 410 (1990) ;Needleman 等的算法，J. Mol. Biol, 48:444 453 (1970);或 Meyers 等的算法AppI. Biosci.4:11 17 (1988)。此类算法掺入 BLASTN,BLASTP 和“BLAST2 序列”程序(综述于 McGinnis和Madden, Nucleic Acids Res. 32: W20-W25, 2004)。当运用此类程序时，可使用缺省参数。例如，对于核苷酸序列可使用“BLAST2序列”的以下设置程序BLASTN，匹配赏分2，不匹配罚分2，开放空位罚分和延伸空位罚分分别为5和2，空位x_下降(dropoff) 50，期 望值10，字长11，过滤器开启(filter ON)。对于氨基酸序列可使用“BLAST2序列”的以下设置程序BLASTP，矩阵BL0SUM62，开放空位罚分和延伸空位罚分分别为11和1，缺口x_下降50，期望值10，字长3，过滤器开启。适于形成本文所述的晶体的A蛋白的氨基酸序列和核酸序列，可包括同源序列、变体序列或基本同一的序列。交联蛋白晶体的制备——蛋白结晶
蛋白晶体通过蛋白的受控结晶从含水溶液或含有机溶剂的含水溶液中生长出。待控制的条件包括例如溶剂蒸发的速率、合适的共溶质和缓冲剂的存在情况、PH和温度。影响蛋白结晶的各种因素的全面综述已由McPherson, Methods EnzymoI. , 114,第112-20页(1985)出版。McPherson 和 Gilliland, J. Crystal Growth, 90,第 51-59 页(1988)已汇编了已结晶的蛋白和核酸的全面列表以及其结晶条件。晶体和结晶配方的概要以及已解决的蛋白和核酸结构的坐标的储存库由Brookhaven National Laboratory的Protein DataBank 保持[http//www. pdb.bnl.gov; Bernstein 等，J. Mol. Biol. , 112,第 535-42页(1977)]。这些参考可用于确定蛋白结晶的必要条件，作为合适的交联蛋白晶体形成的前序，并且可指导其它蛋白的结晶策略。或者，在大多数情况下智能试验和错误搜索策略可产生许多蛋白的合适的结晶条件，前提是可对其达到可接受水平的纯度[参见，例如C. W.Carter, Jr.和 C. W. Carter, J. Biol. Chem. , 254，第 12219-23 页(1979)]。对用于本文所述的方法而言不需要X射线衍射分析所需的大的单晶。微晶簇(Microcrystalline shower)是合适的。例如，交联蛋白晶体可具有约0.01 iim-约500 y m，或者0. I y m_约50 y m的
最长尺寸。其还可具有选自以下的形状球形、针形、棒形、板形例如六边形和正方形、菱形、立方体形、双锥形和棱柱。通常，晶体通过将待结晶的蛋白与合适的含水溶剂或包含合适的结晶剂(例如盐或有机溶剂)的含水溶剂混合来产生。所述溶剂与蛋白混合，并可经受在凭实验确定适于结晶诱导和对保持蛋白活性和稳定性可接受的温度下搅拌。所述溶剂可任选包含共溶质例如二价阳离子、辅因子或离液剂，以及控制pH的缓冲剂种类。对共溶质的需要及其浓度凭实验确定以促进结晶。在工业规模的方法中，导致结晶的受控的沉淀可最佳地地通过在分批工艺中将蛋白、沉淀剂、共溶质和任选缓冲剂简单组合来进行。作为另一种选择，蛋白可通过用蛋白沉淀物作为起始材料来结晶。在这种情况下，将蛋白沉淀物加入结晶溶液中并孵育直至形成晶体。也可采用备选的实验室结晶方法，例如透析或蒸汽扩散。McPherson(见上)和Gilliland(见上)在其关于结晶文献的综述中包括合适条件的综合列表。交联剂和结晶介质之间的不兼容有时可能需要将晶体更换至更合适的溶剂体系中。已描述结晶条件的很多蛋白可用于制备本发明的交联蛋白晶体。然而，应指出的是，已优化大部分上述引用的参考文献中所报道的条件以在大多数情况下得到一些大的、衍射质量的晶体。因此，本领域的技术人员应理解的是，可能需要对这些条件进行一定程度的调节，以提供用于大规模生产较小晶体的高产量方法，所述晶体用于制备交联蛋白晶体。 交联蛋白晶体的制备——蛋白晶体的交联
稳定化晶体。一旦A蛋白晶体已生长于合适的介质中，其可任选稳定化，例如通过交联。交联通过在晶体的组成性蛋白分子之间引入共价键来引起晶格的稳定。这使蛋白有可能转移至可另外与晶格的存在或甚至与完整蛋白的存在不兼容的替代环境中。A蛋白晶体可通过例如赖氨酸胺基团、硫醇(巯基)基团和碳水化合物部分来交联。交联晶体在此也被称作“A蛋白-CLPC”、“CLPC-A蛋白”或“CLPC”。交联晶体可改变稳定性(例如pH、温度、机械和/或化学稳定性)、抗体结合的pH概况、溶解度、晶体大小或晶体体积的均一性，结合的抗体自晶体的释放速率和/或基础晶格中的单个分子之间的孔隙大小和形状。有利的是，本发明的交联或稳定以这样的方式进行，所述方式使得晶体包含以下A蛋白，其显示出与固定化A蛋白/ml凝胶相比至少约60%、80%、100%、150%、200%、250%、300%或更多的结合容量/ml晶体(抗体的结合)。与可溶性或固定化A蛋白相比，稳定性可增加至少约 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300% 或更多。例如可在储存条件下测量稳定性，例如PH稳定性、温度稳定性、针对蛋白酶的稳定性、溶解稳定性以及体外柱稳定性。在一些实施方案中，交联减缓了呈晶体的A蛋白多肽在溶液中的溶解，有效地将蛋白分子固定于微晶颗粒中。在例如在使用条件而非储存条件下于围绕交联蛋白晶体的环境中暴露于触发剂后，该蛋白分子缓慢溶解，释放活性A蛋白多肽和/或增加A蛋白的活性。溶出率通过例如下列因素中的一个或多个来控制交联程度、蛋白晶体曝露于交联剂的时间长度、交联剂加入蛋白晶体的速度、交联剂的性质、交联剂的链长、pH、温度、巯基试剂如半胱氨酸、谷胱甘肽的存在情况、交联蛋白晶体的表面积、交联蛋白晶体的大小以及交联蛋白晶体的形状。交联可用一种交联剂或多种交联剂(包括多功能剂，同时(并行)或按顺序)的组合来实现。在于周围环境暴露于触发剂，或经过既定时间段后，用此类多功能交联剂交联的蛋白晶体之间的交联变少或变弱，导致蛋白溶解或活性的释放。