专利名称：杜仲叶提取物及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药领域，具体涉及ー种杜仲叶提取物及其制备方法和应用。
背景技术：
杜仲为杜仲科植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)的干燥树皮,是中国名贵滋补药材。具补肝肾、强筋骨、降血压、安胎等诸多功效。《神农本草经》列为上品。谓其“主治腰膝痛，补中，益精气，坚筋骨，除阴下痒湿，小便余浙。久服，轻身耐老。”杜仲是中国特有药材，其药用历史悠久，在临床有着广泛的应用。迄今已在地球上发现杜仲属植物多达14种，后来它们在大陆和欧洲相继灭绝。存在于中国的杜仲是杜仲科杜仲属仅存的孑遗植物，它不仅有很高的经济价值。·近年来，国内外专家对杜仲成分进行了反复细致的研究，发现杜仲中含有对人体所必须的苏氨酸，蛋氨酸，异亮氨酸，赖氨酸等17种游离氨基酸，以及锌，铜，镁，铁，钙，磷，钾等15种微量元素。杜仲具有补肝肾，强筋骨，清除体内垃圾，加强人体细胞物质代谢，防止肌肉骨骼老化，平衡人体血压，分解体内胆固醇，降低体内脂肪，恢复血管弾性，利尿清热，广谱抗菌，兴奋中枢神经，提高白血球数量，增强人体免疫力等显著功效。现有的杜仲入药部位为杜仲皮，杜仲皮的采集方法为将栽培10年以上的杜仲，用半环剥法剥取树皮后进行加工。由于杜仲树数量稀少，且为保证药材的质量需要杜仲生长至10年或以上的树龄才能采集杜仲皮，同时由于杜仲的药用价值巨大，所以致使其价格
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发明内容
本发明的目的在于提供一种杜仲叶水和/或低级醇提取物，包括杜仲叶粗提物和杜仲叶精提物。本发明的又一目的在于提供杜仲叶水和/或低级醇提取物在制备抗骨折药物中的应用。本发明的目的可以通过以下技术方案实现一种杜仲叶水和/或低级醇提取物，其在于所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物包括杜仲叶用水或者低级醇提取，或者用水和低级醇混合提取得到的粗提物，以及所述粗提物精制后得到的精制杜仲叶提取物。水提取杜仲叶制备杜仲叶粗提物的方法杜仲叶药材干燥粉碎后，用水提取三次，各次所用水的质量依次为杜仲叶药材质量的10倍、10倍和9倍，每次提取的回流时间依次为2h、l. 5h和lh，将三次提取液过滤后，合并滤液并浓缩至小体积得到杜仲叶粗提物。こ醇提取杜仲叶制备杜仲叶粗提物的方法杜仲叶药材干燥粉碎后，用体积百分浓度为45% 55%的こ醇溶液提取三次，各次所用こ醇溶液质量依次为杜仲叶药材质量的10倍、8倍和6倍，每次提取的回流时间依次为2h、I. 5h和lh，将三次提取液过滤后合并，回收こ醇，得醇提液；将醇提液浓缩至小体积得到杜仲叶粗提物。
水和こ醇混合提取杜仲叶制备杜仲叶粗提物的方法杜仲叶药材干燥粉碎后，用体积百分浓度为45% 55%的こ醇溶液提取三次，各次所用こ醇溶液质量依次为杜仲叶药材质量的10倍、8倍和6倍，每次提取的回流时间依次为2h、I. 5h和lh，将三次提取液过滤后合井，回收こ醇，得醇提液；こ醇提取后的药渣加10倍量水煎煮2h，得水提液；将水提液和醇提液 合并后浓缩至小体积得到杜仲叶粗提物。水和こ醇混合提取杜仲叶时，对粗提物进行精制的方法为先将水提液浓缩后用体积百分浓度不低于90%的こ醇沉淀后与所述的醇提液合并，然后依次经HPD100大孔树脂富集和聚酰胺树脂纯化得到精制杜仲叶提取物。所述的HPD100大孔树脂富集和聚酰胺树脂纯化过程为将こ醇沉淀后的水提液与所述的醇提液合并后加水调节浓度为O. Olg药材/ml，同时调节pH = 4，得到上样液，上HPD100大孔树脂吸附柱，经体积百分浓度为50 60%的こ醇洗脱，减压回收洗脱液中的こ醇至无醇味，得HPD100大孔树脂洗脱液；将HPD100大孔树脂洗脱液调节至浓度为O. Olg药材/ml，上30_60目聚酰胺树脂柱经体积百分浓度为40% 50%的こ醇洗脱得洗脱液，然后减压回收洗脱液中的こ醇后，继续减压蒸出水溶液，至小体积，为洗脱浓缩液；将洗脱浓缩液经65 70°C，在负压O. OSMpa条件下进行干燥，得精制杜仲叶提取物。