专利名称：用于逆转肿瘤细胞耐药性的药物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体地，涉及一种用于逆转肿瘤细胞耐药性的药物组合物及其应用。
背景技术：
肝细胞癌(HCC)是第五大常见的恶性肿瘤，在肿瘤导致死亡人数中排第三位，每年约有600，000人死于肝细胞癌，严重威胁人类健康。对传统化疗药物的耐受是肝细胞癌治疗不成功的重要因素。肿瘤细胞耐药性的产生是一个涉及多因素的复杂过程，其中之一是肿瘤细胞高表达ATP依赖性转运体家族的蛋白。ABCG2是这个家族的重要一员，并且和肿瘤的多样耐药密切相关，它作为一个转 运体，可以外排许多常用化疗药物，如阿霉素，柔红霉素，弥陀蒽醌，拓扑提抗，SN38,甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，丝裂霉素和顺钼等。此外，ABCG2还和侧群细胞表型有密切的关系。侧群细胞(side population，SP)存在于多种肿瘤中，如乳腺癌、神经细胞瘤、肺癌、神经胶质瘤、鼻咽癌、肝细胞癌和结肠癌等，并且被认为是富含了肿瘤干细胞的群体。同样肝细胞癌的侧群细胞也表现出肿瘤干细胞样的特征，如自我更新，肿瘤生成和多向分化能力。除上述干细胞样特征外，我们还发现侧群细胞与肝细胞癌细胞系的耐药密切相关。人肝细胞癌细胞系中，侧群细胞的比例同细胞外排和耐受阿霉素的能力密切相关，MHCC-97L中的侧群细胞，与非侧群细胞相比，有更强的药物外排能力，ABCG2对肝细胞癌的侧群细胞表型形成中具有重要的作用。侧群细胞是一群耐药的细胞，传统化疗药物如阿霉素，弥陀蒽醌，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，丝裂霉素和顺钼等难以有效地杀伤侧群细胞。秀疮花类生物(Dicranostigmaleptopodum(Maxim. )Fedde,DLF)在临床上用于治疗肺结核，具有抗结核杆菌的功能。异紫堇定碱是从紫金龙和秃疮花等植物中提取的活性生物碱，是DLF的主要成分之一。目前，临床应用中，还没有出现能有效地逆转肿瘤细胞耐药性的药物。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于制备治疗肿瘤或逆转肿瘤细胞耐药性的异紫堇定碱或其药学上可接受的盐的药物组合物。本发明的另一目的是提供异紫堇定碱或其药学上可接受的盐的药物组合物在治疗肿瘤、或逆转肿瘤细胞耐药性的应用。本发明第一方面提供了一种异紫堇定碱(Isocorydin, I⑶)或其药学上可接受的盐的用途，用于制备(a)逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性的药物组合物；(b)治疗肿瘤的药物组合物；(c)抑制肿瘤细胞增殖的抑制剂；或
(d)诱导肿瘤细胞周期阻滞或凋亡的诱导剂；在所述的(a)、(b)、(C)和(d)中，所述的肿瘤或肿瘤细胞包括肿瘤侧群细胞和肿瘤非侧群细胞。在另一优选例中，所述抗肿瘤药物选自下组表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、弥陀蒽醌、拓扑提抗、SN38、长春新碱、顺钼、丝裂霉素、氨甲喋呤和氟脲嘧啶脱氧核。在另一优选例中，所述逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性包括提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性；和/或降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性。在另一优选例中，所述逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性包括增加肿瘤细胞中抗肿瘤药物的摄入量；和/或减少肿瘤细胞中抗肿瘤药物的外排量；和/或延长肿瘤细胞中抗肿瘤药物的滞留时间。在另一优选例中，所述药物组合物还用于⑴降低肿瘤细胞中侧群细胞的比例；和/或(ii)下调肿瘤细胞中三磷酸腺苷结合盒膜转运蛋白G2(ABCG2)的表达；和/或(iii)上调程序性细胞死亡因子4(ro⑶4)的表达。在另一优选例中，所述药物组合物还用于抑制肿瘤细胞的生长；和/或诱导肿瘤细胞的G2/M周期阻滞；和/或诱导肿瘤细胞凋亡。在另一优选例中，所述药物组合物还用于抑制肿瘤细胞中侧群细胞的生长；和/或诱导肿瘤细胞中侧群细胞的G2/M周期阻滞；和/或诱导肿瘤细胞中侧群细胞凋亡。在另一优选例中，所述药物组合物还用于降低侧群细胞诱发肿瘤的体积和重量。在另一优选例中，所述药物组合物还用于上调侧群细胞中促凋亡因子的表达，和/或下调侧群细胞中抑凋亡因子的表达。在另一优选例中，所述抑凋亡因子选自下组Bcl2、Bcl-xl和Mcl-I。在另一优选例中，所述促凋亡因子选自下组Fas、Bax、Bim、Bak、Bad、Bid和Bik。 在另一优选例中，所述肿瘤包括肝细胞癌、乳腺癌、神经细胞瘤、肺癌、神经胶质瘤、鼻咽癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾透明细胞癌、或胃癌。