或者，交联可在连接点打断，导致蛋白溶解或活性的释放。参见美国专利第5，976，529号和第6，140，475号。在一些实施方案中，交联剂可为具有至少2、3、4、5或更多个活性部分的多功能交联剂。在不同的实施方案中，该试剂可选自戊二醛、丁二醛、辛二醛、乙二醛、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、3，3’ 二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、3，3’ - 二硫代双丙亚氨酸二甲酯盐酸盐、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、己二胺、二氨基辛烷、乙二胺、丁二酸酐、苯基戊二酸酐、水杨醛、亚胺基乙酸酯、甲醛、丙烯醛、丁二酸半醛、丁醛、十二醛、甘油醛、反式-辛-2-烯醛。另外的多功能交联剂包括卤代三嗪，例如三聚氯氰；齒代嘧唆，例如2，4，6-三氯/溴嘧啶；脂肪族或芳香族单羧酸或二羧酸的酐或卤化物，例如马来酸酐、(甲基)丙烯酰氯、氯乙基酰氯；N-羟甲基化合物，例如N-羟甲基氯乙酰胺；二异氰酸酯或二异硫氰酸酯，例如亚苯基-1，4- 二-异氰酸酯和氮杂环丙烷。其它交联剂包括环氧化物，例如二环氧化物、三环氧化物和四环氧化物。在一个实施方案中，交联剂是戊二醛双功能剂，戊二醛单独使用或与环氧化物按顺序使用。还可将其它交联剂(参见例如，Pierce Chemical Company的1996年目录)与可逆交联剂例如下文所述的那些同时(并行)或按顺序使用。按照本发明的替代实施方案，交联可并行或按顺序利用可逆的交联剂进行。所得 交联蛋白晶体通过活性多功能接头表征，将触发剂作为分隔基团掺入所述接头中。活性官能团涉及将蛋白中的活性氨基酸侧链连接在一起，触发剂由可通过改变周围环境的一个或多个条件(例如pH、还原剂的存在情况、温度或热力学水活度)来打断的键组成。交联剂可为同功能或异功能的。活性官能团(或部分)可例如选自以下官能团之一(其中R、R’、R”和R’’’可为烷基、芳基或氢基团)
I.活性酰基供体，例如羧酸酯RC00R’、酰胺RC0NHR’、酰基叠氮化物RC0N3、碳二亚胺R-N=C=N-Rj、N 羟基酰亚胺酯、RC0-0-NR’、亚氨酸酯 R_C=NH2+(NR’ )、酐 RC0-0-C0R’、碳酸酯R0-C0-0-R 、聚氨酯RNHC0NHR’、酰基卤RCOHal (其中Hal=卤素)、酰基酰肼RCONNR’R’ ’和
0酰基异脲 RCO-O-C=NR’(-NR’ ’ R’ ’ ’)
II.活性羰基，例如-MRCHO和酮RCORj、缩醛RCO(H2) R’和缩酮RR，C02 R，R，，(在蛋白固定化和交联的领域中的技术人员已知的包含活性羰基的官能团描述于文献中(PierceCatalog and Handbook, Pierce Chemical Company, Rockford, III. (1994); S. S.Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking, CRC Press, BocaRaton, Fla. (1991);
III.烷基或芳基供体，例如烷基或芳基卤化物R-Hal、叠氮化物R-N3、硫酸酯
RS03R’、磷酸酯 RPO (0R，3)、烷基氧輸盐 R30+、锍 R3S+、硝酸酯 R0N02、Michael 受体 RCR’ =
CR’ ’ ’ C0R”、芳基氟化物ArF、异腈RN+=C_、卤代胺R2N_Hal、烯烃和炔烃；
IV.含硫基团，例如二硫化物RSSR’、硫醇基RSH和环氧化物R2C_°CR’ 2 ;和
V.盐，例如烷基或芳基铵盐R4N+、碳酸盐RC00-、硫酸盐R0S03-、磷酸盐R0P0/’和胺
R3N。可逆交联剂例如包含触发剂。触发剂包含烷基、芳基或具有可与待交联的蛋白反应的活性基团的其它链。那些活性基团可为任何多种基团，例如易于亲核、游离基或亲电置换的那些，包括卤化物、醛、碳酸酯、聚氨酯、苍耳烷和环氧化物等。例如，活性基团可对酸、碱、氟化物、酶、还原、氧化、硫醇、金属、光解、辐射或热不稳定。可逆交联剂的另外的实例参见T. W. Green, Protective Groups in OrganicSynthesis, John Wiley和Sons (编辑)(1981)。用于可逆保护基团的任何多种策略可掺入适用于产生能够可逆受控溶解的交联蛋白晶体的交联剂中。在关于该主题的Waldmann的综述(载于Chemie InL Ed. EngL , 35:2056 (1996))中列出了不同的方法。其它类型的可逆交联剂为含二硫键的交联剂。打断由此类交联剂形成的交联的触发剂为添加还原剂例如半胱氨酸至交联蛋白晶体的环境中。示例性的二硫化物交联剂参见Pierce Catalog and Handbook (1994-1995)。此类交联剂的实例和方法公开于美国专利第6，541, 606号,其相关部分通过引用结合于此。此外，还可使用在碳水化合物部分之间或在碳水化合物部分和氨基酸之间交联的交联剂。交联剂在溶液中的浓度可为约0. 01%_20%、约0. 02%_10%、或约0. 05%_5%重量体积t匕。典型地，交联剂为约0. 5%或约1%重量体积比。例如，交联剂在溶液中的浓度可为例如约 0. 01%,0. 02%,0. 05%,0. 075%,0. 1%、0. 2%、0. 3%、0. 5%、1%、2%、3%、3. 5%、4%、5%、6%、7%、8 % 、9%、10%、15%或20%重量体积比。交联前可能需要更换缓冲液。包括CLPC在内的晶体可任选冻干或以其它方式配制。包括本文所述的交联晶体在内的晶体可用于治疗方法中和降低循环免疫复合体的IgG水平(例如在免疫血小板减少性紫癜中)的方法。A蛋白晶体还可以柱的形式或浸溃于膜或聚合物中或涂布或固定于支持物上用于涉及纯化工艺的方法(例如，单克隆抗体的纯化、多克隆抗体的纯化、来自不同来源的免疫球蛋白、IgG及其亚型、Fab片段、单链抗体等的纯化。基于上述的稳定化A蛋白晶体的一种或多种性质，本文所述的晶体可应用于这些用途。A蛋白的晶体/CLPC的干燥。A蛋白的晶体通过经由干燥方法移除水、有机溶剂或液体聚合物来干燥，所述干燥方法包括用氮气、空气或惰性气体干燥、真空烘箱干燥、冻干、用挥发性有机溶剂洗涤接着蒸发该溶剂、在通风柜中蒸发、托盘干燥、流化床干燥、喷雾干燥、真空干燥或滚筒干燥。典型地，当晶体变为自由流动的粉末时实现干燥。干燥可通过将空气流流过湿的晶体来进行。所述气体可选自氮气、氩气、氦气、二氧化碳、空气或其组合。原则上，干燥的晶体可通过冻干制备。然而，该技术涉及物质的迅速冷却，仅可应用于冻结稳定的产品。在一个实施方案中，首先将包含晶体/ CLPC A蛋白的含水溶液冷冻至-40至_50°C，接着在真空下移除。A蛋白晶体/CLPC或包含此类晶体的制剂或组合物的制备。在一个方面，公开了 A蛋白晶体/CLPC或包含此类晶体的制剂或组合物。此类组合物可依照以下方法制备
