专利名称：一种合成多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，具体涉及一种合成多肽及其应用。
背景技术：
与老化相关的神经变性疾病主要有阿尔茨海默病(AD)、弥漫性LeWy体病(DLBD)、Parkinsons病(PD)、肌萎缩侧索硬化病(ALS)。这些病症的发病机制尚不十分明了，自由基氧化应激损伤学说是近年来生物学研究的热点。在老龄化神经变性疾病中，脑组织发生3种共同的病理学改变蛋白氧化损伤、蛋白聚积、神经元变性坏死，关于三者的关系尚未阐述清楚，而自由基氧化损伤学说可能为三者提供了联系纽带。正常体内氧自由基的产生和清除处于动态平衡中，主要得益于身体中的抗氧化系统，包括酶类物质S0D、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽还原酶(GRH)和非酶类物质谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸、亲水性抗氧化物质及膜上的疏水性氧化物质。但在老龄化神经变性疾病中，由于体内ROS积聚，动态平衡被打破，诱发一系列自由基连锁反应，造成细胞损伤。以帕金森病为例，帕金森病是老年人中第四位最常见的神经变性疾病，在> 65岁人群中，1%的人患有此病。氧化应激被认为是帕金森患者黑质神经元死亡的主要因素，多巴胺在氧和水的存在下，受单胺氧化酶作用生成过氧化氢、醛和氨。过氧化氢可导致在黑质部位1 2+催化下，进一步生成毒性更大的羟自由基，而此时黑质线粒体呼吸链的复合物活性下降，抗氧化物(特别是谷胱甘肽)消失，无法清除自由基，因此，自由基通过氧化神经膜类脂、破坏DA神经元膜功能或直接破坏细胞DNA，最终导致黑质多巴胺能神经元变性。由于黑质多巴胺能神经元的退变，帕金森患者表现出严重的运动障碍，如震颤、运动迟缓、强直及姿势反射障碍。阿兹海默症的发病机制包含了 β -淀粉样蛋白(Αβ )沉积形成的老年斑诱导细胞膜上的脂质和蛋白质氧化修饰，致使ROS生成增多，改变了膜的通透性，Ca2+内流增加，激活Ca2+依赖性蛋白激酶、脂酶，使胞质自由基合成增多，损伤细胞器。肌萎缩侧索硬化症(ALS)发病主要是由于NMDA受体或AMPA受体激活导致的，线粒体超载Ca2+和ROS生成对其具有推动作用。总结以上神经退行性疾病的发病机制，抗氧化剂对于自由基的捕获和清除作用可减少此类病症的发生，为抗氧化剂在治疗神经退行性疾病方面的应用提供了理论基础。目前抗氧化剂对神经退行性疾病的应用，大部分仍停留在实验阶段，经过临床验证有治疗活性的仅有维生素E，但抗氧化剂的针对性治疗效果以及无不良毒副作用的特性，具有非常广阔的应用前景。抗氧化肽作为抗氧化剂的一个重要组成，有关研究越来越多。经蛋白酶解后分离纯化的手段分离得到高抗氧化活性肽的方法成本高，分离时间长，品质难以控制，产量低制约了抗氧化肽的大规模生产及应用。由此催生了化学合成制备抗氧化肽的方法。化学合成多肽现阶段多采用固相合成法，目前固相合成法的技术较为成熟，可广泛应用于多肽的合成。化学法合成的具有强抗氧化性质的多肽作为药物，具备以下的优势分子量小，易于人工合成，成本低，特异性强，副作用低，无免疫原性，比较安全可靠；并且人工合成多肽纯度高，不存在热原性问题，应用于神经退行性疾病的治疗具有非常广阔的应用前景。谷胱甘肽可应用于帕金森疾病的早期治疗，具有较为显著的疗效。同时谷胱甘肽在新生儿缺氧缺血性脑病的治疗过程中发挥了重要的作用提升了患儿治愈率，成为治疗新生儿缺氧缺血性脑病的有效药物。PC12细胞鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤克隆化的细胞株，分化的PC12细胞具有典型的神经细胞特性，在细胞形态、结构和功能上与神经元极其相似，与原代培养的神经细胞有高度一致性。因此作为体外模型被广泛用于研究多种神经系统疾病，如帕金森病、阿尔茨海默病等。本发明使用H2O2诱导的PC12细胞损伤作为神经损伤体外模型来评价合成多肽的神经保护效果。