本发明第二方面提供了一种非治疗性的抑制肿瘤细胞生长的方法，包括步骤在异紫堇定碱或其药学上可接受的盐存在下，体外培养肿瘤细胞，从而抑制所述细胞的生长。本发明第三方面提供了一种非治疗性的抑制肿瘤侧群细胞生长的方法，包括步骤在异紫堇定碱或其药学上可接受的盐存在下，体外培养肿瘤侧群细胞，从而抑制所述细胞的生长。本发明第四方面提供了一种治疗方法，包括步骤给需要的对象施用药学有效剂量的异紫堇定碱或其药学上可接受的盐、或含异紫堇定碱或其药学上可接受的盐的药物组合物。在另一优选例中，所述方法用于(a)逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性；
(b)治疗肿瘤；(c)抑制肿瘤细胞增殖；或(d)诱导肿瘤细胞周期阻滞或凋亡；在所述的(a)、(b)、(C)和(d)中，所述的肿瘤或肿瘤细胞包括肿瘤侧群细胞和肿瘤非侧群细胞。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。
图IA 显示了用 150 μ g/ml、250 μ g/ml 异紫堇定碱处理 MHCC-97L、MHCC-97H，MHCC-LM324h后侧群细胞流式细胞分析的代表性散点图。图IB 显示了 150 μ g/ml、50 μ g/ml 异紫堇定碱处理 MHCC-97L、MHCC-97H 和MHCC-LM324h后，侧群细胞的比例发生显著的变化，10 μ g/ml阿霉素处理MHCC-97L和MHCC-LM324h后，对侧群细胞比例的影响。图2A显示了 Western blot检测不同浓度的异紫堇定碱和阿霉素处理MHCC-97L和MHCC-LM324h后ABCG2的蛋白表达。图2B显示了免疫细胞荧光化学显示150 μ g/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L和MHCC-LM324h后ABCG2荧光强度的变化；每个细胞中，左图绿色荧光为单克隆抗体标记，FITC联合二抗标记的ABCG2，中图蓝色荧光为DAPI标记的细胞核，右图为左图和中图的合并。图3A显示了分选后的侧群细胞和非侧群细胞的纯度检测。图3B显示了 Western blot检测分选后的侧群细胞和非侧群细胞中ABCG2的蛋白表达水平。图3C显示了 BrdU掺入试验检测不同浓度异紫堇定碱和不同浓度阿霉素处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞24h后对细胞增殖的抑制作用。图3D显示了流式细胞术检测150 μ g/ml处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞12h，24h，48h后对细胞周期分布的影响。图4显示了异紫堇定碱诱导侧群细胞早期和后期凋亡(C2和C4区域)。Annexin V/7-AAD双标记法检测150 μ g/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞48h后细胞早期和后期凋亡情况。图5A显示了 150 μ g/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞24h后caspase家族成员的起始分子的表达改变。图5B显示了 150 μ g/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞24h后细胞膜和线粒体膜上凋亡相关分子的表达改变。图6A显示了异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞裸小鼠皮下成瘤体积的的影响。图6B显示了异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞裸小鼠皮下成瘤瘤重的影响。*，P < O. 05。
图7A显示了异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞裸小鼠移植瘤组织的caspase家族起始分子的表达影响。图7B显示了异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞裸小鼠移植瘤组织的细胞膜和线粒体膜凋亡相关分子的表达影响。图8显示了异紫堇定碱对裸小鼠体重的影响。图9显示了异紫堇定碱对MHCC-97L和MHCC-LM3对阿霉素的敏感性的改变。BrdU细胞增殖检测试验显示150 μ g/ml异紫堇定碱和10 μ g/ml阿霉素分别处理MHCC-97L和MHCC-LM324h后，对细胞系对阿霉素的敏感性的影响。图10显示了异紫堇定碱对MHCC-97L和MHCC-LM3对阿霉素的摄入、外排和滞留的影响。150 μ g/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L和MHCC_LM324h后，对阿霉素的摄入、外排和滞留的影响，柱状图是对阳性细胞率的统计结果。 图11显示了异紫堇定碱对MHCC-97L和MHCC-LM3H)⑶4蛋白表达的改变。用不同浓度的异紫堇定碱处理MHCC-97L和MHCC-LM3细胞系24h后，Western blot检测H)CD4的蛋白表达水平。图12A显示了 H)⑶4在MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞的蛋白表达水平。图12B显示了 150 μ g/ml异紫堇定碱处理MHCC-97L和MHCC-LM3侧群细胞和非侧群细胞后，PDCD4蛋白表达水平的改变。图12C显示了异紫堇定碱对MHCC-97L侧群细胞和非侧群细胞裸小鼠皮下成瘤组织中ro⑶4的表达水平的的改变。