首先，使A蛋白结晶。接着，直接向母液中加入选自以下的赋形剂或成分糖、糖醇、增粘剂、润湿剂或增溶剂、缓冲盐、乳化剂、抗微生物剂、抗氧化剂或包衣材料。或者，移除母液，之后将晶体悬浮于赋形剂溶液中达最短I小时-最长24小时。所述赋形剂的浓度典型地为约0. 01-约10% (重量比)。所述成分的浓度为约0. 01-约90% (重量比)。所述晶体的浓度为约0.01-约99% (重量比)。然后通过过滤或离心从晶体浆液中移除母液。随后，在室温或约-20°C -约25°C的温度下任选用约50%-100% (重量比)的一种以上有机溶剂的溶液洗涤晶体，所述有机溶剂为例如乙醇、甲醇、异丙醇或乙酸乙酯。接着，通过使氮气、空气或惰性空气的气流流过晶体来干燥晶体。或者，通过空气干燥、喷雾干燥、冻干或真空干燥来干燥晶体。干燥在洗涤后进行最短约I小时-最长约72小时，直至终产物的水分含量在约10%重量以下，最优选约5%重量以下。最后，若需要的话可进行晶体的微粉化(micromizing)(减小晶体的大小)。依照本发明的一个实施方案，在制备A蛋白晶体/CLPC或包含此类晶体的制剂或组合物时，结晶期间不添加增强剂(例如表面活性剂)。结晶后将赋形剂或成分以约I-约10%(重量比)的浓度、或者约0. I-约25%(重量比)的浓度、或者约0. I-约50%(重量比)的浓度加入母液中。将赋形剂或成分与晶体在母液中孵育约0. I-约3小时。或者该孵育进行约0. I-约12小时，或者该孵育进行约0. I-约24小时。在本发明的另一个实施方案中，将赋形剂或成分溶解于溶液而非母液中，并从母液中移出晶体并悬浮于赋形剂或成分溶液中。所述赋形剂或成分的浓度及孵育时间与上述的那些相同。
本发明的另一个优点在于A蛋白晶体/CLPC、或包封在聚合物载体内以形成包含微球的组合物的其制剂可通过冻干干燥。冻干或冷冻干燥允许水从组合物中分离。首先将A蛋白/CLPC晶体组合物冷冻，接着置于高真空下。在真空中，结晶水升华，留下仅包含紧密结合的水的A蛋白/CLPC晶体组合物。此类处理进一步使组合物稳定并允许在典型遇到的环境稳定下更易储存和运输。喷雾干燥允许水从晶体制备物中分离。其非常适用于从液体原料(如溶液、乳液、和可泵送的悬浮液)中以粉末、颗粒或团聚物的形式连续产生干燥的固体。喷雾干燥涉及将液体原料雾化成液滴喷雾并在干燥室内将液滴与热空气接触。该喷雾由旋转雾化器或喷嘴雾化器产生。在受控温度和气流条件下从液滴蒸发水分和形成干燥颗粒。喷雾干燥操作需要相对高的温度。然而，产物的热损伤通常只是轻微的，因为临界干燥期间的蒸发性冷却效果和因为干燥物质接触高温的后续时间可很短。粉末从干燥室中不断排出。根据产物的干燥特性和粉末技术指标，选择操作条件和干燥机设计。喷雾干燥是理想的过程，其中终产物必须符合粒度分布、残留水分含量、堆积密度和颗粒形状相关的精确的质量标准。可用于本发明的方法的A蛋白-CLPC可与赋形剂混合。根据本发明，“赋形剂”充当药物组合物中使用的填充剂或填充剂的组合。赋形剂的实例参见由美国制药协会(American Pharmaceutical Association)和英国药学会(Pharmaceutical Society ofGreat Britain)联合出版的 Handbook of Pharmaceutical Excipients (药用赋形剂手册)，以下列出另外的实例。包含于该类别的优选赋形剂为以下的盐1)氨基酸例如甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、脯氨酸；2)碳水化合物，例如，单糖例如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、核糖；3) 二糖，例如乳糖、海藻糖、麦芽糖、蔗糖；4)多糖，例如麦芽糊精、葡聚糖、淀粉、糖原；5)糖醇，例如甘露醇、木糖醇、乳糖醇、山梨醇；6)葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸；7)环糊精，例如甲基环糊精、羟丙基-￠-环糊精等；8)无机分子，例如氯化钠、氯化钾、氯化镁、钠和钾的磷酸盐、硼酸、碳酸铵和磷酸铵；9)有机分子，例如醋酸盐、柠檬酸盐、抗坏血酸盐、乳酸盐；10)乳化剂或增溶剂/稳定剂如阿拉伯树胶、二乙醇胺、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、单乙醇胺、油酸、油醇、泊洛沙姆、聚山梨酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单硬脂酸和其它脱水山梨醇衍生物、聚氧基(polyoxyl)衍生物、蜡、聚氧乙烯衍生物、脱水山梨醇衍生物；和11)增粘剂如琼脂、藻酸及其盐、瓜尔胶、果胶、聚乙烯醇、聚氧化乙烯、纤维素及其衍生物、碳酸丙烯酯、聚乙二醇、己二醇、泰洛沙泊。赋形剂的另一个优选组别包括蔗糖、海藻糖、乳糖、山梨醇、乳糖醇、肌醇、钠盐和钾盐例如醋酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐；甘氨酸、精氨酸、聚氧化乙烯、聚乙烯醇、聚乙二醇、己二醇、甲氧基聚乙二醇、明胶、羟丙基-￠-环糊精、聚赖氨酸、聚精氨酸。在本发明的一个实施方案中，所述赋形剂选自盐、醇、碳水化合物、蛋白质、脂质、表面活性剂、聚合物和聚氨基酸。