专利名称：一种促进水貂增重的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域中的促增重药物组合物，特别是涉及ー种促进水貂增重的药物组合物。
背景技术：
水貂皮具有细密柔软，手感爽滑，色泽美观，结实轻巧，又能防潮去湿的优点，用其制成的裘服华贵、保暖、美观、耐用，因而水貂皮有世界皮毛之冠的美称，也有人称其为“软黄金”。由于水貂的主要经济价值在其皮毛，因此迫切需要促进水貂增重的药物，以提高水貂的经济价值。本发明涉及的Exendin9_39是含有31个氨基酸残基的小肽，它是由exendin_4的39个氨基酸残基缺失N端的前8个氨基酸残基后得到的。Exendin-4发现于美国毒蜥蜴分泌的毒液中(Eng J等，1992)。其作用主要是动物体内的类胰高血糖素样肽_1(glucagon-like peptide-1, GLP-I)受体的激活剂，促进GLP-1与受体结合，诱导cAMP的产生，从而发挥出类似GLP-I的作用増加葡萄糖依赖性的胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的分泌，加速葡萄糖清除，延缓胃排空和诱发饱腹感、抑制食欲，还可以改善外周胰岛素抵抗等。而缺少8个氨基酸的Exendin9-39却是GLP-I受体的抑制剂，其作用也与exendin-4完全相反降低胰岛素的分泌、增加胰高血糖素的分泌、増加食欲等(Goke R等，1993 ;Schepp W 等，1994 ;Thorens B 等，1993)。早在 1999 年，Karim Meeran 等用大鼠的实验证明，exendin9-39能够提高动物食欲，并能增加动物的体重。他们姆天注射30nmol的exendin9_39于大鼠的侧脑室中，连续注射3天,与注射生理盐水的对照组相比，实验组大鼠平均每天的饲料消耗是21. 9±0. 5vs. 19. 5±0. 4g，P〈0. 001，最终体重增加(7±2vs. 2±lg，P〈0. 02)。人们可以利用exendin9_39的特性使毛皮动物达到增肥的目的。但exendin9_39化学合成的成本较高。经分析各种文献和专利，发明人发现与exendin-4有关的国内公开专利有54项、美国专利有51项、欧洲专利有10项，但都与exendin9-39的序列和真核表达无关，关于eXendin9-39基因的优化和真核表达，至今没有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进狐狸增重的药物组合物，其有效成分为含有exendin9-39编码基因的真核表达载体；该药物组合物优选为注射剂。所述exendin9_39编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. I所示。所述真核表达载体中eXendin9-39编码基因的5’端紧密链接有人生长激素的信号肽编码序列，所述人生长激素的信号肽编码序列如序列表中SEQ ID No. 2所示。所述5’端紧密链接有人生长激素的信号肽编码序列的eXendin9-39编码基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示。用于构建所述含有eXendin9-39编码基因的真核表达载体的出发载体为pVAXl(Invitrogen 公司)、pSilencel. 0-U6 (Ambion, Austin, TX, USA)、pEGFP-Nl (ClonTech 公司)、pCMV (Stratagene 公司)、pSV40 (Marker Gene 公司)、pSI、pCI、pCI_neo (Promega 公司)、pPICZa、pTEFl、pcDNA3. I 或 pcDNA (Invitrogen 公司)；其中，优选 pVAXl，以 pVAXl 为出发载体构建的含有exendin9-39编码基因的真核表达载体为pVAXl-EXMK。上述重组表达载体均可按照常规方法构建。所述注射剂中含有exendin9-39编码基因的真核表达载体的浓度为100-200 μ g/ml ο所述注射剂的溶剂的选择是多种多样的，如pH 7. 5-8. 5的TE缓冲液、生理盐水、PBS或灭菌蒸馏水等，优选为pH 7. 5-8. 5的TE缓冲液。 需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、吸收促进剂、表面活性剂等。上述药物一般在10月份应用于水貂肌肉注射，用量为每只水貂注射3_5ml，根据增重情况，可适时追加注射一次，直至11月中下旬水貂取皮。剂量和疗程都可调整。为提高疗效，本发明的药物还可以与抗生素、免疫刺激剂等进行组合治疗。本发明提供一种促进水貂增重的药物组合物。