具体实施例方式本发明人通过长期而深入的研究，意外地发现，异紫堇定碱或其药学上可接受的盐可显著上调一系列促凋亡因子(如Bcl2，Bcl-xl，Mcl-I等)，下调抑凋亡因子(如Fas，Bax, Bim等)，从而诱导侧群细胞发生凋亡，显著抑制侧群细胞的生长，降低肝细胞癌细胞系的侧群细胞比例，降低癌细胞中ABCG2的表达水平，可改善肿瘤侧群细胞中H)CD4蛋白的低表达，可以减小侧群细胞诱发肿瘤的体积和重量，而对非侧群细胞生成的肿瘤没有显著的影响，可以有效地逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物(尤其是阿霉素)的耐药性。在此基础上，发明人完成了本发明。本发明所用“A和/或B”表示具有A、或具有B、或同时具有A和B。例如“提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性；和/或降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性。”表示具有“提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性”的作用，或具有“降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性”的作用，以及同时具有“提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性”和“降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性”两个作用。药物组合物活性成分如本文所用，术语“本发明化合物”指异紫堇定碱或其药学上可接受的盐。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐，包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于盐酸、氢溴酸、磷酸等无机酸，草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。药物组合物和施用方法本发明化合物或含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由侧群细胞介导的疾病，例如但不限于癌症。本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。 通常，药物组合物含有l_2000mg本发明化合物/齐U，更佳地，含有10_200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。“药学上可以接受的载体”应能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效，且适合于人使用，必须有足够的纯度和足够低的毒性。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温 )、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色齐U、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿齐U，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；⑴吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土 ；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物