在另一个实施方案中，所述赋形剂选自鱼精蛋白、聚乙烯醇、环糊精、葡聚糖、聚氨基酸(例如聚精氨酸、聚赖氨酸和聚谷氨酸)、聚乙二醇和树状大分子(dendrimer)、聚合物例如聚卡波非、藻酸钠。组合物。将包括交联晶体在内的A蛋白晶体提供为组合物，例如药物组合物(参见例如美国专利第6，541，606号，描述蛋白晶体的制剂和组合物)。包含A蛋白晶体的药物组合物包含A蛋白晶体和一种或多种成分或赋形剂，包括但不限于糖和生物相容的聚合物。 A蛋白-CLPC可作为在组合物中的晶体、作为任何多种生理学上可接受的盐形式给予和/或与作为药物组合物的一部分的可接受的药用载体和/或添加剂一起给予。生理学上可接受的盐的形式和标准的药物配制技术和赋形剂为本领域的技术人员所熟知(参见，例如 Physician，s Desk Reference (PDR) 2003,第 57 版 ，Medical EconomicsCompany, 2002 以及Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennado等编辑，第20版，Lippincott, Williams和Wilkins, 2000)。为了该应用的目的，“制剂”包括“晶体制剂”。A蛋白晶体组合物的其它有用成分和赋形剂包括以下
生物相容的聚合物。生物相容的聚合物为非抗原性(当不用作佐剂时)、无致癌性、无毒且不另外固有地与活生物体不相容的聚合物，其可用于本文所述的A蛋白晶体组合物。实例包括聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酐)、聚(缩酚肽)、聚(酯)例如聚(乳酸)或PLA、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚(@-羟基丁酸酯)、聚(己内酯)和聚(二飘m);聚乙二醇、聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有机)膦腈]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、马来酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、Pluixmic多元醇、白蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、其混合物和共聚物。生物可降解的聚合物，即被水解或溶解降解的聚合物。降解可为不均质的(主要发生于颗粒表面)或为均质的(在聚合物基质各处均匀降解)。成分例如一种或多种赋形剂或药物成分或赋形剂可包含于A蛋白晶体组合物。成分可为惰性成分或活性成分。本发明一般可适用于IgG，不管来源。用于本发明目的的优选IgG为人和小鼠的IgG类。目标种类可与其分离的蛋白为其它免疫球蛋白，例如IgM和IgE，以及其它蛋白例如白蛋白。已知这些蛋白对A蛋白的结合亲和力比IgG对A蛋白的结合亲和力要小得多。可使用可溶于含水介质的任何无机盐。实例包括碱金属和碱土金属卤化物和硫酸盐。带正电的离子例如铵可替代金属离子。盐还必须对免疫球蛋白、A蛋白或A蛋白所结合的任何支持物无反应。盐的浓度可从约0. 5 M高至溶解度的极限，优选约I. 0 M-约4. 0M0溶液的精确pH并不重要并且可在约中性至弱碱性的范围内广泛地变化。因此，pH可大于或等于约7. 0，优选约8. 5-约9. 5。
优选将盐用作缓冲溶液的一部分，由所述盐本身或由混合物的单独组分产生缓冲效果。可使用常规缓冲液，适当选择以实现所需pH。对于固定化的目的，将A蛋白结晶并交联而无需任何固相支持体，例如亲和层析柱中的填充材料。当本发明用于增加亲和层析的分离时，优选通过用包含高盐浓度的缓冲溶液反复洗涤来使柱填充物平衡，并且在将样品混合物加入柱前还将其于相同的缓冲溶液中稀释。稀释度也可广泛地变化，但优选稀释度为约1:1_约1:20。随着缓冲溶液通过柱，未结合的蛋白将被缓冲溶液带走，从而将它们与结合的免疫球蛋白分离。接着，免疫球蛋白的回收通过用酸性缓冲液，优选具有约2. 0-约5. 0，更优选约2. 5-约4. 0 pH的酸性缓冲液洗脱来实现。柱的性质并不重要，可在从开柱至加压柱的范围内广泛地变化。本发明固有的强结合允许通过使用开柱实现有效的分离。 本说明书所用“包含靶蛋白的样品”是指包含靶蛋白的任何样品，无论是天然来源的还是人工制备的。所述样品可包含不同液体、液体和固体或不同固体的混合物。包含靶蛋白的样品的实例可包括血液、血清、腹水液、奶、组织样品、细胞培养物、细胞裂解物或细胞培养物的上清液。本说明书所用“支持物”是指不管其形式或其制作材料，A蛋白可固定于其上以得到亲和层析介质的任何东西。实例包括琼脂糖，其常用于亲和层析；纤维素和聚丙烯酰胺。本说明书所用“层析介质”是指用于层析纯化的固定相，不管其构型(柱或平面)、状态(液体或固体)或其制作材料。用于蛋白纯化的层析介质的常见实例包括离子交换树月旨、亲和固定相和凝胶渗透固定相。本说明书所用“偶联的”是指直接接触以及两种类型或更多种类型基因或蛋白之间的接头基因或接头蛋白的布置。其还包含通过共价键或非共价键的偶联。本说明书所用“靶蛋白”是指待纯化的任何蛋白。靶蛋白的实例可为抗体。“融合蛋白”在本文中是指两个以上的分离多肽的任何组合。融合蛋白包括两个以上的分离多肽的组合，其中所述两个以上的多肽是共价连接的。融合蛋白包括两个以上的分离多肽的组合，其中所述两个以上的分离多肽是非共价连接的。所述两个以上的分离多肽可在没有任何介体的情况下直接彼此接触。所述两个以上的分离多肽可被介体例如接头肽居中。本文公开的方法利用A蛋白和靶蛋白(例如抗体)之间的高度结合特异性。在一个实施方案中，该方法包括将含有靶蛋白的样品与其上固定有晶体交联A蛋白的支持物接触，其中所述靶蛋白为抗体并且A蛋白-CLPC具有对所述抗体的特异的结合亲和力，并且其中该接触在使得A蛋白结合抗体的条件下进行；移除未结合的样品组分；然后从支持物中移出靶蛋白/抗体。在一些实施方案中，样品是细胞裂解物、细胞培养物、细胞培养物上清液或包含靶蛋白的生物流体。在一些实施方案中，将其上固定有交联A蛋白的支持物配置为亲和层析柱。在用于本文公开的蛋白纯化的方法和柱中，可使用一次性柱。