该药物组合物的活性成分为含有exendin9-39编码基因的真核表达载体，将其导入水貂体内，可使exendin9_39编码基因在水貂体内进行表达，从而达到促进水貂增重的目的，以期获得质优价廉的貂皮。本发明的药物组合物具有以下优点I)与传统的优化水貂饲料配方和从饲养管理等角度出发研究的促进水貂增重的方法相比，本发明的药物组合物具有成本低、起效快的优点。2)该药物组合物严格按照基因药物生产标准进行制备及纯化，具有较高的使用安全性，且经过动物试验结果表明，该药物无任何毒、副作用。3)貂皮仅供人类穿戴，动物尸体一般进行销毁或用于生产エ业用油，故不存在药物的安全性问题肌肉注射的药物组合物即使有残留也只会残留在肌肉中，退ー步讲，如果本发明的药物在毛皮内有残留，也不会对人类健康造成威胁，因为水貂毛皮只被制成大衣或帽子等，不与人体直接接触。4)本发明的药物组合物可利用工程菌发酵培育获得，培养及纯化方法简单，成本低廉，对设备要求低，便于进行エ厂化生产。本发明将在水貂及其他毛皮动物的养殖中发挥重要作用，应用前景广阔。
图I为含有exendin9_39编码基因的真核表达载体pVAXl-EXMK的物理图谱。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可參见《Molecular Cloning:A LaboratoryManual)) (Sambrook, J. , Russell, David W·，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rdedition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。所有引物及DNA序列均由上海生工合成。实施例I制备促进水貂增重的药物组合物
本发明促进水貂增重的药物组合物的制备过程，包括如下步骤I)人工设计合成5’端紧密链接有人生长激素的信号肽编码序列的eXendin9-39编码基因的核苷酸序列Exendin9-39的氨基酸序列如下NH2-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Giy-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser—COOHo根据遗传密码表，并考虑到水貂密码子的偏爱性，我们设计推导出eXendin9-39基因的真核表达编码序列为ATGGACCTGTCCAAGCAGATGGAGGAGGAGGCCGTGCGGCTGTTCATCGAGTGGCTGAAGAACGGCGGC CCCTCCTCCGGCGCCCCCCCCCCCTCCTGA (SEQ ID No. I 所示)。而exendin-4失去N端的前8个氨基酸后的核苷酸序列为GACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCG。(Chen YE 等，1997)。相比之下,我们设计的exendin9_39的核苷酸序列与exendin-4的核苷酸序列显著不同，二者的同源性仅有74. 44%。为促进exendin9_39编码基因的表达，我们在其5’端紧密链接上人生长激素的信号肽编码序列(SEQ ID No. 2所示)，人工设计合成5’端紧密链接有人生长激素的信号肽编码序列的exendin9-39编码基因的核苷酸序列(并携带Hind III和BamH I酶切位点),其完整的表达框序列如SEQ ID No. 3所示。2)真核表达载体pVAXl-EXMK的构建将步骤I)合成的核苷酸序列经Hind III和BamH I酶切后直接克隆入酶切后的PVAXI (购自北京中创先鋒科技有限责任公司，为invitrogen公司产品)中，构建成含有exendin9-39的真核表达载体，命名为pVAXl-EXMK。3)促进水貂增重的药物组合物的获得将步骤2)构建的真核表达载体pVAXl-EXMK转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选阳性克隆，将阳性克隆接种于LB培养基中，37°C下发酵培养16-18小吋，发酵结束后收集菌体，离心，弃上清，提取pVAXl-EXMK质粒DNA，用聚こニ醇沉淀法进行纯化，检测0D26(l/0D28(l比值为1.9:1，符合标准；再将pVAXl-EXMK质粒DNA溶解于TE缓冲液中(含终浓度IOmmol/L Tris-Cl和lmmol/L EDTA的溶液，pH值为8. 0)，得到促进水貂增重的药物组合物(可根据需要调整pVAXl-EXMK质粒DNA和TE缓冲液的混合比例，得到不同浓度的药物组合物，如将100 μ g的pVAXl-EXMK质粒DNA和ImlpH值为8. O的TE缓冲液混合均匀，即得到浓度为100 μ g/ml的促进水貂增重的药物组合物)。