坐寸ο除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味齐U、娇味剂和香料。除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可 接受的化合物联合给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为I 2000mg，优选20 500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。本发明主要优点I.提供了一种异紫堇定碱或其药学上可接受的盐的药物组合物，所述药物组合物能显著抑制肿瘤细胞中侧群细胞生长，有效降低肿瘤细胞中侧群细胞的比例，降低ABCG2的蛋白表达，上调TOCD4的蛋白表达，逆转肿瘤细胞对一些传统抗肿瘤药物的耐药性。2.提供了异紫堇定碱或其药学上可接受的盐在提高肿瘤细胞对传统抗肿瘤药物的敏感性，从而用于治疗肿瘤方面的应用。下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如 Sambrook 等人，分子克隆实验室手册(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明所用“I⑶”是指异紫堇定碱；“SP”是指侧群细胞；“non SP”是指非侧群细胞；“DXR”是指阿霉素；本发明所用“cleaved”表示截断的。本发明所用“Xenograft”表示异体移植瘤。实施例材料与方法I 材料I. I细胞系及实验动物人肝癌细胞系MHCC-LM3，MHCC-97H，MHCC-97L，购自复旦大学附属中山医院肝癌研究所。6-8周龄的雄性BALB/c(nu/nu)小鼠，购自上海肿瘤研究所病理学研究组。I. 2主要试剂本发明所用的主要试剂如表I所示。表I
权利要求
1.一种异紫堇定碱或其药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备 (a)逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性的药物组合物； (b)治疗肿瘤的药物组合物； (C)抑制肿瘤细胞增殖的抑制剂；或 (d)诱导肿瘤细胞周期阻滞或凋亡的诱导剂； 在所述的(a)、(b)、(C)和(d)中，所述的肿瘤或肿瘤细胞包括肿瘤侧群细胞和肿瘤非侧群细胞。
2.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性包括提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性；和/或降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性。
3.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述逆转肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性包括增加肿瘤细胞中抗肿瘤药物的摄入量；和/或减少肿瘤细胞中抗肿瘤药物的外排量；和/或延长肿瘤细胞中抗肿瘤药物的滞留时间。
4.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还用于 ⑴降低肿瘤细胞中侧群细胞的比例；和/或 (ii)下调肿瘤细胞中三磷酸腺苷结合盒膜转运蛋白G2(ABCG2)的表达；和/或 (iii)上调程序性细胞死亡因子4(H)⑶4)的表达。
5.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还用于 抑制肿瘤细胞的生长；和/或 诱导肿瘤细胞的G2/M周期阻滞；和/或 诱导肿瘤细胞凋亡。
6.如权利要求1、4或5任一项所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还用于 抑制肿瘤细胞中侧群细胞的生长；和/或 诱导肿瘤细胞中侧群细胞的G2/M周期阻滞；和/或 诱导肿瘤细胞中侧群细胞凋亡。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述药物组合物还用于上调侧群细胞中促凋亡因子的表达，和/或下调侧群细胞中抑凋亡因子的表达。
8.如权利要求I所述的用途，其特征在于，所述肿瘤包括肝细胞癌、乳腺癌、神经细胞瘤、肺癌、神经胶质瘤、鼻咽癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾透明细胞癌、或胃癌。
9.一种非治疗性的抑制肿瘤细胞生长的方法，其特征在于，包括步骤在异紫堇定碱或其药学上可接受的盐存在下，体外培养肿瘤细胞，从而抑制所述细胞的生长。
10.一种非治疗性的抑制肿瘤侧群细胞生长的方法，其特征在于，包括步骤在异紫堇定碱或其药学上可接受的盐存在下，体外培养肿瘤侧群细胞，从而抑制所述细胞的生长。
全文摘要
本发明涉及一种用于逆转肿瘤细胞耐药性的药物组合物及其应用。具体地，本发明公开了一种异紫堇定碱(Isocorydin，ICD)或其药学上可接受的盐的新用途，用于制备治疗肿瘤的药物组合物。所述药物组合物可提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性，或降低肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药性。
文档编号A61K31/473GK102631345SQ20121008690
公开日2012年8月15日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者李锦军, 路平 申请人:上海市肿瘤研究所