一次性柱可具有约0. I-约I. 0 mm、约0. 3-约0. 7 mm、或约0. 5 mm的直径。柱可被置于约16x125 mm的玻璃试管中。在一个实施方案中，直径为0. 5 mm的一次性柱被置于16x125 mm的玻璃试管中。层析介质例如A蛋白-CLPC可按照本领域已知的任何方法填充于柱中。在使用一次性柱的实施方案中，将充足体积的脱气缓冲液/水加入柱中以使其装满至贮器(广口)部分，然后从柱中消除任何气泡。在此之后，凝胶(A蛋白-CLPC)可在室温下填充至具有脱气50%凝胶浆液和脱气缓冲溶液(或水)的柱中。可加入充足体积的脱气凝胶浆液以得到所需的设定的凝胶体积。可允许凝胶在柱中沉降至少30分钟。填充柱可在4°C下储存和使用。从支持物中移出靶蛋白可包括从支持物中洗脱靶蛋白。洗脱靶蛋白通过在以下pH下洗脱来进行，所述PH降低A蛋白-CLPC和抗体之间的结合亲和力，使得靶蛋白/抗体从支持物(A蛋白-CLPC)中移出。在本发明的方法中的第一步骤，需要具有约pH 7. 0-pH 10的pH和浓度为约0. 01M-2M的一价阳离子和多碱价阴离子的组合的缓冲液。任何缓冲液可用于提供所需的pH。可使用例如磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸盐缓冲或Tris缓冲液。缓冲液的浓度应在约0. 01M-0. 25M。此外，氯化钠、氯化钾、氯化四甲铵(TMAC)、氯化四乙铵(TEAC)、氯化四丙铵和氯化四丁铵等盐可以约0. 05M-2. OM的浓度范围加至缓冲液。 在一价阳离子为钾离子或钠离子和多碱价阴离子为磷酸根离子时，钾离子和磷酸根离子可通过以磷酸三钾K3PO4、磷酸氢二钾K2HPO4或磷酸二氢钾KH2 PO4的形式使用磷酸钾来提供，由于介质的pH控制存在的各种磷酸根离子的比例。钾离子和磷酸根离子存在的浓度应为约0. 6M-1. 75M。发现约I. 0M-1. 5M的浓度尤其令人满意。在本发明使用的高浓度下具有足够溶解度的一价阳离子和多碱价阴离子的其它组合，包括约I. 0M-1. 5M浓度的铵磷酸盐、约I. 0M-1. 5M浓度的铵硫酸盐和约I. 0M-1. 25M浓度的钠硫酸盐。只要盐不在使用的浓度下沉淀，则还可使用其它组合。正如上文指出，吸附剂(A蛋白-CLEC)优选在柱中使用以促进与待纯化的免疫球蛋白接触。在将包含不纯的免疫球蛋白的介质上样至柱之前，包含A蛋白-CLEC的柱用数个柱床体积的包含对柱的组合的缓冲液平衡，所述柱用数个柱床体积的包含浓度在约0. 01M-4M的一价阳离子和多碱价阴离子的组合的缓冲液平衡。这确保了环境最优于免疫球蛋白与柱的结合。将包含待纯化的免疫球蛋白的介质(例如免疫血清或免疫球蛋白的其它来源)与包含一价阳离子和多碱价阴离子的组合的缓冲液混合。接着，将所得混合物上样至柱，导致免疫球蛋白吸附至柱。接着用包含一价阳离子和多碱价阴离子的组合的另外缓冲液洗涤柱，以便从柱中洗脱不强烈吸附至柱的杂质。另一方面，由于作为存在包含一价阳离子和多碱价阴离子的组合的缓冲液的结果，吸附剂对免疫球蛋白增强的亲和力，免疫球蛋白强烈地吸附至柱。在通过用相同的缓冲溶液洗涤来移除非所需的杂质后，通过具有酸性pH (即约pH 2.0- pH 6.0范围内的pH)的缓冲液从柱中洗脱纯化的免疫球蛋白。在pH 6. 0下部分免疫球蛋白主要是IgG1流分被洗脱。随着pH降低，包括IgG2a部分和IgG2M流分在内的免疫球蛋白的剩余物被洗脱。免疫球蛋白可利用pH 2. 0的缓冲液洗脱，该缓冲液对洗脱所有的免疫球蛋白有效。然而若需要的话，一小部分免疫球蛋白可在PH 6.0被洗脱。若需要的话，通过在PH 6.0和pH 2.0之间降低pH可洗脱不同的其它流分。通过逐步降低PH，有可能分离包含所需的特定免疫球蛋白的免疫球蛋白的纯化流分。可使用任何缓冲液用于洗脱。例如醋酸-醋酸盐缓冲液或甘氨酸.HCl缓冲液可用于该目的。可使用在约0. 01M-0. 25M的缓冲液浓度。特别优选约0. 1M-0. 2M的缓冲液浓度。与支持物例如琼脂糖结合的固定化A蛋白相比，免疫球蛋白或其片段可结合A蛋白-CLEC的短柱。分离的免疫球蛋白或其片段可以多达百分之九十(90%)的收率回收。甚至将使用目前可用的最尖端技术所得到的结合提高多达2-10%。在某些实施方案中，使初级回收样品经受亲和层析以从HCP中进一步纯化目标抗体。在某些实施方案中，层析材料能够选择性或特异性地结合目标抗体。此类层析材料的非限制性实例包括:A蛋白、G蛋白、L蛋白。在特定的实施方案中，亲和层析步骤涉及使初级回收样品经历包含合适的A蛋白树脂的柱。A蛋白树脂可用于各种抗体亚型、特别是IgGpIgG2和IgG4的亲和纯化和分离。填充有A蛋白-CLPC的合适的柱的非限制性实例为约I. 0 cm直径X约21. 6 cm长的柱(约17 ml柱床体积)。该大小的柱可用于小规模纯化并可与用于放大的其它柱相比较。例如，其柱床体积为约6. 6 L的20 cmX 21 cm的柱可用于更大的纯化。无论何种柱，所述柱可用A蛋白-CLPC填充。在某些实施方案中，有利的是，鉴定A蛋白树脂的动态结合容量(DBC)以便针对特 定的目标抗体定制纯化。例如但不以限制的方式，可通过单流速上样或双流速上样策略确定A蛋白-CLPC柱的DBC。单流速上样可在整个上样期间以约300 cm/小时的速度评估。双流速上样策略可通过以下确定以300 cm/小时的线性速度上样柱多至约35 mg蛋白/ml树脂，然后减少一半线性速度以允许对于上样的最后部分有更长的停留时间。在某些实施方案中，在样品上样前A蛋白柱可用合适的缓冲液平衡。合适的缓冲液的非限制性实例为PBS或Tris/NaCl缓冲液，约7. 2-7. 4的pH。合适的平衡条件的非限制性实例为PBS缓冲液pH 7. 4或25 mM TrisUOO mM NaCl、约7. 2的pH。在该平衡后，样品可上样至柱上。待柱上样后，柱可用例如平衡缓冲液洗涤一次或多次。可在洗脱柱前应用其它的洗涤，包括应用不同缓冲液的洗涤。例如，柱可用一个或多个柱体积的约6.0的pH的20 mM柠檬酸/柠檬酸钠，0.5 M NaCl洗涤。该洗涤可任选接着用平衡缓冲液的一次以上洗涤。接着可用合适的洗脱缓冲液洗脱A蛋白柱。