精制的杜仲叶提取物中包含4种黄酮类化合物和绿原酸，所述的4种黄酮类化合物为芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素-3-0- a -L-吡喃阿拉伯糖基-(I — 2) - β -D-葡萄糖基苷，所述的精制后杜仲叶提取物中4种黄酮类化合物和绿原酸的质量百分含量不低于50%。一种促进骨折愈合的药物，其在于由治疗有效量的杜仲叶水和/或低级醇提取物加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成制剂，所述的制剂包括丸剤、散剤、胶囊、片剂、颗粒剂、注射或复方制剂。上杜仲叶水和/或低级醇提取物在制备促进骨折愈合的药物中的应用。本发明的有益效果本发明提供杜仲叶提取物可以显著增加碱性磷酸酶，降低血钙，増加血磷，増加骨密度，能明显促进骨折后骨的愈合。另外，研究社仲叶的提取物的应用，可增加杜仲植物的药用部位，扩大其应用范围，并由于杜仲叶与杜仲皮相比，更易获得，可降低杜仲的成本。
具体实施例方式实施例I杜仲叶提取物的制备I.水提取杜仲叶制备杜仲叶粗提物(即杜仲叶水提取液)杜仲叶(无锡市宜兴市张渚镇药材种植园采集)药材干燥，剪碎(剪碎粒度I 3mm2)，用水提取三次，各次所用水的质量依次为杜仲叶药材质量的10倍、10倍和9倍，每次提取的回流时间依次为2h、l. 5h和lh，将三次提取液过滤后，合并滤液并浓缩至2. 857g生药/ml,得到杜仲叶粗提物。II.こ醇提取杜仲叶制备杜仲叶粗提物(即杜仲叶醇提取液)杜仲叶(无锡市宜兴市张渚镇药材种植园采集)药材干燥，剪碎(剪碎粒度I 3mm2)，按质量计，加入10倍量体积百分浓度为50%的こ醇浸泡2h，回流2h，过滤得到第一次提取液；加入8倍量体积百分浓度为50%こ醇回流I. 5h，过滤得到第二次提取液；加入6倍量体积百分浓度为50%こ醇回流lh，过滤得到第三次提取液；合并三次提取液，回收こ醇，并浓缩至2. 857g生药/ml，得到杜仲叶粗提物。III.水和こ醇混合提取杜仲叶制备杜仲叶粗提物(即杜仲叶醇水混合提取液)杜仲叶(无锡市宜兴市张渚镇药材种植园采集)药材干燥，剪碎(剪碎粒度I 3mm2)，按质量计，加入10倍量体积百分浓度为50%こ醇浸泡2h，回流2h，过滤得到第一次提取液；加入8倍量体积百分浓度为50%こ醇回流I. 5h，过滤得到第二次提取液；加入6倍量体积百分浓度为50%こ醇回流lh，过滤得到第三次提取液；合并三次提取液，回收こ醇，得醇提液。こ醇提取后的药渣加10倍量水煎煮2h，得水提液。合并醇提液与水提液，并浓缩至2. 857g生药/ml,得到杜仲叶粗提物。 IV.制备精制杜仲叶提取物杜仲叶药材经醇、水混合提取后，水提液经こ沉淀后与醇提液合并，再经HPD100大孔树脂富集和聚酰胺纯化后可以制备得到精制杜仲叶提取物。I.药材提取方法杜仲叶(无锡市宜兴市张渚镇药材种植园采集)药材干燥，剪碎(剪碎粒度I 3mm2)，按质量计加入10倍量体积百分浓度为50%的こ醇浸泡2h，回流2h，过滤得到第一次提取液；加入8倍量体积百分浓度为50%的こ醇回流I. 5h，过滤得到第二次提取液；加入6倍量体积百分浓度为50%的こ醇回流lh，过滤得到第三次提取液。合并三次提取液，回收こ醇至无醇味，得醇提液。こ醇提取后的药渣加10倍量水煎煮2h，得提取液。水浴浓缩，以水定容至浓度为Ig生药/ml的水提液。2.水提液的こ醇沉淀方法取浓度为Ig生药/ml的水提液，加入体积百分浓度为95%的こ醇液，使体系中こ醇浓度达到70%，静置2h，过滤，得滤液。沉淀物用体积百分浓度为50%的こ醇液反复洗涤，合并洗涤液到滤液之中。回收こ醇至无醇味，得こ醇沉淀后的水提液。3.杜仲叶总提取液的制备方法合并杜仲叶的醇提液和こ醇沉淀后的水提液，得杜仲叶总提取液。4. HPD100大孔树脂富集方法HPD100大孔树脂预处理方法将HPD100大孔树脂适量，用I. 5倍体积的95%こ醇浸泡12h，去掉悬浮物，装柱，用95%こ醇洗柱，至流出液加水无浑浊为止。换用蒸馏水冲洗，洗至无醇味。柱子的径高比I 9。上样液的制备取杜仲叶总提取液，加水调节浓度为O. Olg药材/ml，同时加入适量浓盐酸，使体系的PH = 4，该液体为HPD100大孔树脂上样液。上样量lg药材/Ig干树脂，Ig干树脂=湿树脂4. 4ml。即lOOmlHPDlOO大孔树脂上样液需要4. 4ml湿树脂。上样流速6BV/h。除杂条件使用2BV的pH = 4的盐酸水溶液除杂，以2BV/h流速冲洗。こ醇洗脱条件用体积百分浓度为55%的こ醇洗脱，速度2BV/h，洗脱体积为6BV。