实施例2安全性试验(I)毒性试验将500yg pVAX I-EXMK 质粒 DNA 溶解在 Iml TE 缓冲液(pH 值 8. 0)中，配成 500 μ g/ml的药物组合物，尾部静脉注射10只实验小鼠，注射后连续观察5天，10只小鼠均未出现不良反应和死亡现象。将10. Omg pVAXl-EXMK 质粒 DNA 溶解在 Iml TE 缓冲液(pH 值 8. O)中，配成 IOmg/ml的药物组合物，对10只成年貂进行肌肉注射，注射后连续观察30天，均未出现体温升高和异常临床表现。上述试验结果表明，注射本发明的促进水貂增重的药物组合物具有较高的安全性。(2)药物残留检测将10. Omg pVAXl-EXMK 质粒 DNA 溶解在 Iml TE 缓冲液(pH 值 8. O)中，配成 IOmg/ml的药物组合物，对14只成年貂进行肌肉注射，取治疗后水貂腿部肌肉进行药物组合物残留检测，连续检测14天，结果仅在注射后第3天PCR检测为阳性，证明本发明药物的残留量较低。实施例3药效实验
随机选取成年水貂40只，公母各半，随机分为4组，每组10只，公母各5只。第I组腿部肌肉注射pVAXl-EXMK质粒DNA浓度为200 μ g/ml的促进水貂增重药物组合物5ml ;第2组腿部肌肉注射pVAXl-EXMK质粒DNA浓度为400 μ g/ml的促进水貂增重药物组合物5ml ;第3组腿部肌肉注射pVAXl-EXMK质粒DNA浓度为1000 μ g/ml的促进水貂增重药物组合物5ml ;第4组注射TE缓冲液(pH值8. O) 5ml。用药前和屠宰前分别称重，对数据进行统计分析，综合判定药效。与第4组对照组相比，第1、2、3组的平均增重分别为483±0. 5g、350±0. 7g、312±0. 4g。上述结果证明，本发明的药物组合物对水貂的增重有明显的效果。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作ー些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种促进水貂增重的药物组合物，其有效成分为含有eXendin9-39编码基因的真核表达载体。
2.根据权利要求I所述的药物组合物，其特征在于，所述eXendin9-39编码基因具有SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求I所述的药物组合物，其特征在于，所述真核表达载体中exendin9-39编码基因的5’端紧密链接有人生长激素的信号肽编码序列，所述人生长激素的信号肽编码序列如序列表中SEQID No. 2所示。
4.根据权利要求1-3任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述真核表达载体含有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求I所述的药物组合物，其特征在于，用于构建所述真核表达载体的出发载体为 PVAXK pSilencel. 0-U6、pEGFP-Nl、pCMV、pSV40、pSI、pCI、pCI-neo、pPICZa、pTEFl、pcDNA3. I 或pcDNA。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述出发载体为pVAXl。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述真核表达载体为pVAXl-EXMK。
8.根据权利要求I所述的药物组合物，其为100-200μ g/ml浓度含有exendin9-39编码基因的真核表达载体的注射剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述注射剂的介质为pH7.5-8.5的TE缓冲液、生理盐水或PBS。
全文摘要
本发明提供了一种促进水貂增重的药物组合物，具体是以含有exendin9-39编码基因的真核表达载体为有效成分的注射剂。通过将该药物组合物导入水貂体内，可使exendin9-39编码基因在水貂体内进行表达，促进水貂增重，从而获得质优价廉的貂皮。本发明的药物组合物具有以下优点成本低、起效快；通过该药物组合物增重获得的貂皮仅供人类穿戴，不存在药物的安全性问题；该药物组合物可利用工程菌发酵获得，方法简单、对设备要求低，便于进行工厂化生产。
文档编号A61P43/00GK102688504SQ20121021199
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者刘维全, 王吉贵 申请人:中国农业大学