合适的洗脱缓冲液的非限制性实例为醋酸/NaCl缓冲液，约3. 5的pH。合适的条件为例如0. I M醋酸，约3. 5的pH或0. 2M甘氨酸.HCl缓冲液，pH 2.0。洗脱液可用本领域的技术人员熟知的技术监控。例如可按照OD■处的吸光度。柱的洗脱液可以约0.5 AU的初始偏转起始收集至洗脱峰后沿约0. 5AU的读数。然后可准备目标洗脱流分用于进一步处理。例如收集的样品可用约10的pH的Tris (例如I. 0 M)滴定至约5. 0的pH。任选可将该滴定的样品过滤或处一步处理。本发明提供了适用于多种应用的蛋白浸溃材料以及生产和使用所述材料的方法，所述应用包括例如在纯化或免疫沉淀期间从血液、血浆、血清、细胞培养物中移除免疫球蛋白。此类蛋白溃浸膜还可用于治疗、诊断及其它工业应用。在一个实施方案中，本发明包括浸溃有交联蛋白晶体的膜。所述交联蛋白可包括由各种合适蛋白制备的任何合适的交联蛋白。在一个实施方案中，所述交联蛋白可包括能够从血清、血浆、血液、细胞培养物中移除抗体等的蛋白例如A蛋白、G蛋白、L蛋白等蛋白或其组合。优选交联蛋白晶体为如本文所述的A蛋白-CLPC。在一个实施方案中，本发明包括浸溃有单独或与诸如G蛋白或L蛋白等其它交联蛋白晶体组合的交联蛋白晶体(优选A蛋白-CLPC)的聚合物膜。据认为使用A蛋白-CLPC浸溃膜会提供超越目前可用的固定化技术的多种益处，包括例如1)无任何浸出的更好的A蛋白保留；2)减少的筒/柱大小，这导致使用容易性增加；3)筒/柱制造期间的使用容易性 '及4)优于现有系统的增加的安全性(由于筒中A蛋白更好的保留)。本发明的交联蛋白浸溃膜可以多种合适的方式制备。一般而言，首先制备基于聚合物的制膜液，接着与所需量和所需类型的交联蛋白晶体混合。应理解的是，所述制膜液可制自任何合适的基于聚合物的材料。一旦形成并与交联蛋白混合，则将制膜液通过例如涂布于支持材料上来施用于支持材料，或经受一种或多种沉淀和洗涤顺序以形成可随后在使用前干燥的复合膜。在一个实施方案中，制膜液由包含聚合物基质材料例如聚氨酯等的任何合适的溶剂组成，所述溶剂包括例如I-甲基-2-吡咯烷酮(“NMP”)、二甲基甲酰胺(“DMF”)等或其组合。所述制膜液还可包含另外的其它组分，例如填充剂、亲水剂(例如，可使膜更亲水的试剂)等或其组合。在一个实施方案中，填充剂可包括氧化锆、磷酸锆、碳等或其组合。可足量加入填充剂以控制膜的孔隙率。填充剂可以高达膜的约80%总干重，优选膜的约50%总干重的量加入。在一个实施方案中，填充剂和交联蛋白晶体以等量或至少约等量添加。 在一个实施方案中，亲水剂为聚乙烯吡咯烷酮(“PVP”)等或其组合。可添加任何合适的量的亲水剂以提高膜的亲水性。然后将制膜液与适量的交联A蛋白混合。在一个实施方案中，交联A蛋白-CLPC以有效提供所需水平的结合活性的量加入膜中。在一个实施方案中，用约3. 25 mg/cm2或更少的交联蛋白浸溃膜。在这点上，交联蛋白晶体可占膜重量的约80%或更少。然后将所得膜溶液施用于支持物例如合成的网状材料，并浸入水中或其它合适的介质例如异丙醇和水的混合物，优选异丙醇(“IPA”)和水的比例为50 50的混合物中。然后可在合适的条件下沉淀聚合物膜复合材料。例如，在水沉淀期间可加入合适量的NMP以控制沉淀速度。在这点上，可降低沉淀速度，从而导致膜的更多孔的聚合物基质。本发明的A蛋白-CLPC可通过体外装置或导管给予，例如用于将A蛋白-CLPC递送至患者。导管例如导尿管可用包含A蛋白-CLPC晶体的组合物涂布。以下实施例提供了本发明的阐述性实施方案。本领域普通技术人员应认识到在不改变本发明的精神或范围的情况下可进行许多修改和改变。此类修改和改变包括于本发明的范围内。该实施例并不以任何方式限制本发明。
实施例实施例I.
引言
制备A蛋白交联晶体(CLPC)以开发用于纯化抗体的革新A蛋白层析系统。A蛋白CLPC将提供高度浓缩的A蛋白活性联合高的稳定性和耐化学性的优点。浓缩的A蛋白浓度将减少柱的大小、缓冲液体积和处理时间。此外，A蛋白晶体的交联将防止层析期间A蛋白的浸出。总之,这将减少抗体生产时间和成本。本文的实施例描述了重组A蛋白的结晶(悬滴和分批两者)和交联。目的
以开发用于抗体纯化的交联A蛋白晶体。仪器和材料
# 重组 A 蛋白，Repligen Corporation,目录号 rPA50。
# 重组 A 蛋白，Fitzgerald International，目录号 30-AP75。# Amicon Ultra-4 离心过滤单兀，Millipore，目录号 UFC801008。# Nalgene MF75 系列一次性灭菌过滤单兀，0. 2 微米，Fisher Scientific,目录号 09-740-36K。# pH 电导仪，Denver Instrument, Model 220。# 娃化圆盖玻片Hampton Research,目录号 HR3-233。# VDX 平板，Hampton Research,目录号 H R3_ 140。
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# 硫酸铵，Fisher Scientific,目录号 BP212R-1。# 盐酸溶液，Fisher Scientificsj 目录号 A481-212。
二甲砷酸钠三水合物，Sigma-Alctich，目录号C0250。# 氯化钠，Fisher Scientific,目录号 S271-3。 三(轻甲基)氨基甲焼(Trizma 碱)，Sigma-Aldrichj 目录号 T- 4661。
DI (反渗透和去离子)H20。# 晶体筛选试剂盒(Crystal Screen Kit), Hampton Research,目录号HR2-110o# 晶体筛选 2 试剂盒，Hampton Research,目录号 HR2-112。# JBScreen Classic 1，Jena Bioscience,目录号 CS-101L。# JBScreen Classic 2，Jena Bioscience,目录号 CS-102L。# JBScreen Classic 3，Jena Bioscience,目录号 CS-103L。# JBScreen Classic 4，Jena Bioscience,目录号 CS-104L。# Wizard I 随机稀疏矩阵结晶筛选，Emerald BioSystems。# Wizard II 随机稀疏矩阵结晶筛选，Emerald BioSystems。步骤