洗脱液的回收减压回收洗脱液中的こ醇至无醇味，得HPD100大孔树脂洗脱液。树脂再生方法树脂经95%こ醇冲洗至无色，即可再次使用。4.聚酰胺树脂纯化方法30-60目聚酰胺树脂预处理方法采用I. 5倍量的95%こ醇浸泡12h，去掉悬浮物，装柱，95%こ醇洗柱，至流出液加水无浑浊。再换用蒸馏水冲洗，至无こ醇流出。柱子的径高比径高比为I : 10。上样液的制备取HPD100大孔树脂洗脱液，加水调节浓度为O. Olg药材/ml，为30-60目聚酰胺树脂上样液。上样量上样量为O. 5g药材/Ig干聚酰胺树脂，Ig聚酰胺树脂干树脂=湿树脂4.4ml。即100ml30-60目聚酰胺树脂上样液需要8. 8ml湿的聚酰胺树脂。 上样流速上样流速为2BV/h。こ醇洗脱条件用体积百分浓度为45%的こ醇洗脱，以4BV/h的流速进行，洗脱液的用量8BV。洗脱液的回收减压回收洗脱液中的こ醇后，继续减压蒸出水溶液，至小体积，为洗脱浓缩液。干燥经65 70°C，在负压O. OSMpa条件下进行干燥，得精制杜仲叶提取物。树脂再生方法使用2-3% Na0H2BV浸泡过夜，水溶液洗至中性无色，再用95%こ醇洗至无色，即可再次使用。精制杜仲叶提取物的得率约为3. 5%。实施例2精制杜仲叶提取物中各成分含量检测方法采用HPLC法，同时检测杜仲叶提取物中的5种成分的含量，它们分别为绿原酸，槲皮素-3-0-a-L-吡喃阿拉伯糖基-(I — 2)-β-D-葡萄糖基苷(以下简称为DY_1)，芦丁，异槲皮苷，紫云英苷。使用外标一点法计算杜仲叶提取物样品中各成分含量。I.样品配制I. I混合对照品的配制精密称取绿原酸对照品4. 89mg,体积百分浓度为50%的こ醇溶解，定容至10ml，得到浓度为489 μ g/ml的绿原酸对照品溶液；精密称取DY-I对照品6. 43mg,体积百分浓度为50%的こ醇溶解，定容至10ml，得到浓度为643 μ g/ml的DY-I对照品溶液；精密称取芦丁对照品I. 69mg,体积百分浓度为50%的こ醇溶解，定容至10ml，得到浓度为169 μ g/ml的芦丁对照品溶液；精密称取异槲皮苷对照品3. 15mg,体积百分浓度为50%的こ醇溶解，定容至10ml，得到浓度为315 μ g/ml的异槲皮苷对照品溶液；、
精密称取紫云英苷对照品1.23mg，体积百分浓度为50 %的こ醇溶解，定容至10ml，得到浓度为123 μ g/ml的紫云英苷对照品溶液；分别精密吸取绿原酸对照品溶液4. 5ml、DY-I对照品溶液1ml、芦丁对照品溶液lml、异槲皮苷对照品溶液1ml、紫云英苷对照品溶液I. 5ml、槲皮素对照品溶液O. 3ml、山奈酚对照品溶液O. 2ml至IOml容量瓶，用体积百分浓度为50%的こ醇定容至刻度，即得混合对照品溶液。各对照品浓度分别为绿原酸220. 05 μ g/ml，DY-164. 3 μ g/ml，芦丁 16. 9 μ g/ml,异槲皮苷31. 5 μ g/ml,紫云英苷18. 45 μ g/ml。I. 2样品的配制精密称取实施例IIV制备的精制杜仲叶提取物20. lmg，用体积百分浓度为50%的こ醇溶解，定容至50ml，得到浓度为O. 402mg/ml的精制杜仲叶提取物溶液。2. HPLC色谱条件色谱柱Hedera C18,流动相:溶剂A(0. 1%甲酸こ腈,v/v)和溶剂B(0. 1%甲酸7jC, v/v)梯度洗脱，检测波长270nm，进样体积20 μ L，柱温为30°C，流速I. Oml/min。流动相洗脱梯度变化见下表I。表I流动相洗脱梯度
权利要求
1.一种杜仲叶水和/或低级醇提取物，其特征在于所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物包括杜仲叶用水或者低级醇提取，或者用水和低级醇混合提取得到的粗提物，以及所述粗提物精制后得到的精制杜仲叶提取物。
2.根据权利要求I所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物，其特征在于所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物采用如下方法制备杜仲叶药材干燥粉碎后，用水提取三次，各次所用水的质量依次为杜仲叶药材质量的10倍、10倍和9倍，每次提取的回流时间依次为2h、I. 5h和lh，将三次提取液过滤后，合并滤液并浓缩至小体积得到杜仲叶粗提物。