发明内容
本发明的目的是提供了一种具有保护PC12细胞氧化损伤的合成多肽，可应用于氧化损伤的神经细胞进行保护，使得细胞存活率提高。本发明所述的合成多肽的序列为Tyr-Glu-Cys-Gly，
其中，Tyr表示英文名称为Tyrosine，中文名称为酪氨酸的氨基酸的相应残基；Glu表示英文名称为Glutamic acid,中文名称为谷氨酸的氨基酸的相应残基；Cys表示英文名称为Cysteine，中文名称为半胱氨酸的氨基酸的相应残基。Gly表示英文名称为Glycine，中文名称为甘氨酸的氨基酸的相应残基。发明所述的氨基酸序列采用的已有的成熟技术，通过树脂的筛选，获取合理的多肽合成方法采用标准Fmoc方案，选用Wang树脂进行固相合成。本发明提供所述合成多肽在神经细胞过氧化氢损伤保护中的应用，具体是将浓度为0.001-0. 1 mM的所述合成多肽加入神经细胞培养液中进行孵育，经氧化损伤2 h后，使得细胞存活率提高20%-35%。与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果本发明采用了体外化学抗氧化方法检测了合成多肽的抗氧化活性，所提供的合成多肽供氢能力强，具有较高ORAC活性及羟自由基清除能力，同时应用于氧化损伤的神经细胞进行保护，使得细胞存活率提高，效果较好。
图1为合成多肽Tyr-Glu-Cys-Gly的ESI图谱。图2为合成多肽添加后进行氧化损伤的PC12细胞存活率变化曲线。
具体实施例方式多肽固相合成
1、树脂选型
(1)采用标准 Fomc 方案，选用 0. 0125 mmol, 2-chlorotrityl chloride resin 树脂(天津市南开合成科技有限公司)，按照氨基酸序列Tyr-Glu-Cys-Gly的序列特征，加入0. 3
4mol第一个Fmoc保护氨基酸，将DCC和5 % (质量分数)DMAP加入到反应器振荡反应，用NMP冲洗树脂除去多余保护氨基酸。测定第一个氨基酸与树脂的连接效率即偶合率(如表1所示)。(2)采用标准!^mc方案，选用0. 0125 mmol, Wang树脂，按照氨基酸序列Tyr-Glu-Cys-Gly的序列特征，加入0. 3 mol第一个Fmoc保护氨基酸，将DCC和5 %(质量分数)DMAP加入到反应器振荡反应，用NMP冲洗树脂除去多余保护氨基酸。测定第一个氨基酸与树脂的连接效率即偶合率(如表1所示)。表 权利要求
1.一种合成多肽，其氨基酸序列为Tyr-Glu-Cys-Gly。
2.权利要求1所述合成多肽在神经细胞过氧化氢损伤保护中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于将浓度为0.001-0.1 mM的所述合成多肽加入神经细胞培养液中进行孵育，经氧化损伤2 h后，使得细胞存活率提高。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于细胞存活率提高20%-35%。
全文摘要
本发明公开了一种合成多肽及其应用，合成多肽的氨基酸序列如下所示Tyr-Glu-Cys-Gly。本发明的多肽使用多肽合成仪，采用固相合成法合成。本发明的多肽通过体外抗氧化活性检测，其抗氧化能力很强，将此合成多肽应用于氧化损伤的神经细胞进行保护，细胞存活率得到较大提高，效果显著。
文档编号A61P25/00GK102558299SQ20121008701
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月29日 优先权日2012年3月29日
发明者任娇艳, 崔春, 李文治, 赵谋明, 顾龙建 申请人:华南理工大学