重组A蛋白的结晶用悬滴蒸汽扩散结晶法进行。将A蛋白晶体按比例放大至I ml批量大小并交联。溶液制备 3. 5 M硫酸铵
将46. 2g硫酸铵溶解于100 ml DI H2O中，并将溶液无菌过滤。I M 二甲砷酸钠 pH 6. 5
将21. 4g 二甲砷酸钠溶解于80 ml DI H2O中。pH用浓盐酸溶液调节至6. 5。然后将缓冲溶液用DI H2O调节至100 ml，并用0. 2微米Nalgene过滤单元无菌过滤。5 M氯化钠
将29. 2 g氯化钠溶解于100 ml DI H2O中，并将溶液无菌过滤。Wizard II结晶筛选的内部配方4
Wizard II筛选试剂盒的内部配方#4通过将2. 86 ml 3.5 M硫酸铵与0.5 ml I M 二甲砷酸钠pH 6. 5、0. 2 ml 5 M氯化钠及I. 44 ml已过滤的DI H2O混合来制备。10 mM Tris-HCl 缓冲液 pH 7
将12.11 g Trizma碱溶解于80 ml DI H2O中。pH用浓盐酸溶液调节至7。将缓冲液用DI H2O调节至100 ml并无菌过滤。然后将I M Tris-HCl缓冲液在已过滤的DI H2O中稀释100倍。A蛋白悬滴结晶
最初的结晶筛选用含50. 6 mg/ml Fitzgerald International的重组A蛋白的DI H2O进行。利用Hampton Research的悬滴蒸汽扩散结晶法(參见參考 文献)，A蛋白样品在室温下在24孔板中以I: I蛋白/试剂比，用以下8种不同的筛选试剂盒筛选JBScreen ClassicUJBScreen Classic 2>JBScreen Classic 3>JBScreen Classic 4>ffizard I>ffizara II、Hampton晶体筛选和Hampton晶体筛选2。晶体筛选还用浓缩至120 mg/ml的A蛋白样品和Amicon离心过滤单元来进行(蛋白浓度在280 nm处通过分光光度法确定)。A蛋白分批结晶
A蛋白结晶用Fitzgerald International的重组A蛋白并用最初悬滴结晶筛选中产生晶体的条件之一(即Wizard II矩阵结晶筛选配方#4，其包含2M硫酸铵、0. I M ニ甲胂酸盐缓冲液pH 6. 5和0.2 M NaCl)分批建立。Fitzgerald的A蛋白样品如“A蛋白悬滴结晶”部分所述浓缩至120 mg/ml,晶体筛选以30 μ I微小批量(microbatch)用上述结晶试剂进行。该批量在6-15天期间在室温下无翻转下孵育。分批结晶在相同的结晶条件下还用Repligen Corporation的重组A蛋白制备。然后将A蛋白结晶用Repligen的重组A蛋白(53 mg/ml或120 mg/ml)和Wizard II结晶筛选的内部配方#4按比例放大至0. 5 ml批量。将该批量在6天期间在室温下孵育。A蛋白晶体用53 mg/ml的Repligen的A蛋白按比例放大至I ml批量。将A蛋白样品与Wizard II结晶筛选的内部配方#4混合。将样品在4周期间在室温下翻转鮮育。A蛋白晶体的交联
将含15 mg/ml A蛋白晶体的500 μ I样品(在Wizard II筛选试剂盒的配方#4中的50%浆液)用20 μ I 25%戊ニ醛(戊ニ醛的终浓度为1%)交联。将样品立即涡旋5秒并在室温下无搅拌下孵育20分钟。孵育后，将I ml Wizard II结晶筛选的配方#4加入样品中(戊ニ醛的终浓度为0. 33%)，并将复合物涡旋5秒。然后将样品在室温下无搅拌下孵育I小吋。交联后，将A蛋白样品在I ml 10 mM Tris-HCl缓冲液pH 7中洗涤3次(以4500rpm进行离心5分钟)，并将A蛋白交联晶体(CLPC)重新悬浮于I ml 10 mM Tris-HCl缓冲液pH 7中。结果
A蛋白的悬滴晶体
利用悬滴结晶法，将来自Fitzgerald International的A蛋白晶体用50. 6 mg/ml或120 mg/ml蛋白样品和用Wizard II结晶筛选的配方# 4制备(图I)。晶体还用WizardI结晶筛选的配方# 8 (含2 M硫酸铵的柠檬酸盐缓冲液pH 5.5)以及用以下Wizard II结晶筛选配方制备# 31 (I M柠檬酸钠，0.1 M Tris-HCl缓冲液pH 7，0. 2 M NaCl)、# 35 (0. 8 M NaH2PO4/1. 2 M K2PO4 的 0. I M 醋酸盐缓冲液 pH 4. 5)和# 41 (2 M硫酸铵、Tris-HCl缓冲液pH 7,0.2 M硫酸锂)，数据未显示。在所有条件中，晶体大小为约5微米，具有软立方体形状。A蛋白的分批晶体
如图2所示,将Repligen Corporation的重组A蛋白用Wizard II结晶筛选的配方# 4以I ml批量结晶。分批结晶产生立方体状和针状晶体。立方体状晶体大小为约10微米，而针状晶体大小更小。相似的晶体用Repligen Corporation和Fitzgerald International的A蛋白以30 批量获得，和用R印Iigen的A蛋白以500 批量获得。交联A蛋白晶体
Repligen Corporation的A蛋白晶体用交联剂戍二醒交联。A蛋白晶体的交联并不改变晶体的形态或大小(图3)。参考文献
-Crystal Growth 101 Literature, Hanging Drop Vapor DiffusionCrystallization (悬滴蒸汽扩散结晶)(2001)，Hampton Research Corporation.
实施例2.
浸出交联A蛋白晶体的pH控制的溶解度
不同交联A蛋白晶体的溶解度按照pH从7.5减少至2.0来检查。将交联晶体以I mg/ml孵育于50 mM甘氨酸.HCl (pH 2.0)中。在37°C下搅拌孵育5小时后移出等分试样。在通过2000 rpm离心分离未溶解的交联晶体并将上清液通过0. 22 U m滤器过滤后，于OD28tlnm处测定可溶性蛋白的浓度。年施例3.