3.根据权利要求I所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物，其特征在于所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物采用如下方法制备杜仲叶药材干燥粉碎后，用体积百分浓度为45% 55%的こ醇溶液提取三次，各次所用こ醇溶液质量依次为杜仲叶药材质量的10倍、8倍和6倍，每次提取的回流时间依次为2h、1.5h和lh，将三次提取液过滤后合并，回收こ醇，得醇提液；将醇提液浓缩至小体积得到杜仲叶粗提物。
4.根据权利要求I所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物，其特征在于所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物采用如下方法制备杜仲叶药材干燥粉碎后，用体积百分浓度为45% 55%的こ醇溶液提取三次，各次所用こ醇溶液质量依次为杜仲叶药材质量的10倍、8倍和6倍，每次提取的回流时间依次为2h、l. 5h和lh，将三次提取液过滤后合井，回收こ醇，得醇提液；こ醇提取后的药渣加10倍量水煎煮2h，得水提液；将水提液和醇提液合并后浓缩至小体积得到杜仲叶粗提物。
5.根据权利要求4所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物，其特征在于所述的杜仲叶粗提物采用如下方法进行精制先将水提液浓缩后用体积百分浓度不低于90%的こ醇沉淀后与所述的醇提液合井，然后依次经HPD100大孔树脂富集和聚酰胺树脂纯化得到精制杜仲叶提取物。
6.根据权利要求5所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物，其特征在于所述的HPD100大孔树脂富集和聚酰胺树脂纯化过程为将こ醇沉淀后的水提液与所述的醇提液合并后加水调节浓度为O. Olg药材/ml,同时调节pH = 4，得到上样液，上HPD100大孔树脂吸附柱，经体积百分浓度为50 60%的こ醇洗脱，减压回收洗脱液中的こ醇至无醇味，得HPD100大孔树脂洗脱液； 将HPD100大孔树脂洗脱液调节至浓度为O. Olg药材/ml，上30-60目聚酰胺树脂柱经体积百分浓度为40% 50%的こ醇洗脱得洗脱液，然后减压回收洗脱液中的こ醇后，继续减压蒸出水溶液，至小体积，为洗脱浓缩液；将洗脱浓缩液经65 70°C，在负压O. 08Mpa条件下进行干燥，得精制杜仲叶提取物。
7.根据权利要求6所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物，其特征在于所述的精制后杜仲叶提取物中包含4种黄酮类化合物和绿原酸，所述的4种黄酮类化合物为芦丁、异槲皮苷、紫云英苷、槲皮素-3-0- a -L-吡喃阿拉伯糖基-(I — 2)-β -D-葡萄糖基苷，所述的精制后杜仲叶提取物中4种黄酮类化合物和绿原酸的质量百分含量不低于50%。
8.一种促进骨折愈合的药物，其特征在于由治疗有效量的权利要求I 7中任意ー项所述的杜仲叶水和/或低级醇提取物加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制成制剂，所述的制剂包括丸剂、散剂、胶囊、片剂、颗粒剂、注射或复方制剂。
9.权利要求I 7中所述的任意一项杜仲叶水和/或低级醇提取物在制备促进骨折愈合的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开一种杜仲叶水和/或低级醇提取物及其制备方法和应用，包括杜仲叶用水或者低级醇提取，或者用水和低级醇混合提取得到的粗提物，以及所述粗提物精制后得到的精制杜仲叶提取物。该提取物在制备促进骨折愈合药物中的应用效果显著。本发明提供杜仲叶水和/或低级醇提取物可以显著增加碱性磷酸酶，降低血钙，增加血磷，增加骨密度，能明显促进骨折后骨的愈合。另外，研究杜仲叶的提取物的应用，可增加杜仲植物的药用部位，扩大其应用范围，并由于杜仲叶与杜仲皮相比，更易获得，可降低杜仲的成本。
文档编号A61K127/00GK102670696SQ20121013419
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月3日 优先权日2012年5月3日
发明者张欣, 杨中林 申请人:中国药科大学