目的
本实验的目的在于用人IgG确定交联A蛋白晶体的结合容量。仪器与材料
仪器:
台式离心机Eppendorf离心机5415D Eppendorf 管 I ml
真空泵
Whatman 滤纸片25mm 目录号 1825025 天平Mettler Toledo AG285 锥形瓶材料
交联A蛋白晶体自制
人 IgG :ICN Biomedical, Inc.目录号 64145 磷酸缓冲盐水(PBS)片:Sigma目录号P- 4417 甘氨酸Fluka # 50046 0. IN NaOH: Acros 目录号 12419-0010
步骤
缓冲液的制备 磷酸缓冲盐水(PBS)
将I片溶解于200 ml蒸馏水，获得磷酸缓冲盐水。0. 2 M 甘氨酸 pH 2. 0
将7. 5 g甘氨酸溶解于90 ml水中。pH用IN盐酸调节至2. O。体积用DI水补至100mlo随后检查pH，若需要的话再次调节至2. O。
实验步骤:
用于该实验的交联A蛋白晶体(CLPC)在pH 7.0的10 mM Tris中。将50 u I CLPC离心以移除上清液。将沉淀重新悬浮于PBS中并用PBS洗涤3次以在PBS中平衡CLPC用于抗体结合。在反应管中向含50 U I CLPC的PBS中加入100 Ul体积的2mg IgG。轻轻混合管中的内容物并在室温下孵育30分钟。将管在4500 rpm下离心5分钟。将上清液(流过液)移出并保留用于分析。将沉淀重新悬浮于100 U I PBS中并于4500 rpm下离心5分钟。将上清液(洗涤液)移出并保留用于分析。再重复2次该步骤，总计3次洗涤液。将PBS的3次洗涤液(100 u IX3)合并于一管中，总洗漆体积为300 V- I。
将沉淀重新悬浮于83 U I 0. 2 M甘氨酸pH 2. 0中。将重悬液轻轻混合并孵育10分钟。将重悬液在4500 rpm下离心5分钟并保留上清液(洗脱液)用于分析。再重复该步骤2次并将3次的甘氨酸洗脱液合并于一管中(总洗脱体积为249 u I)。第三次洗脱后，将沉淀重新悬浮于250 ill 0. IN NaOH中以洗脱不被0. 2M甘氨酸pH 2. 0洗脱的任何残留的蛋白。将重悬液孵育15分钟，并在4500 rpm下离心5分钟。保留上清液(NaOH再生液)用于分析。流过液、洗涤液、洗脱液和NaOH再生液的吸光度在280nm处读取。然后将CLPC沉淀重新悬浮于100 U I PBS中以进行干重分析用于确定该实验中所用A蛋白的量。将Whatman滤纸片称重并记录该重量。将滤纸置于已连接到真空的锥形瓶上。在开启真空时将含100 U I CLPC的PBS加于滤纸上，以将液体引流至烧瓶中。将CLPC用水洗涤5次。将滤纸静置于真空上一段时间以使其干燥，然后将其置于烘箱中过夜。次日将滤纸称重并以毫克计算该实验中所用的CLPC的量。结果
交联A蛋白晶体的结合容量计算为每克CLPC结合和洗脱的人IgG的量。实验各步中IgG的浓度见下表I。表I :不同流分中IgG的浓度
权利要求
1.一种组合物，所述组合物包含A蛋白的结晶形式。
2.一种组合物，所述组合物包含A蛋白的交联结晶形式。
3.—种纯化免疫球蛋白的方法，所述方法包括用权利要求I或权利要求2的组合物接触所述免疫球蛋白。
4.权利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白为抗体。
5.权利要求4的方法，其中所述抗体为治疗性抗体。
6.权利要求4的方法，其中所述抗体为单克隆抗体。
7.权利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白为Fab片段。
8.权利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白为Fe片段。
9.权利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白为单链抗体。
10.权利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白为嵌合抗体。
11.权利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白为完全人抗体。
12.权利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白为人源化抗体。
13.权利要求3的方法，其中所述免疫球蛋白属于IgG类。
14.权利要求2的组合物，其中所述组合物用戊二醛交联。
15.一种试剂盒，所述试剂盒包含权利要求I或2的组合物。
16.权利要求15的试剂盒，其中所述试剂盒包含书面说明书，其描述了A蛋白的结晶形式和/或交联结晶形式的用途。
17.一种柱，所述柱包含权利要求I或2的组合物。
18.权利要求2的组合物，其中所述晶体比A蛋白的固定化形式更有活性(结合容量)。
19.权利要求2的组合物，其中所述晶体在约pH2-约pH 12是有活性(结合容量)并稳定的。
20.权利要求2的组合物，其中所述晶体与固定化A蛋白相比具有0.0%蛋白浸出。
21.权利要求I或2的组合物，其中所述组合物作为柱材料用于预填充柱。
22.权利要求I或2的组合物，其中所述组合物用于膜(浸溃的)。
23.权利要求I或2的组合物，其中所述组合物用于体外装置。
24.一种用于纯化免疫球蛋白的方法，其包括 (a)将包含免疫球蛋白的介质与具有在约pH7.0-pH 10范围内的pH并包含阳离子和阴离子的组合的缓冲溶液混合，以提供缓冲的免疫球蛋白介质； (b)将所述缓冲的免疫球蛋白介质与固定化A蛋白(A蛋白-CLPC:通过使A蛋白分子结晶和交联来固定化A蛋白)吸附剂接触以在所述固定化A蛋白吸附剂上吸附所述缓冲的免疫球蛋白介质中存在的免疫球蛋白； (c)用所述缓冲溶液洗涤其上吸附有免疫球蛋白的A蛋白-CLPC吸附剂； (d)将其上吸附有免疫球蛋白的所述A蛋白-CLPC吸附剂与pH在约pH2-pH 6范围内的缓冲溶液接触以从A蛋白-CLPC吸附剂中移出被吸附的免疫球蛋白；和 (e)以基本纯的形式回收移出的免疫球蛋白。
25.权利要求24的方法，其中所述缓冲的免疫球蛋白介质与所述A蛋白-CLPC吸附剂的接触在所述A蛋白-CLPC吸附剂的柱中完成。
26.权利要求24的方法，其中所述包含免疫球蛋白的介质为正常的哺乳动物血清。
27.权利要求24的方法，其中所述包含免疫球蛋白的介质为免疫哺乳动物血清。
28.权利要求24的方法，其中所述介质为哺乳动物血浆。
29.权利要求24的方法，其中所述介质为哺乳动物的腹水液。
30.权利要求24的方法，其中所述介质获自杂交瘤。
31.权利要求24的方法，其中所述介质为组织培养液。
32.权利要求24的方法，其中所述介质为细胞培养液。
33.权利要求24的方法，其中所述介质为哺乳动物细胞培养液。
34.权利要求24的方法，其中所述介质为细菌细胞培养液。
35.权利要求24的方法，其中所述介质为转基因来源的液体。
36.权利要求24的方法，其中所述介质为包含免疫球蛋白的植物提取物。
37.权利要求13的方法，其中所述介质为酵母培养液。
38.一种利用悬滴蒸汽扩散结晶法或分批结晶法制备A蛋白的结晶形式的方法，所述方法包括以下步骤 (a)以1:1蛋白试剂比将A蛋白置于去离子水中，其中所述试剂选自包含2M硫酸铵、0.I M 二甲胂酸盐缓冲液pH 6. 5和0. 2 M氯化钠的组合物；包含含2 M硫酸铵的柠檬酸盐缓冲液PH 5. 5的组合物；包含I M柠檬酸钠、0. I M Tris-HCl缓冲液pH 7和0. 2 M氯化钠的组合物；包含含0. 8 M NaH2PO4/1. 2 M K2PO4的0. I M醋酸盐缓冲液pH4. 5的组合物；以及包含2M硫酸铵、Tris-HCl缓冲液pH 7和0. 2M硫酸锂的组合物；和 (b)温育直至形成晶体。
39.权利要求38的方法，其中步骤(a)的A蛋白在去离子水中的浓度为约50.6 mg/ml或约120 mg/ml A蛋白。
40.一种制备A蛋白的交联结晶形式的方法，所述方法包括将A蛋白的结晶形式与戊二醛混合。
41.权利要求40的方法，其中所述戊二醛的终浓度为约1%。
42.一种纯化方法，所述方法包括将待纯化的物质与权利要求I或2的组合物接触。
全文摘要
本发明描述了A蛋白晶体和A蛋白交联蛋白晶体(CLPC)。本文还公开了制备方法及使用方法。
文档编号C07K1/14GK102753570SQ201080051667
公开日2012年10月24日 申请日期2010年9月13日 优先权日2009年9月15日
发明者巴米·谢诺伊, 玛格丽特·麦格拉思, 纳泽尔·卡拉夫, 西比尔·巴拉迪, 里纳·帕特尔, 钱査尔·兰德哈瓦 申请人:阿尔泰亚科技公司